Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Закономерности модулирования иммунного ответа при экспериментальной анаэробной инфекции, вызванной клостридиями перфрингенс

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НИИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи

Шепелев Александр Алексеевич

ЗАКОНОМЕРНОСТИ МОДУЛИРОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ АНАЭРОБНОЙ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ КЛОСТРИДИЯМИ ПЕРФРИНГЕНС

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Москва - 1995 г.

Рабата выполнена в Астраханском государственном медицинском институте.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Л.В.Ковальчук, доктор медицинских наук, профессор В.М.Земсков, доктор медицинских наук С.С Афанасьев.

Ведущая организация - НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова.

Защита диссертации состоится "_"_„195

г. в __ часов на заседании специализированного совсп

Д.084.66.02 в НИИ физико-химической медицины Минздра медпрома РФ по адресу: 119828, г.Москва, ул-М-Пироговска: 1А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИ1 физико-химической медицины.

Автореферат разослан " 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Л Л.Васильева

Лктуа.1ыюсть темы. Одними ш наиболее широко распростра-нными н природе микроорганизмами являются клострндми перфрин-IIC. Этим обусловлена высокая инфицированность ими, что при нагели соответствующих условий приводит к развитию патологическо-процесса (P.C.Волкова с соавт., 1981; С.Г.Белов, 1985; В.Д.Беляков, Х.Яфаров, 1989; Л.И.Фрепдин, А.А.Шепелёв, 1991; D.E.Fry е.а., 1981; , Sakauguchi е.а., 1983).

Haute всего клостридии псрфрингенс ассоциируются как возбу-¡тели анаэробной газовой гангрены (Д.А.Арапов, 1972; Ю.Г.Шапош-IKOB с соавт., 1984; А.П.Колесов с соавт., 1989). Не оправданным явдя-ся принижение их роли в формировании этого патологического про-сса, так как они высеваются до 50-90% случаев заболевания (Г.С.Баров, 1986; И.Я.Макшанов, 1990). Этиологическим фактором газовой [фекшш могут служить не только клостридии перфрингенс экзоген-(10 происхождения, но и представители нормальной микрофлоры же-дочно-кишечного тракта и половых путей женщин при появлении их микроорганизмов в несвойственных для них местах обитания ..А.Вильцашок с соавт., 19S3; И.В.Иванов, А.Ш.Межиковский, 1984; .И.Иващенко, 1989; З.С.Писковец с соавт., 1989; P.J.Derkers, 1982; R.Reddy е.а., 1982; S. Bohrer, J.Bodino, 1983).

Наиболее благоприятными условиями для развития заболевания ляется наличие массивного повреждения тканей, но и незначитель-.ie травмы, в том числе и медицинские вмешательства, могут приво-ггь к его формированшо (И.К.Караев, 1975; В.Ф.Цыгалко, 1983; .Апшмоп, У.Р.Калиев, 1984; И.И.Кулевшпс с соавт., 1985; Н.И.Пуш-рев, В.И.Парфенов, 1985; J.A.Breslin е.а.,1978; C.T.Durkee, 1981; .VV.Kizer, L.C.Ogle, 1981; B.G.Yangco, B.F.Germain,1982). Описаны учаи газовой гангрены без видимых входных ворот и источника за-1жения (R.M.Nelson е.а., 1985; C.W.Kaizer е.а., 1986; M.Takevama, '86). Инфекция может не иметь специфических клинических проявле-iii (С.Г.Белов, 1985; A.A.Петраков, 1987). При целенаправленном по-:ке у больных с различной патологией часто обнаруживается клост-гдиальная бактериемия (J.Silva, 1976; S.L.Gorbach, 1978; M.D.Tilson, '82; R.M.Nelson е.а., 1985).

Взаимодействие иммунной системы с микроорганизмами и пролетами их жизнедеятельности не может не влиять на возникновение, (звитие и исходы паталогического процесса, актуальным является ¡учение механизмов изменений иммунного статуса и модифицирова-ie иммунного ответа инфекционными агентами (Н.Б.Беклемшяев, >86; Л.В.Ковалъчук, А.Н.Чередсев, 1986; В.ПЛозовой, 1988; А.И.По-ж с соав г., 1991; В.Ф.Лавров с соавт., 1991; И.Б.Семенов, А.К.Акатов,

1991; R.J.Eli», 1982; J.L.Turk, 1982; J.C.Petit e.a., 1983; R.A.Fox, 1987; S.H.B.Kanfmann, M.RôllinghoiT, 1989). ,

Многочисленные публикации, посвященные иммунологическому реагированию при анаэробной газовой инфекции, раскрывают в основном только вопросы антитоксического иммунитета. Практически отсутствуют сведения о механизмах взаимосвязи и взаимозависимости формирования, течения, исходов заболевания и состоянием иммунной системы, о наличии которых свидетельствуют клинические наблюдения. Известно, что газовая гангрена чаще развивается при снижении напряженности иммунитета и естественной резистентности ( Е.В.Матвеев с соавт., 1985; Ю.Н.Левашов, 1985; Л.Г.Баженов, Х.И.Исхакова, 1986), у иммунокомпроментированных больных со злокачественными новообразованиями (M.L.Burrell e.a., 1980; JJ.Pietrafitta, P.J.Deckers, 1982; S.Grutzmeier, 1981; M.Takeyama, 1986), у алкоголиков и наркоманов (D.E.Fry, 1981; A.Trilla, J.M.Gatell, 1986). Вероятно, что определенную роль в развитии анаэробной газовой инфекции как осложнения механического повреждения. тканей играют изменения иммунного статуса, наличие которых при травме общеизвестно (В.И.Говалло с соавт., 1985; Ю.А.Блинков с соавт., 1987; В.А.Череш-нев, К.В.Шмагель, 1989; И.И.Долгушин с соавт., 1980; E.A.Farina e.a.,1984; A.Rodolico e.a., 1984; E.Faist e.a., 1988; R.Massel e.a., 1988; L.Woiowiska e.a., 1988). Инфекции при травме являются не только следствием, но и причиной иммунодефицитных состояний, усугубляющих течение патологического процесса (Г.М.Дизик с соавт., 1981; А.Е.Каплан, 1981; В.А.Долгашнс соавт., 1982; А.В.Николаев с соавт., 1988; P.Ronconi е.а., 1984).

Цель работы. Выявить закономерности влияния экспериментальной анаэробной инфекции, вызванной клостридиямн перфрингенс типа А, на кинетику первичного иммунного ответа в зависимости от массивности инфицирования поврежденных тканей возбудителем, периода развития патологического процесса, состояния популяции антителооб-р а чующих клеток в различные фазы иммуногенеза и природы антигенного раздражителя с учетом действия естественного фактора, ингиби-рующего активность антител класса М.

Задачи исследования. 1 .Изучить временные и количественные характеристики иммуномодулирующего влияния экспериментальной анаэробной инфекции, вызванной клостридиямн перфрингенс типа А, на первичный иммунный ответ.

2. Изучить кинетику формирования популяции антителообра-зующих клеток на эритроциты барана при инфицировании механической травмы клостридиямн перфрингенс типа А.

3. Дать характеристику влияния анаэробной газовой инфекции 1 антителогенез в системе первичного иммунного ответа на гаптен, ншогированньш с тнмуснезависимым и тимусзависимым носителя-1.

4. Определить возможность формирования при механической >авме мягких тканей и их инфицирования клострндиями перфрингенс [па А пммуиодефнцитпого состояния, обусловленного действием ес-ствепно! о фактора, ингнбирующего активность антител класса М.

5. Изучить влияние экспериментальной анаэробной газовой ин-:кщш па активность и продолжительность функционирования пред-рительно индуцированного естественного фактора ингибиции ак-вности антител.

Научная новизна. В результате проведенных исследований ервые установлено, что при анаэробной газовой инфекции, вызван->и клострндиями перфрингенс, возможно значительное модифициро-ние первичного иммунного ответа. Направленность и выраженность личественных сдвигов со стороны антителообразующих клеток зави-г от массивности инфицирования поврежденных тканей, особеннос-Г[ воздействия патогенетических факторов на разных этапах разви-я патологического процесса, специфики состояния популяции имму-компетентных клеток во время воздействия возбудителя и продуктов ) жизнедеятельности.

Впервые исследованы временные и количественные характерис-кн нммуномодифицирующего действия механической травмы мягких дней и ее инфицирования клострндиями перфрингенс типа А в снсте-первичного иммунного ответа на гаптен, коныогированнын с мусзависимым и тнмуснезависимым носителями. Установлено, что няние инфекции на кинетику формирования популяции антитело-разующих клеток проявляется па уровне клеток-пре;ииестаешшкон гителопродуцентов.

Изучено функционирование при механической травме мягких аней и анаэробной газовой инфекции, вызванной клострндиями пер-ингенс типа А, естественного фактора, ингнбирующего активность гител класса М. Показано, что травма способствует формированию мунодефнцитного состояния, обусловленного действием фактора, шпие инфекции приводит к увеличению выраженности и одолжительности иммунодефицита.

В экспериментальных условиях впервые установлено, что пер-оруглеродная эмульсия перфторан обладает выраженным терапев-1 веским действием при анаэробной газовой инфекции.

