Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Кариотипическая стабильность и морфологические показатели перевиваемых линий клеток, культивируемых в среде с ликвором

На правах рукописи

МАКАРОВ АЛЕКСАНДР ВАСИЛЬЕВИЧ

КАРИОТИПИЧЕСКАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ ЛИНИЙ КЛЕТОК, КУЛЬТИВИРУЕМЫХ В СРЕДЕ С ЛИКВОРОМ

16.00.02- патология, онкология и морфология животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САРАНСК-2004

Работа выполнена на кафедре незаразных болезней и радиологии Аграрного института Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева и Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии.

Научные руководители: доктор биологических наук профессор

Зенкин Александр Сергеевич

доктор биологических наук Юрков Сергей Григорьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Балашов Владимир Павлович

доктор биологических наук, профессор Великанов Валериан Иванович

Ведущее учреждение: Казанская государственная академия ветеринарной

медицины.

4 Л

Защита диссертации состоится « 24 декабря » 2004 года в !<*. часов на заседании диссертационного совета К 212.117.05 при Мордовском государственном университете им. Н.П. Огарева по адресу: 430904, г. Саранск, п. Ялга, ул. Российская, 31, ауд. 223

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Мордовского государственного университета им. Н.П.Огарева

« ХЗ »

Автореферат разослан « » ноября 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Т.А. Романова

0&7

/JS4J

2 SA 76 32

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы

Перевиваемые линии клеток (ПЛК) считаются наиболее удобной моделью для изучения биологии клетки в культуре, морфо-функциональных взаимоотношений, факторов, влияющих на пролиферацию, дифференцировку и старение клеток и других общих и частных вопросов биологической науки клеток (Гаврилов, 1964; Бекгемиров, 1991; Миронова и др., 1994; Бектемиров, Горбунов, 1995; Pirtle, Woods, 1968; Petricciani, 1988).

В медицинской и ветеринарной вирусологии ПЛК служат тест-системой для выделения и идентификации многих вирусов. Большое применение они получили в производстве вакцинных и диагностических препаратов в качестве клеточных субстратов для накопления вирусной биомассы, причем в ветеринарии их внедрение идет опережающими темпами (Царева и др., 1990; Мищенко, 1995; Балышева и др„ 1999).

Эффективность использования клеточных систем в биотехнологии определяется их биологическими свойствами, основными из которых являются потенциальное «бессмертие», чувствительность к широкому спектру вирусных патогенов, возможность применения микробиологической техники для промышленного культивирования, криоконсервация в жидком азоте и возможность заблаговременного, всестороннего контроля клеточного субстрата. Совокупность этих свойств ПЛК обеспечивает высокую степень надежности технологии и качества конечных продуктов.

В то же время, ПЛК гетерогенны, т.е. состоят из генетически неоднородных клеток, длительное последовательное пассирование которых часто сопровождается ненаправленными селективными процессами, приводящими к снижению, а иногда и полной потере клеточной популяцией требуемых биологических свойств. С целью повышения стабильности ПЛК и отбора наиболее эффективных субпопуляций проводят клонирование и реклонирование, однако выход фертильных клонов во многом определяется составом клеточного микроокружения. Одним из компонентов питательной среды для клонирования, значительно обогащающим ее биологически активными веществами может служить цереброспинальная жидкость крупного рогатого скота (ЦОК КРС) (Лащ, Зенкин, Юрков, 2002, 2003). Имеющаяся отечественная и зарубежная информация по вопросам использования ликвора в клеточной биотехнологии немногочисленна, критерии оценки самого ликвора для использования в клеточной биотехнологии не разработаны, не изучено его влияние на кариотипи-ческую стабильность культивируемых клеток, определяющую воспроизводимость биотехнологических показателей. Использование ликвора для этих целей представляется чрезвычайно перспективным направлением исследований.

