Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуно- и гемопоэзмодулирующая роль костномозгового фактора, ингибирующего пролиферативную активность стволовой кроветворной клетки

РГБ ОЛ

2 6 ФЕВ

На правах рукописи

ЧЕРКАШКНА ЛАРИСА ЕАСИЛЬЕЕНА

тмсно- и гвюпоззмэдужрущая роль ксстнс\::егсЕсго

ФАКТОРА, ИНГИЕИРУЩЕГО ПРСЛШЕРАТЛЕНУЕ АКТИЕКОСТЬ СТЕОЛОЕОЙ КРОЕЕТЕОРНОЯ КЛЕТКИ.

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск

1925

Работа выполнена в Институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

член-корреспондент РАМН, профессор В.А.Козлов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук К.В.Гайдуль;

кандидат медицинских наук А.А.Останин

Ведущая организация - НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН

Защита диссертации состоится "_" _ 1996 года

в _ часов на заседании диссертационного совета

Д 001.01.01 Института клинической иммунологии СО РАМН (630091. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан "_" _ 1996 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук ^и^фсс^и.— 0. Т.Кудаева

'С с

Актуальность проблемы.Целенаправленная регуляция иммуногенеза является основной задачей современной иммунологии, которая включает в себя знание механизмов пролиферации и дифференцировки стволовой кроветворной клетки (СКК) .поскольку в регуляции кроветворения и иммуногенеза можно найти много общего : во-первых, согласно современным представлениям.существует общий предшественник для всех ростков гемо-и лимфопоэза (Wu, 1968; Bender, 1988; Kirshenbaum, 1991)) -плюрипотентные СКК (CD34+ учеловека, Thyl+, Lin- у мыши). Во-вторых, изменение функционального состояния иммунной системы(налример,при антигенной стимуляции) сопровождается изменениями функциональной активности СКК (увеличивается пролиферативная и миграционная активность KOEc)(Frindel, 1975; Козлов, 1982). В третьих, хорошо известно, что многие цитокины, которые действуют на ранние стадии кроветворения, в то же время являются иммуномодуляторами и продуцируются иммунокомпетентными клетками. В эту группу регуляторов функциональной активности СКК входят КСФ , интерлейкины , а также факторы, которые можно отнести к негативным регуляторам гемопоэза (TGF0, ФНС, ИОН) .

Однако в литературе имеется немного сведений о влиянии на иммунитет факторов, ингибирующих пролиферативную активность СКК ; например, физиологический негативный регулятор ранних гемопоэтических клеток, TGF3, известен как мощный супрессор пролиферации и функциональной активности лимфоцитов (Kehrl, 1991); ИФН-r, который супрес-сирует in vivo все направления гемопозтической дифференцировки (Вгохшеуег, 1986), активирует моноциты и макрофаги (Natan, 1984) , а также усиливает активность NK-клеток и цитотоксических Т-клеток (Herberman, 1979; Farrar, 1981). Некоторые авторы сообщают о возможности использования в качестве иммуномодулятора ингибитора пролифе-ративной активности СКК (ФИП) (Халдояниди, 1993; Матросова, 1995), который снижает in vivo и in vitro число пролиферирующих костномозговых KOEc у мышей.

Таким образом, гемопоэтические регуляторные цитокины могут контролировать те или иные этапы иммуногенеза, поэтому изучение роли такого ингибитора функциональной активности СКК , как ФИП в формировании гуморального иммуного ответа может быть полезным для понимания закономерностей процессз пролиферации и дифференцировки СКК, а также для поиска новых подходов к регуляции иммунных процессов.путем воздействия на пролиферативную активность КОЕс.

Экспериментальные данные и клинические наблюдения последних лет показали, что иммунологические процессы играют значительную роль в развитии широкого круга нарушений-и заболеваний, связанных со ста-

рением : это различные иммунодефициты , аутоиммунные и онкологические заболевания (Corberand,1981; Makinodan, 1984; Vie, 1986). Возможно, что в ослаблении иммунных функций в процессе старения могут играть роль возрастные ' изменения функциональной активности СКК и ранних гемопоэтических предшественников : показано, что при старении снижается способность к самоподдержанию мышиных (Sca+ Lin WGA+) и человеческих (CD34+ CD45RA10 CD71) стволовых клеток (LansdorfY 1994), а также снижается миграционная активность, но увеличивается пролиферативная активность КОЕс в костном мозге старых животных ( ).

Представляется актуальным выяснить,какую. роль в повышении пролиферативной активности СКК старых мышей может играть такой фактор негативной регуляции, как ФИП, а также изучить возможность коррекции нарушенной пролиферации ранних кроветворных предшественников и связанных с ними нарушений гемо- и иммунопоэза с помощью ФИП,' что предполагает перспективу предупреждения и лечения многих возрастных заболеваний, обусловленных нарушением иммунного гомеостаза.

Цель исследования. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы было изучение зависимости между пролиферативной активностью КОЕс, а также субпопуляционной структурой последних и величиной гуморального иммунного ответа к различным антигенам у молодых и старых мышей.

Для выполнения цели исследования были поставлены следующие

задачи - :

1.Исследовать влияние ФИП на формирование иммунного ответа к вирусным антигенам ( вирус Коксаки А13 и вирус гриппа A/Aichi/2/68).

2.Изучить влияние ФИП на формирование иммунного ответа к эритроцитам барана в условиях повышенной пролиферативной активности СКК,вызванной введением ИЛ-1, тестостерон-пропионата,и при воздействии гипобарической гипоксии.

3.Изучить продукцию стимулирующей и ингибируюцей пролиферацию КОЕс активностей в костном мозге мышей с увеличенной пролиферативной активностью СКК : после введения ИЛ-1 и у старых мышей..

4.Изучить у старых мышец эффект ФИП на субпопуляцпонную структуру КОЕс из костного мозга и селезенки в норме и после антигенной стимуляции, а также оценить влияние ФИП на число АОК в селезенке в процессе формирования иммунного ответа к ЭБ.

Основные результаты исследований и их новизна. На различных экспериментальных моделях показано, что изменение уровня пролиферативной активности СКК сопровождается изменением параметров гуморального иммунного ответа.Полученные результаты свидетельствуют о том, что иммуномодуляторное действие ФИП связано, по-видимому , о его эф-

фектом на ранние гемопоэтические предшественики (КОЕс-5 и КОЕс-8).

Показана связь иммуно-гематологических нарушений с повышен-нш уровнем пролиферативной активности КОЕс у старых животных. Впервые показана принципиальная возможность коррекции возрастных нарушений иммуно- и гемопоээа с помощью фактора, ограничивающего пролифе-ративную активность СКК. Исследованы возможные механизмы иммуномоду-лирующего эффекта изучаемого ингибитора у старых мышей.