Практическая ценность. Изучение влияния инфекции, вызванной эсгрнднями перфрингенс типа А, на формирование популяции анти-

телообразующих клеток при первичном иммунном ответе на антигены различной природы открывает новый подход к научению патогенеза этого заболевания. Работа научно обосновывает необходимость проведения в клинической практике при газовой гангрене оценки иммунного статуса и иммунокоррегнрующей терапии.

Разработанный способ определения естественного фактора, ин-гнбирующего активность антител класса М, может быть использован в научно-исследовательской и клинико-диагностической работе при выявлении иммунодефицитного состояния, обусловленного его действием.

Обнаружение выраженного терапевтического эффекта перфтора-на при анаэробной газовой инфекции позволило разработать способ моделирования этого заболевания в условиях массивного инфицирования поврежденных тканей клостридиями перфрингенс.

Внедрение в практику. Разработанные способы защищены 3 авторскими свидельствами на изобретения, 2 удостоверениями на рационализаторские предложения отраслевого и 9 местного значения. Они используются в научно-исследовательской работе Астраханского, Донецкого, Курского, Харьковского мединститута, Астраханского филиала ЦНИИ эпидемиологии, Каспийского НИИ рыбного хозяйства для оценки иммунного статуса, изучения первичного иммунного ответа, идентификации клостридий перфрингенс, моделирования анаэробной газовой инфекции.

Изобретения "Способ определения естественного фактора, инги-биругащего активность антител класса М" и "Способ диагностики сепсиса у новорожденных" нашли широкое применение в клинико-профи-лактических учреждений Астраханской области по диагностике и дифференциальной диагностике гнойно-септических заболеваний, определению выраженности интоксикации, прогнозированшо течения и исходов патологических процессов, оценки иммуносупрессивного действия лекарственных препаратов.

Результаты работы по 'изучению иммуномодифицирующего действия механической травмы и анаэробной газовой инфекции, функционированию естественного фактора, ингибирующего активность антител класса М, используются в преподавании на кафедрах микробиологии, вирусологии и иммунологии, инфекционных болезней, хирургического, терапевтического и педиатрического профиля Астраханского мединститута.

Основные положения, выносимые на защиту. 1. О возможности модифицирования при анаэробной газовой инфекции, вызванной клооридиями перфрингенс типа А, первичного иммунного ответа, направленность и выраженность которого зависят от массивности нн-

фицировання поврежденных мягких тканей, временного соотношения заражения к иммунизации, периода формирования популяции антнте-лопродуценгов, природы антигена.

2. О воздействии анаэробной газовой инфекции на популяцию антителообразующнх клеток в системе первичного иммунного ответа независимо от природы антигена на уровне клеток-предшественников а нгител о пр одуцентов.

3. О значительном влиянии перфгоруглероднон эмульсин пер-фторан на течение и исходы инфекции, вызванной клостридиямн перф-рингенс, при отсутствии нммунокоррегнрующего действия.

4. О влиянии механической травмы мягких тканей на формирование иммунодефицитпого состояния, обусловленного действием фактора, ингибирующего активность макромолекулярных антител класса М.

5. О развитии при анаэробной газовой инфекции, вызванной клостридиямн перфрингенс, иммунодефицитпого состояния, связанного с функционированием фактора, угнетающего активность иммуноглобулинов класса М, степень выраженности которого определяется дозой инфекта и периодом заболевания.

Апробация. Основные положения диссертации обсуждены на Всесоюзной конференции по перфторуглеродным эмульсиям (1986), Всесоюзной конференшш"Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний" (1990), международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (1992), международном симпозиуме "Лабораторные животные в медико-биологических и биотехнологических исследованиях" (1992), I Российском съезде иммунологов (1992), VIII международном симпозиуме по изучению перфторуг-леродных соединений в медицине и биологии (1994), Всероссийской конференции "Эпидемиология; клиника, диагностика, лечение и профилактика важнейших инфекционных заболеваний" (1994), научных сессиях Астраханского мединститута (1986, 1987, 1991, 1993), заседаниях научных медицинских обществ иммунологов (1991, 1992, 1993), микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (1976, 1989, 1990, 1991, 1993), травматологов (1978) Астраханской области.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 36 научных

работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 428 страницах текста (собственно текста 207 страниц), содержит 65 рисунков и 82 таблицы. Состоит из введения, обзора литературы, глав "Материал и методы исследований" и "Результаты собственных исследований и их обсуждение", заключения, выводов, практических ре-

комендаций и указателя литературы, содержащего 373 отечественных н 227-иностранных источников.

Материал и методы исследования. Проведено 426 серий экспериментов на 5344 мышах линии СБА обоего пола 3-4-х месячного возраста массой 16-20 г. Каждая опытная и контрольная группа состояла из 8-10 животных.

Анаэробную тазовую инфекцию воспроизводили путем введения в размозженные мягкие ткани (без видимых повреждений кожных покровов и костей) медиальной стороны бедра 18-часовой культуры клостриднй перфрннгенс типа А штамма ВР6К, полученного из ГИКС им. Л.А. Тарасевича, в количестве 0,5, 0,2, 0,1 или 0,05 LD50 микробных клеток в объеме 0,2 мл изотонического раствора хлористого натрия.

В сериях экспериментов по изученшо массивного инфицирования механической травмы мягких тканей клостриднями перфришенс, его влияния на иммуногенез бал использован разработанный нами способ моделирования заболевания (А.А.Шепелев, 1991), защищенный авторским свидетельством на изобретение. Он отличается тем, что внутривенно, однократно, одномоментно с заражением вводили пер-фторуглеродную эмульсию перфторан в количестве 20 мкл/г массы мыши. Этим достигалось увеличение резистентности животных к этим микроорганизмам, что позволило использовать большие дозы иифекта.

Контролями служили группы интакгных животных, а также мышей, которым после нанесения механической травмы мягких тканей вводили в место повреждения 0,2 мл стерильного изотонического раствора хлористого натрия.

В день проведения исследований животных забивали путем цер-викальной дислокации, получали кровь и извлекали необходимые органы. В поврежденных тканях травмированных и зараженных мышей с помощью общепринятых методов и встречного нммуноэлектрофоре-чн ( А.А.Шепелев с соант., 1990; Л.И.Фрейднн, А.А.Шепелев, 1991) определяли наличие клострндий перфришенс. У животных с анаэробной инфекцией они обнаруживались в чистой культуре, а при механической травме материал не был контамирован микроорганизмами.

Для оценки иммуномодифицирутощеговлияния травмы и ее инфицирования клостриднями была использована система первичного иммунного отпета на эритроциты барана (ЭБ), гаптен ТНФ (2,4,6-три-шпробензолсульфоновая кислота) фирмы "Serva", коныогнрованный с тнмуспезавпспмыми или тимусзависимыми антигенами, в качестве ко-и>ры.\ применяли липополисахарид (ЛПС) E.coli On¡ фирмы "Serva" или эритроциты коровы (ЭК) соответственно. Коныогаг ТНФ-ЛПС

отовили по методу М.В.Rotenberg и A.A.Amkraut (1966) в модифика-шп D.Jocobs и D.C.Morrison (1975). Соединение ТНФ с эритроцитами доводилось по методу М.В.Rittenberg и K.B.Pratt (1969).

Мышей иммунизировали ЭБ или коныогатом ТНФ-ЭК путем тутрибрюшинного введения антигена в объеме 0,5 мл 5% суспензии (5 :1()8 клеток). Иммунизацию конъюгатом ТНФ-ЛПС проводили вводя ту грибрюшннно 0,3 мл иммуногена, содержащего 20 мкг ЛПС.

Определение количества антителообразующнх клеток (АОК) »сущестпляли методом локального гемолиза в агаре (N.K.Jerne, ^.A.Nordin, 1963). Тнзрование гемолизинов и гемагглютинннов сыно-ютки крови проводили общепринятым способом (С.П.Карпов, 1972) в гашем микроварнанте (А.А.Шепелев, 1989).

Определение естественного ингибирующего фактора (ЕИФ) осу-цеств:шли с помощью собственного способа, на который получено ав-орское свидетельство на изобретение (A.A.Шепелев, С.В.Колодина, 989). Он основан на снижении титров РИГА после инкубации тест-ыворотки с исследуемым материалом и отличается большей чувстви-елыгостыо.

Пассивную иммунизашпо животных проводили путем одномо-[ентного, внутривенного введения 0,2 мл сальмонеллезной неадсор-ированной сыворотки группы А с титром 1:12800. Титры антител в ыворотке крови определяли с помощью РНГА применяя комплемен-арный эритроцитарный диагностикум.

Статистическую обработку полученных результатов проводили :а ПЭВМ "Квант" по программе "Каскад" (В.Л.Слувко, Э.Б.Велика-ов, 1979). Уровень значимости различий (Р) определяли по таблице "тыодента (И.П.Ашмарнн, А.А.Воробьев, 1962), величину LD50 по ме-оду Кербера (А.В.Божко, А.Л.Котоиа, 1991).

Результаты собственных исследований и их обсуждение.

Изучение кинетики первичного иммунного ответа на ЭБ после :нфицировання поврежденных мягких тканей клостридиями перфрин-енс позволило получить информацию о закономерностях формирова-ия популяции антителопродуцентов при анаэробной газовой инфек-.ии, дать оценку иммуномодифнцир\тощим эффектам.

