Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Экспрессия генов цитокинов в клетках эритроидного ряда

На правах рукописи

ГА

I \

\ I и / 1у

| Гуськова Лариса Владимировна

V к

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ В КЛЕТКАХ ЭРИТРОИДНОГО РЯДА

14.00.36 "Аллергология и иммунология"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1995.

Работа выполнена в Институте клинической иммунологии СО РАМН

Научный руководитель: д.м.н., член-корр. РАМН Козлов ГчА. Официальные оппоненты:

д.б.а. Лавровский В.А. к.м.н. Киселев C.B.

Ведущая организация: Институт Иммунологии МЗМП РФ

р /п

Защита состоится № Ь п -

на заседании диссертационного совета Д 001.01.01 Института клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск 630091, Ядринцевская 14.

' С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ИКИ СО РАМН

Автореферат разослан

ноября 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

к.б.н. Кудаева О.Т.

Функционально зрелые клетки кроветворной и иммунной системы являются продуктами процессов пролиферации и диффе-ренцировки полипотентной стволовой кроветворной клетки в зрелые клеточные элементы, в ходе которых различные ростки кроветворения вовлечены в сложную сеть взаимодействий как на уровне межклеточных контактов, так и посредством различных сек-ретируемых факторов ( цр1Токинов).

В настоящее время считается установленным, что основными продуцентами цитокинов являются иммунекомпетентные клетки, при этом сами они в процессе созревания и функционирования подвергаются воздействию тех или иных цитокинов (Кетлинский С.А. и др., 1992; Чередеев А.Н., Ковальчук Л.В. 1989; Saeland S. et al., 1991; Sato N. et al., 1994; Savelkoul P. et al., 1990). Известно также, что цитокины продуцируют не только различные иммунокомпетентные клетки, но и клетки нервной системы, кожи, кератиноциты, фиброб-ласты, нейтрофиллы, гепатоциты, клетки эндотелия и др. (Argyris C.F., 1979; Kita М. et al., 1993; Lindermann A. et al., 1989; Means R.T. et al., 1992). Во многом, благодаря цитокинам, кроветворение представляет саморегулирующуюся систему, обуславливающую устойчивое поддержание гомеостаза организма в целом.

Данные о спектре влияния цитокинов на гемо- и иммунопоэз постоянно расширяются за счет описания новых свойств иммуно-медиаторов. Представление о цитокинах, как иммуномодуляторах, обладающих стимулирующими функциями, существенно расширилось с открытием различных супрессорнных свойств в отношении гемо- и иммунопоэза. Современные представления об плейот-ропных функциях важнейших цитокинов, изучение их взаимодействий особенно важны для изучения механизмов регуляции иммуно и гемопоэза.

Одним из направлений исследований является изучение взаимо-регуляторных влияний эритроидного и лимфоидного ростков кроветворения. Влияние лимфоидного ростка на эритроидный продемонстрировано достаточно широко, огромное место при этом отводится цитокинам (Haan G. et al., 1993; Keller J.R. et al., 1989; Keller J. et al., 1990). Однако, эритроидный росток может сам оказывать влияние на другие ростки кроветворения, в частности, на лимфоидный.

Установлено, что эритропоэз-стимулирующие воздействия, такие как острая гипоксия, фенилгидразин-индуцированная анемия приводят к накоплению в селезенке мышей популяции неспецифических супрессорных клеток, способных подавлять гуморальный иммунный ответ как in vivo, так и in vitro. Показано, что этими супрессорными клетками являются эритробласты (Козлов В.А. и др., 1984). Наличие эритроидных бластных клеток, обладающих иммуносупрессивными свойствами, наблюдается у мышей в эмбриональной печени и в селезенке новорожденных (Цырлова И.Г. и др., 1985). Установлено, что эритробласты способны подавлять как первичный IgM иммунный

ответ, так и вторичный IgG ответ (Сенников C.B., 1988). Также установлено, что эритробласты способны негативно влиять на процесс спонтанной и митоген-индуцированной пролиферации В клеток (Чеглякова В.В., 1982). Показано, что эритробласты стимулируют экзогенное колониеобразование клетками костного мозга (Сенников C.B., 1988). Синтез белка, но не ДНК и РНК является существенным для опосредуемой эритробластами иммуносупрессии. Властные клетки эритроидного ряда опосредуют свой иммуносупрессивный эффект на В-лимфоциты через секрецию растворимых факторов (Mitasov A.V. et al., 1991).

Нами было выдвинуто предположение о возможности цитокин-опосредуемого участия клеток эритроидной природы в регуляции ге-мопоэза.

Принимая во внимание отсутствие в мировой литературе данных об экспрессии цитокинов клетками эритроидного ряда и учитывая то, что иммуномодулирующие свойства эритробластов могут быть связаны с комплексным взаимодействием ряда цитокинов, наша работа имела поисковый характер.

Данные о экспрессии цитокинов эритроидными клетами могут быть особенно важными в изучении механизмов регуляции и взаимодействия эритроидного и лимфоидного ростков кроветворения.

Учитывая, что содержание эритроидных бластных клеток в нормальном костном мозге составляет 25% от всех ядросодержащих клеток, полученные данные об экспрессии ряда плейотропных цитокинов эритроидными клетками, позволяют по новому взглянуть на роль клеток эритроидного ряда в регуляции гемо- и иммунопоэза.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение экспрессии генов важнейших цитокинов в ядросодержащих эритроидных клетках мышей на различных стадиях онтогенеза, а также после эритропоэвозмущающих воздействий. В соответствии с этим были определены задачи исследования:

1. Отработать экспресс-метод определения матричных РНК с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.