Научная и практическая ценность работы. Теоретическая значимость работы заключается в раскрытии новых механизмов регуляции иммунного ответа путем воздействия на функциональное состояние СКК с помощью фактора, ингибирующего пролиферативную активность КОЕс (ФИП). Результаты приведенных экспериментов об иммунорегуляторных эффектах ФИП свидетельствуют о существовании еще одного звена в сети регуляторов иммуно- и гемопоэза, что открывает новые возможности для использования в клинической практике фактора, обладающего уникальными свойствами.

Полученные результаты расширяют представления о механизмах изменения иммуно-гематологических параметров у старых мышей, связанных с увеличением пролиферативной активности СКК и обозначают новый подход к коррекции этих изменений с помощью фактора, способного модулировать пролиферативно-дифференцироЕОЧные параметры СКК.

Основные положения, выносимые на защиту.

1.ФИП является регулятором функциональной активности СКК и ' обладает способностью ингибировать пролиферативную активность последних.

2.ФИП является иммуномодулятором в условиях повышенной пролиферативной активности СКК (при введении ИЛ-1, ТСП, а также у старых животных).

Апробация работы и публикации. Апробация диссертации состоялась на расширенном семинаре ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1995). По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на листах машинописного текста, содержит рисунков и таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (главы 1,2), описания мат-риалов и методов (глава 3), результатов исследования (главы 4,5,6), их обсуждения и выводов. Список цитированной литературы включает источника,в том числе иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах были использованы мыши линии СВА,

(CBA/C57B1)F1, BALBc в возрасте 2-3 месяцев, полученные из питомника РАМН "Столбовая".

Экспериментальные воздействия.

Облучение животных проводилось на аппарате РУМ-25 при мощности дозы 0,5 Гр/мин, напряжении 130 кВ, силе тока 10 мА. Летальная доза составляла 7,0-9,5 Гр в соответствии с индивидуальной радиочувствительностью животных используемых линий.

Иммунизация животных производилась 5% эритроцитами барана (ЭБ) (2x10е), внутривенно . Количество антителообразующих клеток (АОК)в селезенках мышей оценивали на 4-е или 5-е" сутки по количеству локальных. зон гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом (Cunningham, 1968).

Для иммунизации использовались :

Вирус КоксаКи А13 (штамм Flores), который культивировали в клетках L-41, титр вируса 6,0 ТЦД 50/0,1 мл.

Коммерческая инактивированная 2-х компонентная гриппозная вакцина, в состав которой входит антигенный вариант вируса А/Аи-чи/2/68 H3N2 .

Фактор, ингибирующий фолиферативную активность КОЕс (ФИП), получали из фракционированного супернатанта костного мозга свиней. Полученный в результате очистки хроматографией на обращенно-фазовом сорбенте продукт был гомогенен по данным электрофореза в полиакрила-мидном геле. Максимальная ингибиторная активность содержалась во фракции весом 17 кД .которая и была использована как ингибитор про-лиферативной активности КОЕс. Исследования показали, что ФИП ингиби-рует пролиферацию КОЕс в дозах 1,0-0,001 мкг/мл in vitro , при введении ФИП in vivo , он был активен в дозах 1,0-0,01 мкг/мышь.

Моделирование повышенной пролиферативной активности КОЕс у животных :

Вводили однократно внутрибрюшинно тестостерон-пропионат в дозе ЮОмг/кг за 4-18 часов до забоя животных, так как по литературным данным эта доза вызывает Ч/же через 2 часа увеличение КОЕс в S-фазе до 30-40%, причем действие препарата на стволовые клетки сохраняется на протяжении 7 дней (Byron, 1970; Цырлова, 1977).

В экспериментах in vivo применяли нативный мышиный ИЛ-1, полученный д.м.н. Ханферяном P.A. из перитонеальных макрофагов мышей (CBA/C57B1)F1, стимулированных ЛПС E.coli. в дозе 25 мкг/мл. Тестирование активности полученного препарата проводилось совместно с д.б.н. Громыхиной Н.Ю. ИЛ-1 вводили в количестве 4мкг/мышь (по белку) (Громыхина, 1995) .

Известно, что у старых мышей (18-24 мес.) пролиферативная акт

тивность СКК увеличена (Deitchman, 1975). В наших экспериментах использовались долгоживущие мыши (CBA/C57B1/6)F1 и СБА.

Число КОЕс в-костном мозге и селезенке животных исследовали методом экзогенного колониеобразования в селезенках летально облученных сингенных рецепиентов (Till, 1961).

Число КОЕс, находящихся в фазе синтеза ДНК, определяли методом "тимидинового самоубийства" (Becker, 1965).

Выделение клеток, продуцирующих стимуляторную (СЦК) и ингиби-торную (ИПК) активности в супернатантах клеток костного мозга мышей производилось по методу, описанному Лордом (Lord, 1977). Костномозговую суспензию , полученную от мышей после различных экспериментальных воздействий, наслаивали на вершину ступенчатого градиента плотности бычьего сывороточного альбумина (БСА). Известно, что клетки, продуцирующие стимуляторную активнбсть, .концентрируются в плотности 1,078 г/мл, а клетки, продуцирующие ингибиторную активность, в плотности 1,062 г/мл (Wright, 1979). Наслоенные на поверхность градиента ЕСА клетки костного мозга (90х10б кл/мл) центрифугировались при 150 об/мин в течение 30 мин. при 4° С. Разделенные клетки осторожно снимались пастеровской пипеткой, отмывались в фосфатном буфере и инкубировались в среде RPMI 1640 с 10% FCS (7-10x10е кл/мл) в течение 18-20 часов при 37° С. Затем клетки осаждались центрифугированием, и полученные супернатанты тестировались на наличие стимуляторной и ингибиторнсй активностей.

Тестирование супернатантов, полученных из популяции клеток костного мозга. Кондиционную среду от клеток с плотностью 1,062 инкубировали в течение 4-х часов (Tejero, 1984) с суспензией клеток костного мозга (ККМ) , выделенных от мышей, которым вводили ТСП и затем оценивали на наличие ингибиторной активности в тесте подавления ТСП-индуцированной повышенной пролиферативной активности КОЕс. Кондиционную среду от клеток с плотностью 1,078 инкубировали в течение 2-х часов с клетками интактного костного мозга (с низким уровнем пролиферации), а затем оценивали на наличие стимуляторной активности по способности увеличивать количество КОЕс в S-фазе у интактных мышей..

Достоверность данных оценивали по критерию Стьюдента при р<0,05; р<0,01.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что процесс формирования иммунного ответа на антиген сопровождается изменением функциональной активности ранних гемо-

- б -

поэтических предшествеников и их вовлечением в процессы антителоге-неза : по-видимому, практически любое антигенное воздействие вызывает усиление пролиферативной активности СКК костного мозга и селезенки и повышенние миграции КОЕс из костного мозга в селезенку (Frin-del, 1973; Козлов, 1982),'при этом увеличивается число предшественников как эритроидного, так и лимфоцитарно-миелоидного направления дифференцировки (Cheers, 1988; Young, 1986). Так как уровень пролиферативной активности КОЕс зависит от соответствующих гемопоэти-ческих факторов, нельзя исключить возможности участия в этих процессах близкодействующих регуляторов пролиферации СКК, описанных Lord (1985). Изучение продукции активностей, стимулирующей и ингибирующей пролиферативную активность КОЕс показало, что в костном мозге мышек во время антигенной стимуляции 5% ЭБ (Цырлова, 1989) прекращается синтез ингибитора пролиферативной активности СКК. Можно предположить, что величина иммунного ответа будет корригироваться с помощью воздействий, ограничивающих пролиферацию стволовой кроветворной клетки.