Однако эта проблема требует серьезной экспериментальной базы и адаптации применительно к конкретным условиям культивирования определенных клеток и вирусов и, безусловно, является важным научным направлением, что

определило цель и задачи настоящих исследований.——•

J » ' « ''ЧЛ'л I

1.2. Цель и задачи исследований

Целью настоящей работы явилось изучение влияния цереброспинальной жидкости КРС на кариотипические показатели перевиваемых линий клеток, стабильность их биологических характеристик и разработка критериев оценки ликвора как компонента питательных сред культивируемых клеток.

Для достижения указанной цели решались следующие задачи:

1. Изучить токсичность и ростостимулирующие свойства цереброспинальной жидкости в культурах клеток различного видового происхождения.

2. Изучить морфологические показатели перевиваемых линий клеток, культивируемых в среде с ликвором.

3. Оценить кариотипическую стабильность перевиваемых линий клеток различной видовой принадлежности в процессе длительного культивирования в среде с ликвором.

4. Оценить влияние цереброспинальной жидкости на уровень репродукции вирусов различных таксономических групп в клетках перевиваемых линий.

1.3. Научная новизна

Впервые изучено влияние ЦСЖ КРС на стабильность кариотипа ПЖ различной видовой принадлежности и их биологические свойства в процессе длительного культивирования. Разработаны критерии оценки ликвора КРС для использования в культуральной практике и показаны различия в интенсивности биологического воздействия цереброспинальной жидкости на клетки перевиваемых линий различного видового происхождения.

1.4. Практическая значимость работы

Полученные в настоящих исследованиях данные показывают перспективность использования ЦСЖ КРС в биотехнологии перевиваемых линий клеток. Результаты исследований представляют интерес для специалистов, занимающихся конструированием ростовых питательных сред для культур клеток, а также разработкой диагностикумов и вакцинных препаратов. Результаты исследований могут быть использованы в учебном процессе на биологическом, ветеринарном и медицинском факультетах.

1.5. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЬШОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Биологические критерии оценки цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота в культуре клеток: индекс цитотоксичности, коэффициент кло-нообразования, уровень патологических митозов.

2. Кариотипическая стабильность перевиваемых линий клеток различного видового происхождения, длительно культивируемых в питательной среде, содержащей цереброспинальную жидкость крупного рогатого скота.

3. Морфологические показатели перевиваемых линий клеток, культивируемых в питательной среде с цереброспинальной жидкостью крупного рогатого скота.

4. Вирусрепродуцирующие свойства перевиваемых линий клеток почки овцы ПО(ВНИИВВиМ) и почки сайги ПС(ВНИИВВиМ), культивируемых в среде с ликвором, в отношении адаптированных вирусов.

1.6. Реализация результатов исследований

Основные научные результаты диссертационной работы достаточно полно отражены в 8 опубликованных научных работах.

1.7. Апробация работы.

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной научной конференции (Покров, 2003), Региональной научно-практической конференции (Саранск, 2004), научной конференции (Огарев-ские чтения) Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева (Саранск, 2003), журнале «Практик» (Санкт-Петербург, 2004).

1.8. Объем и структура работы.

Диссертационная работа изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических предложений, списка использованной литературы и приложений. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 33 рисунками. Список используемой литературы включает 285 источников, в том числе 109 на иностранных языках.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Материал и методы исследований

Исследования по теме диссертационной работы проводились на базе Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии в рамках плановых НИР по темам - 01.09. "Поддержание и пополнение коллекции штаммов микроорганизмов - возбудителей особо опасных и экзотических болезней животных и культур клеток" и 01.02.04 "Поддержание и развитие коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ для диагностических, исследовательских и биотехнологических целей", межкафедральной научно-исследовательской лаборатории «Гистофизиология» и учебно-научной лаборатории кафедры незаразных болезней и радиологии Аграрного института МГУ им. Н.П. Огарева в период с 2001 по 2004 гг. Общая схема исследований представлена в табл. 1.