Сравнительный анализ временных и количественных характе-истик показал, что инфекция в определенных условиях может су-(ествснно влиять на иммуногенез. Изменения со стороны АОК селе-енки имели различную выраженность и даже направленность в зави-

снмости от величины дозы инфекта, соотношения по времени проведения иммунизации и заражения.

Воспроизведение инфекции, которое осуществлялось с помощью 0,5 или 0,2 Ьйзо микробных клеток чq)eз 2 суток после антигенной стимуляции и одновременно с ней с помощью 0,5 ЬО50, способствовало стимуляции иммуногенеза. Одой из причин, приводящей к увеличению абсолютного количества в селезенке клеток, синтезирующих антитела, является более интенсивный приток в орган кариоцитов. В то же время удельный вес АОК среди ЯСК при одновременном проведении иммунизации и инфицирования не был подвержен существенным изменениям, а если антигенная стимуляция предшествовала заражению, то величина этого показателя оказалась значительно ниже, чем в контроля*.

При проведении иммунизации после воспроизведения инфекции, наоборот, имела место выраженная иммуносупрессия. Отставание антигенной стимуляции на 2 суток от заражения приводило к снижению количества антителопродуцентов при использовании всех испытуемых доз инфекта. Это регистрировалось на фоне возрастания общего содержания в селезенке клеток и одновременном уменьшении среди них количества АОК. При отставании иммунизация от инфицирования на 4 суток выраженность иммуносупрессивного действия была меньшей. Этот эффект достигался только после заражения мышей 0,5 и 0,2 ЬР50 микробных клеток, в этих слу чаях понижались по сравнешпо с другими величинами контрольных показателей абсолютные и относительные количества антителопродуцентов. После воспроизведения инфекции в этих временных условиях постановки экспериментов с помощью 0,1 ЬОзо клостридий перфрингеис выраженность первичного иммунного ответа не менялась. В то же время при использовании минимальной из испытуемых доз инфекта имела место стимуляция иммуногенеза, для которой было характерно увеличение содержания клеток, синтезирующих антитела, при сохранении их удельного веса среди кариоцитов.

Таким образом, установлено, что инфекционная фаза анаэробной газовой инфекции, вызванной клостриднями псрфрингснс, во время ко торой в основном преобладают местные проявления без выраженной интоксикации, что по времени, как правило, соответствует 1-2 суткам развития патологического процесса (Л.А.Черная, Г.П.Кавтуно-вич,1968; В.Н.Мельников, Н.И.Мельников, 1973; Ю.Г.Шапошииков с соавт., 1984), оказывала стимулирующее действие на индуктивную фазу иммуногенеза. Можно предположить, что иммуносупресснвное действие токсинов и других продуктов жизнедеятельности клостридий, которыми они обладают (А.А.Задорожный с соавт., 1979), запаздавает

з этих условиях проведения экспериментов по времени и не. успеваеет проявлять этого эффекта в отношении лимфоидных клеток. В то- же зремя продуктивная фаза иммуногенеза более резистентна к действшо факторов обладающих иммунодепресснвным действием (В.М.Кудря-лова, 1974; А.А.Ярилин, 1980; Л.Е.Апскгзоп, .1Хей«т18;1980; Е.М.Мь мсЬ, MJ.Ehrke.1984).

Рост популяции антителопродуцентов в процессе формирования юрвичного иммунного ответа обеспечивается в результате рекрунт-.¡ента клеток-предшественников и деления собственно клеток, синтезирующих антитела (А.Г.Калинкович, 1972; Б.С.Утешев ссоавт., 1978). В :»язи с тем, что АОК сравнительно быстро выходят из пула зролнферирушщих клеток, то именно рекрунтмент в основном определяет кинетику роста популяции антителопродуцентов. Популяция

в значительно большей степени чувствительна к иммуносупрес-:шшыым факторам на ранних стадиях иммуногенеза, а на более тоздних, начиная с 4-5 дня, клетки становятся более резистентными ;В.А.Бабпчев с соавт., 1977; В.Е.Турищев, 1987; Ш.Ьапд,1972). Этим, зо-видимому, можно объяснить тот факт, что после проведения заражения животных клострндиями перфрингенс за 2 или 4 суток до имму-шзации, то есть когда начальные стадии первичного иммунного отве-га развивались на фоне уже сформированной токсичной фазы анаэ->обной газовой инфекции, наблюдалось столь сильное снижение содержания антителопродуцентов в селезенке. В этих условиях даже до-толнительный приток в орган ЯСК не компенсировал выраженность )твета, не приводил количество АОК к таковому уровню у контрольных животных.

При стихании клинических проявлений в результате купирова-1ия инфекционного патологического процесса, что имело место через 8 :уток после заражения мышей двумя меньшими дозами инфекта, наб-нодалась отмена иммуносупрссснвного эффекта, а при использовании и 1Я воспризвсдення ннфекцни минимального количества клостриднн -лимуляция иммуногенеза. Таким образом, у реконвалесцентов ¡юрмировалось состояние готовности к более выраженному, чем у штактных и травмированных животных, иммунному ответу.

Все это свидетельствует о том, что величина рекруитмента при пучаемой инфекционной патологии может значительно уменьшаться. -Согда экспоненциальный рост числа АОК, преимущественно обеспечи-¡ающийся трансформацией клеток-предшественников, совпадал по ¡ремени с наиболее выраженным периодом токсической фазы анаэроб-юй газовой гангрены, происходило падение количества клеток, синте-шрующих антитела. Результаты экспериментов при других временных гоотношеннях антигенной стимуляции и заражения, то есть при раз-

ни гни индуктивной фазы иммуногенеза в инфекционный период заболевания или в период рекоивалесценции, подтверждают большую резистентность рекруитмента к действию патогенетических факторов клостридий перфрингенс.

Конечным итогом и биологическим смыслом гуморального иммунного ответа является синтез антител. Количественные изменения со стороны антитело продуцентов, имевшие место при анаэробной газовой инфекции, не могли не отразиться на титрах антител. После воспроизведения заболевания за 2 или 4 суток до проведения иммунизации было характерно практически параллельное снижение содержания в циркуляции противоэритроцитарных антител и АОК в селезенке. Имела место прямая зависимость между тиграми антител и количеством антителопродуцентов, обратная - с количеством клостридий перфрингенс, использовавшихся для воспроизведения инфекции. Таким образом, в этих случаях снижение титров антител можно объяснить супрессией иммунного ответа, характеризующейся уменьшением пула АОК, выраженность которой, в свою очередь, зависит от величины дозы инфекта.

Нарастание количества антителопродуцентов, наблюдавшееся при иммунизации за 2 суток до заражения, не приводило к существенным изменениям титров гемолизинов. Одновременное проведение иммунизации и инфицирования поврежденных тканей большими количествами клостридий способствовало значительному увеличению в сыворотке крови этих антител. При этом изменения находились в прямой зависимости от содержания в селезенке АОК и в обратной от величины дозы инфекта.

Титры гемагглютишшов после иммунизации за 2 суток или одновременно с воспроизведением инфекции с помощью 0,5 или 0,2 ЬЭзо микробных клеток не претерпевали существенных изменений, заражение же животных меньшими количествами клостридий приводило к возрастанию их тигров. Между количеством антител и содержанием в селезенке антителопродуцентов, а также с величиной дозы инфекта имела место обратная зависимость.

Случаи, когда на фоне увеличения количества АОК не наблюдалось возрастание титров антител, по-видимому, не могут быть связаны с ограничением функциональной активности антителопродуцентов или со снижением авидности синтезирующихся антител. Возможность формирования последнего известна при ряде инфекционных заболеваний, при этом, как правило, выраженность снижения авидности связывалась с тяжестью течения патологического процесса (К.В.Бунин с соавт., 1976; Л.П.Капука, 1977; В.Л.Черкасов с соавт., 1987; З.О.Караев с соавт., 1992).

В связи с тем, что совокупность пммунокомпетентных клеток представляет собой динамичную, саморегулирующуюся систему, становится очевидным, что для объективной оценки иммуномодифицирую-щего действия факторов самой различной природы, в том числе и анаэробной газовой инфекции, вызванной клостридиями перфрингенс, недостаточно изучения только статистических параметров в какой-лн-бо фиксированной точке развития иммуногенеза. Известно, что даже полное отсутствие АОК под действием цитостатиков на пике первичного иммунного ответа еще не свидетельствует о полной элиминации этих клеток (Б.С.Утешев, 1981; Н.Б.Дмитриева, 1983; А.Б.Матвеев, 1992; Е.М.Millich, M.J.Ehrke,1984). Это побудило нас провести кинетические исследования формирования популяции антнтелопродуцен-тов в системе первичного иммунного ответа на ЭБ при анаэробной газовой инфекции. Приведенные выше результаты исследований свиде-тедьтсвуют о развитии наиболее выраженных и противоположных по направленности количественных изменений со стороны АОК селезенки и титров антиэритрощгтарных антител при иммунизации, которая проводилась одновременно или с отставанием ее от иммунизации на 2 суток. Поэтому, именно эти два условия постановки экспериментов были выбраны для изучения динамики первичного иммунного ответа.

