Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Количественная характеристика антителосекретирующих клеток в органах и тканях иммунной системы мышей в процессе иммуногенеза

Актуальность темы. В разработке фундаментальных и прикладных аспектов специфической профилактики болезней животных основополагающая роль принадлежит иммунологии - относительно молодой среди других биологических дисциплин, сложной, но одной из многообещающих областей науки. Развитие новых подходов к предупреждению инфекционных заболеваний, изучение механизмов иммунологической защиты животных и взаимоотношений между различными клетками иммунной системы неразрывно связаны с разработкой и внедрением новых методов и технологий, основанных на современных представлениях об эффекторных механизмах иммунитета, среди которых главное место занимает взаимодействие антиген-антитело (Петров Р.В., 1982, 1988; Грен Э.Л., Пумен П.П., 1988; Ярилин А. А., 1999; 2001).

Интенсивное развитие иммунохимии белков подтвердило важную роль иммуноглобулинов в защите организма человека и животных (Стефани Д.В., 1975; Федоров Ю.Н., 1984; Чекишев В.М., 1985; Ездакова И.Ю., 1994; Верховский О.А., 1998 и др.). Иммуноглобулины (антитела) продуцируются антителосекретирующими клетками (АСК), от количества и функционального состояния которых напрямую зависит способность организма к гуморальному иммунному ответу. АСК обнаруживаются практически во всех органах и тканях иммунной системы (Сапин М.Р. и др., 1992, Cukrowska В., 1995), однако в настоящее время остаются недостаточно изученными вопросы, связанные с изменением их количественных характеристик в процессе иммуногенеза при взаимодействии с различными типами антигенов и на разных стадиях развития иммунного ответа (Cukrowska В., 1995.). Эти сведения необходимы для изучения роли различных составляющих иммунной системы в активации и изотипическом переключении антигенспецифических плазматических В-лимфоцитов, понимания механизмов иммунологического распознавания и презентации антигенов, а также формирования иммунитета в целом.

Одним из самых эффективных методов оценки функциональной активности клеток иммунной системы в процессе онто- и иммуногенеза является ELISPOT-метод (англ. enzyme-linked immunospot assay, точечный иммуноферментный анализ), разработанный двумя группами учёных для выявления и подсчёта клеток, секретирующих антитела одной определённой специфичности (Czerkinsky С.С. et al., 1983; Sedgwick J.D. and Holt P.G., 1983). В настоящее время ELISPOT-метод широко используется при проведении иммунологических исследований в медицине и ветеринарии (Чернышова И.Н. и др., 1999; Viret J.F., 1999; Sestak К. et al., 1999; Lewis P.J. et al., 1999; Jonuleit H. et al., 2000; Bacon A. et al., 2000;

Nagabhushanam V. and Cheers C., 2001 и др.). Его высокая чувствительность и специфичность позволяют выявлять одну клетку иммунной системы при наличии антител к секретируемым ей продуктам (Sedgwick J.D., 1998).

Для оценки антигенных и иммуногенных свойств традиционных, субъединичных и ДНК-вакцин, а также при фундаментальных исследованиях, чаще всего в качестве экспериментальной модели выбирают линейных или беспородных мышей. Это связано, в первую очередь, с удобством их использования, плодовитостью, неприхотливостью и возможностью использовать в сложных опытах большого количества животных. Кроме того, из всех млекопитающих мыши являются исключительным "иммунологическим" видом, что объясняется высокой степенью гомологии биологических свойств иммунной системы у человека и мыши (Хаитов P.M. и др., 2000). В ветеринарии мыши используются для оценки иммуногенности вакцин против сальмонеллеза и колибактериоза различных видов животных, диплококковой септицемии телят, ягнят и поросят, ботулизма норок, рожи свиней, а также для контроля всех био- и фармпрепаратов (Осидзе Д.Ф. и др., 1981; Wood R.L et al., 1981; Takahashi Т. et al., 1984; Shimoji Y. et al., 1994; 1998; и др.).

В связи с этим актуальными являются исследования по оценке функциональной активности клеток иммунной системы мышей в норме и при патологических процессах. Изучение механизмов формирования иммунитета и роли иммунных реакций в патогенезе инфекционных болезней данного вида животных позволяет выявить наиболее общие закономерности для подобных состояний у других видов млекопитающих, в том числе и человека.

Цель работы. Количественная характеристика общих и вирус-специфических IgG-, IgM-, IgA- секретирующих клеток в лимфоидных органах и тканях мышей в процессе иммуногенеза с использованием современных методов исследования (ИФА, ELISPOT). Сравнительный анализ динамики формирования разных типов иммунного ответа (первичного и вторичного, поствакцинального и постинфекционного) на антигены различной природы на основе количественных изменений АСК.

Основные задачи исследований:

• Разработать варианты ELISPOT-метода для количественной оценки общих и антиген-специфических IgG-, IgM-, IgA- секретирующих клеток в органах и тканях лимфоидной системы мышей.

• Разработать непрямой и «сэндвич»-варианты твердофазного ИФА для определения общего уровня иммуноглобулинов и антиген-специфических ^М-, 1§А- антител в сыворотке крови иммунных животных.

• Определить количество 1§0-, 1яМ-, ^А- секретирующих клеток в лимфоидных органах и тканях клинически здоровых интактных мышей.

• Изучить динамику количественных изменений общих и антиген-специфических АСК в лимфоидных органах и тканях мышей и содержания специфических 1§М-, антител в сыворотке крови мышей в процессе формирования первичного и вторичного иммунного ответа на вирусные антигены, входящие в состав ассоциированной вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней.

• Определить динамику изменений общего количества 1§А- секретирующих клеток в лимфоидных органах мышей при формировании поствакцинального и постинфекционного иммунного ответа на бактериальный антиген.

• Изучить динамику количественных изменений Т-лимфоцитов (Е-РОК) в органах и тканях иммунной системы мышей в процессе иммуногенеза.