Работа выполнялась в рамках Федеральной целевой программы «Интеграция науки и высшего образования России» на 2002-2006 года по направлению "1.2. « Использование потенциала ведущих научных центров страны для стажировки молодых исследователей, аспирантов и докторантов высших учебных заведений».

Культуры клеток. В настоящих опытах использовались следующие ПЛК:

- почки овцы, сублинии ПО(ВНИИВВиМ), кат. № 22.1 на уровне 60 пассажа;

- почки теленка MDBK, кат. .№ 13 на уровне 36 пассажа;

- почки сайги, сублинии ПС(ВНИИВВиМ), кат. № 31.1 на уровне 55 пассажа;

- ПЛК почки африканской зеленой мартышки VERO, кат. № 44 на уровне 22 пассажа из музея клеточных культур ВНИИВВиМ.

Таблица 1

Общая схема исследований_

Серия опытов Вид объекта Группа Количество объектов Наименование исследований

I Быки Коровы 1 4 4 2 Отбор ЦСЖ

II ЦСЖ, перевиваемые линии клеток ПО и ПС 1 2 3 4 5 6 6 (500) мл 6 (12 мл) б (12 мл) 12 12 24 Исследование вирусологических, токсических и ростостимули-рующих свойств ЦСЖ КРС

III Перевиваемые линии клеток ПО, ПС, MDBK, VERO. 1 2 3 4 1 1 1 1 Оценка биологических характеристик ПЛК

IV Перевиваемые линии культур клеток, культивируемые в среде с ЦСЖ 1 2 3 4 5 12 48 36 18 8 Изучение цитоморфо-логических, кариоло-гических и биотехнологических показателей культур клеток, культивируемых в среде с ЦСЖ

Питательные среды, сыворотки крови, растворы. Использовались питательные среды Игла-MEM с незаменимыми аминокислотами на солевом растворе Эрла, приготовленные из сухих форм препаратов фирм «НуСЬпе» и «Sigma», США. К питательным средам добавляли 5-10 % сыворотки крови КРС квалификации «для культур ¡слеток», изготовленной во ВНИИВВиМ из полуфабриката сыворотки крови КРС, полученного на базе Смоленской НИВС, в соответствии с паспортными данными каждой культуры или 5% фе-тальной сыворотки крови КРС (FBS фирм «HyClone» и «Sigma», США), не контаминированных вирусом диареи КРС.

Для профилактики контаминации в культуры добавляли антибиотики в конечной концентрации в среде культивирования: пенициллин - 100 ЕД/мл; стрептомицин - 100 мкг/мл; гентамицин - 100 мкг/мл; пефлоксацин -25 мкг/мл.

В работе использовали 7,5% раствор бикарбоната натрия, 3% раствор глю-тамина, 0,25% раствор трипсина, 0,02% раствор версена, забуференный физиологический раствор, диметилсульфоксид, тестированный для культур клеток («Sigma-Aldrich», США).

Реактивы и оборудование. Использовались следующие реактивы и оборудование: холодильник до минус 70°С, роллерные установки, милливольт-

метр рН-121; камера Горяева; весы аналитические; микрополичашки 96-луночные; микропипетки-капельницы, бокс настольный с ламинарным потоком очищенного воздуха и УФ-лампой «Laminar Flow», TVG, термостат T304GF81, а также другая лабораторная посуда.

Вирусы. При выполнении вирусологических исследований использовали вирус бешенства, вирус оспы овец и вирус диареи КРС.

Вирус бешенства - вакцинный штамм «ТС-80» на уровне 75 пассажа в культуре клеток ПС (ВНИИВВиМ) с инфекционной активностью 7,5 lg МЛД

50/см •

Вирус оспы овец - вакцинный штамм «Б5-96» (клонированный вариант штамма «НИСХИ») с активностью в культуре клеток ПО (ВНИИВВиМ) 5,5 lg ТЦЦ5о/е„3.