После одновременной антигенной стимуляции с заражением 0,5 и 0,2 LD50 клостридий перфрингенс наблюдалась значительная активация иммуногенеза, которая носила преходящий характер. Содержание АОК селезенки после введения в размозженнные мягкие ткани максимального количества бацилл было существенно больше, чем у животных с механической травмой, со дня развития иммунного ответа. Затем выраженность этих изменении нарастала до 10 дня и начинала снижаться к 15, а на 20 сутки различий с контрольными величинами не регистрировалось. Для анаэробной газовой инфекции, вызванной 0,2 LD50 клостридий, увеличение количества антигелопродуцентов было характерно на 2, 7 и 10 день после иммунизации. Меньшие дозы инфек-та существенных изменений не вызывали. Во все сроки проведения исследований имела место прямая связь между содержанием в селезенке АОК и количеством клостридий, применявшихся для воспроизведения инфекции.

Результаты этих экспериментов показали, что в определенных условиях, несмотря на известное наличие прямого повреждающего действия экзотоксинов клостридий перфрингенс на клетки иммунной системы (Н.И.Мельников с соавт., 1969; И.Я.Аносов с соавт., 1970; S.M.Fincgold, 1982), может наблюдаться не иммуносупрессия , а, наоборот, активация иммуногенеза. Продукты жизнедеятельности и структурные компоненты многих микроорганизмов обладают способностью

стимулировать иммунокомпетентные клетки (Б.Д.Брондз, 1987), проведенные исследования свидетельствуют о том, что такие свойства характерны н для клостридий перфрингенс.

Существенные изменения претерпевала динамика титров протн-ноэритроцитарных антител. Со стороны изменений титров гемолизинов сЬшоротки крови прослеживалась выраженная прямая зависимость от .величины лозы инфекта и количества АОК селезенки. На 4 день после проведения иммунизации и заражения мышей двумя большими количествами микробных клеток содержание этих антител в циркуляции была существенно выше, чем у животных с травмой. Через 7 дней от начала постановки экспериментов этот эффект регистрировался при инфицировании от 0,5 до 0,1 ЬР50 бацилл, а через 10 - во всех опытных 1-руппах. В следующий срок наблюдения величины титров антител были выше контрольных при использовании для воспроизведения инфекции 0,5 и 0,2 ЬОзо, а на 20 день - только максимальном из испытуемых количеств клостридий.

Как известно, экзотоксины клостридий перфрингенс обладают выраженным гемолитическим действием (М.А.Каменева, 1974; С.О.Берсудский, 1981; 1.аКлгапо\у, 1980; КЖКлгег, О.С.С^е, 1981), но с этим не был связан лизис эритроцитов тест-системы при титровании гемолизинов, что подтверждено отрицательными результатами контролен, в которых выявлялась возможная гемолитическая активность сывороток крови мышей с анаэробной газовой инфекцией.

Повышение титров гемагглютининов сыворотки крови зараженных животных было зарегистрировано по сравнению с контрольными «руппами с 4 по 20 сутки развития иммунного ответа. На 4 день количество антител в циркуляции было значительно большим после заражения двумя, а на 7 - тремя меньшими дозами инфекта. При этом до 10 суток вюочительно имела место обратная зависимость этих изменений от количества клостридий, использовавшихся для воспроизведения инфекции, и содержания в селезенке антителопродуцентов. Через 10 и 15 дней нарастание титров антител наблюдалось во всех опытных группах, но в последний из этих сроков наблюдения отсутствовали достоверно значимые связи с величиной дозы инфекта и количеством АОК селезенки. На 20 день зависимость между титрами гемагглютининов от количества микробных клеток, использовавшихся для заражения, и содержанием в селезенке антитело-продуцентов была прямой. В этот срок проведения исследований регистрировалось повышение титров антител после инфицирования двумя максимальными из использовавшихся дозами инфекта.

Таким образом, при развитии анаэробной газовой инфекции наблюдалось повышение титров гемагглютининов сыворотки крови

после заражения мышеи небольшими количествами бацилл, а у рекон-валесцентов к этому приводили наибольшие дозы инфекта. Возможно, что и на более ранних этапах формирования иммунного ответа большие количества клострпдий также стимулировали синтез гемагглютн-нинов, но функциональная активность их страдала и они не выявлялись. Это может быть обусловлено функционированием естественного фактора, ншибирующего активность иммуноглобулинов класса М.

Совершенно иными были характеристики первичного иммунного ответа на ЭБ в условиях постановки экспериментов, когда антигенная стимуляция отставала от воспроизведения инфекции на 2 суток, то есть при развитии индуктивной фазы иммуногенеза в токсический период заболевания,

На ранних стадиях формирования иммунного ответа регистрировалось его значительное угнетение. Содержание АОК селезенки на 2 и 4 сутки после проведения иммушгэрции было меньшим во всех опытных группах, чем у животных с травмой. При этом имела место выраженная обратная зависимость между количествами антигелопродуцен-тов и микробных клеток, использовавшихся для заражения.

Это отражалось на величинах титров противоэритроцитарных антител сыворотки крови. На 2 сутки в циркуляции было меньше как гемолизинов, так и гемагглютининоа при использовании двух больших доз инфекта, а на 4 день - во всех опытных группах. Величины титров антител находилось в обратной зависимости от количества бацилл, применявшихся для воспроизведения инфекции, и в прямой -от содержания в селезеже АОК.

В более поздние сроки выраженность иммуносупрессии снижалась, уменьшение количества антнтелопродуцентов было зарегистрировано только на 7 день после иммунизации у животных, которым в поврежденные мягкие ткани вводили максимальную из испытуемых доз инфекта. Однако; на протяжении всего срока наблюдения сохранялась обратная зависимость содержания АОК в селезенке от количества микробных клеток, использовавшихся для заражения.

Также уменьшалось влияние инфекции на количество антгорит-роцитарных антител на 7-10 сугки, но и в эти сроки наблюдения сохранялась обратная зависимость от величины доз инфекта и прямая - от содержания в селезенке антнтелопродуцентов. Начиная с 15 дня после проведения иммунизации у животных, которых заражали от 0,05 до 0,2 ЬОзо микробных клеток, более интенсивно нарастало количество антител. В этих случаях сохранялась зависимость титров гемолизинов и гемагглютинннов от дозы инфекта и количества АОК.

Таким образом, угнетение формирования популяции антнтелопродуцентов и снижение титров противоэритроцитарных антител при

проведении иммунизации - спустя 2 суток после заражения носили временный характер. На поздних этапах развития выраженность иммунного ответа восстанавливалась, а у реконвалесцентои даже повышенными были титры гемолизинов и гемагглкгшнинов.

Было установлено, что перфторуглеродная эмульсия перфторан обладает выраженным терапевтическим эффектом при экспериментальной анаэробной газовой инфекции. Значительное увеличение резистентности животных к клостридиям перфрннгенс типа А после введения препарата позволило разработать модель заболевания. С ее применением представилось возможным изучить первичный иммунный ответ в условиях массивного инфицирования механической травмы, что часто наблюдается при развитии заболевания у человека.

Однократное введение 20 мкг/г массы мышей перфторана интак-тным животным приводило к увеличению в селезенке АОК со 2 на 10 сутки после антигенной стимуляцитьлто согласуется с литературными сведениями (Т.Л.Вереина с соавт., 1у87, 1988).При значительном влиянии препарата на исходы анаэробной газовой инфекции существенных изменений в выраженности количественных сдвигов со стороны анти-телопродуцентов при механической травме и ее инфицировании 0,5 LD50 микробных клеток отмечено не было. Сравнительный анализ показал, что в этих группах мышей от соотношения по времни нанесения травмы, заражения, введения препарата и проведения иммунизации, а также от времени формирования иммунного ответа количества АОК селезенки изменялились в одинаковой степени по сравнению с соответствующими контролями независимо от того вводился перфторан или не вводился.

Увеличение количества микроорганизмов, вводившихся в поврежденные ткани, до соответствовавшего 1 или 2 LD50 клостридий для нитактных животных, как правило, приводило к угнетению иммуногенеза. Исключения составили только случаи, когда заражение осуществляли обеими из этих количеств микробных клеток спустя 2 суток после иммунизации и максимальным из них при одновременном проведении инфицирования и антигенной стимуляции ответа, характерной для меньшей дозы инфекга.

Иммуносупрессия на фоне действия препарата наблюдалась не только на пике иммунного ответа, но и в динамике. После одновременного проведения иммунизации, заражения и введения перфторана вы-ражсннность и продолжительность этого эффекта находилась в прямой зависимости от величины дозы инфекта. При инфицировании 1 LD50 бацилл угнетение иммуногенеза наблюдалось еще и на 2 сутки, а после заражения максимальным количеством клостридий - со 2 по 10 су тки формирования популяции антителопродуцентов. В условиях пос-

тановки экспериментов, когда антигенная стимуляция отставала от воспроизведения инфекции на 2 суток, использование обеих этих количеств микроорганизмов приводило к значительному снижению в селезенке АОК на протяжении всего срока наблюдения. Дозовая зависимость содержания в органе клеток, синтезирующих антитела, отсутствовала.

Таким образом, при анаэробной газовой инфекции, вызванной клострпдиямн перфрингенс типа А, в определенных условиях возможно как угнетение, так и активация первичного иммунного ответа. Направленность и выраженность иммунных сдвигов зависят от массивности инфицирования и от состояния популяции иммунокомпетентных клеток во время воздействия патогенетических факторов заболевания.