2. Оценить экспрессию цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-б, ГМ-КСФ, ТФР-Ь, ИФН-g) в эритроидных ядросодержащих клетках , полученных из спленоцитов мышей

а. после воздействия острой гипоксии

б. после индуцированной введением фенилгидразина гемолитической анемии

в. у новорожденных

3. Изучить экспрессию тех же цитокинов в клетках отдельных эритроидных колоний, полученных из костного мозга взрослых и селезенки новорожденных мышей.

4. Исходя из полученных данных, провести сравнительный анализ экспрессии цитокинов в эритробластах мышей со стимулированным эритропоэзом.

Научная новизна результатов исследований.

Впервые проведено комплексное исследование экспрессии цитокинов в эритроидных ядросодержащих клетках.

Установлено, что клетки эритроидного ряда способны экс-прессировать гены некоторых цитокинов. Продемонстрировано наличие специфических мРНК ряда важнейших плейотропных цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ТФР-Ь в эритроидных ядросодержащих клетках из селезенки новорожденных мышей, а также в эритробластах после эритропоэзстимулирующих воздействий (острая гипоксия, фенил гидразин индуцированная анемия).

Установлено наличие мРНК ряда цитокинов в клетках единичных эритроидных колоний, образуемых клетками селезенки новорожденных и клетками костного мозга взрослых мышей. Показано наличие мРНК для ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ГМ-КСФ генов во всех эритроидных колониях. Колонии, полученные из клеток селезенки новорожденных мышей не содержали мРНК ИФН-§ и ТФР-Ь в отличие от колоний, выращенных из клеток костного мозга взрослых мышей.

Впервые показано, что эритробласты выделенные от мышей в различных моделях со стимулированным эритропоэзом качественно отличаются по наличию специфических мРНК для ГМ-КСФ и ИФН^.

Установлено, что уровень экспрессии мРНК цитокинов сопоставим, а для ТФР-Ь, ИФН^, ИЛ-1 даже превышает уровень экспрессии цитокинов спленоцитами мышей, иммунизированных ЭБ.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Полученные результаты расширяют представление об экспрессии генов цитокинов клетками различных органов и тканей, позволяют глубже понять взаимосвязи различных ростков кроветворения и их взаиморегуляцию. Факт экспрессии генов цитокинов клетками эритроидного ряда существенно дополняет и органически вписывается в понимание функционирования лимфоидного и эритроидного ростков кроветворения. Из представленных данных можно сделать вывод о возможности цитокин-опосредованного участия эритробла-стов в регуляции гемо и иммунопоэза.

Выяснение спектра экспрессии генов цитокинов в эритроидных клетках может быть полезно для разработки нового подхода к коррекции иммунного ответа в эксперименте и клинике, основанного на модуляции активности клеток эритроидного ростка.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Эритроидные ядросодержащие клетки, наряду с клетками лимфоидного, гранулоцитарного, моноцитарного, тромбоцитарного рядов способны экспрессировать мРНК некоторых цитокинов.

2. Эритробласты, полученные в различных моделях со стимулированным эритропоэзом качественно и количественно отличаются по наличию специфических мРНК цитокинов.

3. Разработанный подход оценки экспрессии генов цитокинов следует использовать для изучения функциональной активности иммунокомпетентных и других клеток как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях.

Апробация работы и публикации.

Апробация диссертации состоялась на расширенном семинаре ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 9 октября 1995). По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста, содержит 12 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Список цитированной литературы включает 178 источников, в том числе 34 работы отечественных автров.

Материалы и методы.

Животные. В работе использовались мыши СВА, C57BL/6 , полученные из питомника РАМН "Столбовая", самцы и самки в возрасте 3—4 месяца. Новорожденные мыши (CBAxC57BL/6)Fl были получены в нашей лаборатории. Гипоксию проводили в барокамере по 16 часов в течение 3 дней (6700м). Селезенки забирали на 4 день. Гемолитическую анемию у мышей вызывали внутрибрюшинным введением фенилгидразина (Cheng Т.С. et al., 1974). Селезенки забирали на 4 день. Селезенки новорожденных мышей забирали на 1—4 сутки постнатального периода.

Эритроидные ядросодержащие клетки получали из спленоцитов мышей после удаления макрофагов, Т- и В-клеток. Макрофаги удалялись прилипанием. В-клетки удалялись с помощью пенинга с кроличьими высокоаффинными антителами против иммуноглобулинов (анти-Ig) мыши ("Биосан"). Т-клетки удалялись с помощью моноклональных антител anti-Thyl.2 ("Cederlane") с последующим пенингом на чашках Петри, кроличьими высокоаффинными антителами против иммуноглобулинов (анти-Ig) мыши. Чистота выделения эритроидных бластных клеток контролировалась морфологически после окрашивания по методу Нохта-Максимова (Гольдберг Е.Д., 1992).

Эритроидные колонии выращивали с помощью предельного разведения клеток костного мозга взрослых и спленоцитов новорожденных мышей. Клетки культивировали в среде или в агаре в течение 10—15 суток с добавлением эритропоэтина (2 ЕД/мл) и кондиционных сред от культуры WEHI-3B. Тип колонии подтверждался морфологически, окрашиванием по Нохту-Максимову.

Суммарную РНК выделяли по методу (Chomozynski P., Sacchi ,n., 1987). Качество и полимерность выделенной РНК оценивали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле (Chemapol, Чехословакия), приготовленном на трис-ацетатном буфере. Спектральные характеристики РНК определяли на спектрофотометре "Милихром".

Реакция обратной транскрипции.