Вирус диареи КРС (BVD), штамм "Oregon C24V" - инфекционная активность 3,0 lg ИД 50/см3.

Методы культивирования клеток. ПЛК выращивали в монослойных культурах клеток общепринятым методом последовательных пересевов.

Полученные суспензии клеток с концентрацией 0,12-0,15 млн./см3 помещали в культуральные сосуды с питательной средой, содержащей 5-10% сыворотки крови животных, и инкубировали при 37,0±0,5°С в течение 2-4 суток.

Концентрацию и жизнеспособность клеток определяли просмотром и подсчетом под микроскопом суспензии клеток с витальным красителем (0,5% раствором трипанового синего) в камере Горяева с расчетом по формуле: (ж + м)х2х 1000

Х= --, где

0,9

X - количество клеток в I мл суспензии;

ж - количество жизнеспособных клеток в камере;

м - количество мертвых клеток в камере;

2 - коэффициент разведения исходной клеточной суспензии раствором красителя;

1000 - количество кубических мм в 1 мл;

0,9 - объем счетной камеры Горяева в мм3.

Для эквилибрации расфасованные в ампулы клеточные суспензии выдерживали в течение 40 минут при температуре 4°С, после чего помещали на 1-2 дня в камеру низкотемпературного холодильника (минус 70°С), а затем переносили в сосуд Дьюара с жидким азотом (минус 196°С).

Методы цитоморфологического и кариологического исследования клеточных культур. Морфологическое изучение клеток проводили в моно-слойной культуре на покровных стеклах, фиксировали в растворе Буэна и окрашивали гематоксилин-эозином.

Кариологическое изучение клеток проводили на стадии активной пролиферации культуры клеток, накапливая клетки в стадии митоза путем инкуби-

7

рования в среде с колхицином (0,05 мкг/мл среды) в течение двух часов. Клетки диспергировали смесью 0,02%-ного раствора версена и 0,25%-ного раствора трипсина в соотношении 9:1, подогретого до 37,0±1,0°С.

После гипотонической обработки клеток в суспензии (1 часть сыворотки крови КРС и 4 части дистиллированной воды), их выдерживали в термостате 30 минут и фиксировали в смеси метанола с ледяной уксусной кислотой в соотношении 3:1, наносили на поверхность предметных стекол и окрашивали 2%-ным водным раствором Гимза. Кариологические исследования проводили подсчетом метафазных хромосом в 50-100 клетках данной популяции.

Бактериологические методы. Бактериологический контроль стерильности культур клеток, ЦСЖ, растворов, питательных сред, сывороток крови КРС, вируссодержащих материалов проводили путем высева проб исследуемых материалов в жидкие и твердые питательные среды: МПБ, МПА, среда Китт-Тароцци, тиогликолевая среда, среда Сабуро.

Вирусологические методы. Активность вируссодержащего материала определяли путем титрования вируса в культурах клеток:

- для вируса бешенства в ПЛК ПС(ВНИИВВиМ) методом флуоресцирующих антител и на белых мышах по методике по X. Копровски (1975);

- для вируса оспы овец в перевиваемой культуре клеток почки овцы, сублинии ПО(ВНИИВВиМ) по характерному цитопатическому действию.

Титр вируса рассчитывали по Риду и Менчу и выражали в логарифмах ККИД so/см3, МЛД so/см3 и ТЩЫсм3.