Чтобы выяснить, оказывает ли ФИП влияние на развитие гуморального иммунного ответа у мышей (CEAxC57El/6)Fl к такому антигену, как ЭБ, мы использовали сочетанное введение фактора и разных доз антигена. Иммунный ответ к ЭБ (в концентрации 5% и 50%) оценивали по числу АОК в селезенке на 4-е и 5-е сутки после иммунизации. Фактор вводили трижды : за 1 сутки до антигена, в день иммунизации и через 1 сутки после иммунизации. Из данных, представленных на рис.1, следует, что введение ФИП In vivo мышам не отражалось на формировании IgM АОК в селезенке при использовании 5% ЭБ. Не наблюдается стимулирующий эффект на 4-е сутки после введения большой дозы антигена (50% ЭБ), однако заметно резкое увеличение числа АОК в группе, получавшей ФИП на 5-е сутки после иммунизации 50% ЭБ. По-видимому.возрастание дозы антигена приводит к усилению пролиферативной активности СКК, и, возможно, в более ранние сроки, что увеличивает число КОЕс, которые под влиянием ФИП потенциально могут дифференцироваться в иммунекомпетентные клетки. Литературные (Халдояниди, 1993) и собственные данные свидетельствуют о том, что, по-видимому, ФИП действует только на популяцию пролиферирующих КОЕс. С другой стороны, показано (Цырлова, 1989), что пик пролиферации КОЕс в костном мозге в ответ на стимуляцию 5Z ЭБ приходится на 4-е сутки .Поэтому отсутствие эффекта ФИП на продукцию IgM АОК, определяемых в селезенке на 4-е сутки, можно объяснить тем, что во время формирования иммунного ответа в первые сутки антигенной стимуляции отсутствуют клетки-мишени (КОЕс, находящиеся в S-фазе).

Многие антигены , в том числе и ЭБ, индуцируют сдвиги в костномозговой популяции позднее, чем в селезеночной,но существуют антигены (например, бактериальные) , иммунизация которыми приводит к значительной стимуляции пролиферации костномозговых КОЕс уже в ранние сроки : так, через 4 часа после инъекции 1мг вакцины ЕЦЖ 40% КОЕс костного мозга находилось в З-фазе клеточного цикла (РоиШаг!:, 1976); введение мышам бактериального эндотоксина приводило к увеличен™ пропорции пролиферирующих КОЕс в костном мозге через 72 часа (ЦиеэепЬеггу, 1973).

Поэтому целью следующих экспериментов было исследование влияния ФИП на формирование иммунного ответа к вирусным антигенам. Для иммунизации был выбран вирус Коксаки А13 , который вводился внутриб-рюшинно трижды, с интервалом в 2 дня (Ильенко, 1977). ФИП, в дозе 1 мг на мышь вводили внутрибрюшинно в день первой иммуннизации и затем на 3, 6 сутки после заражения вирусом. На 9-е сутки определяли в сыворотке наличие вируснейтрализующих антител (Ворошилова, 1964). На рис.2а) видно, что ФИП в 4 раза увеличивал продукцию нейтрализующих антител к вирусу Коксаки А13.

Е следующей серии экспериментов были проведены исследования с целью изучить влияние ФИП на иммунный ответ при его введении с коммерческой инактивированной 2-х компонентной гриппозной вакциной, которую вводили однократно,внутрибрюшинно; ФИП вводили внутрибрюшинно трижды : одновременно с вакциной, через 24 и 72 часа в дозе 0,05 мкг/мышь. На 7-й день после вакцинации определяли количество вируснейтрализующих антиел. Как видно из данных, представленных на рис.2 б) , в группе животных , получавших вакцину вместе с препаратом ФИП, число антител к гемагглютинину вируса гриппа, содержащемуся в вакцине, было в 3 раза выше, чем у животных, получавших одну вакцину.

По-видимому, введение ФИП мышам на фоне развития иммунного ответа к вирусному (вирус Коксаки А13 и гриппа А/А1сМ/2/68) и чужеродному антигену (ЭБ) снижает пролиферативную активность костномозговых КОЕс, изменяя их пролиферативные и дифференцировочные потенции, так как было показано, что инкубация клеток костного мозга,выделенных на 4-е сутки от мышей, стимулированных 5% ЭБ) с ФИП снижало число ранних эритроидных предшественников, но увеличивало число мо-ноцитарно-гранулоцитарных предшественников (КОЕ-ГМ) и предшественников В-лимфоцитов (КОЕ-В) (Халдояниди, 1993). Для того, чтобы количественные и качественные изменения, произошедшие под действием Ш1 в костном мозге могли проявиться на уровне иммунокомпетентных клеток, по-видголому, необходимо определенное время : поэтому мы не могли наблюдать эффект фактора на формирование ^-М АОК в ответ на 5%

Рис.1.

ВЛИЯНИЕ «ИП НА ФОРМИРОВАНИЕ АОК В СЕЛЕЗЕНКАХ МЫШЕЙ ИМИУНИЭИРОВАННЬК ЭБ.

В* ЭБ 60» ЭБ

Рис.2.

ВЛИЯНИЕ ♦ИП НА ФОРМИРОВАНИЕ ИМЕННОГО ОТВЕТА К ВИРУСНЫМ АНТИГЕНАМ.

РисЗ.

»нру« мрус КоксакиАП ФИП

»«шин» »»кимн»

Л|Л1СН1И)«1 «ип

СО I

ВЛИЯНИЕ СОВМЕСТНОГО ВВЕДЕНИЯ ТПС И ФИП НА АНТИТЕЛО-ОБРАЗОВАНИЕ В СЕЛЕЗЕНКАХ МЫШЕЙ (СВлхСЯВ1.

ЕЗЗ

контроль

РРЗЪ

ТСП

Б5Н

ТСГНФИП

АОК/ю теток селезенки

АО)Сс«пвз«н»у * 10

* - здесь и далее различия достоверны при р< 0,05 ** - различия достоверны при р? 0,01

ЭБ, но получили 3-4 кратное увеличение под воздействием ФИП вирус-нейтрализующих антител, которые определяются в более отдаленные сроки - на 7-9 сутки после антигенной стимуляции.

Обобщая вышеприведенные экспериментальные данные, можно предположить, что иммуномодуляторные свойства ФИП могут зависеть от его способности снижать пролиферативную активность КОЕс. Поэтому следующим шагом в изучении влияния ФИП на антителогенез было исследование последствий его применения в условиях повышенной вследствие разных экспериментальных воздействий пролиферативной активности СКК.