• На основании полученных результатов провести сравнительный анализ изменений параметров клеточного и гуморального иммунного ответа у мышей в лимфоидных органах и определить роль последних на различных этапах иммуногенеза.

Научная новизна работы.

Разработан чувствительный и специфичный ЕЬКРОТ-метод, предназначенный для количественной характеристики общих и антиген-специфических ^0-, 1§М-, секретирующих клеток в органах и тканях иммунной системы мышей.

С помощью разноплановых методов (ЕЫБРОТ, ИФА, Е-РОК) впервые проведены комплексные исследования по изучению динамики формирования гуморального и клеточно-опосредованного иммунного ответа у мышей на антигены различной природы и патогенности. Получены новые данные о количественных изменениях ^О-, секретирующих клеток, Е-РОК в органах и тканях иммунной системы на отдельных этапах иммуногенеза.

Впервые дана количественная характеристика ^О-, секретирующих клеток в лимфоузлах, селезенке, костном мозге, лимфоидной ткани слизистых оболочек, крови и тимусе мышей в процессе формирования поствакцинального и постинфекционного иммунного ответа.

На основании сравнительных исследований получены новые фундаментальные данные и подтверждены некоторые закономерности изменений клеточного состава лимфоидных органов и тканей в процессе иммуногенеза. Показана ведущая роль лимфоузлов, селезенки и костного мозга мышей, как главных органов развития 1§-СК, при формировании основных типов иммунного ответа.

Практическая значимость исследований.

Разработанный ЕЫБРОТ-метод может использоваться в качестве основного метода определения количества как общих, так и антиген- специфических АСК в органах и тканях иммунной системы мышей. При этом установленные значения общего количества 1^0-, 1§М-, ^А- секретирующих клеток в лимфоидных органах клинически здоровых интактных животных могут служить нормативными показателями.

Полученные результаты являются основой для дальнейших фундаментальных исследований по изучению механизмов и закономерностей формирования иммунного ответа у животных на антигены различной природы.

На основании проведенных исследований разработаны, апробированы и рекомендованы для использования в НИУ «Методические рекомендации по количественному определению антителосекретирующих клеток методом точечного иммуноферментного анализа (ЕЫ8РОТ-метод)» (рассмотрены и одобрены на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 21 декабря 2000 г. протокол №3).

Основные положения, выносимые на защиту.

Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

• результаты исследований по разработке ЕЫЗРОТ-метода для количественной оценки общих и антиген-специфических ^О-, 1§М-, 1§А- секретирующих клеток в органах и тканях лимфоидной системы мышей;

• результаты экспериментов по изучению динамики количественных изменений общих и антиген-специфических 1^,0-, 1§М-, ^А- секретирующих клеток в лимфоидных органах и тканях мышей при различных типах иммунного ответа на антигены вирусной и бактериальной природы с использованием разработанных современных методов исследований для характеристики В-системы иммунитета (ЕЬКРОТ и ИФА) и Т-системы (метод Е-РОК);

• результаты сравнительных исследований содержания АСК и РОК в органах и тканях лимфоидной системы иммунных и неиммунных мышей в процессе иммуногенеза после заражения патогенным штаммом Е.гктюраШае с использованием современных методов ЕЬКРОТ, ИФА и Е-РОК.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлены на:

• 26-м Ветеринарном конгрессе, Франция, 1999;

• II Международной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии", Москва, 2000;

• заседании секции "Ветеринарная биотехнология" Отделения ветеринарной медицины РАСХН, Москва, 2000;

• заседании учёного совета ВИЭВ, Москва, 2000;

• У1-м международном ветеринарном иммунологическом конгрессе, Швеция, 2001;

• межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, Москва, 2002.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано десять научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 136 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка цитированной литературы. Материалы диссертации иллюстрированы одной схемой, б таблицами и 35 рисунками. Список литературы включает 163 источника (49 отечественных и 114 зарубежных авторов).

6.ВЫВОДЫ

1. Разработаны непрямой и «сэндвич»-варианты точечного иммуноферментного анализа (ELISPOT-метода, англ. enzyme-linked immunospot assay), предназначенные для количественной характеристики общих и вирус-специфических IgG-, IgM-, IgA-секретирующих клеток в центральных и периферических органах иммунной системы мышей. Показано, что метод характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью результатов.

2. Дана количественная характеристика IgG-, IgM-, IgA- секретирующих клеток в центральных и периферических органах иммунной системы мышей. Установлено, что среди всей популяции антителосекретирующих клеток в исследованных органах иммунной системы преобладающими являются IgM- и IgG-секретирующие клетки. IgA-CK являются доминирующими в лимфоидной ткани лёгкого.

3. Разработан непрямой вариант твердофазного ИФА для определения общего уровня иммуноглобулинов IgG-, IgM-, IgA-изотипов и вирус-специфических антител в сыворотке крови иммунных животных, оптимизированы условия постановки метода спонтанного розеткообразования (Е-РОК) для характеристики Т-системы иммунитета.

4. Комплексными исследованиями с использованием ELISPOT-метода, ИФА и Е-РОК, определена динамика формирования первичного и вторичного иммунного ответа у мышей на вирусные антигены, входящие в состав ассоциированной вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней. Определено количество общих и вирус-специфических IgG-, IgM-, IgA- СК и розеткообразующих клеток в лимфоидных органах, а также титр IgG-, IgM-, IgA-антител в сыворотке крови иммунных животных.