Статистические методы. Цифровые данные, полученные в результате экспериментов, обрабатывали статистическими методами, принятыми в биологических исследованиях. Статистическую достоверность между средними величинами определяли по разностному методу Стыодента - Фишера.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Приступая к выполнению настоящих исследований по теме диссертации, мы исходили из следующих теоретических и практических предпосылок:

- метод культуры клеток, несмотря на значительные практические успехи в решении многих научных и прикладных задач биологии, медицины и ветеринарии, как область науки, находится еще в стадии постоянных научных и практических преобразований (Бектемиров, 1991; Petricciani, 1988 и др.);

- большой теоретический и практический интерес представляет вопрос стабилизации основных морфологических и кариологических характеристик клеток в процессе их культивирования (Браплавец, 1975; Petricciani, 1985);

- в стандартизации биотехнологии клеточных культур можно выделить два основных направления: выделение устойчивых стабильных генотипов клеток и оптимизация техники и условий процесса культивирования (Новохат-ский, 1977; Халитов, 1996 и др.);

- показаны определенные перспективы применения ЦСЖ в культуральных исследованиях (Ткач с соавт., 1985; Лащ, Зенкин,'Юрков, 2001,2003).

8

22.1. Оптимизация стерилизующей фильтрации и хранение ликвора

При отборе цереброспинальной жидкости от крупного рогатого скота использован опыт сотрудников кафедры незаразных болезней и радиологии Аграрного института МГУ им. Н.П. Огарева (Зенкин с соавт., 1999). Для отбора ЦСЖ КРС была выбрана модифицированная система. Она позволяла рационально, быстро, в различных условиях содержания животных, без потерь, с соблюдением правил асептики и антисептики извлекать из затылочной цистерны необходимые количества и наиболее активные формы цереброспинальной жидкости. ЦСЖ получали от предубойных животных, это достаточно хорошо отработанная операция, ее эффективность подтверждена в настоящих опытах. Полученные пробы ЦСЖ не содержали примесей крови, были прозрачны, их внешний вид соответствовал физиологическим нормам.

Для настоящих исследований были отобраны пробы ЦСЖ от шести животных: от коров в возрасте 4,5 года; быков в возрасте 2,5 лет и от быка в возрасте 1,5 года. Объем проб составлял от 50 до 150 мл. Полученные образцы ликвора замораживали и при минусовых температурах непродолжительное время (до двух недель) хранили до проведения стерилизации.

Отработанный и использованный нами рёжйм стерилизующей фильтрации через систему мембранных фильтров (АР-15—► AW-06—► HVWP —»GSWP фирмы «Millipore», США) и хранения (минус 20°С) позволил длительное время (два года) использовать в различных научных экспериментах стерильную ЦСЖ одних и тех же проб, что особенно важно для сравнительных оценок.

2.2.2. Исследование вирусологических, токсических и ростостимули-рующих свойств цереброспинальной жидкости КРС

С проблемой контаминации клеток вирусом диареи КРС сталкивается большинство исследователей, использующих клеточные культуры. Практически все ПЛК, чувствительные к этому вирусу, оказываются зараженными вирусом BVD, что вызвано его широкой циркуляцией среди поголовья КРС. В связи с этим в своих следующих исследованиях нами проведено бактериологическое и вирусологическое исследование ликвора.

Бактериологические исследования полученных серий ЦСЖ КРС, включая тесты на микоплазмы и вирусологические исследования на наиболее распространенный вирус-контаминант сыворотки крови КРС - вирус диареи дали отрицательные результаты.

Исследования по обнаружению вируснейтрализующих антител к этому вирусу (отрицательные результаты), позволили исключить возможное негативное влияние вируса диареи на кариотипическую стабильность клеток перевиваемых линий и показали перспективность использования ЦСЖ КРС в вирусологических исследованиях. При этом антибиотики, как фактор воздействия на хромосомный аппарат клеток, нами использовались ограниченно и в рекомендованных концентрациях (Осидзе, 1975;Полянская, 1989; Jrjima, 1984).

Известно, что любой компонент, включенный в систему культивирования

клеток, должен быть предварительно оценен по показателю цитотоксичности, который, как правило, для перевиваемых культур определяют по воздействию на морфологические характеристики клеток в процессе продолжительного пассирования (Юрков с соавт., 2003).