Многие авторы, исследуя влияние андрогенов на гемопоэз', указывают на их способность усиливать пролиферативную активность- СКК (Byron, 1972; Shahidi, 1973; Gorshein, 1974; Козлов, 1982)./По всей вероятности, стимулирующий эффект тестостерона на пролиферативную активность СКК обусловлен наличием у стволовых клеток специфических рецепторов для этого гормона (Byron, 1975). Перечисленные эффекты тестостерона на гемопоэтическую ткань позволили нам выбрать его для моделирования повышенной пролиферативной активности СКК.

Нами были выполнены эксперименты с целью определить пролиферативную активность КОЕс-5, КОЕс-8, КОЕс-12 после воздействия тес-тост ерон-пропионата (ТСП), а также выяснить возможность отмены его эффекта . на кроветворные клетки их последующей обработкой ФИП. Для этого суспензию ККМ из бедренных костей мышей (СВА/С57В1)Fl,получивших иньекцию ТСП, инкубировали с ФИП в дозе 0,1мкг/107 ККМ в термостате при 37°С в течение 4-х часов.Затем клетки отмывали средой 199 и вводили внутривенно летально облученным сингенным рецепиентам. Процент пролиферирующих КОЕс определяли методом "тимидинового самоубийства". Полученные результаты представлении в Табл.1.

Влияние ФИП на пролиферативную активность разных субпопуляций КОЕс из костного мозга мышей (СБА С57ВЬ/6)И, стимулированных ТСП.

Таблица 1.

Субпопуляции КОЕс

Число КОЕс на 10 ККМ (М+м) КОЕс в Р без Н-тимидина с Н-тимидином Б-фазе,%

КОЕс-5 после ТСП КОЕс-5 после ТСП+ФИП КОЕс-8 после ТСП КОЕс-8 после ТСП+ФИП КОЕс-12 после ТСП

14,87+0,78 8,72+0,65 41,1 0,001

15,76+0,91 12-,32+1,10 21,8 0,05

19,67+1,34 13,14+1,20 33,2 0,01

20,36+0,70 20,67+0,99 0,0 0,05

8,94+1,18 9,80+1,34 0,0 0.05'

Видно, что введение ТСП опытным животным значителен увеличи-

вало число пролиферирующих КОЕс-5 и КОЕс-8 . В популяции КОЕс-12 не наблюдалось изменения пролиферативной активности после воздействия ТСП', т.е., действие андрогена в данных экспериментальных условиях на эту субпопуляцию не проявилось.

Инкубация клеточной суспензии ККМ, содержащей активно проли-ферирующие КОЕс, с ФИП отменяла повышение пролиферативной активности КОЕс-8 и снижало число пролиферирующих КОЕс-5 на 53%.

Многие исследователи указывают на выраженный иммунодепрес-сивный эффект тестостерона: одни (Ко1ап1,1975) отмечают стойкое снижение гуморального иммунного ответа, измеряемого по титрам антител, другие (Цырлова,1987) наблюдали снижение антителопродуцентов в селезенках мышей,иммунизированных 5% ЭБ через 2 часа,3 и 8 суток после введения ТСП.

В связи с изложенными фактами нам представлялось важным изучить возможность коррекции сниженной антителообразующеп способности у мышей после введения ТСП с помощью фактора, ингибирующего пролифе-ративную активность СКК, для чего ТСП в дозе 100 мг/кг вводили вну^-рибрюшинно один раз за 3-е суток до иммунизации мышей 5% ЭБ.- В -опытной группе животные получали инъекции ФИП в дозе 0,05 мкг/мышь в течение 3 дней до и на следующий день после введения антигена. Контрольная группа животных получала адекватное количество среды 199. Число АОК определялось на 4-е сутки после введения антигена .

На рис.3 представлены результаты влияния совместного введения мышам ФИП и ТСП на формирование иммунного ответа к 5% ЭБ. На 3-й сутки после инъекции ТСП наблюдалось достоверное снижение числа ан-тителопродуцирующих клеток у ТСП-индуцированных животных (50719+6861) по сравнению с интактными животными (92242+10465) . В группе мышей, которым вводили ТСП и ФИП, мы наблюдали отмену негативного эффекта гормона на антителогенез: абсолютное количество АОК в их селезенках увеличивалось до значений, характерных для контрольных животных (119465+15233) , а относительное число АОК на 106 ядро-содержащих клеток селезенки было даже Еыше (498+71) значении, полученных в контрольной группе (273+43) , что могло быть вызвано сниже-ниём клеточности селезенки у животных, получавших ФИП.

Существует мнение, что иммунодепрессивный эффект гормона связан с его способностью усиливать пролиферативную активность КОЕс, что приводит к укорочению Б-1 периода (Цырлова, 1987) , и делает ге-мопоэтические клетки чувствительными к ЭП, оказывающему свое воздействие только при достаточно коротком Б-1 периоде, так как при длительном 6-1 периоде ЭП претерпевает метаболические изменения с потерей активности (КгеЬсЬтаг,1986). Поэтому увеличение в костном

могзе числа пролиферирующих КОЕс может приводить к накоплению ранних эритроидных предшественников, которые , как это показано Чегляковой (1986) .оказывают иммуносупрессивный эффект на антителогенез. Поэтому ограничение пролиферативной активности КОЕс и, как следствие, ограничение эритроидного ростка с помощью ФИП, должно было иметь положительный эффект на величину иммунного ответа.

Еозможно также , что под действием ФИП КОЕс становятся более чувствительными к воздействию таких дифференцировочных факторовв, как ГМ-КСФ, а в условиях антигенной стимуляции и иммуномодуляторов ( в первую очередь интерлейкинов), что предполагает переориентацию диф-ференцировки СКК преимущественно на развитие миелоидного и лимфоид-ного ростков, что и становится предпосылкой полноценного ответа на антиген.

Известно, что антигенная стимуляция приводит к значительному высвобождению из макрофагов и лимфоцитов множества регуляторных ци-токинов, в том числе и ИЛ-1, одного из основных иммуномодуляторов, определяющих величину иммунного ответа. В то же время этот монокин способен стимулировать пролиферацию ранних гемопоэтических предшественников. Показано, что ИЛ-1 стимулирует вступление в S-фазу КОЕс-9 и в дозозависимой манере (при введении in vivo) увеличивает их содержание з костном мозге (в селезенке стимуляция роста КОЕс-9 была незначительна) (Грсмыхина, 1985; Gallicchio, 1989) .

В ряде работ была доказана регуляция пролиферативной активности СКК с помощью факторов макрофагального происхождения, стимулирующего и ингибирующего пролиферацию данной популяции клеток (Lord, 1982; Kczlov, 1987). Мы не исключали возможности влияния ИЛ-1 на продукцию стимуляторной и ингибиторной активностей в костном мозге мышей. Для проверки этого предположения была проведена следующая серия экспериментов. Мышам (CEA/C57B1)F1 вводили ИЛ-1 (4 мкг/мышь) в течение 3 дней, после чего выделяли клетки костного мозга, которые разделяли в градиенте плотностей БСА на клетки, продуцирующие стиму-ляторную активность (СПК) и клетки, продуцирующие ингибиторную активность (ИПК) (Lord,1977).

