Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов в процессе онто- и иммуногенеза у животных

На правахлукописи

□03474023

ЕЗДАКОВА ИРИНА ЮРЬЕВНА

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ И РЕЦЕПТОРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВ СУПЕРСЕМЕЙСТВА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В ПРОЦЕССЕ ОНТО- И ИММУНОГЕНЕЗА У ЖИВОТНЫХ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

о 11 .Л»'

ЧЧ1

3

Москва - 2009

003474023

Работа выполнена в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко» РАСХН (ВИЭВ)

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Верховский Олег Анатольевич.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Петров Алексей Михайлович

доктор медицинских наук, профессор Булычева Татьяна Ивановна;

доктор биологических наук Власова Наталья Никифоровна.

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Защита диссертации состоится «.,30 » "ЪС-ЮНо! 2009 г. в £>0 часов на заседании диссертационного совета Д.220.042.01 при ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23, тел. (495) 377-93-83).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Автореферат разослан « » _2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, профессор

Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Механизмы врожденного и адаптивного иммунитета основаны на межклеточной кооперации трех основных популяций лейкоцитов: макрофагов, Т- и В-лимфоцитов, которые на разных этапах онто- и иммуногенеза включаются в иммунные реакции, причем доля их участия зависит от вида инфекции (Цинкернагель Р., 2008). Иммунокомпетентные клетки несут на своей поверхности специфические рецепторы, с помощью которых их можно идентифицировать. Принципы классификации рецепторов - антигенных маркеров лейкоцитов человека, выявляемых моноклональными антителами, были сформулированы на 1-м Международном совещании в Париже в 1982 г. Эти маркеры обозначили как cluster of differentiation - символом CD и соответствующими номерами. К настоящему времени создана единая номенклатура системы CD, состоящая из более 300 дифференцировочных молекул клеток человека и животных. 30% CD-антигенов относится к суперсемейству иммуноглобулинов (IgSF), при участии которых происходит распознавание антигенов. Они содержат общие структурные элементы, характеризуются определенной пространственной доменной организацией и статистически значимой гомологией аминокислотных последовательностей (Ройт А. и др., 2000, Рабсон А. и др., 2006, Бурместер Г.-Р. И др., 2007 и др.). IgSF, как одни из важнейших молекул иммунной системы, обеспечивают защиту от микро- организмов, поврежденных и генетически измененных клеток (Ярилин А.А., 1999, Давтян Т.К. и др., 2005, Сидорова Е.Б., 2006 и др.). Наиболее иммунологически значимыми белками IgSF являются:

- иммуноглобулины (Ig), существующие в двух формах: растворимые белки (секретируемые антитела) и мембраносвязанные (slg), являющиеся поверхностными рецепторами В-лимфоцитов;

иммуноглобулиноподобные молекулы (ILT), представляющие собой мембранные рецепторы иммунокомпетентных клеток.

Среди мембраносвязанных белков IgSF большой интерес представляют рецепторы, находящиеся на поверхности Т-клеток (CD2, CD4, CD8 и др.), макрофагов (Fe- рецепторы) и В-лимфоцитов (BCR - антигенный рецептор В-

клетки). Функциональная и количественная характеристика данных белков является чувствительным маркером оценки состояния иммунной системы (Кирюхин A.B. и др., 2003, Добротина H.A. и др., 2005, Артюхов В.Г и др., 2006 и др.).

Вместе с тем, следует отметить, что закономерности формирования иммунного ответа на молекулярном уровне у животных, в частности, механизмы перекрестного связывания антигена с рецепторами B-клеток, роль адгезивных молекул Т-лимфоцитов и макрофагов в трансдукции сигнала при иммунизации, изучены недостаточно. Разработка методов исследования IgSF, характеристика их функциональных и рецепторных свойств в процессах онто- и иммуногенеза является перспективным направлением для определения иммунологической эффективности биологических препаратов, создания новых безопасных вакцин - основу специфической профилактики болезней животных.

В настоящее время для оценки состояния иммунной системы разработан комплекс лабораторных методов, позволяющий выявлять изменения на молекулярно-клеточном уровне. Прежде всего, это иммуноцитохимический анализ мембранных и цитоплазматических структур иммуноцитов (Haines D.M. и West К.Н , 2005, Саидов М.З. и др., 2006, Высочин И.В. и др., 2006 и др.). Эти и другие способы определения и характеристики IgSF послужили методологической основой наших исследований.

Цель работы - функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов в процессе онто- и иммуногенеза животных с использованием разноплановых методов оценки Т- и В- систем иммунитета.

Для достижения указанной цели в работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать способы получения иммуноглобулинов изотипов G, M, A (IgG, IgM, IgA) крупного рогатого скота и мышей.

2. Получить моноспецифические антисыворотки для количественной оценки иммуноглобулинов изотипов G, M, A (IgG, IgM, IgA) в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота.

3. Оптимизировать методы определения функциональной активности Т-лимфоцитов и макрофагов с помощью различных вариантов реакции розеткообразования.

4. Разработать методы исследования В-клеток крупного рогатого скота с использованием моноклональных антител к 1§М.

5. Изучить функциональные и рецепторные свойства иммунокомпетентных клеток (Т-лимфоциты, В-лимфоциты, макрофаги) мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза.

6. Дать характеристику секретируемой и мембраносвязанной (б^М) формам крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза.

7. Провести оценку количественных изменений клеток, несущих рецепторные белки ^БИ у различных видов животных.

Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР ВИЭВ задание 01.01.05 М МП «Разработать и освоить производство моноспецифических антисывороток и моноклональных антител для количественного определения уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных», этап Н.02.2 «Провести комплексные исследования по оценке функционального состояния гуморальных и клеточных факторов иммунной системы у мышей в процессе иммуногенеза»; задание 01.01.09 М МП «Разработать и освоить производство набора компонентов для оценки иммунного статуса организма животных»; задание 02.02.11 РНТП «Изучить механизмы формирования иммунного ответа у животных в процессе онто- и иммуногенеза, разработать и усовершенствовать методы иммунологического мониторинга».

Научная новизна. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена концепция комплексного подхода к оценке состояния иммунной системы в процессе онто- и иммуногенеза на основе функционально-рецепторной характеристики белков суперсемейства иммуноглобулинов.

Установлено, что рецепторный профиль иммунокомпетентных клеток определяет их функциональную активность в реакциях различного генеза.

На основании результатов проведенных исследований:

- получен штамм гибридных культивируемых клеток животных Ми5.тизси1и$, используемый для получения моноклональных антител к ^М рогатого скота (Авторское свидетельство № 1560549 от 3.01.90 г.);

- разработан способ выделения иммуноглобулина А из молозива крупного рогатого скота (патент на изобретение № 2277421 от 5 апреля 2005 г.);

- разработан способ получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости крупного рогатого скота (патент на изобретение № 2288008 от 27 ноября 2006 г.);

- разработан метод иммунопероксидазного окрашивания клеток для количественной оценки В-лимфоцитов крупного рогатого скота на основе моноклональных антител к иммуноглобулину М (патент на изобретение № 2293330 от 10 февраля 2007 г.).

Впервые определены формы локализации поверхностных иммуноглобулинов В-клеток у крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза и проведен корреляционный анализ содержания растворимого и мембраносвязанного 1§М в периферической крови животных данного вида.

Впервые изучена динамика содержания Б^М-клеток у коров в период плодоношения.

Определен уровень экспрессии рецепторных белков ^ЯР на иммуно-компетенгных клетках мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза.

Практическая значимость. Систематизированы экспериментальные данные о функционально-рецепторной характеристике ^Р, содержащие выводы по методическому подходу к изучению иммунной системы животных, а также даны конкретные рекомендации, которые позволяют интенсифицировать исследования в области ветеринарной иммунологии.

На основании результатов проведенных исследований разработаны:

- «Набор компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии», утвержденным Министерством Сельского хозяйства и продовольствия РФ, ТУ № 9388-0039-00008064-96, 1996 г.;

временное наставление по применению набора компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии № 13-7-2/617, утвержденное Департаментом Ветеринарии МСХиП РФ от 27.05.96 г.;

методические рекомендации «Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных», рассмотренные и утвержденные Сибирским отделением РЛСХН, Новосибирск, 2003 г.

Рассмотрены и утверждены в установленном порядке Отделением ветеринарной медицины РАСХН:

методические рекомендации по количественному определению и оценке функциональной активности иммунокомпетенгных клеток животных (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 20 мая 2005 г., протокол № 1);

методические рекомендации по определению slg В-клеток (иммунопероксидазное окрашивание) (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г., протокол № 2);

методические рекомендации «Определение поверхностных структур иммунокомпетентных клеток методом иммунофлуоресценции» (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г., протокол № 2).

Получены: серебряная медаль на 8-ой Российской агропромышленной выставке «Золотая осень» «За Способ получения секреторного иммуноглобулина А крупного рогатого скота» (2006 г.); золотая медаль на 10-й «За способ определения антител в иммуноцитохимическом анализе» (2008 г.); медали «Лауреат ВВЦ» в 1998 г. и в 2008 г. за разработку препаратов для оценки состояния иммунной системы животных.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены: - на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИиТИБП «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2000); Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2001); Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМиБ им. К.И.Скрябина (Москва, 2004); научной конференции «30 лет развития современных направлений клеточной биотехнологии» (Москва, 2005); секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2005, 2008);

Международной научной конференции «Современные проблемы клеточной биотехнологии и сохранение генетических ресурсов» (Москва, 2006); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р.Коваленко (Москва, 2006); Международной научно-практической конференции «Аюуальные проблемы ветеринарии в современных условиях», посвященной 60-летию Краснодарского научно-исследовательского ветеринарного института (2006); 20- 21- и 22-ой Международных ежегодных конференциях Европейского сообщества по изучению китообразных (ECS) (Гдыня, 2006; Сан-Себастьян, 2007; Эгмонд, 2008); Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2008); Ученом Совете, Методической комиссии ВИЭВ (1995-2008); VII съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 42 научные работы, в том числе 14 работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ, монография «Рецепторы иммунного узнавания у животных», 3 патента на изобретение.