Цитотоксичность различных веществ и препаратов в культуре клеток определяют по индуцированному ими воздействию на морфологические характеристики клеток. В зависимости от типа клеток отклонения в развитии культур регистрируют в процессе разового или длительного, от шести до десяти пассажей, выращивания, причем эффект может быть подробно описан, но не измерен. Визуально не всегда удается оценить качественные изменения клеток, и сама оценка носит достаточно субъективный характер. Количественную оценку степени токсичности препарата в культуре клеток можно установить на основе определения индекса цитотоксичности (ИЦ), что позволит судить о степени выраженности одного показателя у разных проб препарата.

В последнее время культуры клеток широко используются как тест-системы для определения токсичности в фармакологии, косметологии, для оценки пищевых добавок и даже оценки качества питьевых вод (Адаме, 1983; Белова и др., 1988; Лашкевич , 1992; Подчерняева и др., 1996). Существенным недостатком этих методик является то, что визуально не всегда возможно оценить качественные изменения клеток при последовательных разведениях испытуемых веществ, вследствие чего они достаточно субъективны.

Токсичности препарата в культуре клеток можно дать и количественную оценку на основе определения ИЦ, определение которого для сыворотки крови в первичной культуре клеток разработано профессором А.Н. Курносовым (1980). Этот способ определения ИЦ модифицирован нами для ЦСЖ КРС и -перевиваемых линий клеток и предложена методика определения и расчет количественного критерия оценки индекса цитотоксичности ликвора (ИЦЛ).

В результате определения ИЦЛ на двух ПЛК ПС(ВНИИВВиМ) и ПО(ВНИИВВиМ), нами установлено, что этот показатель различен для каждой пробы препарата. Более чувствительной к токсическому действию ликвора оказалась ПЛК почки овцы (рис.1).

□ ПО

□ ПС

Однако, как и в случае с сывороткой крови для культур клеток, ИЦЛ, необходимо определять в каждом случае для конкретного типа клеток.

Пробы ЦСЖ Рис.1. Индекс цитотоксичности ЦСЖ КРС в ПЛК

2

6

Экспериментально установлено, что потребность в сыворотке крови неодинакова для клеток, полученных

из тканей и органов разных видов животных (Иванов, 1995) и обычно находится в диапазоне 1-10% к объему культуральной среды.

В отличие от большинства других составляющих частей сыворотки крови, концентрация некоторых биологически активных веществ относительно постоянна и не изменяется даже при патологии более чем в два-три раза. Содержание же гормонов в крови у одного и того же донора в зависимости от физиологической ситуации может изменяться во много раз. Для них характерны также суточные, сезонные и биологические циклы. Следствием этого, по-видимому, и является вариабельность способности сывороток интенсифицировать рост клеток (Purchio, Larson, Collett, 1983). Отмечается, что состав сыворотки обусловлен видом, возрастом и физиологическим состоянием животных (Крюков с соавт., 1965; Федотова с соавт., 1994; Хороших и др., 1994).

Влияние сыворотки крови различных партий на скорость роста и урожай клеток также неодинаковы (Leftheriots, Precansta, Caillere, 1971).

Качественный и видовой состав сыворотки крови в ростовой среде оказывает существенное влияние на вирусрепродуцирующие характеристики культивируемых клеток (Bodeker et al, 1985).

В крови всегда присутствуют продукты неполного синтеза, а также распада гормонов, которые обладают биологическим действием. Тоже можно сказать и о ферментных системах. Вместе с сывороткой крови в питательную среду для культур клеток вводится целый комплекс факторов, варьирующих качественно и количественно от серии к серии препарата (Костина с соавт., 1994; Коренева, 1995; Неверовская и др., 2000; Chernov et. al, 1994).

Сыворотки крови КРС, заготавливаемые на крупных мясокомбинатах без учета возраста животных-доноров, истории их вакцинации, пола и иных факторов, иногда непригодны для культивирования клеток и вирусов, т.к. содержат антитела и неспецифические ингибиторы (Шафеева и др., 1999).