0,5мкг суммарной РНК "отжигали" с 0,5мкг oligo(dT)12—16 при 70°С 5 минут, охлаждали до комнатной температуры и хранили до реакции на льду. Реакционная смесь для проведения синтеза кДНК по РНК-матрице в ЮОмкл, содержала 0,5 мкг суммарной РНК, 0,5 мкг oIigo(dT)12—16, MnCh 2 mM, трис-HCl 20мМ (pH 8,3 при 25°С), KCl ЮОмМ, дитиотрейтол 50мМ (смесь готовили непосредственно перед использованием), 15ед-М-МиЬУ обратной транскрипта-зы (Сибэнзим, Новосибирск). Реакцию проводили в течение 1,5 часов при 37°С.

Праймеры к интерлейкину ИЛ-lb, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6, ГМ-КСФ (Ehlers S. et а!., 1992), ИЛ-5 (Svetic А. et al., 1991), ИФН-g, ТФР-b (Shire D., Staff E., 1993), ИЛ-la (Kennedy M.K. et al., 1992), и b-актину (Allen R.D., 1993) для полимеразной цепной реакции (ПЦР) были синтезированы согласно структуре описанной ранее.

Полимеразная цепная реакция.

ПЦР проводили в 20 мкл, наслаивая сверху 20 мкл минерального масла (Sigma, США). Реакционная смесь содержала 1—10 мкл смеси после реакции обратной транскрипции. Концентрация праймеров 2,5 мкМ каждого, концентрация dNTP 250 мкМ. Реакционный буфер содержал 67мМ трис-HCl (pH 8,3 при 25°С), 2 мМ MgCh, ЮмМ 2-меркаптоэтанола, 166мМ (NH4)2S04- Режим термоциклирования: 1 цикл — денатурация: 5 минут 95°С, отжиг: 5 минут 60°С и синтез: 5 минут 72 С. Затем вносили под масло 1 ед. Tag-pol. (Biopol, Москва) и проводили реакцию амплификации: 30 циклов: 0,5 минуты 95°С, 1 минута при 60°С и 1 минута при 72°С. Для клонов проводили до 60 циклов. Продукты амплифицирования анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле (Sigma, США), приготовленном на трис-ацетатном буфере. В качестве маркера молекулярного веса использовали Sau3A I или Mspl гидролизат плазмиды Рис 18. После проведения электрофореза гель окрашивали водным раствором бромистого этидия ( 0,5 мкг/мл ). Продукты полимеразной цепной реакции визуализировали и фотографировали в ультрафиолете. Негативы получали на фоюпленке "Изопан", сканировали на лазерном сканере. Для количественной оценки степени почернения фотопленки использовали программу PhotoStyller с распознаванием 256 оттенков серого цвета.

Статистический анализ.

Достоверность полученных результатов оценивали по критерию Стьюдента при Р<0,05, Р<0,01. В качестве оценки средней величины для нормального распределения использовали среднее арифметическое.

Везде в таблицах и в тексте даны значения средней и стандартной ошибки (М±т), на рисунках приведены доверительные интервалы при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

В нашем исследовании экспрессии генов цитокинов клетками эритроидного ряда мы использовали один из самых современных методов определения экспрессии генов на уровне мРНК — метод полимеразнои цепной реакции после обратной транскрипции (получения копии кДНК по матрице мРНК). Метод обладает рядом преимуществ: -

во-первых, высокой чувствительностью, позволяющей определить единичные молекулы мРНК в отдельных клетках, за счет получения множенственных копий с обратного транскрипта.

во-вторых, высокой специфичностью и возможностью анализа целого спектра мРНК, за счет использования в реакции амплификации специфических комплементарных олигонуклеотидных затравок к различным участкам кДНК известных цитокинов.

в-третьих, высокой воспроизводимостью и быстротой получения результатов, что особенно важно в условиях клинической лаборатории и при проведении научного иследования.

в-четвертых, после проведения реакции амплификации , количество ДНК достаточно для проведения рестрикционного анализа, сек-венирования, клонирования и т.д., что позволяет изучать механизмы регуляции сплаисинга и транскрипции мРНК цитокинов Суть метода отражена на рисунке 1.

МЕТОД

АМПЛИФИКЦИИ РНК.

1-106 КЛЕТОК

ВЫДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ РНК

ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ (ПОЛУЧЕНИЕ кДНК)

АТв

АКТИНр

-ИРНК ААААААА 3* -КДНК ТТТТТТТ 5' ОЛИГО(дТ)

Экспрессия цитокинов в эритроидных ялросодержащих клетках из селезенок мышей после гемолитической анемии, индуцированной введением фенилгидразина.

Введение интактным животным фенилгидразина, который является сильным гемолитическим ядом, вызывает достаточно быстрые и сильные изменения в клеточном составе гемопоэтических органов, в результате которых в селезенке мышей уже на 1—3 сутки после последнего введения фенилгидразина наблюдается резкая стимуляция эритропоэза (Richard К.A. et al., 1971; Dickerman H.W. et al., 1976).

Мы исследовали экспрессию мРНК различных цитокинов в эритробластах мышей после введения фенилгидразина. Для получения эритроидных ядросодержащих клеток из спленоцитов удалялись Т-, В-клетки, макрофаги, чистота выделенной популяции клеток конролировалась морфологически окрашиванием по Нохту-Максимову. Мы получили клетки на 90% состоящие из эритробла-стов, остальные 10% составляли малораспознаваемые бластные формы клеток.

При оценке иммуносупрессорных свойств популяции спленоцитов, обогащенных эритробластами, после введения мышам фенилгидразина, подавление пролиферации спленоцитов на ЛПС составляло 40%.

Мы обнаружили наличие мРНК ИЛ-1а, ИЛ-lb, ИЛ-4, ИЛ-6, ИФН-g, ТФР-Ь и отсутствие мРНК ИЛ-2, ИЛ-3, ГМ-КСФ и ИЛ-5 в популяции клеток, обогащенной эритробластами, после введения мышам фенилгидразина (рис. 2).