Зависимость влияния изучаемой инфекционной потологии на ан-гителогенез от тимнческих факторов была изучена в системе первичного иммунного ответа на гаптен ТНФ, конъюгированный с тимусзави-:имым иди тнмуснезависимым носителями. В результате проведенных экспериментов, когда иммунизация коньюгатом ТНФ-ЛПС или ТНФ-ЭК осуществлялась в разные сроки развития анаэробной газовой инфекции, а также изучая кинетику формирования популяции АОК селе-»енкн, представилось возможным дать характеристику влияния завоевания на первичный иммунный ответ в отношении тимуснезависимо-~о и тимусзависимого антигенов.

Анализ изменений со стороны антителопродуцентов селезенки три ответе на конъюгат ТНФ-ЛПС после заражения животных пока-1ал, что они зависели от временного соотношения иммунизации и зажжения, периода формирования популяции антителопродуцентов во фемя инфицирования, величины дозы ннфекта. На пике иммунного я кета достоверно значимым иммуномодифицирующпм эффектом об-1адало максимальное из использовавшихся в этих сериях экспериментов количество клостриднн (0,5 ЬЭ5о). Если инфекция, которая »оспроизводнлась через 2 суток после иммунизации, стимулировала гммупогенез, то при одновременном проведении иммунизации и зара-ксния количество АОК селезенки находилось на уровне величин контрольных показателей. При отставании иммунизации на 2 суток от инфицирования вновь этих клеток становилоь больше, чем у животных с механической травмой; а если разницы по времени между вмешательствами составляла 4 суток, наоборот, имела место иммуносупрес-:ня. Воспроизведение инфекции за 7 суток до антигенной стимуляции >пять способствовало значительному увеличению количества антите-[опродуцентов.

Изучение кинетики формирования популяции клеток, синтезнру-ощих антитела к тимуснезависимому антигену, в системе первичного

иммунного ответа показало, что влияние инфекции существенно варьирует в зависимости от времени, которое прошло после введения антигена. Так, в условиях постановки экспериментов, когда иммунизация и заражение осуществлялись одновременно, наблюдалась выраженная стимуляция иммуногенеза, о чем свидетельствовало увеличение в селезенке количества антителопродуцентов с 7 дня после антигенной стимуляции. Продолжительность и выраженность иммуностимулирующего эффекта находились в прямой зависимости от величины дозы ин-фекта. После инфицирования поврежденных тканей 0,5 ЬЭ50 микроб-пых клеток, повышенное по сравнению с контрольными группами содержание в селезенке клеток, синтезирующих антитела к гаптену, регистрировалось до 20, а 0,1 ЬЭ50 - только до 15 суток после иммунизации. Относительное содержание антителопродуцентов среди кариоцитов органа на 2-4 сутки уменьшалось ниже контрольного уровня. На 7 сутки ситуация нормализовалась, а в более поздние сроки проведения исследований величина этого показателя была выше, чем у травмированных животных.

Таким образом, в этих случаях на ранних этапах развития иммунного ответа несмотря на значительное снижение удельного веса АОК среди ЯСК органа абсолютное количество антителопродуцентов сохранялось на уровне такового у животных с механической травмой, по-видимому, в основном это было обусловлено за счет более интенсивного притока в селезенку кариоцитов. Начиная с 7 суток после антигенной стимуляции количество клеток, синтезирующих антитела, существенно увеличивалось, что было связано не только с нарастанием общего количества клеток в органе, но и относительным содержанием среди них антителопродуцентов.

Обобщая результаты изучения первичного иммунного ответа на тнмуснезависимый антиген, когда иммунизация проводилась спустя 2 суток после воспроизведения анаэробной газовой инфекции, можно констатировать, что на фоне заболевания может иметь место значительное модифицирование выраженности иммуногенеза различной направленности. На более ранних стадиях формирования ответа, которые по времени совпадали с наиболее выраженной токсической фазой заболевания, наблюдалась иммуносупрессия. Начиная с 4 суток после антигенной стимуляции и до последнего срока наблюдения количество АОК быстро нарастало по сравнению с таковым у травмированных животных за счет увеличения общего содержания в органе кариоцитов, и относительного количества среди них антителопродуцентов. Количественные изменения со стороны АОК селезёнки как в сторону снижения их содержания , так и увеличения в определенные сроки проведе-

ния исследований находились в прямой зависимости от величины дозы ннфекта.

Таким образом, кинетика формирования популяции АОК селезенки при первичном иммунном ответе на коныогат ТНФ-ЛПС в условиях постановки экспериментов, когда иммунизация совпадала по времени с заражением животных шш если первое воздействие отставало от второго па 2 суток, существенно разшшалась.

Значительными оказались отличия в выраженности ответа и на тимусзависимый антиген при инфекции, вызванной клосзгридиямн перфрингенс типа А, по сравнению с интактными и травмированными животными. Количественные изменения со стороны клеток, синтезирующих антитела, имели различный характер при изменении соотношения по времени проведения иммунизации и заражения. Если антигенная стимуляция осуществлялась за 2 суток или одновременно с воспроизведением инфекции, то имела место значительная активация иммуногенеза. В первом случае это наблюдалось после заражения 0,5 ЬБзо микробных клеток, а во втором - обеими испытуемыми дозами ннфекта, но и при этом сохранялись дозовые различия между опытными группами. При отставании антигенного воздействия от инфицирования поврежденных тканей ситуация со стороны антителопродуцентов менялась на противоположную, значительно падало количество АОК селезенки по сравнению с таковым в контрольных группах. После заражения животных максимальной из испытуемых доз ннфекта это регистрировалось во всех сериях исследований, а инфицирование меньшим количеством клострндий приводило к этому только в условиях, когда временная разница между двумя воздействиями составляла 2 суток. Основной причиной таких количественных изменений являлось значительное падение удельного веса содержания среди кариоцитов селезенки антителопродуцентов. Изменения величин этой характеристики имели сходную закономерность с таковыми различиями абсолютного количества клеток, синтезирующих антитела.

В целях более детального изучения иммуномодифицирующих эффектов при изучаемой инфекционной патологии были проведены исследования в динамике в условиях постановки экспериментов, когда иммунизация коньюгатом ТНФ-ЭК совпадала по времени или отставала от инфицирования на 2 суок, для которых были характерны наиболее выраженные количественные изменения со стороны а НТ1 гг ел о пр оду центов.

При одновременном осуществлении иммунизации и заражения регистрировалась стимуляция иммуногенеза. Значительно повышалось количество антителопродуцентов со 2 по 15 день после антигенной

стимуляции при использовании для воспроизведения инфекции 0,5 ЬЭ5о микробных клеток, а при заражении 0,1 ЬЭзо - также со 2, но только на 7.сутки. Не только временная, но и количественная выраженность активации иммунного ответа находилась в прямой зависимости от .величины дозы инфекта. В то же время повышение содержания в селезенке клеток, синтезирующих антитела, среди кариоцнтов было зарегистрировано лишь на 15 сутки от начала постановки экспериментов .и только после заражения масимальной из испытуемых доз инфекта. Это свидетельствует о том, что увеличение абсолютного количества антител о продуцентов в основном, и в первую очередь на ранних этапах развития иммунного ответа, было обусловлено нарастанием общего содержания клеток в селезенке, а не их удельным весом среди кариоцнтов.

После проведения иммунизации тимусзависимым антигеном, отстающей от заражения на 2 суток, наоборот, наблюдалось значительное снижение количества антителоп]>о;суцеитов. Выраженность этих изменений зависила от времени, прошедшего после лизигенного воздействия, и от количества клостриднй, использовавшихся дтя воспроизведения инфекции. После заражения максимальной из испытуемых дозой инфекта иммуносупрессивное влияние наблюдалось со 2 по 10 сутки формирования популяции АОК, а при применении меньшего количества микробных клеток это было отмечено только на 2 и 4 сутки. Сходная картина изменений регистрировалась со стороны динамики относительного содержания антителопродуцентов среди кариоцнтов органа.

Результаты проведенных исследований по изучению первичного иммунного ответа на гапген, коныогированный с тимусзависимым носителем, свидез ельтсвует о том, что формирование популяции анпнелопродуцентов при анаэробной газовой инфекции, вызванной к.чосчридиями перфрингеис, во многом определяются фазой развития инфекционного процесса. Так, если индуктивная фаза иммуногенеза совпадала по времени с бактериемическим периодом заболевания, то это приводило к более интенсивному возрастанию в селезенке клеток, сшпезирующих антитела. В противоположность этому в условиях, когда начальные стадии иммунного ответа развивались на фоне сформировавшимся токсическим периодом патологии, наблюдалась выраженная иммуносупрессня. Следует отметить тот факт, что незавнемо от направленности иммуномодифицирующих эффектов количественные изменения со стороны АОК селезенки в наиболее выраженной степени регистрировались на 2-4 сутки после антигенного воздействия. Из этого следует, что в основе иммуномодифицирутощего действия инфекции лежат не только механизмы патогенетических

факторов заболевания на иммунокомпетентную популяцию, но и состояние последней в отдельные сроки иммуногенеза.

Следует отметить, что в более выраженной степени изменения выраженности первичного иммунного ответа наблюдались на тимусза-висимый антиген. Это свидетельствует о значительном влиянии патогенетических факторв анаэробной газовой инфекции на Т-снстему иммунитета, что согласуется со сведениями Р.В.Петрова с соавторами (1977) о зависимости иммунного ответа на антигены клострндий перфрингенс от тимуса.