5. Установлено, что доминирующая роль в первичном иммунном ответе на ВТГС и РВ принадлежит лимфатическим узлам, селезенке и частично лимфоидной ткани слизистых оболочек; во вторичном иммунном ответе ведущая роль принадлежит костному мозгу, как органу синтеза антителосекретирующих клеток (АСК). При этом в процессе иммуногенеза максимальное количество вирус-специфических АСК установлено в лимфатических узлах на 2-3-е сутки первичного и на 3-5-е сутки вторичного иммунного ответа, в селезенке - на 4-е (для IgM-CK) - 7-е (для IgG-CK) и на 1-3-е сутки соответственно. В ЛТК максимальное количество вирус-специфических АСК зарегистрировано на 2-е (для IgM-CK), 7-е (для IgG-CK) и на 9-е (для IgA-CK) сутки первичного иммунного ответа. В костном мозге максимальное количество вирус-специфических АСК обнаружено на 4-7-е сутки вторичного иммунного ответа.

6. Экспериментальными исследованиями установлено, что достоверное увеличение или уменьшение вирус-специфических IgM- и 1§А- СК в лимфоидных органах мышей в процессе иммуногенеза положительно коррелирует (г=0,86, р<0,05) с количеством розеткообразующих клеток. При первичном иммунном ответе динамика появления, логарифмического роста и снижения титра изотип-специфических антител в сыворотке крови положительно коррелирует с количеством соответствующих по специфичности 1§М-, 1^А-СК в селезенке (г=0,68).

7. В опытах по оценке иммуногенной активности вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2 определено общее количество 1^0-, 1§М-, ^А- секретирующих клеток и Е-РОК в лимфоидных органах у мышей в процессе формирования поствакцинального и постинфекционного иммунного ответа. Установлено, что поствакцинальный иммунный ответ сопровождается увеличением общего числа секретирующих клеток в лимфатических узлах, селезенке, ЛТК и в крови. В 1-7-е сутки после иммунизации в количественном отношении в лимфатических узлах, селезенке и крови преобладают ^М-СК. Показано, что в постинфекционном иммунном ответе наряду с лимфоузлами и селезёнкой значительная роль в продукции плазматических В- клеток принадлежит костному мозгу.

8. Установлены закономерности в развитии иммунокомпетентных клеток в процессе иммуногенеза, которые позволяют разделить первичный иммунный ответ на несколько стадий. На первой стадии после введения антигена в лимфоидных органах происходит увеличение количества неспецифических АСК. На второй стадии происходит уменьшение количества АСК и появление первых антиген-специфических ^О-антител в крови. Третья фаза иммуногенеза характеризуется повторным увеличением количества АСК за счёт антиген-специфических клеток и возрастанием титра специфических антител в крови. Первые две стадии характеризуют индуктивную фазу иммуногенеза, а третья -продуктивную.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработанный ЕЫЗРОТ-метод рекомендуется в качестве основного метода, определения как общего количества, так и антиген-специфических АСК в органах и тканях иммунной системы мышей. При этом установленные значения общего количества 1§0-, ^М-, ^А- секретирующих клеток в лимфоидных органах и тканях клинически здоровых интактных животных могут служить ориентиром при оценке иммунного ответа на антигены различной природы.

На основании проведенных исследований разработаны и рекомендованы для использования в НИУ «Методические рекомендации по количественному определению антитело- секретирующих клеток методом точечного иммуноферментного анализа (ЕЬШРОТ-метод)» (рассмотрены и одобрены на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 21 декабря 2000г. протокол №3).

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основной целью нашей работы являлось выявление динамики количественных изменений IgG-, IgM-, IgA- секретирующих клеток в органах и тканях иммунной системы мышей в процессе иммунного ответа на антигены различной природы.

Для решения поставленных задач необходимы чувствительные и специфичные методы соответствующего назначения, поэтому первым этапом нашей работы была разработка непрямого и «сэндвич»-вариантов ELISPOT-метода и ИФА.

ELISPOT-метод является вариантом ИФА и в настоящее время применяется для оценки клеточного и гуморального звеньев иммунной системы в процессе онто- и иммуногенеза. Он широко используется для характеристики иммуногенных свойств вакцинных препаратов, оценки функционального состояния иммунной системы, ее отдельных тканей и органов, изучения механизмов регуляции иммунного ответа [Makela M.J., Nikkari S., Meurman О. et al., 1995; Arvilommi H., 1996; Daugaharty H., Messmer Т.О., Fields B.S., 1997; Sedgwick J.D., 1998; и др.]. Однако, наряду с высокой чувствительностью и информативностью метода, исследования, связанные с его разработкой для каждого конкретного антигена и практическое применение, являются довольно трудоемкими и в настоящее время, это является основным сдерживающим фактором его широкого внедрения в практику [Cui Y., Chang L.J., 1997].

При проведении исследований в целях повышения специфичности метода мы получали высокоочищенную суспензию мононуклеарных клеток в одноступенчатом градиенте плотности Histopaque, благодаря которому присутствие клеток других типов (кроме МНК) в исследуемой суспензии практически исключалась. Кроме того, для повышения эффективности всех иммуноферментных методов (ИФА и ELISPOT), нами использовались очищенные препараты РВ и ВТГС, а также коммерческие моноспецифические реагенты к отдельным изотипам иммуноглобулинов мыши, меченые биотином, и авидин, коньюгированный с пероксидазой. Методы, основанные на использовании системы авидин-биотин, являются очень чувствительными, поскольку авидин, являясь биологическим антагонистом биотина, специфически замещает его во всех химических соединениях [Fujihashi К., McGhee J.R., Beagley K.W. et al., 1993].

Однако эффективность использования системы авидин-биотина в ELISPOT-методе требовала дополнительных исследований, поскольку существовала вероятность появления ложноположительной реакции. Это связано с тем, что биотин (витамин Н) является составной частью дыхательных ферментов клетки и присутствует в ней в большом количестве. Можно было предположить, что при специфическом его замещении, авидин, коньюгированный с пероксидазой, окажется связанным не только с мечеными антителами, но и с ферментами клеток, которые не являются АСК.