Из данных, представленных в Табл.2, видно, что у мышей, которые получали иньекции ИЛ-1 СПК теряли свою активность (в отличие от СПК, выделенных от интактных мышей) : обработка клеток костного мозга интактных мышей супернатантом, полученным от СПК обработанных ИЛ-1 животных, практически не изменяла их уровень пролиферации, в то время как супернатант от СПК интактных■мышей увеличивал пролиферацию интактных КОЕс с 12,ВХ до 35,7%. Определение продукции ингибиторной активности в костном мозге обработанных ИЛ-1 мышей показа-

Pm.l.

ВЛИЯНИЕ «ИЛ ЧИСЛО КОЕс В КОСТНОМ МОЗГЕ МЫШЕЙ (CBAxCS-JBW)H, СТИМУЛИРОВАННЬК ИГИ tu VIVO.

Рис.5. I

Э»«€КТ СОЧЕТАННОГО ВВЕДЕНИЯ ИП-1 И *ИП HA АНГИГЕПО-ОБРАЗОВАНИЕ В СЕЛЕЗЕНКАХ МЫШЕЙ (СВА«СЯВ1К)> I

KOKTponV

Рис.10.

А0КЛСГ«1»ГОК С<П*»«ИКЯ

t* от контроле

I

н» N

ВЛИЯНИЕ ФИП НА АНТИТЕПООБРАЭОВАНИЕ В СЕЛЕЗЕНКЕ МОЛОДЫХ И СТАРЫХ МЫШЕЙ (CBA»CS7BW)H ПОСЛЕ ИММУНИЗАЦИИ ЮС ЭБ.

К 40 '

i 30'

1&'

е-

I

I

I

■

старив

| контроль KS3 ФИП

ло, что супернатант от ИПК не изменял высокий уровень пролифератив-ной активности КОЕс из костного мозга мышей, обработанных тестостерон- пропионатом (ТСП) , в то время, как супернатант от КПК интактных животных снижал число стимулированных ТСП КОЕс до 6,931.

Таблица 2.

Влияние 3-х кратного введения ИЛ-1 мышам in vivo на продукцию стимуляторной и 1Шгибиторной активностей в костном мозге.

условия Число КОЕс на 105 ККМ (М+м) кОЕс В

эксперимента без Н-тими- с ,3Н-ти- S-фазе, Р

дина мидином %

ККМ интактных мышей 27,5+0,97 24, 1+1, 1 12, 5 0,05

ККМ интактных мышей

+ супернатант от СПК 23,8+1,24 15, 3+1, 2 35, 7 0,001

ККМ интактных мышей

+ супернатант от СПК

мышей, получавших ИЛ-1 22,0+1,39 19, ,1+1, 5 13, 2 0,05

ККМ мышей после ТСП 27,2+0 ,91 ,1+0, 9 29, 8 0,01

ККМ мышей пссле ТСП

+ супернатант от ИПК 23,1+1 ,1 21, ,5+0, 9 6, 9 0,05

ККМ мышей после ТСП

+ супернатант от ИПК

мышей, получавших ИЛ-1 33,3+1 ,6 23 ,5+1, 5 29, 4 0,05

Таким образом, из данных вышеприведенных экспериментов можно сделать вывод о том, что ИЛ-1 ингибирует в костном мозге мышей продукцию как стимулирующей , так и ингибирущей пролиферацию КОЕс активностей. Поэтому увеличение числа активно пролиферирующих КОЕс-8 у опытных животных, по-видимому, является следствием влияния монокина непосредственно на СКК. Е пользу последнего предположения говорят данные о наличии на гемопоэтических клетках-предшественниках рецепторов к ИЛ-1 (Dubois, 1990) . Нельзя не отметить и косвенное воздействие монокина на гемопоэз через увеличение продукции колониести-мулпрующих активностей макрофагами, активированными иммуноцитами, эндотелпальнымп клетками и др.

Представляло интерес выяснить, возможна ли коррекция стимулированной ИЛ-1 пролифератиЕНой активности КОЕс с помощью ФИП. Из представленных на рис;4 данных видно, что инкубация клеток костного мозга, выделенных от-мышей, обработанных ИЛ-1, с ФИП приводила к

снижении увеличенного под влиянием ИЛ-1 числа КОЕс в S-фазе (с 27,8% до 13Х) т.е., до значений, полученных для интактных животных (12,5%).

В настоящее время считается хорошо доказанным факт, что ИЛ-1 является ключевым монокином в запуске гуморального иммунного ответа. Известно, что ИЛ-1 оказывает стимулирующий эффект на пролиферацию Т-лимфоцитов (Reed, 1989), стимулирует пролиферацию и дифференциров-ку В-лимфоцитов (Jelinek, 1987 ) и активирует функциональную активность макрофагов, индуцируя синтез ими других регуляторных молекул. Показано, что при введении рекомбинантного ИЛ-la и ИЛ-1в in vivo наблюдается усиление гуморальной иммунной реакции (Reed, 1989; Lo-wenthal, 1986 ).

Принимая во внимание данные об отсутствии ингибирующей активности в костном мозге стимулированных ИЛ-1 мышей, и учитывая , что у них наблюдается повышенная пролиферативная активность КОЕс,которая ингибируется введением ФИП, нам представлялось важным выяснить роль СКК в механизме иммуностимулирующего эффекта ИЛ-1, модулируя ее активность с помощью ФИП.

Нами была предпринята попытка оценить эффект сочетанного введения ИЛ-1 и ФИП на процесс формирования клона антителообразующих клеток в селезенках мышей, для чего фактор вводили животным внутриб-рюшинно в дозе 0,07 мкг/мышъ за сутки до антигена , вместе с антигеном и на следующие сутки. Рекомбинантный человеческий ИЛ-1 в дозе 100 нг/мышь вводили внутривенно за сутки и 2 часа до иммунизации ЭБ. Количество АОК в селезенке мышей оценивали на 4-е сутки после внутривенной иммунизации 57. ЭБ. Из рис.5 следует, что инъекция одного Ю1-1 мышам приводила к 2-кратному увеличению в селезенках мышей числа антителопродуцирующих клеток, инъекция одного ФИП практически не влияла на число антителоподуцентов , а при совместном введении препаратов в указанные сроки наблюдалось достоверное подавление иммуностимулирующего эффекта ИЛ-1.

Таким образом, на основании полученных результатов- можно сделать предположение о том, что увеличение КОЕс в S-фазе вносит существенный вклад в иммуностимулирующее действие ИЛ-1 на иммунный ответ, так как в условиях подавления пролиферативной активности СКК с помощью ФИП наблюдается значительное снижение указанного эффекта ИЛ-1 на антителообразование.