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие: член-корр. РАСХН, д.б.н., профессор Ю.Н.Федоров, к.б.н. Т.А.Чеботарева, к.в.н. А.И.Жаданов, к.б.н. И.В.Третьякова, к.в.н. М.Н.Борисова. Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи д.б.н., профессору Л.П.Дьяконову, д.б.н., профессору В.Ф.Полякову, научному консультанту д.б.н., профессору О.А.Верховскому; д.в.н., профессору В.В.Субботину за помощь в организации научных исследований.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 313 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений.

Материалы диссертации иллюстрированы 29 таблицами и 55 рисунками. Список литературы включает 377 источников, из них 204 зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

- разработка и оптимизация методов количественной оценки иммуноглобулинов, Т- лимфоцитов, В- лимфоцитов и макрофагов;

- оценка содержания секретируемой и мембраносвязанной форм ^М крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза;

- функциональные и рецепторные свойства ^БИ иммунокомпетентных 1ЬТ -клеток млекопитающих, птиц и рыб в норме и при различных антигенных воздействиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования выполнены в лаборатории иммунологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко в период 1985-2008 гг.

В качестве объектов исследования использованы различные виды животных -мыши линии ВАЬВ/с, гибриды Р1 (ВАЬВ/с х ОВА/2) и беспородные мыши, кролики, крупный рогатый скот, куры, серебряные караси, карпы.

Материалом для исследований служили первичные (тимус, костный мозг) и вторичные (селезенка, лимфатические узлы, пейеровы бляшки) лимфоидные органы и периферическая кровь, а также перитонеальные макрофаги лабораторных мышей. Исследования иммунного статуса проводили у рыб, доставленных из рыбхозов «Гжелка» и «Биссеровский» Московской области. Отбор проб крови крупного и мелкого рогатого скота для иммунологических исследований проводили в ЗАО «Кузнецовский» Наро-Фоминского района Московской области и на опытной базе ВИЭВ оЛисий. Образцы крови норок и кур получены в ходе совместных исследований с сотрудниками МГАВМиБ им. К.И.Скрябина и лаб. по изучению болезней птиц ВИЭВ.

Для определения уровня иммуноглобулинов, исследований по количественной характеристике и функциональной активности иммуно- компетентных клеток использовано более 5000 проб сыворотки и цельной крови мышей, крупного рогатого скота, птиц и рыб.

При изучении поверхностных структур иммунокомпетентных клеток применяли производственную вакцину против рожи свиней из штамма ВР-2 (Щелковская биофабрика), ассоциированную вакцину против трансмиссивного гастроэнтерита

(«ТМК») и ротавирусной инфекции («К») свиней (опытная серия, ВИЭВ) и производственную вакцину против парвовирусного энтерита собак (АО «Ветзвероцентр»),

IgG и IgA из биологических жидкостей крупного рогатого скота и мышей выделяли методами гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Наличие и степень чистоты полученных препаратов определяли методом иммуноэлектрофореза с использованием антисыворотки к белкам крови крупного рогатого скота и мышей и методом электрофореза в полиакриламидном геле в буферной системе Laemmli U.K. (1970). Изофокусирование белков проводили в системе «Phast System» (Pharmacia, Швеция) по методике, предложенной фирмой. Иммуноблоттинг осуществляли в буферной системе H.Towbin et al (1979).

Методы исследований Разработка и оптимизация методов количественной оценки иммуноглобулинов и клеток с 1д-подобными рецепторами

Клеточные факторы Методы оценки ILT- и slg- рецепторных клеток

Гуморальные факторы

"1

Методы количественного определения lg

Динамика ILT-рецепторных клеток мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза

Характеристика растворимой и мембраносвязанной форм ^М

крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза

Функциональные свойства иммунокомпетентных ILT-рецепторных клеток у различных видов животных

Рис.1. Общая схема исследований

Гипериммунизацию кроликов породы Шиншилла с массой 2,5-3,0 кг, проводили по методу, разработанному М.А.Мисниковой и А.Ю.Самострельским.

Реакцию двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони (РДП) использовали для определения чистоты, рабочего разведения антисывороток и изотипирования антител (Фримель Х.,1979).

Уровень иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных определяли методом простой радиальной иммунодиффузии - РИД (Manchini G. et al, 1965). Количественную динамику розеткообразующих клеток определяли в реакции розеткообразования (Е-РО) (Кондрахин И.П. и др., 1985), теофиллиновом тесте (Караулов А.В.,2002), антигенном розеткообразовании (А-РО) (Лебедев К.А. и др., 1981).

Фагоцитарную активность исследовали с помощью клеток дрожжей, тест-культуры Staphylococcus aureus (АТСС 29213), частиц зимозана и латекса по стандартным методикам. Исследование механизмов межклеточных

взаимодействий и адгезивной активности иммунокомпетентных клеток проводили в реакции контактного взаимодействия макрофагов и тимоцитов (РКВ) (Горбачева Л.Д. и др., 1981).

Для определения поверхностных иммуноглобулинов использовали цитотоксический тест - ЦТТ (Хаитов P.M., 1995), иммунопероксидазное окрашивание клеток - ИПО (Дергачева Т.И. и др., 2000), реакцию иммунофлуоресценции - РИФ (Новикова М.С.,1990).

Для идентификации поверхностных антигенов лимфоцитов мышей использовали МкА к CD2, МкА к CD 19, конъюгированные с флуорохромом (DakoCytomation) и МкА к IgM рогатого скота (лаб. иммунологии ВИЭВ).

Статистическая обработка результатов исследований проводилась общепринятыми методами с использованием программы Excel для Windows. Значение критерия достоверности оценивали по таблице вероятностей Стьюдента-Фишера в зависимости от объема анализируемого материала. Вероятность различий считалась существенной при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Одними из самых распространенных белков иммунной системы являются гликопротеины IgSF, участвующие в гуморальном и клеточном иммунном ответе. При этом гуморальные механизмы иммунной системы обеспечивают растворимые

формы иммуноглобулинов, а клеточные - мембраносвязанные 1ЬТ- рецепторы иммунокомпетентных клеток. Задачей первого этапа нашей работы была разработка и оптимизация методов количественной оценки ^М, ^А и лейкоцитов с 1ЬТ-рецепторами.

Выделение из сыворотки крови и молозива крупного рогатого скота

Учитывая, что основным иммуноглобулином сыворотки крови и молозива крупного рогатого скота является для его получения использовали эти биологические жидкости. В результате гель-фильтрации у-глобулинов сыворотки крови и молозива на БерЬасгу! Б-ЗОО и БерЬагове 6В были получены препараты с примесями.

В связи с этим, для выделения иммуноглобулинов в использована ионообменная хроматография, основанная на различиях в соотношении и распределении заряженных групп на поверхности белка. Для десорбции иммуноглобулинов использовали повышение ионной силы элюирующего раствора с применением градиента концентрации №С1 от 0,1 М до 0,4 М.

Осажденные у-глобулины из сыворотки крови и молозива наносили на колонки с ЭБАЕ БерЬагозе 6В. В качестве элюирующего раствора использовали 0,02 М Тпб-НС1, рН 7,2 с 0,1М, 0,15М,0,25М и 0,4М МаС1.

Методом иммуноэлектрофореза установлено, что элюировался в первом белковом пике при 0,1 М ЫаС1,1§А во втором при 0,15 М №С1, а ^М в третьем при 0,25 М ЫаС1. Элюаты концентрировали в ПЭГ 40000.

Степень чистоты полученных препаратов иммуноглобулинов проверяли методом электрофореза в ПААГ-ДСН (рис.2).

Образцы подвергали термоденатурации в присутствии 2-меркаптоэтанола, в объеме 2 мкл наносили на пластины с полиакриламидным гелем. Предварительно в образцах определяли концентрацию белка по методу Лоури. Из 2 мл у-глобулинов крупного рогатого скота, нанесенных на колонку с ОЕАЕ БерИагове 6В, получали 1,0 мл с содержанием белка 10-15 мг/мл. На электрофореграмме видно, что при выделении методом ионообменной хроматографии с применением градиента

концентрации соли получены иммунохимически чистые иммуноглобулины б. К препаратам добавляли 50% глицерина и хранили при -20°С.

Разработка способа получения ^А из носовых секретов и молозива крупного

рогатого скота

Иммуноглобулины А в биологических жидкостях находятся в нескольких полимерных формах. В сыворотке крови 1§А встречается как в виде мономера с молекулярной массой 160 Ша, так и в полимерной форме, в основном, как димер. Присутствие различных полимерных форм ^А и незначительная его концентрация затрудняют его выделение из сыворотки крови крупного рогатого скота. Поэтому, для получения ^А использованы носовые секреты и молозиво, концентрация 1&А, в которых является максимальной.

Как видно на иммуноэлектрофореграмме (рис.3) в сыворотке крови и в молозиве доминирующим иммуноглобулином является при этом в крови концентрация 1§А очень низкая (~ 1,0 мг/мл), а в молозиве - наиболее высокая из всех биологических жидкостей. В носовом секрете количество 8-1§А значительно преобладает над иммуноглобулинами других изотипов и на

иммуноэлектрофореграмме не видно других линий, кроме полос преципитации соответствующих ^А.

В бронхоальвеолярных смывах также преобладают Б-^Л, концентрация которых не превышает 0,24 мг/мл. Содержание 1§А в слезах достаточно высокое, достигает 2,72 мг/мл, но в данной биологической жидкости присутствуют и другие белковые примеси. Таким образом, наиболее оптимальной биологической жидкостью для выделения 8-1§А служат носовые секреты и сыворотка молозива.

Для выделения Б-^А сыворотку молозива животных обрабатывали 0,1 М раствором сернокислого цинка и этилендиаминтетрауксусной кислотой, а затем проводили разделение глобулинов на колонке с 8ерЬасгу1 8-400 (в качестве элюанта использовали 0,1 М Трис-НС1 буфер рН 8,0 с 1,0 М ИаС1). Для выделения 8-1§А из носовых секретов крупного рогатого скота, данную биологическую жидкость в количестве 5,0-6,0 мл центрифугировали при 1500 об/мин в течение 15 мин. и диализовали против 0,02 М Тш-НС1 буфера рН 8,0 два часа. Затем диализат фракционировали на колонке с 8ерЬасгу1 8-300-НЯ (рис.4-а). Иммунохимическую

чистоту S-IgA подтверждали иммуноэлектрофоретическим анализом белковых фракций (рис.4-б). Анализ проведенных исследований показал, что лучшим источником для выделения S-IgA являются носовые секреты, поскольку концентрация данного изотипа в них достаточно велика (2,81 мг/мл) по сравнению с IgM (0,04 мг/мл) и IgG (1,56 мг/мл) (Butler, 1986).