Можно полагать, что при первичном иммунном ответе инфекция не препятствует трансформации клеток-предшественников в клетей, синтезирующие антитела. Вероятнее всего, снижение количества ангителопродуцентов, что наблюдалось в определенных условиях постановки экпериментов, обусловлено элиминацией пролиферирующихсл предшественников. При этом она несомненно была далеко неполной, так как после ингибнрующего действия наблюдалось восстановление выраженности иммунного ответа или даже его активация.

Механизмы,ведущие к активации иммуногенеза, протекают как на уровне В-.лимфоцитов, так и Т-лимфоцитов. Возможно, что в проявлении иммуностимулирующего эффекта определенное значение имеет прямое действие продуктов метаболизма клострндий перфрингенс на В-клеткп и элиминация Т-супрессоров. Преимущественное действие изучаемой инфекционной патологии на В-лимфоцнты и Т-лимфоцнты, вероятно,имеет место не только прн активации иммуногенеза, но и в случаях иммуносупресси которая определяется различной степенью чувствительности иммунокомпетентных клеток.

Таким образом, проведенные исследования по изучению влияния анаэробной газовой инфекции, вызваны клостридиями перфрингенс типа А, на кинетику формирования популяции антителопродуцентов в системе первичного иммунного ответа на тимуснезавнснмый и тимус-зависимый антигены свидетельствует о том, что иммуномодифи-цирутощее действие проявляется на уровне клеток-предшественников.

Вторичные иммунодефицита разнообразны по механизму формирования, индуцировать их развитие могут самые различные факторы экзогенной и эндогенной природы (Р.В.Петров, 1983). Одно нз возможных иммунодефицитных состояний обусловлено действием естественного фактора, ингибнрующего актиность антител класса М (М.В.Земсков с соавт.,1977; Н.В.Журавлева, 1985; Н.В.Журавлева, Н.К.Родосская, 1988). В целях выяснения некоторых возможных механизмов иммуносупрессни при механической травме и

инфицирование ее клостридиями перфрннгснс были проведены эксперименты по изучению ЕИФ.

После нанесения животным механической травамы мягких 1каней (формировалось иммунодефицитное состояние, обусловленное действием ншнбирукнцего фактора. Это явление носило временный характер, ЕИФ определялся на достоверно значимом уровне только через 3 суток после проведения вмешательства в сыворотке крови и экстракте печени.

Заражение животных клостридиями приводило к значительно большей, чем у травмированных мышей, ннгибицнп активности антител тест-сыворотки как исследуемыми сыворотками, так и ВСЭ печени. Это регистрировалось уже через 1 сутки после воспроизведения инфекции в течении 10 суток при тестировании фактора в сыворотке кропи и 5 - в экстракте печени. При этом выраженность иммунодефицита была большей на 3 день проведения исследований по сравнению с таковой у мышей с травмой. Важно отметить, что выраженность и продолжительность ингибирующего эффекта на холилась в прямой зависимости от массивности инфицирования повреженных тканей.

Используя методический прием дифференцированного определения 19S и 7S антител (Е.В.Чернохвостова, 1965), было показано, что снижение титров антител тест-сыворотки при проведении определения ЕИФ в условиях постановки наших экспериментов обусловлено инги-бинней активности именно иммуноглобулинов класса М.

Изучение ингибиции активности гетерогенных антител in vivo после проведения.пассивной иммунизации показало, что несмотря на наличие в сыворотке крови мышей с механической травмой ЕИФ уровни противосальмонеллезных антител в циркуляции существенным изменениям по сравнению с таковыми у ннтактных животных подвержены не были.

В то же время после введения в размозженные мягкие ткани клос-трн;шй перфрннгенс ситуация существенно менялась, что выражалось в значительном снижении титров антител после проведения пассивной иммунизации. При этом выраженность изменений зависела от целого ряда причин : количества микробных клеток, использовавшихся для воспроизведения инфекции, соотношения по времени проведения заражения и иммунизации, времени, прошедшего от введения сыворотки до осуществления исследований. Выраженность снижения содержания в сыворотке крови антител находилась в прямой зависимости от величины дозы инфекта. При отдалении времени введения сыворотки от воспроиведения инфекции интенсивность ингибирующего эффекта снижалась. Выраженность изменения содержания в сыворотке крови антител была значительно больше

через 2, чем через 1 сутки после их введения по сравнешпо с иитактными и травмированными мышами. Эти факты сходны с результатами исследований, проведенных Н.В.Журавлевой с соавторами (1979,1988), можно согласиться с мнением, что при наличии ингибирующего фактора существенно снижается авндность антител. У животных с анаэробной газовой инфекцией наблюдалась взаимосвязь между уровнями антител в сыворотке крови и наличием в этой биологической жидкости ЕИФ. Максимальная выраженность снижения титров антител наблюдалась на 1-3 сутки после заражения животных клостридиями перфрингенс, то есть в то же самое время, когда содержание фактора в сыворотке крови было наиболее высоким.

Возможность формирования нммунодефицитного состояния, обусловленного действием ЕИФ, доказана при самых различных нозологических формах заболеваний, после проведения кровопусканий, иммунизацией малыми дозами бактериальных препаратов, введения иистеина, гидрокортизона и ряда лекарственных препаратов (Н.В.Журавлева, 1970; Н.В.Журавлева с соавт., 1982; А.Н.Горяйнова, 1985; В.В.Сорелля, 1985; А.А.Шепелёв с соавт., 1989, 1990). Таким образом, этот иммунодефицит имеет широкое распространение и является вполне возможным развитие анаэробной газовой инфекции на фоне состояния, когда функционирует ЕИФ. Поэтому было проведено изучение влияния механической травмы и ее инфицирования клостридиями перфрингенс на ингибирование активности антител, в которых предварительно индуцировали появление фактора путем проведения кровопусканий или введением цистеина.

Проведение пяти кровопусканий с интервалом в пять суток в объеме 0,5% массы тела животных вызывало формирование нммунодефицитного состояния, обусловленного действием ЕИФ. После нанесения механической травмы выраженность его возрастала, но продолжительность наличия не увеличивалась по сравнению с иитактными мышами.

У животных с анаэробной газовой инфекцией уже после проведения четырех и в еще более выраженной степени пяти кровопусканий ре-гистрировалось более значимое повышение величин ИИ активности антител, чем в контрольных группах и у инфицированных животных, которым кровопускания не проводились. После заражения увеличивалась продолжительность выявления ингибирующего фактора в сыворотке крови до 15 суток, когда у интактных и травмированных мышей это наблюдалось только до 5 суток посе проведения пятого кровопускания. При этом через 1 и 5 суток ИИ у инфицированных животных были также значительно выше контрольных. Установлено, что при анаэробной газовой инфекций

после проведения кровопусканий значительно быстрее и в более выраженной степени снижались титры гетерогенных антител в сыворотке крови после осуществления пассивной иммунизации. Таким образом, после воспроизведения инфекции и проведения кровопусканий наблюдалось суммирование эффекта ингибиронания активности антител по времени и степени выраженности, которое проявлялось in vil го и in vivo.

Сходные закономерности влияния механической травмы и изучаемой инфекционной патологии регистрировались и в модельных экспериментах индуцирования появления ^ингибирующего фактора введением солянокислого цистенна. Моделирование ннгнбнрующей активности сыворотки крови в отношении иммуноглобулинов класса М циетеином подтверждает вывод Н.В.Журавлсвой (1979) о том ,что активность ЕИФ в основном связана с повышением содержания этой аминокислоты - донатора SH-групп, так как во всех группах животных этих серий экспериментов величины ИИ были значительно выше таковых в соответствующих контрольных и опытных группах, которые препарат не получали. Наиболее выраженные изменения регистрировались у животных с анаэробной газовой инфекцией в период с 1 по 10 сутки. При этом величины ИИ были значительно выше таковых у инфицированных мышей, которым препарат не вводился. Под действием цистеина существенно снижалось количество антител в сыворотке крови животных после их пассивной иммунизации. В значительно большей степени это наблюдалось после введения в поврежденные ткани клостридий, в этом случае титры гетерогенных антител были значительно ниже, чем в обеих контрольных группах, получавших препарат, и инфицированных, которым он не вводился. Интенсивность снижения антител после введения цистенна находилась в прямой зависимости от содержания в сыворотке крови ингибирующего фактора. Это свидетельствует о том, что иигибиция активности пассивно получаемых антител связана с действием ЕИФ.' Таким образом, инфекция, вызванная клострндиями перфрингснс, в значительной степени усугубляет выраженность и продолжительность иммунодефицитного состояния, обусловленного действием ингибирующего фактора, появление которого предварительно индуцировали введением солянокислого цистенна.

Проведенные исследования показали, что при механической травме и особенно после инфицирования ее клостридиями перфрингенс формируется временное иммунодефнцнтное состояние, связанное с функционированием ЕИФ. Выраженность иммунодефицита и его продолжительность находятся в прямой зависимости от массивности инфицирования поврежденных тканей. Фактор определяется в печени

я сыворотке крови, проявляет ингибирующий эффект толькЬ в гшошешш антител класса М, значительно снижая их авидность.