Мы предполагаем, что иммуномодулируюпщй эффект ФИП реализуется, по-видимому, через его способность изменять уровень пролиферативной активности СКК, так как 3-х кратное введение животным одного фактора не изменяло число IgM АОК в ответ на стимуляцию' 5% ЭБ.

Из литературных данных известно, что в-присутствии ИЛ-1 зна-

чительно увеличивается число моноцитарно-гранулоцитарных прекурсоров (КОЕ-М, КОЕ-Г, КОЕ-ГМ) (Gallicchio, 1989), а также показано, что данный монокин усиливает продукцию колониестимулирующих факторов, определяющих дифференцировку СКК в мелоидном направлении (М-, Г-, ГМ-КСФ) клетками микроокружения,, макрофагами и Т-клетками (Hoang, 1988; Fibbl, 1989).

Суммируя полученные результаты и литературные сведения, можно предположить, что после стимуляции с помощью ИЛ-1 пролиферативной активности СКК значительная часть ее потомков дифференцируется в гранулоцитарно-макрофагальном направлении. Способность ФИП уменьшать размеры пролиферирующего пула кроветворных клеток до пределов нормы вероятно, может стать причиной снижения вышеназванной популяции клеток-предшественников, в том числе и тех, что могли бы реализоваться при формировании гуморального отьета на антиген. Поэтому мы и наблюдаем негативный эффект совместного введения ИЛ-1 и ФИП на антитело-образование. Тем не менее, число АОК не достигает уровня, характерного для контрольных животных, что отражает, по-видимому то обстоятельство, что ИЛ-1 имеет самостоятельный, не зависящий от уровня пролиферативной активности СКК, эффект на зрелые иммунокомпетентные клетки.

Неоднократное наблюдение иммуностимулирующих эффектов ФИП, реализующихся на фоне повышенной в силу различных причин пролиферативной активности СКК позволили нам надеяться на успех при попытке коррекции вторичного иммунодефицита, который развивается в процессе старения и проявляется снижением функциональной активности иммуно-компетентных клеток у старых животных. Принимая во внимание, что СКК является предшественником для макрофагов, Т и В-лимфоцитов, можно предположить, что одной из причин множественных нарушений функции иммунной системы при старении является нарушение процессов пролиферации и дифференцировки, наблюдающиеся в отделе ранних гемопоэтичес-ких предшественников : ограничиваются компенсаторные возможности СКК (Fozzi, 1973; Harrison, 1975), ее способность к самовоспроизводству (Mauch, 1982), уменьшается миграционная активность КОЕс (Micklem, 1975)'. Причем описанные изменения в популяции СКК сопровождаются заметным увеличением пролиферативной активности КОЕс в костном мозге (Deitchman, 1975; Acagawa, 1984; Pietrzyk, 1989).

В связи с этим, представляло интерес выяснить, как связана высокая пролиферативная активность стволовой клетки у старых мышей с продукцией стимуляторной и ингибиторной активностей клетками костного мозга. Kai-: видно из Табл.3, супернатант от клеток, продуцирующих стимулятор, усиливает пролиферацию СКК, взятых от интактных мы-

шей, в то время как супернатант от клеток, продуцирующих ингибитор, не снижает пролиферацию СКК от мышей с повышенным уровнем пролиферации стволовой клетки (получивших инъекцию ТСП) .

Таблица 3.

Продукция стимуляторной и ингибиторной активностей клетками костного мозга мышей-гибридов (СВАхС57В1/6)П в возрасте 1,5 лет.

условия Число КОЕс на 105 ККМ (М+м) КОЕс в

эксперимента без лН-ти- с ^Н-ти- 5-фазе Р

мидина мидином 7.

ККМ интактных мышей 16,1+1,76 15,1+1,44 6,2 0,05

ККМ интактных мышей +

супернатант от СПК

старых мышей 29,0+2,36 16,0+0,73 44,8 0,001

ККК мышей после ТСП 32,3+2,25 18,9+1,43 41,5 0,001

ККМ мышей после ТСП +

супернатант от ИПК

старых мышеи 28,8+1,81 13,2+1,41 54,2 0,001

Описанные изменения в микроокружении стволовой кроветворной клетки (синтез стимуляторной и отсутствие синтеза ингибиторной фракции) могут, по-видимому, играть роль в формировании повышенного про-лиферативного статуса СКК старых мышей.

Увеличение количества пролиферирующих клеток в костном мозге не может не привести к изменению количественных характеристик гемо-поээа, таких, как клеточность костного мозга и селезенки, число различных субпопуляций СКК и зрелых клеток крови. Е литературе существует множество сведений по данному вопросу , но они отличаются большим разнообразием и не позволяют сделать однозначный вывод относительно реального состояния популяции КОЕс при старении у мышей.

Принимая во внимание, что воздействия, подавляющие пролиферацию СКК, не могут не отразиться на объеме пулов клеток-потомков, в следующей серии экспериментов была поставлена задача изучить возрастные изменения в-содержании ранних (КОЕс-12) и поздних (КОЕс-5 и КОЕс-8) гемопоэтических предшественников в костном мозге и селезенке и одновременно оценить возможный эффект длительного введения препарата ФИП на субпопуляционную структуру КОЕс у старых мышей/■

Для исследования были выбраны мыши долгоживущих линий :.. СБА и •(СВА/С57В1/6)П-гибриды в возрасте- 2-3 мес. (молодые) и 24-28 мес. (старые). Препарат СИП ВВОДИЛИ миЛццшл И СТорЫм Мышам БНу'ТрПирКщишНи

в 0,2 мл среды 199 в дозах 0,1 и 0,01 мкг/мышь соответственно в течение 2-3 недель 2 раза в неделю, так как ранее нами было установлено, что действие фактора на стволовые клетки после его введения in vivo сохраняется в течение 3-4 дней. Контрольные старые и молодые мыши вместо ФИП получали адекватный объем среды 199.

На рис.6 представлены данные о возрастной структуре КОЕс из костного мозга у молодых и старых мышей , а также у старых мышей, обработанных ФИП. Видно, что число разных субпопуляций КОЕс, приходящихся на бедро, у старых мышей существенно повышено по сравнению с молодыми животными. Введение ФИП старым мышам обусловливало снижение численности КОЕс-5, КОЕс-8 и КОЕс-12 до значений, близких к полученным у молодых мышей.

Учитывая, что у грызунов селезенка является активным органом кроветворения и тесно связана с кроветворением в костном мозге (Хаитов, 1986), мы оценивали колониеобразующую сособность клеток селезенки, у старых мышей.' Из рис.7 видно, что у старых мышей в селезенке снижено число как КОЕс-5, так и КОЕс-8, в то время как число КОЕс-12 не меняется по сравнению с молодыми мышами. Многократное введение мышам ФИП обусловливало повышение числа КОЕс-5 и КОЕс-8 до величин, характерных для молодых мышей.