Результаты проведенных исследований и анализ размеров окрашенных точек, полученных на нитроцеллюлозной мембране, позволили сделать вывод о том, что при использовании малого увеличения (х40) возможность подсчёта неспецифически окрашенных точек очень мала, так как антитела, секретируемые АСК, покрывают гораздо большую площадь НЦ- мембраны, нежели занимает, даже очень крупная клетка. Таким образом, точки, характеризующие АСК, выглядят значительно крупнее.

Специфичность моноспецифических антисывороток к IgG, IgM, IgA мыши, меченых биотином и авидин-пероксидазных коньюгатов была проверена нами в предварительных опытах при подборе их оптимальных разведений для постановки метода. В результате был сделан вывод о том, что реагенты неспособны к неспецифическому взаимодействию между собой. Для всех опытов был подобран инертный блокирующий белок - Б С А, применение которого практически исключало появление неспецифических точек (при оптимальных условиях подбора реагентов неспецифические точки не видны). О чувствительности метода говорит тот факт, что мы смогли определить АСК в крови, тимусе и перитонеальной полости, где они в большинстве своем находятся в неактивном состоянии и являются преимущественно CD5 В1-клетками [Inaba М. et al., 1988; CukrowskaB. et al, 1995].

Таким образом, в результате проведения первого этапа нашей работы были разработаны непрямой и «сэндвич»-варианты ELISPOT-метода, предназначенные для подсчета общего количества и вирус-специфических IgG-, IgM-, IgA- секретирующих клеток в органах и тканях лимфоидной системы мышей. Получены убедительные данные, свидетельствующие о том, что ELISPOT является высокочувствительным, специфичным, информативным и воспроизводимым методом количественного определения АСК.

Перед проведением каждой серии экспериментов с помощью разработанного метода было определено общее количество IgG-, IgM-, IgA- секретирующих клеток в лимфоидных органах и тканях клинически здоровых интактных мышей линии BALB/c, а также беспородных белых мышей, использовавшихся в качестве отрицательного контроля (таблица 4). Результаты исследований показали, что больше всего плазматических В- лимфоцитов содержится в селезенке (средние значения составляли: IgG-CK- 298±57, IgM-CK- 357±49, IgA-CK- 189±32 клеток на 104 МНК), лимфатических узлах (191+51, 245+59 и 172+35 клеток соответственно) и костном мозге (195+36, 244+52 и 127+24 клеток соответственно). В перитонеальной полости (IgG-CK- 84+25, IgM-CK- 192+43, IgA-CK- 40+23 клеток на 104 МНК), ЛТЛ (127+16, 59+25, 140+30 клеток соответственно), ЛТК (53+32, 64+44, 44+21 клеток соответственно) и крови (34+23, 76+37, 15+9 клеток соответственно) эти показатели были ниже. Минимальное количество 1^0-, ^А- секретирующих клеток было обнаружено в тимусе (13±15- ^С-, 14±13 ^М- 119±8б ^А-СК на 104 МНК).

Наши дальнейшие исследования были направлены на использование разработанного ЕЫБРОТ-метода в экспериментах по оценке В-системы иммунитета у мышей в процессе иммуногенеза на клеточном уровне и определение роли отдельных лимфоидных органов мышей в динамике формирования иммунного ответа на основе количественных изменений общих и вирус-специфических ^О-, СК.

Исследования проводили в двух направлениях:

• определение динамики содержания общих и вирус-специфических ^О-, ^М-, ^А- СК в лимфоидных органах мышей, титра изотип- специфических антител в сыворотке крови животных в процессе формирования первичного и вторичного иммунного ответа на вирусные антигены, входящие в состав ассоциированной вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней;

• оценка иммуногенной активности вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2 и определение динамики содержания общего количества ^М-, 1§А- секретирующих клеток в различных лимфоидных органах мышей в процессе формирования поствакцинального и постинфекционного (после экспериментального заражения вирулентным штаммом Е. rhusiopa.th.iae) иммунного ответа.

Как известно, количество клонов активированных В- лимфоцитов зависит не только от существующей популяции В- клеток, но и от АПК и субпопуляций Т- лимфоцитов. Поэтому, для более углубленного изучения механизмов формирования иммунного ответа во всех проведенных нами экспериментах, испытуемые пробы параллельно исследовались как в ЕЫБРОТ-методе, так и методом Е-РОК, что позволило охарактеризовать не только гуморальное, но и клеточное звено иммунного ответа.

В результате проведённых опытов были получены данные в динамике развития иммунного ответа по каждому исследованному органу и ткани иммунной системы.

Сравнительный анализ полученных результатов позволил заключить, что динамика формирования гуморального иммунного ответа в центральных и периферических лимфоидных органах мышей на антигены различной природы, характеризующаяся количественными изменениями общих и вирус-специфических 1§М-, АСК и Е

РОК, имеет ряд аналогичных закономерностей.

Во-первых, антигенная стимуляция приводила к повышению количества как общих, так и специфических АСК. Это совпадает с мнением Е.В.Сидоровой (1993) и И.Н.Чернышевой с соавт. (1999), которые в своих экспериментах на мышах показали, что введение антигена индуцирует как синтез специфических антител, так и резкое повышение образования неспецифических иммуноглобулинов.

Во-вторых, в процессе формирования иммунного ответа принимали участие практически все лимфоидные органы и ткани, при этом основная роль принадлежала лимфатическим узлам, селезенке и костному мозгу, которые являются главными органами синтеза АСК.