Иммунохимическая характеристика моноклональных антител к IgM рогатого скота

В 1990 г. нами была получена коллекция гибридом, секретирующих МкА к IgM рогатого скота, открывшая перспективу разработки различных тест-систем на их основе (табл.1).

Таблица 1. Иммунохимическая характеристика моноклональных антител

Клоны Изотип Изоэлектри-ческая точка IgG IgA IgM Тип эпитопа

Пентамер Це й пи L

с2 IgG, 6,85 - - + - - конформационныП

с4 IgG, 7,35 - - + - - конформационный

G, IgG, 7,35 - - + - - конформациошшй

Си IgG, 7,35 - - + + - линейный

В3 IgM 8,45-8,5 - - + + - линейный

Как видно из данных таблицы 1, полученные МкА взаимодействали только с ^М, не реагируя и ^А. По результатам иммуноболотгинга, МкА клонов С2, С4 и в., взаимодействали только с нативной молекулой ^М, что свидетельствует о конформационном характере эпитопов на молекуле ^М, распознаваемыми полученными антителами. МкА клонов Си и В3 взаимодействовали не только с нативной молекулой, но и с тяжелой полипептидной цепью ^М, что свидетельствует о линейном характере эпитопов, которые распознают МкА. В результате проведенных исследований были отобраны МкА Сг и в?, взаимодействующие с нативной молекулой ^М и сохранившие титр в РДП 1:32 после лиофилизации. На основе полученных МкА Сг и в? приготовлены реагенты для количественного определения уровня ^М рогатого скота в биологических жидкостях организма животных в РИД и мембранных ^М (б^М) В-клеток методами РИФ и ИПО.

Применение различных вариантов реакции розеткообразования для определения функциональной активности иммуноцитов

Ведущая роль в реакциях приобретенного иммунитета принадлежит лимфоцитам, ответственным за специфическое распознавание патогенных организмов. Взаимоотношения лимфоцитов с антигенами и между собой осуществляется посредством рецепторов клеточной мембраны, которые с помощью соответствующих внутриклеточных молекул трансформируют антигенный сигнал в клеточные реакции.

Спонтанное розеткообразование основано на присутствии на мембранах лимфоцитов рецепторов к эритроцитам. У человека это адгезивная молекула С02, для которой на эритроцитах барана существует соответствующий лиганд С058 (ЬРА-З).

Параллельно с Е-РО изучено наличие СЭ2- и С019- (аналог розеткообразующих клеток с рецептором к третьему компоненту комплемента) молекул на мембране лимфоцитов мышей методом РИФ с использованием МкА к рецепторам СЭ2 (рис.5) и СЭ19 мыши (табл.2).

Таблица 2. Сравнительная оценка уровня Т- и B-клеток методами розеткообразовання и иммунофлуоресцениии (М±т)

№ п/п Источники клеток Е-РОК | CD2-| клетки Коэф. корр.(г) ЗС-РОК CD19-клетки Коэф. корр.(г)

Т-клетки В-клетки

Е-РО РИФ Е-РО /РИФ Е-РО РИФ Е-РО/ РИФ

1 Кровь 21,0±1,7 11,3±0,8 0,5' 11,6±1,2 13,2 ±0,9 0,9

2 Лимфатические узлы 54,5±2,2 33.3±1,6 0,97 34,0±1,5 13,5±1,0 0,99

Тимус 26,5±0,8 20,7±1,0 0,67 9,1 ±0,3 4,5±0,6 0,83

4 Костный мозг 41,1±2,5 44,8±2,1 0,98 14,2±1,4 22,9±1,3 0,97

5 Селезенка 25,2±0,3 10,7±0,9 0,86 22,3±0,4 25,2±1,5 0,87

Примечание. Р<0.01, *-р<0,05, п=100

Как видно из данных таблицы 2 , содержание иммунокомпетентных клеток с Е-розеткообразующим рецептором выше в крови (21,0%), лимфатических узлах (54,5%) и селезенке (25,2%), чем уровень СЭ2-клеток (11,3%, 33,3%, 10,7% соответственно). Степень сопряженности между иммунологическими параметрами

Т- и В-клеток, определяемых в Е-РО и РИФ, установлена при высоких значениях коэффициента корреляции.

Оптимизированы методы антигенного розеткообразования, реакция контактного взаимодействия тимоцитов и макрофагов на лабораторных животных, позволяющие оценить рецепторную активность IgSF иммунокомпетентных клеток на антигены различной природы.

Разработка способа идентификации В-лимфоцитов

К важнейшим рецепторам В-клеток относятся slg, специфичные к одному определенному эпигону антигена. Известно, что на поверхности В-лимфоцита экспрессируется slgM, являющийся неотъемлемой частью рецепторного комплекса В-клетки для антигена. Изучение форм локализации и плотности распределения slg на поверхности В-клеток крупного рогатого скота у молодых и взрослых животных является перспективным направлением исследований механизмов клеточной активации и анергии в процессах онто- и иммуногенеза. Возможно, что белки IgSF, функционирующие на поверхности мононуклеарных клеток (МНК), образуют своеобразную систему иммунного контроля поверхности не только иммуноцитов, но и клеток нервной и эндокринной систем.

Для изучения локализации slg клетки и определения количества В-лимфоцитов был оптимизирован метод иммунопероксидазного окрашивания клеток с использованием моно- и поликлональных антител к Ig крупного рогатого скота и мышей. Было показано, что высокочувствительный метод ИПО является оптимальным для детального исследования модуляции Ig-рецепторов, функционирующих как в мембранной (slg) так и в цитоплазматической (clg) формах. Slg, clg и секретируемые белки IgSF, являются также показателями уровня дифференцировки В-лимфоцитов. Для визуализации реакции применяли З-амино-9-этилкарбазол (АЭК). К slg-клеткам относили лимфоциты с окрашенной мембраной, а к clg-MHK - клетки с окрашенной цитоплазмой.

При апробации разработанного метода на мышах и анализе полученных результатов было установлено, что относительное содержание окрашенных клеток в костном мозге распределялось следующим образом: 22,3% - clgM, 27,5% - clgG и 20,5% - clgA, 10,3% лимфоцитов содержали sIgM-рецепторы. Следовательно,

костный мозг не только поставляет клетки-предшественники различных популяций лимфоцитов в лимфоидные органы, но и одновременно является местом синтеза антител.

В тимусе обнаружено 18,2% тимоцитов с б^М, 1,0% МНК с 2,1%

лимфоцитов с с^А. В селезенке зарегистрировано 7,5% МНК с б^М, 7,1% - 5^0 и 6,3% - с^А. Как вторичный лимфоидный орган селезенка является главным источником циркулирующих В-лимфоцитов. По-видимому, лимфоциты, на мембране которых выявлены ^в-рецепторы, являются В-клетками памяти.

В лимфатических узлах наблюдалось 25,2% клеток с б!§М и 40,5% - с з^С. До 70% фолликулов лимфатического узла содержат зародышевые центры, состоящие, в основном, из пролиферирующих Б^С-В-лимфоцитов.

В лимфоидной ткани кишечника зафиксировано 8,3% МНК с з1§М; 2,6% -3,8% - с^А. Уровень с^А-В-лимфоцитов превышает (3,8%) количество 1§0-клеток (2,6%), что согласуется с данными о том, что основными клетками, синтезирующими ^А, являются В-лимфоциты кишечника (Соп!еу М.Е., 1987, Першин Б.Б. и др., 2001). Следует отметить, что 1яА в лимфоцитах обнаружены только в цитоплазматической форме.

Больше всего В-лимфоцитов находится в костном мозге и лимфатических узлах. При этом у мышей в клетках костного мозга преобладают с1§, что подтверждает его важную роль в синтезе антител.

В иммунных реакциях большое значение имеет функциональное состояние фагоцитов, в частности макрофагов. В крово- и лимфотоке постоянно циркулируют антитела, проникающие через стенку сосудов проходят в различные полости организма и взаимодействующие с клетками. Нами установлено, что на перитонеальных макрофагах мыши, полученных методом адгезии на пластике и тщательно отмытых от экзогенных иммуноглобулинов, присутствуют Рс-рецепторы как к ДО - 25,0%, так и к ^М - 23,0% и к ^А - 21,0%.

Таким образом, в результате проведенных исследований был оптимизирован иммунопероксидазный метод, который впоследствии был использован для определения поверхностных структур лимфоцитов крупного рогатого скота.

Лимфоциты крови крупного рогатого скота выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности (Histopaque-1077) при 3000 об/мин. в течение 45 мин. Для диссоциации экзогенных иммуноглобулинов, клетки обрабатывали 1%-ным раствором лимонной кислоты (ЛК).

На рис. 6 показано, что при обработке клеток 1 %-ной ЛК, количество иммуноглобулинов на поверхности клетки значительно уменьшается (рис.6-б). Большая плотность экзогенных иммуноглобулинов на поверхности клетки обусловлена способностью молекул 1§ к образованию поперечных сшивок. РсуМ1-рецептор В-лимфоцитов связывает только иммуноглобулины в и с довольно низким сродством (<107М_|). В кислой среде нековалентные взаимодействия между Рс-рецептором клетки и Рс-фрагментом антитела ослабевают, и экзогенные диссоциируют с поверхности лимфоцита.

Мембранные ^М ориентированы РаЬ-областью по направлению к внешней среде, тогда как Рс-фрагмент находится в контакте с клеточной поверхностью. Б-^М содержит на С-концах тяжелых цепей домены, образованные гидрофобными аминокислотами, которые удерживают молекулу ^ на наружной поверхности мембраны.