Функционирование фактора является неблагоприятным моментом, который может в определенной степени угнетать формирование иммунитета. Возможно, что ингибирующий эффект в отношении антител обусловливает низкое терапевтическое действие антитоксических зротивогангренозных сывороток при лечении заболевания (В.Яо(1й^ а1., 1972; О.М.Оа\зез,1979), так как лечебные сыворотки жазываются терапевтически не эффективными, если не содержат лакроглобулиновых антител (Е.В.Ченохвостова, 1965). Все это :видете:п>ствуст о необходимости своевременного выявления тммунодефицптного состояния, связанного с действием ЕИФ, при шаэробной газовой инфекции, что может быть с успехом эсуществлсно с помощью разработанного нами способа.

В итоге можно сделать заключение о иммуномодифицирующем действии анаэробной газовой инфекции, вызванной клостридиями перфрингенс типа А. Изменения в иммунологическом реагировании »ависят от выраженности течения и периода развития заболевания, юстояния иммунной системы и фазы формирования популяции штителопродуцентов во время воздействия инфекционного агента, 7рироды антигена, стимулировавшего иммунный ответ. Одной из тричин иммуносупрессии при этой инфекционной патологии является функционирование естественного фактора, ингибирующего зктивность антител класса М.

вьгеоды

1. При экспериментальной анаэробной газовой инфекции, зызванной клостридиями перфрингенс типа А, возможно .юднфпцнрование первичного иммунного ответа, которое может иметь зазлнчную выраж'енность и даже противоположную направленность в ггорону иммуносупрессии или активации иммуногенеза.

2. Направленность и выраженность иммуномодцфицирующих )ффектов после заражения животных клостридиями перфрингенс ¡авнеят от массивности инфицирования поврежденных мягких тканей, временного соотношения воспроизведения инфекции и проведения иммунизации, периода формирования популяции штителообразукших клеток, природы антигена.

3. Для первичного иммунного ответа при анаэробной газовой тфекции в условиях, когда антигенная стимуляция предшествует формированию патологического процесса, вызванного клостридиями

перфрингенс, как правило, характерна стимуляция иммуногенеза, а после осуществления иммунизации на. фоне выраженной токсической фазы .. . заболевания наблюдается снижение количества ангптелопродуцентов. У реконвалесцентов формируется состояние готовности к более выраженному иммунологическому реагированию.

4. Иммуномодцфицирутощее действие инфекции, вызванной клостридиями перфрингенс, на кинетику формирования популяции клеток, синтезирующих антитела к гаптену, в системе первичного иммунного ответа на тимуснезависимые и тимуезавнеимые антигены проявляется на уровне клеток-предшественников анппелопродуцентов.

5. В более выраженной степени модифицирование первичного иммунного ответа при анаэробной газовой инфекции наблюдается на тпмуезавнеимый антиген, что свидетельствует о значительном влиянии ее на Т-систему иммунитета..

6. Перфторуглеродная эмульсия перфторан значительно увеличивает резистентность животных к клостридиям перфрингенс. Препарат обладает существенным иммуностимулирующим действием, по не влияет на'выраженность количественных сдвигов .со стороны аитнтелообразующих .клеток в системе первичного иммунного ответа, характерных для механической травмы мягких тканей и анаэробной газовой инфекции.

7. Экспериментальная механическая травма мягких тканей способствует формированию иммунодефнцнтного состояния, обусловленного действием естественного фактора, ингибирующего активность иммуноглобулинов класса М, увеличению его выраженности и продолжительности после предварительной индукции.

8. После инфицирования поврежденнных мягких тканей клостри-диями перфрингенс возрастает содержание и продолжительность выявления в сыворотке крови и экстрактах печени фактора, ингибирующего активность антител класса М. Степень выраженности и время проявления ингибирующего эффекта находится в прямо!! зависимости от количества микробных клеток, используемых для воспроизведения инфекции.

9. Развитие инфекции, вызванной клостридиями перфрингенс, в значительной степени усугубляет выраженность и увеличивает продолжительность предварительно моделированного проведением дробных кровопускании или введением солянокислого цистеина иммунодефнцнтного состояния, связанного с функционированием естественного щи ибпруюшего фактора.

10. Угнетающее действие на активность иммуноглобулинов класса М у животных с анаэробной газовой инфекцией проявляется ¡11

vitro в отношен«» антител тест-сыворотки и in vivo в отношении гетерогенных антител, получаемых в результате проведения пассивной иммунизации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные результаты, свндетельстввутощие о значительном влиянии анаэробной газовой инфекции, вызванной клостридиями перфрннгенс, на иммунологическую реактивность, диктуют необходимость проведения при этой инфекционной патологии оценки иммунного статуса, что позволит более объективно оценить состояние больного, прогнозировать течение, возможность развития осложнений, исходы и назначать соответствующую коррегнрующую терапию.

2. Установление выраженного терапевтического эффекта пер-фторуглеродной эмульсии перфторана, что заключается в значительном увеличении выживаемости и продолжительности жизни животных после заражения клостридиями перфрннгенс, позволяет рекомендовать этот препарат для клинической апробации при лечении анаэробной газовой инфекции.

3. Введение в практику работы научно-исследовательских и лечебно-профилактических учреждений способа определения естественного фактора, ингибнрующего активность антител класса М, обогатит арсенал научных сотрудников и практических врачей новым, информативным и доступным методом оценки иммунного статуса.

4. Разработанный способ моделирования анаэробной газовой инфекции может быть с успехом использован для изучения патогенеза, саногенеза, разработки средств терапии и профилактики этого заболевания в условиях массивного инфицирования клостридиями перфрннгенс.

СПИСОК

научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Выживаемость крыс Внстар при заражении клостридиями перфрннгенс в зависимости от содержания белка в рационе питания. -Астрахань, 1985. - 9 с. - Деп. в ВИНИТИ 28.02.85. № 1556-В 85 (Соавт. Е.В.Матвеев, С.В.Колодина, Ю.А.Черемин).

2. Ингибнцня активности антител сальмонеллезной тест- сыворотки в РНГА сывороткой крови и экстрактами органов мышей с экспериментальной газовой инфекцией, вызванной клостридиями

перфриш спс штамма ВР6К. - Астрт\;шь, 1986. - 17 с. - Деп. в ВИНИТИ 17.12.86 № 8691-В 86.

3. Естественное ингибироваппе активности антител . рп экспериментальной анаэробной газовой ннфскнин И Тез. докл. к предстоящей 68-й областной научно-практической конференции медиков Астраханской области. - Астрахань, 1986. - с. 82-83 (Соавт. С.В.Колодина).

4. Динамика количества ядросодержащнх клеток селезенки мы-кей при экспериментальной газовой гангрене и иммунизации эршро-уцами барана, // Тез. доклад 68-й итоговой научной сессии :отрудников ин-та и обл. научно-практ. конф. врачей Астраханской шласти. - Астрахань, 1987.-е. 207-208 (Соавт. В.И.Миталев).

5. Индуцирование пенициллином выработки естественного Ьактора ингибирования активности иакромодекулярных антител ласса М.-Астрахань, 1987,- 14 с. - Деп. в ВИНИТИ 17.12.87 № 8899! 87 (Соавт. Л.Н.Патерикина).

6. Влияние инфицирования экспериментальной травмы клостри-иями перфрннгенс типа А на продуктивную фазу иммуногенеза. -Астрахань, 1987. - 20 с. - Деп. в ВИНИТИ 17.12.87 № 8900-В 87.

7. Модифицирование первичного иммунного ответа при нфнцировании экспериментальной травмы клотридими перфрингенс ила А. - Астрахань, 1988. - 22 с. - Деп. в ВИНИТИ 26.01.88 № 700-В

8. Функционирование естественного фактора ингибирования аивности антител при экспериментальной травме и пенициллиноте-1пии. - Астрахань, 1988. - 15 с. - Деп. в ВИНИТИ 26. 01.88 № 701-В 88 л>авт. Л.Н.Патерикина).

9. Изучение влияния перфторуглеродной эмульсии на течение и :ход экспериментальной анаэробной газовой инфекции, вызванной юстридиями перфрингенс типа А. - Астрахань, 1988. - 14 с. - Деп. в ¡4 НИТИ 26.01.88 № 702-В 88 (Соавт. А.Б.Матвеев, С.В.Колодина).

10. Методика и преимугцетсва определения естественного жтора ингибиции активности антител класса М в РНГА. -.трахань, 1988. - 14 с. - Деп. в ВИНИТИ 19.08.88 № 6644-В 88 (Соавт. В.Колодина, Л.Н.Патерикина).

11. Агармнграцнонная активность кариоцнтов селезенки мышеи, ренесишх анаэробную газовую инфекцию. - Астрахань, 1988. - 4 с.-п. в ВИНИТИ 18.10.88 №7494-В 88.

12. Влияние на каррагиновое воспаление экспериментальной ¡шмы и ее инфицирования клостридиями перфрингенс. - Астрахань,

- 11 с. - Деп. в ВИНИТИ 17.02,89. № 1023-В 89 (Соавт. И.Стемпковская). •

13. Тестирование естественного фактора ннгибиции активности антител в РИГА. // Изобретательство и рационализация в медицине. Респ. сборник наччных трудов/ Под.ред. В.Н.Ярыгина. - М.: 2-й МОЛГМИ им. Н.Й.Пирогова, 1989. - С. 25-27 (Соавт. С.В.Колодина).