И, в-третьих, процесс формирования и угасания первичного (однократное введение ассоциированной вакцины против ВТГС и РВ, вакцинация против рожи свиней) иммунного ответа В-клеток у мышей можно разделить на фазы. Первая фаза, по нашим данным, характеризовалась увеличением количества АСК всех изотипов и продолжалась с 1 до 4-х сут. после антигенной стимуляции (для разных органов и антигенов сроки могли несколько варьировать). Возможно, что это увеличение количества антителосекретирующих клеток может быть связано с опосредованной их стимуляцией, через цитокины АПК, которые первыми отвечают на антигенное воздействие и выделяют интерлейкины, стимулирующие все МНК, ранее активированные другими антигенами. Также следует учесть тот факт, что исследованные нами животные не являлись гнотобиотами, и можно предположить, что мы наблюдали не абсолютный первичный ответ, а на какую-то часть вирусных антигенов ответ уже был вторичным. Вероятность этого достаточно велика, поскольку на фоне увеличения общего количества 1§М-, ^А- секретирующих клеток было зарегистрировано увеличение количества и вирус-специфических АСК. Наличие у контрольных мышей во всех органах иммунной системы вирус-специфических АСК можно объяснить, наличием нестимулированных клонов клеток с различными антигенными рецепторами и специфичностью, а также вероятностью того, что животные уже однажды встречались с антигенно-родственными вирусами (см. раздел 4.2.). В наших последующих опытах по характеристике ответа секретирующих клеток на бактериальный антиген, в рассматриваемый период времени были получены сопоставимые результаты. Антиген-специфические АСК при исследовании ответа на бактериальный антиген мы не определяли, но поскольку культура Е. тки$юраШае для мышей была патогенна (проводили контрольное заражение штаммом 1329), вызывает сомнение в том, что опытные животные могли встретиться с её антигенами до иммунизации. При этом следует отметить, что динамика изменения количества ]£- секретирующих клеток при ответе на бактериальный антиген, несколько отличалась от таковой при иммунном ответе на вирусный антиген. Возможно, при этом определённую роль играет структурный состав антигена, его патогенность, доза введения и наличие примесных белков, входящих в состав вакцин.

Вторая фаза первичного иммунного ответа характеризовалась уменьшением количества АСК в период с 3 по 5-е сутки. В зависимости от органа, сроки этого процесса могли сдвигаться до 7-х сут. после антигенной стимуляции. У некоторых животных в эти периоды количество АСК было сопоставимо с контрольными показателями. По нашему мнению, это связано с процессами пролиферации активированных клонов незрелых клеток и клеток-предшественников в ответ на антигенную стимуляцию. Таким образом, в этот период популяция МНК пополнялась большим количеством клеток, которые либо не определялись методом ELISPOT, либо мы их не принимали во внимание при учёте реакции (в связи с мелким размером точки). Т.И.Дергачёва с соавт. (2000) связывают процессы изменения количества клеток определённых специфичностей с их миграцией из органов иммунной системы, что, возможно, имело место и в наших опытах.

Третья фаза выделялась в период с 5-х суток после иммунизации и до конца срока наблюдения и характеризовалась повторным увеличением количества АСК с последующим его уменьшением, свидетельствующим об окончании первичного иммунного ответа. В это время увеличение количества АСК практически во всех органах происходило за счёт клеток антиген-специфических клонов.

При вторичном иммунном ответе вышеперечисленные фазы и процессы происходили в течение не более 5-ти суток и регистрировались не во всех органах. Например, в лимфатических узлах мы установили лишь один период увеличения и уменьшения количества АСК. Таким образом, мы предполагаем, что рассмотренные выше фазы характерны в большей степени для первичного иммунного ответа и их выраженность зависит от природы антигена.

Зависимость, подобная изменениям АСК, была нами установлена и для Т-клеток. Однако метод Е-РОК не позволяет определить, за счёт какой субпопуляции происходит изменение их количества в суспензии МНК, поскольку С02-рецептор имеется у всех Т-лимфоцитов и части NK-клеток. Тем не менее, мы предполагаем, что увеличение происходило, главным образом, за счёт CD4+ ТЬ2-лимфоцитов, ответственных за формирование гуморального иммунитета. Косвенно это подтверждается увеличением количества АСК и использованием в качестве модели мышей линии BALB/c, которые генетически более склонны к гуморальному иммунному ответу, нежели клеточному [Shibuya К., Robinson D., Zonin F., et al. 1998].

Следует отметить, что подобных столь подробных исследований по изучению динамики формирования иммунного ответа в лимфоидных органах и тканях на клеточном уровне до настоящего времени практически не проводилось. Поэтому, некоторые полученные нами данные ещё нуждаются в подтверждении.

В процессе проведения экспериментов, нами отмечен тот факт, что в ряде случаев большое количество АСК не свидетельствует о высоком уровне антител в супернатанте МНК (обычно в первые дни после иммунизации). На наш взгляд, это связано с тем, что не все выявляемые ЕЫЗРОТ-методом клетки являются активными АСК. Например, титр ^О-антител в супернатанте МНК, как правило, был значительно выше, чем титр 1§М-антител даже в случае незначительной разницы в количестве клеток. По-видимому, это связано с тем, что в лимфоидных органах постоянно присутствуют незрелые В1-клетки, которые, как известно, секретируют только 1§М. Такие клетки синтезируют очень незначительное количество иммуноглобулина, по сравнению с ^О-секретирующими, которые являются полноценными АСК. Незрелая В-клетка имеет на своей мембране антигенные рецепторы в виде 1§М, при её взаимодействии с сенсибилизированной НЦ-мембраной лунки, эти рецепторы собираются на одном полюсе клетки в виде «шапочки», и остаются связанными с НЦ-мембраной после отмывания клетки [Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д., 2000]. Косвенным образом это подтверждается значительной вариабельностью размеров точек на нитроцеллюлозной мембране. По нашему мнению, чем больше точка - тем активней клетка. Однако, достоверную статистическую зависимость уровня антител в супернатанте от размера точек нам выявить не удалось.

Одной из главных задач, стоящей перед нами, было проведение сравнительного анализа динамики формирования различных типов иммунного ответа и определение роли различных лимфоидных органов мышей в процессе иммуногенеза. Для этого нами были проведены исследования, направленные на изучение количественных изменений общих и антиген-специфических ^М-, ^А- СК и Е-РОК в лимфоидных органах мышей в процессе иммуногенеза и получены новые данные, позволяющие оценить их значение в продукции активированных клеток в ответ на вирусные и бактериальный антигены. Результаты сравнительного анализа распределения секретирующих клеток и Е-РОК позволили заключить следующее.