По окончанию инкубации и отмывания в ФСБ на предметные стекла наносили антитела к иммуноглобулинам М (моноклональные антитела мыши) или О, А (поликлональные антитела кролика) крупного рогатого скота, полученные нами на первых этапах работы, в рабочих разведениях и инкубировали 60 мин. во влажной камере при комнатной температуре.

По окончании инкубации с первичными антителами препараты отмывали в ФСБ и наносили вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши (НПЦ «МедБиоСпектр») и кролика («МЕДГАМАЛ»), конъюгированных с пероксидазой, в течение 30 мин. при комнатной температуре во влажной камере. В качестве контроля использовали препараты, подготовленные аналогичным способом, за исключением того, что вместо первичных антител клетки обрабатывали ФСБ.

В результате проведенных исследований установлено, что количество э^М-клеток в периферической крови телят в возрасте одного месяца составляет 16,6%, у

коров в возрасте 5-7 лет- 22,8%. Уровень клеток с мембраноассоциированными молекулами IgG и IgA в крови коров находится в пределах 10,7%.-12,9%.

Представленные данные свидетельствуют о том, что все изотипы иммуноглобулинов (IgM, IgG, IgA) экспрессируются на поверхности клеток периферической крови крупного рогатого скота.

Таким образом, в результате проведенных исследований был оптимизирован иммунопероксидазный метод для его дальнейшего использования при определении поверхностных структур лимфоцитов крупного рогатого скота.

Динамика адгезивной активности лимфоцитов в процессе иммуногенеза

(in vivo и in vitro)

Активация Т-клеток возможна как по классическому (СОЗ-зависимому), так и альтернативному (СБ2-зависимому) пути. Блокада CD-2-зависимого способа активации приводит к нарушению иммунных процессов (Талаев В.Ю., 1999). Поэтому уровень экспрессии данных ILT-рецепторов является функционально значимым в механизме формирования иммунного ответа.

Иммунный ответ при вакцинации имеет ряд особенностей, определяемых спектром воздействия вакцины - стимулирующим или супрессирующим. Иммуногенез начинается со структурных изменений мембран иммунокомпетентных клеток, поэтому определение модуляции адгезивных молекул в процессе первичного и вторичного иммунного ответа является показателем функциональной активности лимфоцитов.

Известно, что при кратковременной инкубации лимфоцитов с антигеном, к которому сенсибилизированы данные лимфоциты, происходит увеличение или уменьшение количества розеткообразующих клеток и, соответственно, изменяется число поверхностных рецепторов лимфоцитов. В нашей работе метод стимуляции лимфоцитов in vitro (антигенное розеткообразование) был использован для оценки динамики уровня розеткообразующих рецепторов лимфоцитов и макрофагов под действием вакцины в процессе иммуногенеза и определения индекса сдвига, показывающего активность иммунокомпетентных клеток.

Таблица 3. Процентное содержание Т- и В- лимфоцитов у мышей в процессе поствакцинального иммунного ответа (п=100)

Показатели Сутки иммунного ответа

0 2 7 14 20

Тимоциты, %:

опыт.группа 7,0±0,2 66,5±1,2*** 49,5+1,0*" 59,0+1,4*'"* 20,0+0,8

контроль 15,0+0,32 30,0±0,9* 19,5+0,2 37,0±1,0* 55,0+1,3*

В-спленоциты, %:

опыт.группа 8,7+0,1 60,0±2,0" 30,0+1,8*** 16,0±1,0* 10,010,3

контроль 8,0+0,2 32,0±1,2* 9,0±0,5 12,0±0,35 31,0±0,8*

Примечание. *'** р< 0,05: * - по сравнению с контролем, " - между показателями с антигеном и без антигена

Как видно из представленных в таблице 3 данных, на 2-е, 7-е и 14-е сутки после иммунизации розеткообразующая активность лимфоцитов возрастает с 30,0% до 66,6% после инкубации с вакциной. На 20-е сутки - инкубация лимфоцитов с вакциной не стимулирует розеткообразование, а наоборот, приводит к его угнетению (с антигеном 20,0%, без антигена - 55,0%).

Таблица 4. Динамика показателей индекса стимуляции (ИС) в нагрузочном тесте с вакциной против рожи свиней из штамма ВР-2

Показатели Сутки иммунного ответа

0 2 7 14 20

Тимоциты 0,4±0,02 2,2±0,2* 2,5+0,2* 1,6±0,3* 0,4±0,02

Т-клетки селезенки 1,0+0,03 1,2±0,2 1,9+0,3* 1,5+0,1* 0,7±0,03

В-клетки селезенки 1,0+0,03 1,9+0,3 3,3±0.5* 1,310,1 0,310,01

Примечание. *-р< 0,05, п= 100.

Лимфоциты мышей контрольной группы не были активированы и короткая инкубация с антигеном in vitro не привела к изменению уровня Т- и В-лимфоцитов (ИС=1,0). Как видно из данных таблицы 4, функциональная активность иммуно-цитов наиболее выражена на 7 сутки иммунного ответа (ИС=3,3-1,9), а наименее -на 20-е (ИС< 1,0).

Сравнительный анализ полученных данных свидетельствует о том, что иммуномодулирующее влияние вакцины in vitro на активированные лимфоциты выражается в изменении количества рецепторов на поверхности Т- и В-клеток.

При этом показано, что 30-минугного воздействия вакцины на интактные лимфоциты недостаточно для изменения количества С02-молекул и рецепторов к Сз-компоненту системы комплемента на поверхности клеток (ИС=1,0). Аналогичная инкубация лимфоцитов, иммунизированных животных, существенно увеличивала количество Т-ллмфоцитов (ИС>1,0) и соответственно их 1ЬТ-рецепторов. Таким образом, активированные лимфоциты в период до 14 суток иммунного ответа обладают способностью отвечать на повторный антигенный сигнал повышением числа рецепторов, членов суперсемейства иммуноглобулинов.

Изменения 1ЬТ-рецепторного профиля иммунокомпетентных клеток

после вакцинации

В процессе иммунного ответа осуществляется множество межклеточных взаимодействий, среди которых наиболее важным является распознавание чужеродного антигена Т-клетками, основанное на специфичности связывания пептидов молекулами МНС, расположенными на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК). Для характеристики функционально-рецепторных свойств мембраносвязанных ^БР в процессе поствакцинального иммунного ответа определяли рецепторную активность Т-клеток и антигенпрезентирующих клеток (перитонеальные макрофаги). Т-лимфоциты дифференцировали на высокоаффинные -многорецепторные (МРОК) (рис.7) и неполные - малорецепторные (мРОК). В качестве модельных антигенов использовали живые вакцины бактериальной (производственная вакцина против рожи свиней из штамма ВР-2) и вирусной (ассоциированная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита («ТМК») и ротавирусной инфекции («К») свиней -опытная серия, ВИЭВ) этиологии.

Повышение адгезивной активности перитонеальных макрофагов зарегистрировано на 2-е, 10-е и 14-е сутки иммунного ответа на бактериальную вакцину и только на 3-й сутки после введения вирус-вакцины (табл.5), что обусловлено различными путями презентации эндогенных и экзогенных антигенов макрофагами.

Таблица 5. Показатели реакции контактного взаимодействия в процессе ______поствакцинального иммунного ответа_

Группы животных Сутки иммунного ответа

0 1 2 3 7 10 14 21

1 (Т/ПМ) 26,0±0,5 52,0±0,7 70,3±1,0 200,7±12,0 21,0±0,3 40,1 ±0,4 21,0±0,8 20,0±0,7

2 (Т/ПМ) 30,5±0,9 34,8±0,32 212,3±30,4 70,7±0,91 56,1±0,3 260,3±35,9 125,5±15,8 26,2±0,4

Примечание: р< 0,05, п=100, Т/ПМ - число адгезированных тимоцитов на поверхности 100 макрофагов. 1 группа - животные, иммунизированные ассоциированной вакциной против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней, 2 группа - животные, иммунизированные производственной вакциной против рожи свиней из штамма ВР-2

Неактивированные макрофаги содержат незначительное количество молекул МНС. Их экспрессия начинается только после захвата антигена и образования фагосом или протеасом. Как следует из приведенных материалов, в первый день после вакцинации адгезивная активность макрофагов не отличалась от контроля. Если макрофаги, находящиеся в непосредственной близости от места внедрения антигена, не справляются с его уничтожением, то антиген распространяется по всему организму, в том числе, в перитонеальную полость. На 2-е сутки иммунного ответа на бактериальный антиген наблюдалось резкое увеличение числа тимоцитов, контактирующих с макрофагами, что связано с возросшей функциональной активностью макрофагов, которая сопровождалась морфологическими и биохимическими изменениями клеток (рис.8).

В результате повышается адгезивная активность мембран макрофагов, представляющих фрагменты антигена на своей поверхности. Второй пик повышения функциональной активности ПМ (10-14-е сутки) обусловлен выполнением макрофагами роли эффекторных клеток.

В первые сутки после введения вакцины ВР-2 установлено значительное повышение количества высокоаффинных Т-клеток в костном мозге (75%, контроль - 15%), число которых на 2-е сутки снижается вдвое (рис.9). На 7-е сутки поствакцинального иммунного ответа, их уровень возрастает в лимфатических узлах (50,2%, контроль - 11%) и тимусе (60,0%, контроль - 27,0%), что характеризует активизацию клеточных реакций, как в первичных, так и во вторичных лимфоидных органах. Усиление экспрессии адгезивных СБ2-молекул улучшает межклеточный контакт для обеспечения эффекторных функций

12 3 4

Рис. 2. Электрофореграмма «Phast-System» («Pharmacia»).

1 - (+) вариант. IgG после гель-фильтрации у-глобулинов молозива коров,

2 - (+) вариант. IgG после ионообменной хроматографии на DEAE Sepharose 6В у-глобулинов молозива коров.