!Л

ю

I

со

I

CVÎ I

» со.

т-1 4-1

I I

аз s

Ь-1

U) I

I

QQ.

е

и

?Jd I

S

u.

oû. I

О.

e н

rc e s i

t

Рис,2. Результаты ПЦР анализа мРНК цитокинов в эритробластах мышей после введения фенилгидразина. Разделение продуктов реакции амплификации (30 циклов) в 2% агарозном геле. \l-Sau3A I гидролизат Рис18.

Известно, что особенностью данной модели является повышенное содержание в таких селезенках макрофагов, активно фагоцитирующих разрушенные фенилгидразином эритроциты и обладающих способностью стимулировать антителогенез (Громыхина Н.Ю., 1982). Известно, что активированные в процессе фагоцитоза макрофаги секретируют ряд цитокинов (Lord B.J., 1991), поэтому возможно, что реципроктные влияния макрофагов и эритробластов на антителогенез в данной модели могут осуществлятся на уровне экспрессии цитокинов.

Экспрессия цитокинов в эритроидных ядросодержащих клетках из селезенок мышей, подвергнутых воздействию острой гипоксии.

Одним из распространенных экспериментальных подходов для изучения влияния эритропоэза на иммуногенез и наиболее физиологичным является острая и хроническая гипоксия.

От мышей, подвергнутых воздействию острой гипоксии, нами была получена популяция спленоцитов, состоящая на 95% из эритроидных ядросодержащих клеток.«.

При исследовании влияния популяции спленоцитов, обогащенных эритробластами, на пролиферацию спленоцитов, стимулированных ЛПС; подавление пролиферации составляло 57%.

Было обнаружено полное совпадение спектра мРНК в популяции спеноцитов, обогащеных эритробластами, от мышей после острой гипоксии и после введения фенилгидразина. В "гипоксичных" эритробластах присутствовали мРНК ИЛ-1а, ИЛ-lb, ИЛ-4, ИЛ-6, ТФР-Ь, ИФН-g. Экспрессии ИЛ-2, ИЛ-3, ГМ-КСФ и ИЛ-5 (рис.3) не показано.

!ё - »

I

«=; ж

со. со с\г

тН 1 I

I «=? >=;

ц s s

^ щ ю са в

I I I I I о

(=! е? tst О.

S ЙС

X! Ы «©• I ж г

32 Я

н

I

со.

Рис.3. Результаты ПЦР анализа мРНК цитокинов в эритробластах мышей, подвергнутых воздействию острой гипоксии. Разделение продуктов реакции амплификации (30 циклов) в 2% агарозном геле. М-5аиЗА 1 гидролизат Рис18.

Итак, с помощью метода ПЦР РНК мы показали, что эритробла-сты, полученные от взрослых мышей в различных моделях, со стимулированным эритропоэзом, содержат мРНК следующих цитокинов: ИЛ-1а, ИЛ-lb, ИЛ-4, ИЛ-6, ИФН-g, ТФР-Ь.

Можно предположить, что установленные для эритробластов иммуносупрессорные свойства могут быть непосредственно связаны с экспрессией ТФР-b и ИФН-g.

Экспрессия цитокинов в эритроидных ядросодержащих клетках из селезенок новорожденных мышей.

Для получения эритроидных ядросодержащих клеток кроме используемых модельных ситуаций: введение фенилгидразина или воздействие острой гипоксией, часто используют модель с физиологически стимулированным эритропоэзом — клетки эмбриональной печени зародышей 11 —12 дня и клетки селезенки новорожденных мышей 0—3 дня после рождения. Известно, что селезенка у мышей и крыс в период эмбриогенеза является активным органом эритропоэза, который наблюдается в селезенке до 3 дня после рождения (Rencricca N.J. et al., 1976).

Иммуносупрессорные свойства эритробластов из селезенки новорожденных мышей продемонстрированы различными исследователями (Чеглякова В.В., 1982; Argyris С. et all., 1979; Pavia C.S., Stites P.D., 1979; Rodriquez G. et al., 1979; Piquet P.F. et al., 1987). Предполагая, что иммуномодулирующие эффекты эритробластов во многом могут быть связаны с экспрессией цитокинов и, что спектр цитокинов в эритроидных клетках может меняться в онтогенезе, мы исследовали наличие специфических мРНК цитокинов в эритробла-стах, полученных из селезенок новорожденных мышей.

Выделенная нами популяция спленоцитов из селезенок новорожденных мышей содержала 85% эритроидных бластных клеток. Данная популяция клеток подавляла пролиферацию спленоцитов, стимулированных Л ПС, на 40%.

Нами показаны качественные отличия экспрессии мРНК ГМ-КСФ и ИФН-g в популяции спленоцитов, обогащенных эритробла-стами, из селезенок новорожденных мышей, с одной стороны, и после фенилгидразина или гипоксии, с другой стороны.

Эритробласты селезенки новорожденных мышей содержали мРНК ГМ-КСФ, мРНК ИФН-g не обнаружена, кроме этого, также как и в предыдущих исследованных популяцих спленоцитов, было показано наличие мРНК ИЛ-1а, ИЛ-lb, ИЛ-4, ИЛ-6, ТФР-b и отсутствие мРНК ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-5 (рис.4).

т * d

шИ

w»

I * ~

w»

Ö ca.

41

Рис.4. Результаты 11ЦР анализа мРМК цитокинов в эритробластах новорожденных мышей. Разделение продуктов реакции амплификации (30 циклов) в 2% агарозном геле. M-Sau3A I гидролизат PuelS.