На ранней стадии иммунного ответа (как первичного, так и вторичного) основную роль в иммуногенезе играли лимфатические узлы. Установлено, что уже через 24 часа после иммунизации мышей (как ассоциированной вакциной против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней, так и вакциной против рожи свиней) в лимфоузлах происходило резкое увеличение количества общих и вирус-специфических ^М-СК, пик которых зарегистрирован на 1-3 сутки после инъекции вакцин. На этом фоне, происходило постепенное увеличение количества 1§0-СК, и незначительное увеличение 1§А-СК. Достоверное увеличение изотип- специфических АСК сопровождалось активным синтезом антител соответствующей специфичности, выявляемых в супернатанте культивируемых МНК. Появление первых вирус-специфических ^М-и 1§0-антител в сыворотке крови (приблизительно через 72 часа после инъекции) по времени совпадает с максимальным количеством вирус-специфических АСК в лимфоузлах.

Первичный иммунный ответ в селезенке характеризовался повышением как общего количества секретирующих клеток, так и количества вирус-специфических АСК. Достоверное увеличение числа вирус-специфических АСК всех изотипов начиналось на 2-е сутки после инъекции вакцины, максимальное значение их зафиксировано на 7-е сутки п.и., затем количество АСК, начинало постепенно уменьшаться. При этом полученные результаты свидетельствуют о том, что увеличение общего количества 1^0-, 1§М-, ^А-секретирующих клеток происходило, главным образом, за счёт вирус-специфических клеток. Увеличение вирус-специфических 1§М- и ^О-СК в селезенке совпадало с повышением уровня вирус-специфических антител данных изотипов в сыворотке крови иммунизированных животных (2-4-е сутки для 1§М и 7-9-е для 1§0).

Процесс окончания первичного иммунного ответа в селезенке начинался на 9-12 сутки п.и. и продолжался в течение всего срока наблюдения (до 18-х суток). При этом, происходило значительное снижение количества Е-РОК, ^М- и 1§0-СК и резкое падение титра специфических антител к ВТГС и РВ в сыворотке крови иммунизированных животных. Вместе с тем, достаточно высокий уровень ^О-антител (титр 1:200-1:400) сохранялся и на 18-е сутки после первичного введения антигена.

При вторичном иммунном ответе в селезёнке мышей, иммунизированных ассоциированной вакциной, не наблюдалось значительного увеличения количества АСК, однако, в сыворотке крови уровень вирус-специфических антител всех изотипов увеличивался к 5-м суткам после иммунизации. Иммунный ответ в селезёнке мышей, вакцинированных против рожи свиней и зараженных вирулентным штаммом Е. гкшюраШае (можно рассматривать как вторичный ответ), проходил несколько иначе. Нами установлено, что на 7-е сутки п.з. у иммунизированных животных общее количество секретирующих клеток было сопоставимо с количеством 1§0- СК в костном мозге. На наш взгляд, это может быть связано с тем, что в зависимости от вирулентности антигена и его локализации в организме, могут изменяться сроки формирования вторичного иммунного ответа (в последнем случае 7-е сутки п.з. являются сроком наблюдения, что, по-видимому, недостаточно), также как и приоритетность лимфоидных органов в продукции АСК.

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что в настоящее время практически нет научных данных о количественном соотношении различных типов АСК в костном мозге, полученных с помощью современной методологии с применением высокоспецифических антител к отдельным эпитопам иммуноглобулинов. Недостаточно изучена роль этого органа в формировании первичного и вторичного иммунного ответа у животных в процессе иммуногенеза. Вместе с тем его значение для функционирования иммунной системы огромно. Так, по мнению C.A.Janeway et al. (1999), костный мозг является важным местом продукции IgG- антител. У гипериммунизированных животных, продуцирующих специфические IgG- антитела в ответ на антигенную стимуляцию, до 90% антител секретируются плазматическими клетками в костном мозге. Е.И.Соколов и др. (1998) приводят данные о том, что у взрослой мыши в костном мозге сосредоточено до 80% всех клеток, секретирующих иммуноглобулины. При этом, следует отметить тот факт, что большинство исследований, направленных на подсчет специфических АСК в костном мозге, было проведено с использованием метода гемолитических бляшек по Jerne, который имеет существенные ограничения для детекции клеток, секретирующих антитела, направленные к растворимым антигенам [Scheffel J.W., Setcavage Т.М., Kim У.В., 1979; Bianchi A.T.J., Sholten J.W., Jongenelen I.M.C.A., Koch G, 1990].

Впервые нами были проведены широкомасштабные исследования, направленные на изучение количественных изменений общих и вирус - специфических IgG-, IgM-, IgA- АСК и Е-РОК в костном мозге мышей в процессе иммуногенеза и получены новые данные, позволяющие оценить значение этого центрального органа иммунной системы в продукции активированных клеток.

Ранее костный мозг никогда не считался таким же общепризнанным местом синтеза антител, как селезенка, лимфатические узлы и ЛТК после первичной иммунизации. Вероятно это связано с тем, что синтез антител в костном мозге зависит от наличия В- клеток памяти, поэтому в процессе формирования первичного иммунного ответа количество АСК, определяемое методом гемолитических бляшек, почти не определялось или же было весьма незначительно. С помощью ELISPOT-метода, используя специфические антитела и систему биотин-авидин, мы показали, что костный мозг является не только основным органом, синтезирующим АСК во вторичном иммунном ответе, но и принимает участие в формировании первичного ответа. Анализ полученных нами результатов свидетельствует о том, что на различных этапах поствакцинального (первичного) иммунного ответа в костном мозге мышей (иммунизированных как ассоциированной вакциной против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней, так и вакциной против рожи свиней) зарегистрировано более чем двукратное увеличение количества общих и вирус-специфических АСК. Вместе с тем, анализ роли костного мозга, как органа продукции АСК, по сравнению с двумя важнейшими лимфоидными органами - селезенкой и лимфоузлами, позволяет заключить, что именно лимфоузлы и селезенка играют доминирующую роль в первичном иммунном ответе.