3 - (+) вариант. IgG после ионообменной хроматографии на DEAE Sepharose 6В у-глобулинов сыворотки крови КРС,

4 - маркеры молекулярной массы (Cytochrome С- 12.3 kDa, а-Lactalbumin 14.4 kDa. myoglobin 17,8 kDa. chymotrypsinogen 25,0 kDa. carbonic anhydrase 30.0 kDa. albumin (egg) 45,0 kDa)

3

4

5

6

Рис. 3. Иммуноэлектрофореграмма различных биологических жидкостей КРС

(В лунках - 1- сыворотка крови. 2- сыворотка молозива, 3 - носовой секрет, 4 - слезный секрет. 5 - бронхоальвеолярные смывы, б -иммунохимически чистый б^А; в траншеях - антисыворотка против у-глобулинов КРС)

а б

Рис. 4. а - Профиль элюции образцов носового секрета коров на колонке с 8ерЬасгу] 8-300 НИ (II пик - 81йА); б - Иммуноэлектрофореграмма. Степень чистоты Б-^А, полученных из носовых секретов КРС (в лунках - белковые фракции после гель-фильтрации на 8-300. в траншеях - антисыворотка против белков КРС)

Рис. 5. РИФ. СБ2-клетка лимфатического узла мыши. хЮОО

а б

Рис. 6. Иммунопероксидазное окрашивание клеток без инкубации с ЛК (а) и после воздействия 1% ЛК (б)

Рис. 7. Многорецепторный лимфоцит костного мозга мыши. хбОО

Рис. 8. Реакция контактного взаимодействия макрофага с тимоцитами мыши. х900

/

\

С

/•• >у

СI

Рис. 12. Различные формы распределения поверхностных иммуноглобулинов по периферии В-лимфоцитов. а,б - «кэп», эндоцитоз, в - «петч», г - «шеддинг»

*0

Рис.13. с^М-клетка (цитоплазматическая форма) периферической крови крупного рогатого скота. \900

Определение ШГ-рецепторных клеток у различных видов животных

-Я»

* •* • *

. Л

..V V , * -

•• -..........^

' I * •

Рис.14. Т-клетки периферической крови серебряного карася (реакция розеткообразования). х900.

Рис.15. Теофиллинрезистентные лимфоциты кур. х900.

Рис.16, а - В-лимфоцит (ЗС-розеткообразуюшая клетка), Т-клетки периферической крови крупного рогатого скота. х900.

■ Костный мозг В Тимус

□ Лимфатические

узлы___

1 2 7 10 14

Время после вакцинации, сут.

Рис. 9. Динамика содержания высокоаффинных Т-клеток (МРОК) в лимфоидных органах мышей после иммунизации вакциной против рожи свиней

Возрастание С02-белков вначале на Т-клетках костного мозга, затем в тимусе и лимфатических узлах обуславливает достаточно высокую аффинность связывания комплексов молекулы МНС класса II и линейного пептида бактериальной клетки.

Анализ полученных результатов показал, что при увеличении числа тимоцитов на 1-е и 7-е сутки иммунного ответа, адгезивная активность макрофагов была на уровне контроля. И наоборот, повышение числа тимоцитов, прикрепленных к поверхности макрофагов на 2-е сутки при введении бактериальной вакцины и на 3-й - вирусной, сопровождалось только незначительным повышением уровня Т-лимфоцитов. Обратно пропорциональная связь между уровнями тимоцитов и макрофагов в определенные периоды иммуногенеза, по нашему мнению, обусловлена компенсаторными механизмами иммунной системы.

В процессе иммуногенеза установлена прямая корреляционная взаимосвязь между показателями Т-клеток в тимусе и крови (г=0,62). Сопряженность между данными параметрами объясняется поступлением части активированных тимоцитов в циркуляцию и перемещением их во вторичные лимфоидные органы.

Значительное повышение уровня высокоаффинных Т-клеток в костном мозге в первые сутки свидетельствует об усилении адгезивной активности Т-клеток, направленной на контакт с В-клетками, а возможно, и для генерирования

дополнительного активационного сигнала. Прямая корреляция между показателями в костном мозге и лимфатических узлах (г=0,65) свидетельствует о межклеточной кооперации Т-лимфоцитов этих органов в иммуногенезе. Отсутствие корреляционных взаимосвязей между уровнем экспрессии С02-рецепторов на клетках костного мозга и лимфоцитах крови косвенно подтверждает теорию отрицательной селекции ангигеннеспецифических лимфоцитов, которые погибают в результате апогтгоза и не попадают в циркуляцию. Отрицательная корреляция показателей адгезивной активности спленоцитов и макрофагов (1=-0,64), объясняется различными функциями регуляторных и эффекторных пулов иммунокомпетентных клеток в процессе иммунного ответа. В результате проведенных исследований установлено, что С02-рецепторы иммуноцитов обуславливают их функциональную активность и играют важную роль в формировании адекватного иммунного ответа.

Оценка функциональной активности В-клеток в процессе поствакцинального иммунного ответа

Наряду с методами НПО и РИФ, для идентификации поверхностных рецепторов клеток использовали лимфоцитотоксический тест. Подопытной группе мышей вводили подкожно вакцину против рожи свиней (штамм ВР-2) в дозе 0,2 мл, ревакцинировали через 30 дней по аналогичной схеме.

Рис.10. Динамика содержания В-лимфоцитов селезенки в процессе поствакцинального иммуногенеза. Время после иммунизации: 1,3, 7, 14 сут. - первичный иммунный ответ; 1, 7, 14, 20-вторичный. I-опыт; Н-контроль.

Контрольным животным вводили 0,2 мл физиологического раствора. Процент погибших клеток (В-лимфоциты) определяли на 1-е, 7-е и 14-е сутки первичного и вторичного иммунного ответа.

Как видно из данных на рис. 10, при первичном иммунном ответе увеличение В-лимфоцитов наблюдалось в первые сутки после введения вакцины (23,0%, контроль

время после иммунизации, сут.

- 12,0%) , и на 1-е и 14-е сутки после повторной инъекции, что свидетельствует также и о повышении экспрессии на клетках. Помимо количественного определения В- лимфоцитов, методом РИД в надосадочной жидкости МНК селезенки мышей определяли концентрацию (рис.11).

Рис. 11. Уровень 1|>С1 в надосадочной жидкости МНК селезенки в процессе поствакцинального иммуногенеза. Время после иммунизации: 1, 3, 7,14 сут. - первичный иммунный ответ: 1,7, 14,20 - вторичный.

В результате проведенных исследований установлено, что в первые сутки после инъекции вакцины в селезенке достоверно повышается количество В-клеток (рис.10) и уровень ^01 (рис.11), тогда как количество Т-клеток увеличивается только на 7-е сутки иммуногенеза.

В процессе иммунного ответа первичные фолликулы селезенки превращаются во вторичные фолликулы с зародышевым центром. В первые сутки иммунного ответа увеличивается число фолликулярных В-клеток, затем эти клетки превращаются в первичные В-бласты и центробласты, которые являются ^-негативными. На следующей стадии активации В-клеток и образования центроцитов, экспрессия иммуноглобулинов возобновляется. Реакция в зародышевом центре селезенки продолжается около 20 суток. Полученные нами результаты подтвердили цикличность активации В-клеток селезенки и зависимость Б^-рецепторной активности от стадии дифференцировки лимфоцита в процессе иммуногенеза.

Корреляционный анализ показателей 1ЬТ-рецепторных клеток при введении иммунотропных препаратов

Известно, что иммунотропные препараты широко используются для профилактики вторичных иммунодефицитных состояний животных. В соответствии

с задачами нашей работы, дальнейшим этапом исследований был анализ модификации мембранных структур иммуноцитов и определение корреляционной взаимосвязи показателей 1ЬТ-рецепторных клеток под воздействием препаратов, наиболее широко используемых в ветеринарии в качестве иммуномодуляторов.

Определение иммунологических показателей проводили на 1-е и 7-е сутки после инъекции препаратов (табл.6).

С целью характеристики межклеточной кооперации лимфоцитов на фоне введения иммунотропных препаратов, были определены коэффициенты корреляции между иммунологическими показателями. Так при введении селенопирана и иуклеината натрия корреляционная взаимосвязь между числом Т-клеток крови и тимуса, тимуса и селезенки отсутствовала, а между количеством Т-лимфоцитов крови и лимфатических узлов - имела положительное значение (г=1,0). На высоком уровне значимости (р<0,01) наблюдалась корреляционная зависимость между розеткообразующей активностью клеток крови, тимуса и лимфатических узлов на фоне введения риботана (^0,98). На основании корреляционного анализа установлен наиболее оптимальный иммуномодулятор на модели мышей. Учитывая, что степень сопряженности между представленными показателями является весьма высокой во второй группе, можно констатировать, что риботан наиболее эффективно и продолжительно активирует 1ЬТ-рецепторы Т-клеток.

Таблица 6. Влияние иммунотропных препаратов на показатели клеточного

иммунитета

Показатели Срок исследования (сутки)

1 1 7 1 1 7 1 | 7 Контро ль

Селенопиран Риботан Нуклеинат №

Т-клетки крови, % 19,8±1,2 23,7+0,7* 34,0+0,7* 59,0±1,2* 71,6±2,0* 63,0±1,6* 10,0±0,7

Т-клетки лимф, узлов, % 15,3 ±0,9 25,5+0,7* 18,0+0,9 40,5+2,0* 53,5+1,6* 50,0+1,7* 10,5±0,2

Тимоциты,% 21,8+0,7 17,3+1,2 22,0+0,9 43,5+1,5* 42,7+1,2* 67,0±1,9* 26,5±0,8

Фаг.активность ПМ, % Ю,4±1,0 12,8+0,9 24,4±0,1Г 36,9+1,0" 20,0+0,6' 10,5±0,07 9,2+0,3

Фагоцитарное число 2,5+0,04 3,7+0,04 7,3±0,2* 6,6+0,05* 4,0+0,07 4,2±0Д 3,2+0,06

Лейкоциты, тыс./мкл ^3,2+0,02 3,9+0,3 4,5+0,4 5,2+0,07 5,7+0,1 5,6+0,03 4,2±0,05

Лимфоциты, % 60,6±1,6 44,9±1,5 34,1+1,2 71,7±1,9 41,0+1,6 58,6±1,9 49,0+0.7

Нейтрофилы, % 21,6+0,9 50,7+1,8 54,8+0,9 23,6+0,7 40,6+1,4 34,2+1,4 41,2±0,4

Моноциты, % 7,0+0,8 4,1 ±0,7 10,1+0,5 4,5+0,3 18,0+0,7* 10,0+0,2 9,6+0,1

Примечание: р<0,05: по сравнению с контролем

Из результатов эксперимента следует, что степень сопряженности между исследуемыми иммунологическими показателями при введении иммунокорректоров различна. Однако во всех группах постоянно сохранялась прямая корреляция показателей Т-лимфоцитов крови и лимфатических узлов (г=0,89), абсолютного числа розеткообразующих лимфоцитов крови и лейкоцитов (i=0,95), содержания лимфоцитов и Т-клеток тимуса (г=0,9). Одновременно наблюдалась сильная обратная корреляционная взаимосвязь между содержанием лимфоцитов и нейтрофилов (г=-0,9), абсолютным числом лейкоцитов и моноцитов (г—0,88), уровнем тимоцитов и количеством нейтрофилов (г=-0,9), между содержанием моноцитов и уровнем Т-клеток периферической крови.