Возможно, полученные нами качественные отличия в экспрессии цитокинов в эритробластах из селезенки новорожденных и из селезенки "фенилгидразнновых" и "гипоксичных" мышей отражают различное состояния данных клеток в процессе онтогенетического развития организма. В отличие от селезенок, полученных от мышей после введения фенилгидразина или подвергнутых воздействию острой гипоксии, где идет запрос в первую очередь на эритропоэз, селезенка новорожденных мышей является не только органом с повышенной активностью эритроидного ростка, но и органом, где происходит активное формирование всех ростков кроветворения, поэтому наличие мРНК ГМ-КСФ в спленоцитах новорожденных мышей, обогащенных эритробластами, может быть важным для становления гранулоцит-макрофагального и других ростков кроветворения.

Отсутствие мРНК ИФН-g, обладающего различными иммуносуп-рессорными свойствами, в эритробластах новорожденных мышей может быть важным именно в период раннего онтогенеза, когда формируется иммунная система.

Наши данные об отсутствии мРНК ИФН-g, согласуются с данными работы (Kita М. et al., 1993), где, с помощью метода блот-гибридизации РНК, показано отсутствие экспрессии этого цитокина в спленоцитах новорожденных мышей в течение первых трех суток после рождения. Авторы показали появление мРНК ИФН-g только после стимулирования спленоцитов ИЛ-2.

■

I

\i со

I I

Tjt Ю 1Г> I I I

5 5 5

>©•

0 bä

1

со. аз

I

си н

S

f-H

со.

I

5

Я

Экспрессия генов цитокинов в отдельных эритроидных колониях.

Несмотря на то, что нам удалось получить популяцию спле-ноцитов на 95% состоящую из эритробластов, вопрос о вкладе лимфоцитов, макрофагов, гранулоцитов, для которых показано наличие мРНК исследуемых цитокинов, оставался решенным не полностью. Без получения чистых популяций эритроидных клеток, утверждение об экспрессии мРНК цитокинов клетками эритроидной природы могло вызвать ряд возражений. Поэтому следующим этапом данной работы было получение эритроидных колоний, не содержащих примеси других клеток.

В связи с тем, что у мышей с возрастом органы активного ге-мо(эритропоэза) изменяются: у новорожденных это селезенка, а у взрослых — помимо селезенки, это костный мозг, для получения эритроидных колоний были использованы клетки костного мозга взрослых мышей, в одном случае, и клетки селезенок новорожденных мышей, в другом случае. С помощью предельного разведения клеток и дальнейшего культивирования с добавлением эритропо-этина и кондиционных сред от культуры клеток \VEHI-3B ( источника ИЛ-3) были выращенны отдельные колонии, состоящие из эритроидных клеток.

Через 15—20 дней культивирования, под микроскопом в колониях можно было наблюдать наличие гемоглобина, при окрашивании клеток было показано, что колонии состояли из ядро-содержаших эритроидных клеток без примеси других клеток.

При исследовании экспрессии генов цитокинов в клетках эритроидных колоний, полученных из клеток костного мозга взрослых мышей мы обнаружили мРНК ИЛ-1а, ИЛ-1Ь, ИЛ-4, ИЛ-6, ГМ-КСФ, ТФР-Ь, и ИФН^. мРНК ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-5 не установлено (рис.5).

«

е<

0 и

1

ГЕ

1ч

аз я

I

со.

со со. I

с; К

I

е; я

а со <м

тН | |

| <=; (=;

5 к к к

К ей СЧ Ю

■е I г I I

ко. в; с?

| ¡2ц ¡22

Рис.5. Результаты ПЦР анализа мРНК цитокинов в клетках эритроидных колоний (2000 клеток), выращенных из клеток костного мозга взрослых мышей. Разделение продуктов реакции амплификации в 2% агарозном геле после проведения 60 циклов реакции. М1- Рис18/ БаиЗЛ I, М2- Рис18/ Мер I

При исследовании эритроидных колоний, выращенных из клеток селезенок новорожденных мышей, было показано наличие мРНК ИЛ-1а, ИЛ-1Ь, ИЛ-4, ИЛ-6, ГМ-КСФ, но не ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-5, ТФР-Ь, ИФН^ (рис.6).

15—17-ти дневные эритроидные колонии, образуемые спле-ноцитами новорожденных мышей отличались от эритробластов, полученных из селезенки новорожденных отсутствием детектируемого уровня мРНК ТФР.

Эти различия могут быть связаны с тем, что эритробласты находятся в селезенке в определенном клеточном окружении и взаимодействии с клеткал других ростков кроветворения. Ппи выращивании колоний, условия культивирования несомненно влияют на функциональное состояние клеток и, следовательно, на экспрессию различных генов.

Все исследованные нами клетки эритроидных колоний различного происхождения содержали мРНК важнейших плейотропных цитокинов: ИЛ-1а, ИЛ-1Ь, ИЛ-4, ИЛ-6, ГМ-КСФ.

В клетках эритроидных колоний из спленоцитов новорожденных мышей, также как и в спленоцитах, обогащенных эритробластами, новорожденных мышей не обнаружена экспрессия ИФН^. По-видимому, это может быть связано с определенным состоянием клеток эритроидной природы в период раннего онтогенеза.

СЭЛ

ä C\¡ C£L ocx.

тН т-1 1 e

1 1 Du Ä

5 f=i e i

ж tss f-H

lílWriiSiriiocgn^ I SS X О III I

5 bei 5 5 ^

ЭЙ I s s я я

s u,

Рис.6. Результаты ПЦР анализа мРНК цитокинов в клетках эритроидных колоний (2000 клеток), выращенных из клеток селезенки новорожденных мышей. Разделение продуктов реакции амплификации в 2% агарозном геле после проведения 60 циклов реакции. Ml— Рис18/ Sau3A I, М2— Рис18/ Msp I. 1— Ь-актин в клетках эритроидных колоний из костного мозга взрослых мышей, 2— b-актин в клетках эритроидных колоний из селезенки новорожденных мышей.