Тагам образом, под действием ФИП у старых мышей в костном мозге уменьшается содержание КОЕс-5, КОЕс-8 и КОЕе-12 , одновременно в селезенке увеличивается число КОЕс-5 и КОЕс-8. Принимая во внимание литературные данные об увеличении пролиферативной и снижении миграционной активности КОЕс в процессе старения (Micklem, 1975; Петров, 1981), можно предположить, что с возрастом в костном мозге старых животных происходит накопление большого количества незрелых кроветворных клеток-прешественников. Некоторые авторы (Илюхин, 1972; Натан, 1994) считают, что накопление избыточной клеточной массы в костном мозге может стать причиной "неэффективного" кроветворения, при котором разрушается часть ранних предшественников гемопоэза. При этом е периферической крови наблюдается снижение некоторых параметров функциональной активности зрелых клеток крови : снижается гема-токрит, уменьшается концентрация гемоглобина в эритроцитах мыши (Si-lini, 1974) и человека (Пименов,1993). Еозможно, что последствия процесса "неэффективного кроветворения" в костном мозге являются одним из факторов, приводящих к снижению в селезенке старых мышей численности популяций КОЕс-5 и КОЕс-8.

Под влиянием длительного курса иньекций ФИП у старых животных уменьшается уровень пролиферативной активности КОЕс , в резуль-TSTS чёГи СККЖЗёТСЯ GunSM КЛсТОчНОИ МЗССЫ В KuCTHQM МОЗГв И, ПО"ВИ-

ВЛИЯНИЕ «ИП НА АБСЛЮТНОЕ ЧИСЛО КОЕс В КОСТНОМ МОЗГЕ СТАРЫХ МЫШЕЙ (СВЛхСЛШ;«)*!.

Рис.'

ВЛИЯНИЕ *ИП НА АБСОЛЮТНОЕ ЧИСЛО КОЕс В СЕЛЕЗЕНКЕ СТАРЫ* МЫШЕЙ (СВА*С51В1«)П.

Е23

иолодые

Е52Э

ста|эцё старые+ФИП

ВЛИЯНИЕ «ИЛ НА ЧИСЛО КОЕоб И KOE&G В КОСТНОМ МОЗГЕ СТАРЫХ МЫШЕЙ HA1-« ИИ СУТКИ ПОСЛЕ ИММУНИЗАЦИИ ЭЬ

Рис.8.

ВЛИЯНИЕ «ИЛ т ЧИСЛО КОЕ« И КОЕ&« В СЕЛЕЗЕНКЕ СТАРЫХ МЫШЕЙ НА1-» И«-> СУТКИ ПОСЛЕ ИММУНИЗАУИИ ЭБ

димому, восстанавливаются миграционные связи между костным мозгом и селезенкой, так как наблюдается увеличение числа ранних кроветворных предшественников в селезенке при их одновременном снижении в костном ' мозге, что,в свою очередь, может стать предпосылкой как для полноценного завершения эритропоэза, так и для нормализации процессов иммуногенеза. Наши предположения подтверждает наблюдаемая нами нормализация гематокрита у получавших ФИП животных с 45,9+0,71 до 50,3+0,81, (р<0,01).

Многие авторы отмечают, что с возрастом изменяется функциональная активность как клеточного, так и гуморального звеньев системы иммунитета: снижается способность Т- и В-лимфоциттов отвечать пролиферацией в ответ на митогенную или антигенную стимуляцию (Gerbase, 1874; Meredith, 1975 ; Петров, 1984), уменьшается число циркулирующих CD4+, CD8+, В-клеток (Sansoni, 1993) . Первичный ответ к ЭБ у старых мышей составляет около 10% соответствующего значения молодых животных (Makinodan, 1971). С другой стороны,с возрастом происходит значительное снижение функциональной активности и численности ранних предшественников В-клеток (slg1 ,В220 ) в костном мозге мышей линий BALB/c, B10.D2, С57В1/6 (Zharhary, 1988; Nagarkatti, 1989) , а также снижается интенсивность созревания В-клеток в костном мозге (Farrar, 1974), что в свою очередь, может сказываться на величине гуморального иммунного ответа.

Чтобы выяснить, каким образом влияет коррекция субпопу^яци-онной структуры КОЕс в костном мозге и селезенке на процесс иммуногенеза, мы подвергали старых мышей после курса хронических инъекций препарата стимуляции 5* ЭБ. В первые сутки после иммунизации в селезенках животных, обработанных ФИП, наблюдалось достоверное увеличение концентрации КОЕс-5 и КОЕс-8 по сравнен™ с животными, получавшими Еместо препарата соответствующий объем среды 199 (рис.8) ; в костном мозге (рис.9) наблюдалась тенденция к увеличению этих типов КОЕс. К 4-м суткам, на пике первичного иммунного ответа на антиген в группе мышей, получавших ФИП, число КОЕс-8 в костном мозге было достоверно выше, а число КОЕс-5 как в костном мозге, так и в селезенке, было достоверно ниже, что свидетельствует о влиянии ФИП на процессы дифференцировки СКК.

Учитывая, что между эритроидным и миелоидным ростками кроветворения существуют конкурентные взаимоотношения (Козлов, 1982), мы предполагаем, что уменьшение доли монопотентных эритроидных предшественников (КОЕс-5) и увеличение популяции КОЕс-8, способных к дифференцировке в миелоидном направлении, может положительным образом отразиться на величине иммунного ответа. В селезенке число КОЕс-8

в опытной группе было достоверно ниже, возможно вследствие того, что часть клеток из клонов, образующих КОЕс-8, могла в процессе иммуногенеза успеть пройти дифференцировку в лимфоидном и/или миелоидном направлениях . Правильность наших рассуждений подтверждают данные, представленные в Табл.4 и на рис 10.

Таблица 4.

Влияние курса инъекций ФИЛ (в течение 2-3 недель) на уровень пролиферативной активности КОЕс в костном мозге молодых и старых мышей-гибридов (СВАхС57В1/б)П.

группы животных

Число КОЕс на 105 ККМ (М+м) с 3Н-ти-мидином

без 3Н-ти-мидина

КОЕс в Б-фазе 7.

ККМ старых мышей 28,65+1,22 18, ,87+1, ,11 34,4 0,001

ККМ старых мышей + ФИП 31,18+1,59 30, ,40+1, ,51 2,6 •0,01

ККК молодых мышей 39,63+2,42 37, ,67+2, ,81 5,0 0,01

ККМ молодых мышей + ФИП 36,83+1,09 34, ,94+1, ,68 5,1 0,01

Видно, что у старых животных под влиянием ФИП процент проли-ферирующих КОЕс-8 снижался до уровня молодых животных , при этом в их селезенках более, чем в 2 раза увеличивалось число 1ёМ продуцирующих АОК (22790+6430) по сравнен™ с контрольной группой (10260+3380) . В то же время хроническое введение ФИП молодым животным (рис. 10) практически не изменяло пролиферативный статус КОЕс, а также не оказывало зэметного влияния на способность к формированию иммунного ответа на антиген. Отсутствие эффекта ФИП на пролифератив-ную активность СКК молодых здоровых мышей означает, что мишенью для данного ингибитора по-видимому, являются только активно пролифериру-ющие КОЕс .