Формы локализации sIgM-рецепторов В-лимфоцитов в периферической

крови коров

В онтогенезе дифференцировка в зрелые Т- и В-клетки сопровождается изменением фенотипа поверхности лимфоцита, определяемого с помощью моно- и поликлональных антител методами иммуноцитохимии. Так экспрессия clgM на поверхность клетки играет решающую роль в В-клеточном онтогенезе. Модуляция количества slg или блокировка их антителами приводит к изменению характера иммунных реакций, поскольку именно slg связывают антиген на поверхности В-лнмфоцита для дальнейшего его процессирования в эндосомах и представления Т-клеткам.

Нами были изучены формы локализации slg на поверхности В-клеток в периферической крови у телят и коров в рамках исследования механизмов клеточной активации в процессе онтогенеза. Количество sIgM-лимфоцитов определяли методами ИПО и РИФ; уровень IgM, IgG, IgA - методом РИД. В исследованиях использованы моно- и поликлональные антитела к Ig крупного рогатого скота, полученные на первом этапе исследований.

В опытах использовали периферическую кровь коров черно-пестрой породы в возрасте 4-5 лет. Иммунопероксидазное окрашивание клеток позволило определить количество В-клеток и локализацию sIgM-рецепторов. Различные формы распределения slg на поверхности В-клетки продемонстрированы на рис.12.

Известно, что б^М присутствует на мембране В-клеток с различной плотностью, играющей важную роль в дифференцировке лимфоцитов (Сидорова Е.В.,2006). Так негативная и позитивная селекция В-лимфоцитов зависят от плотности рецепторов на клеточной поверхности. Связывание рецептора с его лигандом сопровождается не только изменением конфигурации рецептора, но и его движением в мембране клетки. На поверхности клетки в результате этого рецепторы могут собираться в форме «петч» (неравномерное распределение по периметру клетки) и «кэп» (скопление на одном из полюсов клетки) с последующим погружением их в цитоплазму - эндоцитоз (рис. 12-6).

Подобно другим поверхностным белкам, свободно перемещаются в билипидном слое плазматической мембраны клетки и при образовании комплекса с антигеном концентрируются на одном из полюсов клетки («кэппинг»- эффект рис.12-а, б). Виноградова Т.В. и др. (1995) отмечали, что основной формой расположения на поверхности В-лимфоцита человека является

«петч»/эндоцитоз. В результате проведенных исследований нами установлено, что В-клетки в периферической крови коров с окрашенной мембраной в форме «петч»/эндоцитоз составляют 68,9±3,9%, «петч» - 15,0±3,3% (рис.12-в), «ринг» (равномерное распределение по периметру клетки) - 10,5±3,3%, «кэп» -5,6±1,9%. Образование «кэпов» на мембране лимфоцита способствует оптимальному концентрированию иммунных комплексов на одном из полюсов клетки для образования кластеров, подвергающихся эндоцитозу.

Изменение локализации рецепторов, их перераспределение в мембране, определяет роль В-лимфоцита, как антигенпредставляющей клетки в иммунном ответе. взаимодействуя с антигеном, посредством эндоцитоза включают его в цитоплазматический компартмент клетки, где он подвергается деградации.

Помимо механизма поглощения лигандосвязанных рецепторов показан феномен сбрасывания рецепторов (шеддинг) (рис.12-г). Кластеры, состоящие из агрегированных комплексов антиген/я^ на одном из полюсов клетки, отделяются от поверхности клетки в окружающую среду. Процессы эндоцитоза и «шеддинга» являются неотъемлемой частью нормального функционирования рецепторного аппарата клетки. Исследование форм локализации представляет теоретический

и практический интерес, поскольку под влиянием различных факторов, в том числе патогенных микроорганизмов, изменяется локализация рецепторов на поверхности клетки. По перераспределению рецепторов на мембране клетки можно судить о способности связывать антигены, т.е. характеризовать функциональную активность лимфоцита.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о присутствии в периферической крови крупного рогатого скота В-клеток с различной локализацией поверхностных иммуноглобулинов. Основной формой распределения на мембране В-лимфоцита является «петч»/эндоцитоз.

8^М-клетки и ^М-антитела в развитии иммунной системы у телят

Важной задачей наших исследований являлась разработка специфичного метода для количественного определения В-лимфоцитов крупного рогатого скота и изучения механизма дифференцировки лимфоцитов из общей лимфоидной клетки-предшественницы, поскольку первыми появляющимися в цитоплазме В-

клетки, являются тяжелые цепи 1§М (ц-цепи). Распределение ^М в В-лимфоцитах периферической крови у телят определяли методом иммунопероксидазного окрашивания с использованием в качестве первых антител моноклональных антител к 1§М крупного рогатого скота.

При микроскопическом исследовании препаратов установлено, что клетки периферической крови телят, экспрессирующие э^М, составляют 19,2%. Кроме того, в результате иммуноцитохимического анализа в крови обнаружены с^М-клетки, которые не окрашиваются по периметру из-за отсутствия бГц (рис.13). Такие клетки могут быть пре-В-клетками с цитоплазматическими ц-цепями или плазматическими клетками, секретирующими ^М.

Таблица 7. Показатели В-системы иммунитета у телят

Показатели В-лимфоциты, %* з^М-клеткн, %** Концентрация 1§М, мг/мл *** Индекс ^М/В-клетки

М±т, п=15 12,0±0,5 19,2±0,8 0,92±0,03 0,065+0,01

Примечание: р<0,05. * - ЗС-РО - СО 19; **- ИПО, ***- РИД

Таким образом, установлено, что в периферической крови телят присутствуют В-клетки на разных стадиях дифференцировки. Основные показатели,

характеризующие Б^М-клетки и ^М-антител а (секретируемая форма igM) В-системы иммунитета телят приведены в таблице 7.

Для повышения информативности иммунологических исследований в таблице 7 приведен индексный показатель гуморальной системы (соотношение уровня ^М к количеству В-клеток). Все компоненты иммунной системы взаимосвязаны и в условиях патологии происходит изменение сбалансированности отдельных ее звеньев, поэтому индексные показатели более адекватно отражают нарушения иммунореактивности и повышают диагностическую значимость иммунологического мониторинга.

Определение И/Г-рецепторных клеток у различных видов животных

Заключительным этапом исследований было определение 1ЬТ-рецепторных клеток у различных видов животных с помощью метода спонтанного розеткообразования и нагрузочного теста с теофиллином (табл.8). Теофиллиновый тест использован для оценки состояния цитоплззматических мембран иммунокомпетентных В- и Т- клеток, характеризующихся колебанием уровня внутриклеточного цитоплазматического АМФ, связанного с экспрессией СВ2-рецептора.

Таблица 8. Относительное содержание субпопуляций лимфоцитов в крови здоровых животных (М±т)

Вид животных В-лимфошпы, Т-лимфоцигы, %

% Общее CD4- CD8-

количество хелперы цитотоксические

Мыши (BALB/c), п=500 И,6±1,2 21,0±1,7 21,0±1,5 12,2±0,5

Норки, п-80 10,5±0,8 52,0±2,1 33,0±1,5 19,0±1,0

Куры,п=50 23,3±1,5 38,0±2,1 12,2±0,6 10,4±0,8

Рыбы, л=100 14,0±1,5 35.1+0,6 18,0±0,2 14,5±0,8

Примечание: р<0,05

Изучая феномен розеткообразования у животных, находящихся на различных ступенях эволюционной лестницы - костистые рыбы (рис.14), птицы (рис.15), млекопитающие (рис.16), было показано, что их лимфоциты обладают рецепторами к эритроцитам барана. Несмотря на то, что у этих видов животных структура иммунной системы различна* основные клеточные и молекулярные компоненты врожденного иммунитета достаточно консервативны.

Как видно из данных таблицы 8, количественные соотношения клеток с иммуноглобулиноподобными рецепторами, такими как CD2 (Т-клетки), CD19 (В-клетки), CD4, CD8, у данных видов животных одинаковы: Т-клеток > В-клеток; Т-хелперов больше, чем цитотоксических лимфоцитов. Это доказывает функционально-рецепторный консерватизм Ig-подобных рецепторов лимфоцитов у различных видов животных. Анализ способности к розеткообразованию у исследуемых видов животных показывает различие рецепторной активности В-клеток. Это обусловлено тем, что В-система иммунитета в процессе эволюции развивалась позже Т-системы. У млекопитающих, птиц и рыб есть тимус -центральный орган иммунной системы, место дифференцировки Т-клеток до зрелых форм. Увеличение иммунорегуляторного индекса ( соотношение CD4 Т-хелперов к цитотоксическим CD8 Т-клеткам) от 1,3 у рыб и 1,2 у птиц до 1,7 у норок показывает различие в процессах дифференцировки Т-лимфоцитов, основанное на структурных особенностях тимуса.

Возможно, что С02-рецепторы, как адгезивные молекулы, появляются одними из первых в процессе филогенеза иммунокомиетентных клеток позвоночных животных. Еще П.Эрлих впервые указал на отсутствие видовой специфичности рецепторов у животных различных видов. А, по мнению Галактионова В.Г. (2004) филогенез клеток иммунной системы строится на рецепторной и функциональной общности клеток, участвующих в эволюционном процессе, в котором на пути от НК-клеток к Т-лимфоцитам сохранилось несколько общих рецепторов, указывающих на филогенетическую связь между этими клетками, в частности CD2.