Сравнение экспрессии цкфокинов в эритроидных клетках с уровнем экспрессии в спленоцитах мышей, иммунизированных ЭБ.

Чувствительность метода ПЦР РНК для используемых нами праймеров очень высока и позволяет обнаружить 10" мкг ДНК, что было показано нами при использовании плазмиды pMus, содержа-шей в полилинкере праймеры цитокинов и предоставленной нам D.Shire. Для оценки уровня экспрессии мРНК в анализируемых эритроидных клетках было важно сравнить количество мРНК цигокинов в эритроидных клетках с таковым в популяции клеток, для которых данным методом установлено содержание мРНК цитокинов.

Известно, что при определенных воздействиях в спленоцитах мышей наблюдается высокий уровень экспрессии различных цитокинов.

В частности для мышей C57BL/6J, иммунизированных ЭБ, показано наличие высокого уровня мРНК ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ФНО-а, ЛТ, ИФН-g, ТФР-b в клетках селезенки (Kita М. et al., 1993). Представлялось интересным провести сравнительный анализ содержания мРНК этих цитокинов в спленоцитах иммунизированных мышей и в эритроидных ядросодержащих клетках.

РНК выделяли из такого же количества клеток, как в моделях со стимулированным эритропоэзом (10 клеток). Реакцию обратной транскрипции проводили для 0,5 мкг суммарной РНК. В реакции аплификации использовали исходно одинаковое количество кДНК, чему соответствовало равное содержание "маркерной" ДНК — Ь-актина. На рис. 7. представлены количественные отличия содержания кДНК цитокинов. Количество ДНК после проведения реакции амплификации, выраженное в единицах "Gray", определяли по почернению фотопленки, используя программу PholoSlyller. Содержание кДНК цитокинов в спленоцитах мышей иммунизированных ЭБ принято за единицу.

ИЛ-U ИЛ-lf. ИЛ-4 ИЛ-6 ГМ-КСФ ТФР(5 ИФН-^

Рис.7. Сравнение количества кДНК цитокинов в эритробластах, полученных в различных моделях со стимулированным эритропоэзом, с кДНК цитокинов в спленоцитах мышей, иммунизированных ЭБ.

1 — эритробласты из селезенок новорожденных мышей

2 — эритробласты из селезенок мышей после введения фенилгидразина

3 — эритробласты из селезенок мышей, подвергнутых воздействию острой гипоксии

4 — спленоциты иммунизированных мышей

Из рис.7, видно, что уровень экспрессии изученных цитокинов в эритробластах, полученных в моделях со стимулированным эритропоэзом ростком, сравним, а для ИЛ-1, ИЛ-4, ТФР-Ь, ИФН^ превышает уровень экспрессии цитокинов в клетках селезенки мышей, иммунизированных ЭБ.

Эритробласты новорожденных мышей содержали ДНК ИЛ-1а в 2 раз больше, а ТФР в 4 раза больше, чем спленоциты иммунизированных мышей. Содержание ДНК ИФН^ в эритробластах взрослых мышей превышало количество ДНК ИФН^ в спленоцитах иммунизированных мышей, кроме того эритробласты мышей после введения фенилгидразина содержали кДНК ТФР в 2,5 раз больше, чем сленоциты иммунизированнных мышей. Эритробласты, полученные во всех моделях характеризовались высоким уровнем ДНК ИЛ-4.

Высокое содержание мРНК цитокинов в эритроидных ядросодер-жащих клетках, сопоставимое с уровнем мРНК в активированных иммунизацией спеноцитах, может служить еще одним подтверждением, выдвинутой выше гипотезы о возможном цитокин-опосредо-ванном участии эритробластов в регуляции иммунопоэза.

Таким образом было показано, что эритроидные ядросодержащие клетки различного происхождения содержат мРНК цитокинов: ИЛ-1а, ИЛ-1Ь, ИЛ-4, ИЛ-6, ГМ-КСФ, ТФР-Ь, ИФН-я. Экспрессии ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-5 нами не обнаружено. Отсутствие экспрессии данных цитокинов согласуется с известными иммуносупрессорными свойствами эритробластов.

ИЛ-2 обладает мощным, поддерживающим пролиферацию активированных В-клеток, действием. Доказано, что пролифе-ративное действие ИЛ-2 сочетается со способностью усиливать синтез иммуноглобулинов. Отсутствие экспрессии ИЛ-2 в эритроидных клетках согласуется с их иммуносупрессорными свост-вами в отношении В-клеток.

Кроме того, отсутствие экспрессии ИЛ-2 в эритробластах может указывать на то, что иммуносупрессорное влияние данных клеток, по-видимому, не реализуется через индукцию Т-супрессоров.

ИЛ-3 является единственным фактором, который активирует к синтезу гистамина гемопоэтические клетки в процессе реакции отторжения трансплантанта (Кетлинский С.А. и др., 1992). Для эритроидных ядросодержащих клеток ранее было показано отсутствие влияния на РТПХ, что находится в соответствии с полученными в настоящем исследовании данными об отсутствии мРНК ИЛ-3 в эритробластах.

ИЛ-5 является обязательным условием дифференцировки В-лимфоцитов в ^-сек ротирующие клетки. Показано, что у мышей (в отличие от человека) ИЛ-4 сам по себе не индуцирует ^01 и ^Е секрецию, что происходит только в комбинации с ИЛ-5. Поэтому наличие в эритробластах экспрессии ИЛ-4 и способность подавлять синтез не являются взаимоисключающими, благодаря отсутсгию ИЛ-5.