14. Способ получения взвесей клостридий перфрингенс определенной концентрации.// Аннотнр. указатель рац. предложении Аст])а\а11ского мед. ин-га, НИИ по изучению лепры и врачей области. Т.Ш. - Астрахань, 1989. - С. 5.

15. Способ получения биомассы микробных клеток клостридий перфрингенс. // Аннотнр. указатель рац. предложений Астраханского мед. ин-та, НИИ по изучению лепры и врачей области. Т.Ш. -Астрахань, 1989.-С. 5-6.

16. Способ определения естественного фактора, йнгнбнрующего активность макромолскулярных антител. И Аннотир. указатель рац. предложений Астраханского мед. ин-та, НИИ по изучению лепры и врачей области. Т.Ш. - Астрахань, 1989. - С. 28-29. (Соавт. С.В.Колодина).

17. Способ тестирования ЕИФ в РНГА. // Аннотир. указатель рац. предложений Астраханского мед. ин-та, НИИ по иученшо лепры и врачей области. Т.Ш. - Астрахань, 1989. - С.- 34. (Соавт. С.В.Колодина).

18. Способ определения естественного йнгнбнрующего фактора в экстрактах органов. // Аннотир. указатель рац. предложений Астаханского мед. ин-та, НИИ по изучению лепры и врачей области. Т.Ш. - Астрахань, 1989. - С. 34-35. (Соавт. Л.Н.Патерикина).

19. Способ одновременного титрования нормальных и иммунных гемолизинов.// Аннотир. указатель рац. предложений Астраханского мед. ин-та, НИИ по изучению лепры и врачей области. Т.Ш. - Астрахань, 1989. - С. 42.

20. Способ титрования гемагглзотшшнов.// Аннотир. указатель рац. предложений Астраханского мед. ин-та, НИИ по изучению лепры и врачей области. Т.Ш. - Астрахань, 1989. - С. 42-43.

21. Способ оценки иммуносупресии при инфицировании мягких тканей. //Аннотир. указатель рац. предложений Астраханского мед. ин-та, НИИ по изучению лепры и врачей области. Т.Ш. - Астрахань, 1989. - С. 46-47,(Соавт. Л.Н.Патерикина).

22. Способ определения антителобразующих клеток при экспериментальной инфекции клостридий перфрингенс.//Аннотир. указатель рац. предложений Астраханского мед. ин-та, НИИ по изучению лепры и врачей области. Т.Ш. - Астрахань, 1989. - С. 57-58.

23. Способ индикации клостридий перфрингенс по видоспецнфи-ческим антигенам при раневой инфекции.//Аннотир. указатель рац.

преатожешш Астраханского мед. ил-га, НИИ по изученшо лепры п врачей . области., ТкЩ. - Астрахань, 1989. - С. 64-65. (Соавт. С.Т.Ганнулин,, Л.Н.Патерикина).

2.4. Определение естественного фактора ингпбирования активно стп'ашнтсл класса М с помощью РИГА. - Ред. Ж.Лаб.дело, 1989. - 5 с. - Деп. н ВИНИТИ 12.09.89. №5826-В 89.(Соавт. С.В.Колодина).

25. Деполимеризация макромолекул иммуноглобулина класса М íi) vilro. //Тез. докл. обл. научно-практ. конф. сотр. мед. ин-'ra н врачей Астраханской обл. - Астрахань, 1990. - С.259-260.

26. Вторичный иммунодефицит, обусловленный действием сеюстчешюго иигибирующего фактора (ЕИФ) активности антител при инфекционной патологии.// Тез. докл. Всесоюзн. конф. " Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний". -Звенигород, 1990. - С. [28 (Соавт. С.В.Колодина, Л.Н.Патерпкина,

B.А.Шепелев, В.И.Миталев, П.И.Чупров).

27. Иммуноэлекгрофоретическое выявление клостридий пер(|)рннгенс в клиническом материале.// Тез. докл. IV съеда врачей и провизоров КалмАССР. - Элиста, 1990. - С. 106-107. (Соавт.

C.В.Колодина, Н.А.Панова).

28. Клострцдии перфрингенс в слюне полости рта при гальвано-зе.// Стоматология. - 1991. - № 5. - С. 20-21.

29. Клиническое значение выявления вторичного иммунодефицита, обусловленного действием естественного фактора ингибиции акт ивности антител класса М.// Тез. докл. обл. научно-практ. кош]), и сотр. ин-та и врачей Астраханской области. - Астрахань, 1991.- С. 216217. (Соавт. В.В.Белопасов, А.В.Болдырев, С.В.Колодина, О.Б.Мамиев, Г.А.Трубников, П.И.Чупров).

30. Определение естественного фактора ингибиции активности :|нппел класса М (Методические рекомендации). - Астрахань, 1991.- 6

(Соавт. С.В.Колодина).

31. Преимущество определения естественного фактора шгибшиш активности антител класса М с помощью РНГА.// Естественное ингибнрование активности и подавления синтеза штител класса М ( Материалы экспериментальных и клинических ^следований): Сборник научн. тр. - Саратов, 1993. С.69-72. (Соавт. З.В.Колодина),

32. Оценка фагоцитарной активности перитонеальных макрофа-ов мышей, зараженных клостридиями перфрингенс.// Тез. докл. I ьездн иммунологов России. - Новосибирск, 1992. - С. 555. (Соавт. '.Ф.Вншнеиецкнй).

33. Экспрессия маннозо-фукозных рецепторов на мембранах ерпгонеальных макрофагов мышей, зараженных клостридиями перф-

рпнгсис.// Материалы юбилейной научи, конф. Астраханского гос. мед. ин-та (к 75-летню со дня основания). - Астрахань, 1993. - С. 316-317. (Соавт. Р.Ф.Вишневецкий).

34. Ингибированне активности антител класса M при гнойно-септических заболеваниях у детей.// Эпидемиология, клиника, диагностика, профилактика и лечение важнейших инфекционных болезней ( Материалы конф.). - Тамбов-Астрахань, 1994. - С. 140-141. (Соавт. П.И.Чупров, В.Л.Красилов, О.К.Кирилочев, А.В.Буркин).

35. Влияние анаэробной газовой инфекции, вызванной клостри-диямн перфрингенс типа А, на выраженность иммунодефнцнтных состояний, индуцированного кровопусканиями или введением цистсина.// Тез. докл. заседания Астраханского обл. научи, общества иммунологов. - Астрахань, 1994. - С. 10-11.

36. Объективная оцеш<а содержания иммуноглобулинов- класса M в биологических жидкостях.// Тез. докл. заседания Астраханского обл. научи, общества иммунологов. - Астрахань, 1994. - С. 11-12. (Соавт. С.И.Матвеева.).

ИЗОБРЕТЕНИЯ

1.Способ определения естественного фактора ингибиции активности антител класса М: A.c. 1486929 AI СССР, МКИ4 01 №33/53/ А.А.Шепелёв, С.В.Колодина (СССР).-4 с.

2. Способ диагностики сепсиса у новорожденных: A.c. 1681260 AI СССР, МКИ4 01 №33/53/ Н.Н.Силищева, О.К.Кирилочев, А.А.Шепелёв (СССР).-З с.

3. Способ моделирования анаэробной газовыой инфекции, вызываемой клосгриднями nqxjjpnnrenc типа А: A.c. 1679529 AI СССР, МКИ4 01 №33/53/ А.А.Шепелёв, (СССР).-2 с.

РАЦИОНАЛИЗАТОРСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ ОТРАСЛЕВОГО

ЗНАЧЕНИЯ

1.Шепелев A.A., Колоднна C.B. Способ определения естественного фактора ингибирующего активность макромолекулярных антител. 1986, № 0-2756.

2. Шепелев A.A., Патерикина Л.Н. Способ определения иммуно-супрессивного действия пенициллина. 1987, № 0-2886.

РАЦИОНАЛИЗАТОРСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1.Шепелев A.A. Способ получения взвесей клостридий перфрингенс определенной концентрации. 1984, № 664.

2.Шспелёв A.A., Патершаша JT.H. Способ определения естественного фактора ингибнцин активности антител в экстрактах органов. 1986, № 789.

3. Шепелев A.A., Патер икина Л.Н. Способ оценки нммупосупресии при инфицировании травмы мягких тканей. 1987, № 825."

4. Шепелев A.A. Способ титрования гемагглютинииов. 1987, №

813.

5. Шепелев A.A. Способ определения ннтителообра зующих клет ок при экспериментальной инфекции. 1988, № 854.

6. Шепелев A.A., Гайнулин С.Т., Патерикииа Л.Н. Способ индикации клостридий перфрингенс по видоспецифическим антигенам при раневой инфекции. 1988, № 874.

7. Шепелев A.A. Способ обдновременного титрования нормальных и иммунных гемолизинов. 1988, № 812.

8. Шепелев A.A., Чалов В.В., Гайнулин С.Т. Способ приготовления агарового геля для реакции встречного иммуноэлектрофореза. 1988, № 876.

9. Шепелев A.A., Кулагин П.П., Панова H.A. Способ получения прсципитирующей сыворотки к антигенам клостридий перфрингенс типа А. 1989, №915.