В настоящее время не вызывает сомнений определяющее значение белков суперсемейства иммуноглобулинов в развитии адаптивного иммунитета, основанного на врожденных механизмах защиты от инфекций. Иммунная система, как система специфического распознавания чужеродных структур, на ранних этапах эволюции начала свое становление с появлением иммуноглобулиноподобных доменов, стабилизированных дисульфидными связями. Именно из этой молекулярной, конформационной структуры, свойственной только членам суперсемейства иммуноглобулинов, построены клеточные рецепторы, ответственные за распознавание антигена, а межклеточная кооперация с участием

^БР является ведущим фактором в развитии иммунных реакций, обуславливающих функционирование иммунной системы, распознавание и деструкцию структур, зондирующих защитные возможности организма. Проведенные исследования показали, что функциональная активность иммунокомпетентных клеток находится в тесной взаимосвязи с мембранными и растворимыми формами молекул иммуноглобулинов. Определив модуляцию ^Р в онто- и иммуногенезе и консерватизм в филогенезе нами была показана возможность оценки физиологических и молекулярных аспектов функционирования иммунной системы. В результате проведенных исследований было установлено, что 1ЬТ-рецепторный профиль иммунокомпетентных клеток определяет их функциональную активность и роль в реакциях различного генеза.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны способы получения иммуноглобулинов А (8-1§А) крупного рогатого скота из молозива и носовых секретов животных. Показано, что оптимальной биологической жидкостью для выделения 8-1§А служат носовые секреты крупного рогатого скота, а в связи с полиморфизмом иммуноглобулинов данного изотипа для его количественного определения следует использовать стандарт из гомологичного субстрата.

2. Разработана технология получения и контроля моноспецифических реагентов к иммуноглобулинам крупного рогатого скота, предназначенных для определения уровня иммуноглобулинов у животных. Экспериментально установлена возможность использования полученных антисывороток и моноклональных антител в иммуноцитохимических реакциях для количественной оценки ^Р-содержащих клеток.

3. Приведены количественные показатели уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови коров в период 3-6 мес. стельности, которые составляют: -29,2± 5,9 мг/мл, ^М - 2,6 ±0,6 мг/мл, ^А -1,0± 0,3 мг/мл. Показано, что иммунный статус этих животных характеризуется значительным повышением концентрации

который затем переходит в молозиво, где является основным изотопом иммуноглобулинов и доминирующим фактором колострального иммунитета.

4. Разработан способ идентификации В-лимфоцитов крупного рогатого скота с применением иммунопероксидазного окрашивания клеток на основе моно- и поликлональных антител. Установлено, что мембранные иммуноглобулины В-клеток периферической крови коров распределяются по периметру лимфоцита в форме «петч»/эндоцитоз на 68,9±3,9% клеток, «петч» (неоднородные скопления рецепторов) - 15,0±3,3%, «ринг» (равномерное распределение рецепторов по периметру клетки) - 10,5±3,3%, «кэп» (скопление рецепторов на одном из полюсов клетки) - 5,6±1,9%.

5. С использованием реакции непрямой иммунофлуоресценции на основе моноклональных антител установлено, что число sIgM-клеток в периферической крови крупного рогатого скота составляет от 0,97±0,5 х10'/л до 1,0±0,7 х109/л. При этом количество sIgM-клеток у стельных коров значительно выше и достигает значения 1,5±0,3х109/л.

6. Цитохимическим методом определено количество sIgM-клеток в периферической крови телят 30-дневного возраста, находящееся в пределах 16,6±4,5%- 19,2±0,8%.

7. Показана практическая эффективность применения реакции антигенного розеткообразования и контактного взаимодействия с макрофагами для определения рецепторной активности иммунокомпетентных клеток в поствакцинальном иммунном ответе у лабораторных животных.

8. Установлено, что воздействие in vitro вакцины против рожи свиней на интактные лимфоциты мышей не оказывает значительного влияния на число CD2-молекул и рецепторов к С3-компоненту комплемента на поверхности клеток. Аналогичное воздействие на лимфоциты вакцинированных животных, приводит к повышению уровня экспрессии рецепторов иммуноцитов, при этом индекс стимуляции равен 2,5-3,3 (в контроле 1,0). Двойной антигенный сигнал (in vivo u in vitro) усиливает экспрессию рецепторов в первые 14 суток иммунного ответа, когда в организме сохраняется достаточное количество активированных лимфоцитов.

9. Определено различное воздействие антигенов бактериальной и вирусной этиологии на экспрессию ILT-рецепторов лимфоцитов, отражающую степень их активации. Так иммунизация мышей вакциной против рожи свиней приводит к

образованию высокоаффинных Т-клеток в первые сутки в костном мозге, а в последующие - в тимусе; при использовании вирус-вакцины высокоаффинные Т-лимфоциты обнаружены в костном мозге на 14-е сутки. Показана ведущая роль костного мозга в индукции рецепторной активности Т-клеток в поствакцинальном иммунном ответе.

10. Установлено различное влияние антигенов бактериальной и вирусной этиологии на процесс активации макрофагов, который является более продолжительным при иммунизации животных бактериальным антигеном. Так количество тимоцитов, взаимодействующих с перитонеальными макрофагами мышей на 2-10-14 сутки после введения вакцины против рожи свиней составило 212,3±30,4, 260,3±35,9 и 125,5 ±15,8 клеток/100 макрофагов соответственно (в контроле - 26,0±0,5). Более продолжительное повышение рецепторной активности поверхностных структур макрофагов и Т-клеток определяется различной МНС-рестрикцией иммунного ответа на бактерии и вирусы.

11. Показано, что вторичный иммунный ответ на введение Т-независимого антигена 2 типа (ТН-2) характеризуется увеличением количества В-клеток костного мозга и селезенки. Установлено увеличение количества 1§С1 в селезенке, что подтверждает участие Т-клеточных факторов в ТН-2-иммуногенезе.

12. Предложен диагностический алгоритм для изучения эффективности иммунотропных препаратов на модели лабораторных мышей, включающий следующие показатели: положительная корреляция (> 0,7) между розеткообразующей активностью клеток периферической крови и лимфатических узлов; положительная корреляция между относительным содержанием лимфоцитов и розеткообразующих тимоцитов; отрицательная корреляция (> - 0,7) между нейтрофилами и Т-клетками тимуса. Разработанная схема позволяет определять уровень корреляционной связи по трем соотношениям, характеризующим сбалансированность иммунной системы.

13. Установлена филогенетически детерминированная рецепторная и функциональная общность С02-рецепторных клеток у животных, находящихся на различных ступенях эволюционной лестницы (костистые рыбы, птицы, млекопитающие) и отличающихся строением иммунной системы.

14. Показано, что белки суперсемейства иммуноглобулинов в мембраносвязанной и секретируемой формах (CD2, CD4, CD8, CD 19, slg, lg, антитела) определяют функциональную активность лейкоцитов и играют ведущую роль в адаптивном иммунитете.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Предложен комплексный подход к оценке Т- и В-клеточных звеньев иммунной

системы крупного рогатого скота и лабораторных животных, который может быть использован для определения эффективности иммунотропных препаратов, используемых в ветеринарной практике РФ.

Получение иммунохимически чистых иммуноглобулинов класса G крупного рогатого скота рекомендуем с помощью ионообменной хроматографии в градиенте NaCl от 0,1 М до 0,4 М.

Для выделения секреторного IgA крупного рогатого скота рекомендуем носовые секреты, которые фракционируют методом гель-фильтрации на Sephacryl S-300-HR. В качестве элюанта используют 0,1 М Tris-HCl буфер рН 8,0 с 1,0 М NaCl.

С целью повышения специфичности реакции, для количественного определения иммуноглобулинов класса А методом радиальной иммунодиффузии по методу Манчини (РИД), следует использовать стандарт из гомологичного субстрата в связи с полиморфизмом данного изотипа.

Для количественного определения В-лимфоцитов крупного рогатого скота рекомендуем реакцию непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител к IgM.

С целью повышения эффективности поствакцинального иммунного ответа рекомендуем включать в состав инактивированных вакцин смесь Т-зависимых и Т-независимых антигенов.

Метод иммунопероксидазного окрашивания с поли- и моноклональными антителами к Ig может быть использован для определения форм распределения Ig-рецепторов на мембране клетки, что дает возможность изучения молекулярных аспектов иммуногенеза.

Для оценки иммунного статуса животных рекомендуем использовать индексные показатели, которые более адекватно отражают состояние иммунной системы, чем

отдельные его параметры, и что в значительной мере повысит диагностическую эффективность иммунологического мониторинга.

Разработанные методы могут быть использованы для оценки иммунного статуса животных, в том числе морских млекопитающих, в рамках программ по оценке здоровья популяций животных, обитающих в естественных условиях.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ Монографии, патенты РФ, методические рекомендации

1. Ездакова И.Ю. Рецепторы иммунного узнавания у животных /И.Ю.Ездакова. -

М.:Компания Спутник+, 2008.- 88 е.: ил.; Библиогр.:с.72-73.-500 экз.- ISBN 978-5364-01149-7.

2. A.c. 1560549 СССР. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus, используемый для получения моноклональных антител к IgM рогатого скота / Федоров Ю.Н., Сологуб В.К., Феоктистова Т.А., Ездакова И.Ю. и др.- №4229427; заявл.15.04.87; опубл. 3.01.90.

3. Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных: методические рекомендации /П.Н.Смирнов, М.И.Гулюкин, Ю.Н.Федоров,... И.Ю. Ездакова... и др.- Россельхозакадемия, Сиб. отд-ние, ГНУ ИЭВС и ДВ, ГНУ ВИЭВ, ФГОУ НРИПК АПК МСХ РФ, НГАУ. - Новосибирск, 2003 .-32 с.

4. Пат. 2277421 Российская Федерация, МПК А61К 35/12, А61К 35/20. Способ получения секреторного иммуноглобулина А из молозива рогатого скота / Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю., Чеботарева Т.А.; заявитель и патентообладатель ГНУ ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко.- №2005109539/15; заявл.05.04.05; опубл. 10.06.06, Бюл.№16.-5с.