Ранее показано, что эритробласты обладают способностью стимулировать колониеобразование клетками костного мозга в селезенке. Представленые в работе данные об экспрессии мРНК ИЛ-1, ИЛ-6, ГМ-КСФ в клетках эритроидной природы указывают на то,

что стимулирующий эффект клеток эритроидного ростка на стволовые кроветворные клетки, возможно, проявляется через экспрессию данных цитокинов.

Полученные нами данные об экспрессии мРНК ряда важнейших плейотропных цитокинов в клетках эритроидного происхождения позволяют по-новому взглянуть на роль эритробластов в гистогенезе кроветворной ткани. Способность эритробластов к экспрессии цитокинов наряду с Т- и В- клетками, макрофагами ставит их в единый ряд важнейших регуляторных клеток в системе гемо и иммунопоэза.

Заключение.

В настоящее время получены убедительные доказательства активного механизма взаимоотношений между различными ростками кроветворения. Центральное место в регуляции кроветворения отводится цитокинам.

Оказалось, что подобно тому, как клетки различных ростков кроветворения осуществляют контроль за пролиферацией и диффе-ренцщювкой гемопоэтических клеток, клетки эритроидного ряда способны влиять как на стволовую кроветворную клетку, так и на клетки других ростков кроветворения.

Идентификация эффектов эритроидных супрессорных клеток,

.ученных в самых разнообразных моделях (гипоксия, введение фс^ллгидразина, селезенка новорожденных) позволила отнести их к естественным супрессорным клеткам. Можно отметить, что естественные супрессорные клетки при различии в происхождении обладают рядом общих свойств:

1. осуществляют ингибиторное действие дистантно, посредством выделения супрессорнного фактора (факторов)

2. мишенями служат активно пролиферирующие клетки

3. это не зрелые, а бластные формы клеток

4. их активация происходит при стимулировании гемопоэза. Складывается впечатление, что на определенном этапе диффе-ренцировки бластные формы клеток различных ростков кроветворения, в частности эритроидного, приобретают супрессорные свойства, физиологическая роль которых заключается в регуляции гемо и иммунопоэза по типу обратной связи.

Представленные в данной работе данные показывают, что регуля-торные свойства эритроидных ядросодержащих клеток в отношении других ростков кроветворения могут быть связаны с экспрессией цитокинов.

Мы исследовали экспрессию важнейших цитокинов в популяциях спленоцитов мышей, обогащенных эритроидными ядросодержащими клетками, полученных в различных моделях со стимулированным эритропоэзом. Кроме этого, была проанализирована экспрессия цитокинов в отдельных клетках эритроидных колоний, полученных из клеток костного мозга взрослых мышей и из спленоцитов ново-

рожденных. Анализ мРНК цитокинов из небольшого количества клеток (100-3000) стал возможен с постановкой и оптимизацией современного, высоко чувствительного метода амплификации РНК.

Впервые было показано наличие мРНК цитокинов: ИЛ-1а, ИЛ-1Ь, ИЛ-4, ИЛ-6, ГМ-КСФ, ТФР-Ь, ИФH-g в клетках эритроидного происхождения. В связи с этим становится возможным объяснение некоторых иммунорегуляторных свойств эритробластов через экспрессию конкретных цитокинов.

Экспрессия цитокинов в эритроидных клетках, полученных из различных органов, отличается, так как спектр мРНК цитокинов в эритроидных колониях, полученных из клеток селезенок новорожденных мышей отличался от спектра мРНК цитокинов эритроидных колоний, полученных из клеток костного мозга взрослых мышей. Отличия выражались в отсутствии экспрессии иммуносупрессорных цитокинов: ИФН^, ТФР-Ь в эритроидных колониях, полученных из спленоцитов новорожденных мышей.

Эритробласты новорожденных мышей отличались от эритробластов взрослых мышей со стимулированным эритропоэзом тем, что содержали мРНК ГМ-КСФ. мРНК ИФН^ мы не обнаружили. При стимулировании эритроидного ростка фенилгидразином и острой гипоксией в эритробластах определялась мРНК ИФН^, но не ГМ-КСФ. Эти данные могут отражать различные функциональные состояния клеток эритроидной природы в условиях стимулированного гемопоэза в целом и отдельно стимулированного эритроидного ростка.

Количество кДНК ИЛ-1а, ИЛ-6 и ТФР-Ь после реакции амплификации в эритробластах из селезенок новорожденных мышей в 5 раз больше, чем в эритробластах, полученных из селезенок мышей, подвергнутых воздействию острой гипоксией и в 2 раза больше, чем в эритробластах, полученных после введения мышам фенилгидразина.

Отличия в экспрессии генов цитокинов эритробластами в исследуемых моделях со стимулированным эритропоэзом могут быть связаны с различными механизмами активации эритроидного ростка в раннем постнатальном периоде, когда идет становление иммунной системы и формирование всех ростков кроветворения, и при различных воздействиях стимулирующих в основном эритроидный росток.

Основная роль в реализации иммуносупрессорных свойств эритробластов новорожденных мышей, по-видимому, принадлежит ТФР-Ь.

Наличие высокого уровня экспрессии ТФР-Ь и ИФН^ в эритробластах, полученных из селезенок взрослых мышей со стимулированным эритропоэзом позволяет предположить, что способность этих клеток подавлять спонтанную и митоген индуцированную пролиферацию В-клеток, может быть непосредственно связана с данными иммуносупрессорными цитокинами.

ИФН^ обладает выраженным костимулиругощим диффе-ренцировку В-лимфоцитов действием. Однако, известно, что гамма-интерферон действует только в присутствии ИЛ-2.