Наиболее вероятным объяснением активности вирус-специфических АСК костного мозга после первой инъекции является то, что во всех экспериментах до иммунизации в этом органе были обнаружены специфические АСК. Иными словами, возможно, что на самом деле такая реакция относится ко вторичному ответу. Цитированные выше авторы установили, что удаление селезенки предотвращает появление АСК в костном мозге, из-за прекращения миграции активированных антигеном В-клеток памяти из селезенки в костный мозг. В этом случае лимфоузлы способны заменить селезенку. После чего было сделано предположение о том, что для появления АСК в костном мозге, антиген должен присутствовать не только в нем, но и в периферических лимфоидных органах.

Немногочисленные литературные данные и результаты проведенных опытов свидетельствуют о том, что и вторичный иммунный ответ можно разделить на несколько фаз. Первая фаза (продолжительность 1-3 суток) характеризуется значительным увеличением АСК всех изотипов в лимфоузлах, костном мозге и селезенке. Ранее зарубежными авторами с помощью метода гемолитических бляшек было показано, что в первой фазе вторичного иммунного ответа в селезенке значительно больше АСК, чем в костном мозге, а во второй фазе число таких клеток в костном мозге значительно больше, чем во всех других органах вместе взятых. Образующиеся при этом в костном мозге антитела относятся как к IgM-, так и к IgG- и IgA-изотипам [Лефковитс И., Пернис Б., 1983; Janeway С.A. et al., 1999].

Наши результаты, полученные с помощью ELISPOT-метода, свидетельствуют о том, что действительно, начиная с 4-6 суток после повторной антигенной стимуляции, костный мозг является главным местом синтеза антител. Однако и в первой фазе он играет важную роль в иммунном ответе. При этом, по нашим данным (на модели ассоциированной вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней) общее количество изотип- специфических АСК в селезенке было значительно меньше чем в костном мозге. Однако, как уже было описано ранее, у мышей, иммунизированных вакциной против рожи свиней и зараженных вирулентным штаммом Е. rhusiopathiae, общее количество IgG- секретирующих клеток на 7-е сутки п.з. в костном мозге и в селезенке было приблизительно одинаковым. Достоверная разница наблюдалась в соотношении IgM-CK (1750 клеток на 104 МНК в костном мозге и 700 клеток в селезенке) и Е-РОК (32% в костном мозге и 5% клеток в селезенке соответственно). В любом случае, суммируя полученные нами и цитированными выше исследователями данные, можно заключить, что костному мозгу принадлежит ведущая роль во вторичном иммунном ответе.

В процессе формирования вторичного иммунного ответа резкое увеличение количества общих и вирус-специфических IgG-, IgM-, IgA- и Е-РОК в костном мозге закономерно приводило к адекватному повышению титра вирус-специфических антител в сыворотке крови животных. Уровень антител сохранялся на высоком уровне достаточно длительное время на фоне постепенного снижения количества АСК в костном мозге, которое, по-видимому, объясняется, во-первых, поступлением этих клеток в кровь и последующей их миграцией и, во-вторых, за счёт пролиферации и увеличения количества других клонов клеток, также относящихся к МНК.

При проведении экспериментов нами были обнаружены общие и вирус -специфические IgG-, IgM- и IgA- АСК в тимусе. Сам по себе этот факт не представляет ничего удивительного. Уже первые исследования клеточного состава тимуса показали наличие в нём В-клеток [Sainte-Marie G., 1965; Hawarg W.S. et al., 1974; Lennert K., Keiserling E., Muller-Hermelink H., 1975; Kendall M.D., 1981], что объяснимо с позиции современного представления о регуляции иммуногенеза. В настоящее время доказано, что созревание и активация Т-лимфоцитов невозможны без их взаимодействия с антиген-стимулированными В-клетками. Таким образом, становится очевидным, что основным назначением тимических В-клеток является участие в активации тимоцитов и, скорее всего, активированные В-клетки попадают в тимус, как и в костный мозг, из лимфатических узлов и селезёнки. В ранних исследованиях, данные по АСК тимуса авторы пытались получить с помощью метода гемолитических бляшек. Однако, в силу малой активности тимических АСК, получить достоверные результаты с помощью этого метода не удалось. Только с появлением ELISPOT-метода началось изучение количественных изменений АСК в тимусе на качественно новом уровне (B.Cukrowska et al., 1996).

Более интересным является тот факт, что в супернатанте МНК тимуса нами установлен достаточно высокий уровень антител, обнаруживаемых методом ИФА, несмотря на то, что в настоящее время известен фактор, выделяемый некоторыми тимическими клетками, который тормозит созревание и функционирование В-лимфоцитов в качестве полноценных АСК. Это можно объяснить только одним: клетки, выделяющие этот фактор, не относятся к мононуклеарным и при выделении МНК в градиенте плотности, в суспензию не попадают, а в его отсутствие ничто не мешает антиген-стимулированным АСК выполнять свои функции in vitro.

Таким образом, наши данные подтверждают, во-первых, наличие активированных В-клеток в тимусе, и, во-вторых, то, что тимические клетки активируются в те же периоды, что и клетки в остальных лимфоидных органах. При этом увеличение количества тимических АСК совпадало с увеличением количества розеткообразующих клеток.

При анализе изменений общего количества Ig-секретирующих клеток всех изотипов и вирус-специфических АСК, установлено, что точное совпадение сроков увеличения количества ^-СК наблюдается только у 1^М-СК (на 2-е сутки после иммунизации). Увеличение же количества вирус-специфических 1§0-АСК сопровождается снижением общего количества клеток данного изотипа. Из этого можно сделать вывод, что за счёт вирус-специфических АСК увеличивается только общее количество 1§М- секретирующих клеток, увеличение же количества клеток других изотопов связано, видимо, с их неспецифической стимуляцией.