Таким образом, результаты последних экспериментов свидетельствуют об улучшении некоторых параметров, характеризующих функциональную активность зрелых клеток крови ( эритроцитов и иммуноцитов )', что по-видимому связано с восстановлением нормальной функциональной активности в популяции ранних предшественников кроветворения : под действием ФИП у старых мышей в костном мозге и селезенке восстанавливается численность субпопуляций разной степени- зрелости в границах, характерных для молодых животных. Кроме того, ФИП , подавляя пролиферацию КОЕс в костном мозге, заметно угнетает в нем эритроид-'ное направление дифференцировки, поддерживал, относительно незрелые популяции колониеобраэующих клеток . Таким образом, в условиях нор-

Р

мальной пролиферативной активности СКК создаются условия для нормальных дифференцировочных процессов, что становится предпосылкой для полноценной реализации эритро- и иммунопоээа.

ВЫВОДЫ

1.Усиление пролиферативной активности КОЕс в костном мозге, в процессе старения или вследствие стимуляции ИЛ-1, сопровождается изменением в продукции костномозговых гемопоэтических регуляторов : супернатант от ингибитор-продуцирующих клеток не снижает стимулированную пролиферативную активность КОЕс.

2.ФИП оказывает иммуномодулирующий эффект в условиях повышенной пролиферативной активности СКК, т.к. его введение мышам после инъекции ИЛ-1 или тестостерон-пропионата приводило к снижению числа КОЕс в Б-фазе до уровня интактных животных, что сопровождалось коррекцией гуморального иммунного ответа на ЭБ.

3.ФИП обладает иммуностимулирующим эффектом , о чем свидетельствует увеличение продукции вируснейтрализующих антител у животных, иммунизированных вирусом Коксаки А13 и вирусом гриппа, а также снижение смертности мышей при гриппозной инфекции.

4.У интактных старых животных ФИП оказывает иммуностимулирующий эффект, т.к. его многократное введение приводит к увеличению продукции АОК у старых мышей, иммунизированных ЭБ.

5.ФИП обладает корригирующим эффектом на функциональную активность КОЕс старых мышей: под влиянием ФИП происходит нормализация пролиферативной активности КОЕс и коррекция численности субпопуляций КОЕс в костном мозге и селезенке до значений, наблюдающихся у молодых интактных животных.

6.Коррекция с помощью ФИП функциональной активности СКК (снижение пролиферативной активности СКК и изменения в субпопуляци-онной структуре КОЕс) лежит в основе корригирующих эффектов ФИП на параметры гуморального иммунного ответа к различным антигенам.

ПУБЛИКАЦИИ

1. И.А.Орловская, Л.Е.Дубинина, И.Г.Цырлова, В.А.Козлов. Попытка коррекции РГЗТ с помощью фактора, подавляющего пролиферативную активность стволовой клетки. //Стволовая кроветворная клетка в норме и при патологии. Тез. докл. - 1988.- Томск, с.49.

2. И.А.Орловская, Л.В.Дубинина, В.В.Осипов, И.Г.Цырлова, В.А.Козлов. Продукция факторов, регулирующих пролиферацию полипо-тентной стволовой кроветворной клетки, в норме и при патологии // Стресс и иммунитет. Тез.докл. - Ростов-на-Дону, 1989. - с.135.

3. И.А.Орловская, Л.В.Дубинина. Иммунорегуляторная роль костномозговых факторов у старых животных.// I Всесоюзный иммунологический съезд. Тез. докл. - Сочи, 1989. - с. 347.

4. V.A. Kozlov, I.A,Orlovskaja, L.Y.Dublnina, V.V.Osipov. Approach to immunodeficiency correction in ading. // 7th International Congress of Immunology, Berlin, 1989.

5. I.G.Tsyrlova, I.A.Orlovskaja, L.V.Dubinina, V.A.Kozlov. In vivo studies of negative regulators of CFUs proliferation, //in: Negative regulators of totipotential stem cells and myelopoiesis. Annals of N.Y.A.S. - 1990.- p.13-29.

6. И.А.Орловская , А.Н.Евстропов, Л.В.Дубинина, А.Е.Кулемзи-на, Л.Б.Топоркова, Д.А.Яхонтов. Влияние костномозгового фактора, ин-гибирующего пролиферативную активность ПСКК, на формирование иммунного ответа к вирусному и невирусному антигену // Иммуномодуляторы природного происхождения. Тез. докл. - Владивосток, 1990. - с. 57.

7. I.A.Orlovskaja, L.V.Dubinina. Bone marrow macrophage production of the regulators of hemopoietic stem cell proliferation in mice. // Mononuclear phagocyte system in normal and pathological states, Novosibirsk, 1990. - p. 184.

8. И.А.Орловская, Л.В.Дубинина, В.В.Осипов, Б.А.Козлов. Отсутствие продукции костномозговыми макрофагами ингибитора пролиферации СКК у старых мышей. // Иммунология - 1991. - М.6.- с. 23 -25.

9. I.A.Orlovskaya, L.V.Dubinina, S.K.Khaldoyanidi .I.G.Tsyrlova, V.A.Kozlov The change of old mice hemopoietic progenitors differentiation by stem cell proliferation unhibitor// 2nd International simposium of molecular biology of haematopoiesis - Austria,-

1991.- p. 76.

10. Л.В.Дубинина. Эффект ингибитора пролиферации стволовой кроветворной клетки на субпопуляции стволовой клетки и величину гуморального иммунного ответа у старых мышей.// I съезд иммунологов России. - 1992. - с. 147.

11. I.A.Orlovskaja, L.V.Dubinina, S.K.Khaldoyanidi, V.A.Kozlov.. Immunostimulative effect of stem cell proliferation inhibitor.// Structure and function of regulatory polypeptides.- Moscow.-

1992.- p. 57.

12. И.А.Орловская, А.Н.Евстропов, Л.Н.Гриценко, Л.В.Дубинина, И.Г.Цырлова, В.А.Козлов. Влияние фактора,■ ингибирующего пролиферацию полипотентной стволовой кроветворной клетки , на формирование иммунного ответа к вирусному антигену. // Был. эксперим. биологии и медицины. - 1992. - N.3, с. 294-296.

13. И.А.Орловская, Л.В.Дубинина, С.К.Халдояниди, В.А.Козлов.

Изменения в возрастной структуре стволовых кроветворных клеток старых мышей под влиянием фактора, ингибирущего их пролифера-тивную активность. // Онтогенез - 1994. - т.25, N.3, с.26-32.

14. Н.Ю.Громыхина, И.А.Орловская, Л.В.Дубинина, В.А.Козлов. Участие стволовой кроветворной клетки в механизмах иммуностимулирующего эффекта интерлейкина -1 у мышей. // Иммунология - 1995. - N.2. - с. 29-30.

Зак. . Тир. 100 экз. Печ.л. 1,25. Формат 60 х 84/16. Бумага офсетная N1. Тип. СО РАМН. г.Новосибирск. 1996г.