Кроме иммуносупрессорных свойств в отношении В-клеток, установлено, что эритробласты способны оказывать стимулирующие воздействия на различные гемопоэтические клетки. Показано, что эритробласты стимулируют колониеобразующую активность стволовых кроветворных клеток костного мозга.

Доказано, что важнейшими дитокинами, обладающими способностью стимулировать пролиферацию стволовой кроветворной клетки, являются ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-3, ГМ-КСФ. Полученные нами данные по экспрессии ИЛ-1, ИЛ-6, ГМ-КСФ клетками эритроидной природы указывают на возможность стимулирования колониеобразующей активности стволовоклеточных элементов посредством важнейших цитокинов.

Известные два эффекта клеток эритроидного происхождения на антителогенез и на стволовые кроветворные клетки, по-видимому, взаимосвязаны, так как способность эритробластов увеличивать количество экзогенных колоний (8—9 сутки), большинство из которых, являются эритроидными колониями, с одной стороны, уменьшает дифференцировку стволовых клеток в лимфопоэз, за счет преимущественной дифференцировки в эритропоэз, а с другой — ведет к образованию большого количества эритробластов, которые непосредственно подавляют пролиферацию В-лимфоцитов.

Безусловно, что наиболее полное представление об экспрессии цитокинов можно получить исследуя как мРНК, так и белок. Тем не менее, можно заметить, что исследование экспрессии цитокинов в эритроидных клетках на уровне мРНК более специфично и логически предшествует анализу продукции с помощью антител. Полностью ответить на вопрос о цитокин-опосредованном участии клеток эритроидного ростка в регуляции гемо и иммунопоэза станет возможным после проведения экспериментов с использование антител к цитокинам, экспрессия которых на уровне мРНК доказана.

Факт обнаружения высокого уровня экспрессии цитокинов эритроидными клетками позволяет по-новому оценить вклад эритроидных клеток в регуляцию иммуно и гемопоэза.

Выводы.

1. Оптимизирован и адаптирован для использования в клинической лаборатории современный высокоспецифичный метод определения содержания мРНК цитокинов в небольшом количестве клеток. Данный подход может быть использован при решении различных фундаментальных и прикладных научных проблем.

2. Эритроидные ядросодержащие клетки выделенные из селезенок мышей с гиперплазией эритроидного ростка (новорожденные, после

острой гипоксии, после введения фенилгидразина) содержат мРНК следующих цитокинов: ИЛ- 1а, ИЛ-lb, ИЛ-4, ИЛ-6, ГМ-КСФ, ТФР-Ь, ИФН-g. Содержание специфических мРНК цитокинов в эритроидных клетках сопоставимо с уровнем мРНК соответствующих цитокинов в спленоцитах иммунизированных мышей. мРНК ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-5 не обнаружено.

3. Эритроидные клетки, полученные в моделях с различными механизмами стимуляции эритропоэза, качественно отличаются по спектру мРНК цитокинов. В эритроидных клетках, выделенных из селезенки новорожденных мышей, показано наличие мРНК ГМ-КСФ и отсутствие мРНК ИФН-g. В эритроидных клетках селезенки мышей после эритропоэзвозмущающих воздействий (острая гипоксия, фенилгидразин-индуцированная анемия) — наоборот, обнаружена мРНК ИНФ-g и не определяется мРНК ГМ-КСФ.

4. Факт экспрессии генов цитокинов эритроидными ядросодер-жащими клетками подтвержден в клетках единичных эритроидных колоний, т.к. показано наличие мРНК ИЛ-1а, ИЛ-lb, ИЛ-4, ИЛ-6, ГМ-КСФ, ИФН-g, ТФР-b в отдельных эритроидных колониях, образуемых in vitro клетками костного мозга взрослых и спленоцитами новорожденных мышей.

5. Наличие высокого уровня экспрессии важнейших иммунорегу-ляторных медиаторов в ядросодержащих клетках эритроидной природы указывает на то, что цитокины являются одним из возможных механизмов, участвующих в формировании иммунорегулятор-ных свойств эритроидных клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Sennikov S.V., Guskova L.V., Samarin D.M., Kozlov V.A. Expression of cytokines genes in erythroid cells. // XIII Meetting of the Interna tional Society of Haematology.—Instanbul, Turkiye.— 1995.—p. 201.

2. Сенников C.B., Гуськова Л.В., Козлов В.А. Регуляция функциональной активности стволовых кроветворных клеток костного мозга эритроидными клетками у мышей.//Тез. докл. в сборнике "Идеи И. И. Мечникова в развитии современного естествознания" Международная научная конференция, посвященная 150-летию со дня рождения И. И. Мечникова.— Харьков (ноябрь), 1995.—С. 247.

3. Козлов В.А., Сенников C.B., Гуськова Л.В., Кашлакова Н.В., Чеглякова В.В. К механизму иммунорегуляторного действия эритроидных клеток. / / Тез. докл. в сборнике "Идеи И. И. Мечникова в развитии современного естествознания" Международ-

ная научная конференция, посвященная 150-летию со дня рождения И. И. Мечникова.—Харьков (ноябрь), 1995.—С. 140.

4. Козлов В.А., Сенников C.B., Гуськова JI.B., Сенникова Ю.А. Экспрессия генов основных медиаторов иммунной и кроветворной систем у лиц, подвергшихся радиационному воздействию. / / Вестник научной программы "Семипалатинский полигон — Алтай", 1995.— N 2.—С. 58—64.

Зак. 76. Тир. 100. Формат 64x841/16. Бумага №1.

Типография СО РАМН. ул. Ак. Тимакова, 9. 1995 г.