5. Пат. 2288008 Российская Федерация, МПК А61К 39/395, А61К 35/12. Способ получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости животных / Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю., Чеботарева Т.А.; заявитель и патентообладатель ГНУ ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко.- №2005109538/15; заявл.05.04.05; опубл. 27.11.06, Бюл.№33.-4с.

6. Федоров Ю.Н. Методические рекомендации по количественному определению и оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток животных / Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю. //Сборник «Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины».-2008.-4 - С. 144-158

7. Пат. 2293330 Российская Федерация, МПК G01N 33/53. Способ определения антител/ Ездакова И.Ю.; заявитель и патентообладатель ГНУ ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко.-№2005120538/15; заявл.04.07.05; опубл. 10.02.07, Бюл.№4.-5с.

Научные работы в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук

8. Определение специфичности моноклональных антител к отдельным классам

иммуноглобулинов крупного рогатого скота и свиньи методом «вестерн-блоттинга»/ Верховский О.А., Федоров Ю.Н., Феоктистова Т.А., Ездакова И.Ю. и др. // Сельскохозяйственная биология. - 1993.- № 6.- С. 135-141.

9. Использование моноклональных антител для оценки антигенных свойств иммуноглобулинов животных / Верховский О.А., Федоров Ю.Н., Соло1уб В.К. Феоктистова Т.А. , Федорова И.П., Ездакова И.Ю. // Сельскохозяйственная биология,- 1995.-№ 4.-С. 94-99.

10. Изотипспецифические антителосекретирующие клетки у мышей в процессе иммуногенеза. /Жаданов А.И., Ездакова И.Ю., Верховский О.А., Федоров Ю.Н. // Ветеринария.-2000.- №11,- С.22-26.

11. Кинетика синтеза различных типов антителосекретирующих клеток костного мозга мышей в процессе иммуногенеза / Федоров Ю.Н., Верховский О.А., Жаданов А.И., Ездакова И.Ю.// Доклады РАСХН,- 2000.-№ 5.-С. 42-44.

12. Ездакова И.Ю. Динамика количества Т-клеток и их взаимодействие с антигенпредставляющими клетками в процессе иммунного ответа / Ездакова И.Ю., Федоров Ю.Н., Жаданов А.И. // Цитология,- 2001,- Т. 43.- № 9-. С. 858.

13. Количественное определение иммуноглобулинов А-класса в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммуноферментного анализа и радиальной иммунодиффузии / Ездакова И.Ю., Борзенко Е.В., Феоктистова Т.А., Федоров Ю.Н. // Сельскохозяйственная биология,- 2002.-№ 2.-С. 118-122.

14. Ездакова И.Ю. Влияние Trypanosoma sp. на иммунокомпетентные клетки серебряного карася /Ездакова И.Ю., Борисова М.Н., Дьяконов Л.П. //Ветеринария.-2005 .-№ 12.-С. 28-31.

15. Ездакова И.Ю. Влияние зимозана на клетки крови серебряного карася (Carassius auratus gibelio)/ Ездакова И.Ю., Борисова М.Н. // Ветеринарная патология.-2007.-№ 2,- С. 205-207.

16. Ездакова И.Ю. Динамика иммунологических показателей стельных коров/ Ездакова И.Ю. //Ветеринарная патология,- 2007.-№ 2.-С. 148-151.

17. Ездакова И.Ю. Изучение морских млекопитающих - новое направление экологической иммунологии / Ездакова И.Ю., Соколова О.В. // Веткорм.-2008.-№ 4.-С. 14-15.

18. Ездакова И.Ю. Динамика розеткообразующих клеток кур в онтогенезе / Ездакова И.Ю., Чуйко О. М., Чадина Е.О. //Ветеринарная патология.-2008.-№ 2.-С. 62-64.

19. Ездакова И.Ю. Локализация [gM в B-клетках периферической крови крупного рогатого скота/ Ездакова И.Ю. // Аллергология и иммунология.- 2008,- Т. 9.- № 3.-С. 274.

20. Ездакова И.Ю. Корреляционный анализ иммунологических показателей при введении иммунотропных препаратов / Ездакова И.Ю.// Веткорм.-2009.-№2.-С. 1819.

21. Ездакова И.Ю. Динамика slgM-клеток и IgM-антител в периферической крови коров в период плодоношения / Ездакова И.Ю.// Аллергология и иммунология.-2009.-Т. 10.- № 2.-С. 295.

Научные работы в периодических изданиях, в материалах конференций и сборниках научных трудов

22. Иммуноферментный метод количественного определения IgA-изотипа в биологических жидкостях крупного рогатого скота / Феоктистова Т.А., Ездакова И.Ю., Федоров Ю.Н., Борзенко Е.В. // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Сб. науч. тр. - Щелково: ВНИиТИБП,- 2000. - С. 279281.

23. Разработка и совершенствование методов оценки B-системы иммунитета у животных / Верховский O.A., Феоктистова Т.А., Федоров Ю.Н, Ездакова И.Ю. и др. II Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Сб. науч.тр. - Щелково:ВНИиТИБП.- 2000. - С. 273-275.

24. Quantitation of total IgG-, IgM-, and IgA-secreting cells in mice immunized with live erysipelas vaccine and challenged with the virulent strain of Erysipelothrix rhusiopathiae/ Fedorov Yu.N., Zhadanov A.I., Verkhovsky O.A., Ezdakova I.Yu. //Sixth International Veterinary Immunology Symposium: Abstracts book.-2001.- 206.- P.174.

25. Количественная характеристика иммуноглобулинов А-класса в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммунохимического анализа /Борзенко Е.В., Ездакова И.Ю., Федоров Ю.Н., Феоктистова Т.А. // Труды ВИЭВ,- 2003,- Т. 73.- С. 217-221.

26. Ездакова И.Ю. Оценка иммуномодулирующей активности вакцины против рожи свиней (ВР-2) в процессе иммуногенеза / Ездакова И.Ю., Федоров И.Ю., Третьякова И.В. // Труды ВИЭВ,- 2003,- Т.73,- С. 200-204.

27. Моноклональные антитела к иммуноглобулинам класса А рогатого скота: получение, характеристика, применение / Феоктистова Т.А., Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю., Сологуб В.К. // Труды ВИЭВ.-2003,- Т. 73.- С. 197-200.

28. Ездакова И.Ю. Динамика показателей клеточного иммунитета при введении препаратов с иммунотропной активностью / Ездакова И.Ю., Третьякова И.В.// Материалы Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМ и Б им.К.И.Скрябина.- М: МГАВМиБ.-2004.-С. 190-194.

29. Влияние иммунотропных препаратов на иммуногенез при вакцинации. / Ездакова И.Ю., Федоров Ю.Н., Ханис А.Ю., Боряев Г.И. // «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее»: Сб.науч.тр.- Щелково:ВНИиТИБП .-2004.-С. 47-52.

30. Sokolova O.V.Adaptive changes of the serum immunoglobulins level in the black sea bottienose dolphin (Tursiops truncates)! Sokolova O.V., Denisenko Т.Е., Ezdakova I.Yu. // Marine Mammals and man in coastal ecosystem: Can they co-exist? : Abstracts book.-Gdynia:ECS.- 2006.- P. 180.

31. Ездакова И.Ю. Динамика мембранных s-Ig лимфоцитов мышей в процессе иммуногенеза /Ездакова И.Ю.// «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ.-2006.- С. 472-474.

32. Ездакова И.Ю. Фагоцитарная активность иммунокомпетентных клеток серебряного карася / Ездакова И.Ю. // «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ.-2006.- С. 475-477.

33. Ездакова И.Ю. Выявление иммуноглобулинов на мононуклеарных клетках лимфоидных органов мышей / Ездакова И.Ю. // «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях»: Сб. науч. тр.-Краснодар.- 2006.- С. 400-403.

34. Ездакова И.Ю. Определение уровня адгезивной активности лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота / Ездакова И.Ю. // «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»: Сб. науч.тр. - Щелково: ВНИиТИБП.-2006,- С. 157-160.

35. Ездакова И.Ю. Изучение иммунного статуса лабораторных мышей под влиянием пробиотиков / Ездакова И.Ю., Субботин В.В. // «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»: Сб. науч.тр. - Щелково: ВНИиТИБП.-2006,- С. 182-187.

36. Данилевская Н.В. Фармакологические эффекты пробиотика Лактобифадол при его назначении глубокостельным коровам / Данилевская Н.В., Ездакова И.Ю., Кудинов В.В.// Веткорм,- 2006.-№ 6.- С. 24-25.

37. Ездакова И.Ю. Динамика иммунокомпетентных клеток в процессе иммунного ответа на Т-независимые и Т-зависимые антигены / Ездакова И.Ю. // Ветеринарная медицина.- 2007.-№ 1.-С. 11-12.

38. Ездакова И.Ю. Определение показателей В-системы иммунитета телят/ Ездакова И.Ю. // Ветеринарная медицина.- 2007.-№ 4.-С. 10-11.

39. Ездакова И.Ю. Поверхностные иммуноглобулины В-клеток крови крупного рогатого скота / Ездакова И.Ю. // Ветеринарная медицина.- 2007.-№ 4.-С. 11-13.

40. The cross-reactivity of the blood serum albumens from Steller sea lion pups (eumetopias JUBATUS) / Ezdakova I.Yu., Sokolova О. V., Denisenko Т. E., Burkanov V. N. // Marine mammals in time: past, present and future: Abstract book.-Egmond aan Zee:ECS- 2008,- P. 191-192.

41. The Ladoga ringed seal (Pusa hispida ladogensis) as a species - indicator of the influence of global warming on the wild population of the marine mammals/ Sokolova O.V ., Lisitsina T. Yu., Ezdakova I.Yu., Denisenko Т. E. // Marine mammals in time: past, present and future: Abstract book.- Egmond aan Zee:ECS.- 2008,- P. 151-152.

42. Ездакова И.Ю. Иммуноцитохимический метод определения В-лимфоцитов / Ездакова И.Ю. //«Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел»: Сб. науч. тр,-М:ВИЭВ,- 2008.- С. 329-332.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 14.05.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2,0 Печать авторефератов: 730-47-74,778-45-60