Впервые нами были проведены исследования и показана возможность изучения на мышах иммунного ответа АСК слизистых оболочек кишечника и лёгких. Получены данные по количественному определению ^О-, 1§М-, 1§А- секретирующих клеток в перитонеальной полости и в крови опытных и контрольных животных. Установлено, что первичный иммунный ответ на ВТГС и РВ в лимфоидной ткани кишечника сопровождается изменением количества вирус-специфических АСК всех изотипов. При вторичном иммунном ответе значительных изменений не установлено. При изучении иммунного ответа на бактериальный антиген, нами выявлены изменения в содержании ^М-, ^А-секретирующих клеток в ЛТК с 1 по 7-е сутки п.и., при этом в количественном отношении преобладали ^А- СК. Таким образом, следует отметить интересный факт, что, по нашим данным, АСК ЛТК также принимают участие в иммунном ответе на антиген, введённый парентерально.

При проведении экспериментов мы также обнаружили значительное количество АСК и Е-РОК в лимфоидной ткани легких и перитонеальной полости. Однако полученные данные по этим двум органам еще требуют дополнительного уточнения и подтверждения. Очевидно, что ЛТЛ представляет собой очень интересный объект для исследований, особенно при использовнии патогенов с тропизмом к респираторному тракту. Примером исследований в этом направлении может служить работа А.Васоп й а1. (2000), которые изучали иммуномодулирующий эффект биополимеров (хитозана и джелана) введенных в состав субъединичной вакцины против вируса гриппа. В качестве модели авторы использовали мышей ВАЬВ/с, вакцинированных различными способами и препаратами, иммуногенную активность которых оценивали по количеству вирус- специфических АСК в ЛТЛ и титру антител в сыворотке крови и носовых секретах.

Помимо ЛТЛ вызывает интерес и определение АСК в перитонеальной полости. Результаты нашей работы и проведенный анализ литературы не позволяют однозначно ответить на вопрос, являются ли обнаруженные нами АСК циркулирующими или они составляют постоянную популяцию в перитонеальной полости.

При проведении экспериментов, направленных на определение ^О-, 1§М-, ^А-секретирующих клеток и антител в крови, нами установлено, что АСК в крови, также как и специфические антитела в сыворотке присутствовали непостоянно, а появлялись в определённые фазы иммунного ответа.

Сравнительный анализ динамики формирования иммунного ответа у вакцинированных и интактных мышей в первые сутки после заражения вирулентным штаммом Е.гктюраШае показал, что увеличение количества 1§0-, 1§М-, ^А-секретирующих клеток у интактных животных происходит в лимфатических узлах, а у вакцинированных - в селезёнке и костном мозге (эти органы наиболее активны при повторной встрече с антигеном). Максимальное количество АСК всех изотипов было зарегистрировано через шесть часов после заражения. При этом доминирующими были 1§М-секретирующие клетки. На наш взгляд, это связано с тем, что макрофаги при первой встрече с антигеном, представляющим сложность для процессинга и презентации, выделяют цитокины, приводящие к стимуляции всех клонов АСК, а не только антиген-специфических. Таким образом, были стимулированы все активированные на данный момент АСК лимфоузлов. Наши результаты по данному разделу работы не позволяют однозначно заключить, развивался ли иммунодефицит В-системы иммунитета у интактных мышей перед гибелью или адекватная иммунная реакция организма на заражение не успевала развиться. Также не совсем понятна ситуация с предварительно иммунизированными животными. На фоне значительного увеличения количества ^О-, ^М-, ^А- секретирующих клеток на 3-7-е сутки после заражения у вакцинированных мышей наблюдалось снижение уровня сывороточного (хотя его уровень был выше, чем в контроле).

Таким образом, в результате проведенных нами экспериментов, изучена динамика формирования гуморального иммунного ответа у мышей на клеточном уровне после одно- и двукратного введения ассоциированной вакцины против ВТГС и РВ и вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2 с последующим экспериментальным заражением Е. гЫторсйЫае. Определена роль различных лимфоидных органов мышей в процессе формирования гуморального иммунного ответа на разных стадиях иммуногенеза. Сравнительный анализ полученных данных показал сходство и различия в процессе формирования иммунного ответа на антигены различной природы и патогенности. Установлено, что лимфатические узлы и селезенка играют доминирующую роль в формировании первичного (после введения ассоциированной вакцины против ВТГС и РВ) и поствакцинального (после введения вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2) иммунного ответа, в котором также принимают участие костный мозг и ЛТК. При этом отмечено, что первичный иммунный ответ можно разделить на периоды увеличения и уменьшения количества АСК. Во вторичном иммунном ответе (после повторного введения ассоциированной вакцины) ведущая роль принадлежит костному мозгу и частично лимфоузлам (только в первой фазе ответа) как органам синтеза АСК. В постинфекционном иммунном ответе (после контрольного заражения штаммом 1329 Е. гктюраМае) ведущую роль наряду с клетками костного мозга играют ^С-СК селезенки (на 3-7-е сутки п.з.) и лимфоузлов (на 3-е сутки п.з.).

Резюмируя весь изложенный в настоящей работе материал, можно сделать общее заключение о том, что проведенные комплексные исследования позволили теоретически и экспериментально обосновать перспективные подходы к анализу гуморальных факторов иммунитета с помощью разработанных современных методов иммуноанализа. Многие вопросы специфической профилактики, диагностики инфекционных и инвазионных заболеваний невозможно решать без глубокого знания природы, функциональных свойств и количественных показателей 1§М-, 1§А- секретирующих клеток в различных лимфоидных органах и тканях, динамики их количественных изменений в процессе иммуногенеза и той роли, которую они играют в иммунном ответе.