Функции сыворотки в культуре до сих пор полностью не изучены, а высказываемые по этому поводу мнения различных исследователей весьма противоречивы, однако не вызывает сомнений ее ростостимулирующая (Буеверо-ва и др., 1983, Nakamura et. al, 1983), адгезивная (Pau, Buul van Goudzwaard, 1980; Wahl, Wong, McCartney-Francis, 1989) и протективная (Курносов и др., 1987) роль при культивировании клеток.

Некоторые авторы цитотоксическое действие сыворотки объясняют случайным совпадением комплиментарное™ ее антител с антигенами культивируемых клеток (Герасимова и др., 1996), на что косвенно указывает факт различного взаимодействия одной серии сыворотки с различными видами клеточных культур (Миронова, Хапчеев, 1994).

При выращивании перевиваемых клеток VERO-B и первично-трипсинизированных клеток ПСХ нативная сыворотка крови КРС может быть заменена в культуральной среде ростовыми протеинами, выделенными из этой сыворотки (Шафеева и др., 1994). В то же время, ряд исследователей отмечают, что ростовые факторы не обладают свойствами цельной сыворотки (Бер-

нет, 1971, 1952; Montagnon et. al„ 1984) или вообще неэффективны при культивировании ^трансформированных клеток (Saha, 1988).'

Для оптимального ответа клеток, даже при достаточно высоких дозах сочетаний гормонов и факторов роста, необходимо присутствие хотя бы низких концентраций сыворотки (Сергеенко и др., 1982; Карышева и др., 1995; 1965; Clark, Gelb, Hirtenstein, 1982). Это, очевидно, свидетельствует о том, что эффект сыворотки представляет собой результат совместного синергического действия разнофункциональных компонентов (Scherer, Syverton, Gey, 1953).

Следует однако отметить, что несмотря на перспективность использования бессывороточных питательных сред, ни одна из них не может считаться универсальной при работе с несколькими линиями клеток и быть адекватной замены сыворотке крови (Коренева и др., 1991; Нариманов, 1991; Пригода и др., 1991; Пригода и др., 1993; Коренева, 1995; Clark, Hirtenstein, Gelb, 1979).

Однако целый ряд агентов вирусной природы, микоплазмы и химические <

вещества могут индуцировать в клетках изменения, приводящие к трансформации и опухолеобразованию (Malmquist, I960; Saha, 1984; Botner, 1994).

Нас заинтересовали исследования C.B. Лабинова (2000, 2001), в которых было установлено, что физико-химические свойства ЦСЖ КРС (в том числе и '

гормональный профиль) существенно не меняются в зависимости от возраста, пола и физиологического состояния животных. Данные, полученные исследованиями других авторов (Лабинов, 2003, Лащ, 2003), также свидетельствуют о стабильности ЦСЖ и ее перспективности для применения в качестве компонента ростовых питательных сред.

Изучение влияния ЦСЖ КРС на адгезивные свойства проводили на модели ПЛК почки овцы ПО(ВНИИВВиМ), как более чувствительной к цитоток-сическому действию биологически активных препаратов и имеющей наименьшие показатели ИЦЛ.

Ранее, в исследованиях А.П. Лаща и др. (2002) на модели перевиваемой '

линии клеток почки африканской зеленой мартышки CV-1 также было установлено, что клетки в среде с ЦСЖ КРС, не содержащей сыворотки крови КРС, теряли способность к адгезии и это свойство полностью восстанавливалось при введении в культуральную среду 2,5% сыворотки крови КРС. Положительно оценивая полученные автором научные данные, мы, тем не менее, отмечаем, что для изучения влияния ЦСЖ КРС на адгезивные свойства ПЛК необходима количественная оценка этого явления с учетом данных по цито-токсичности препарата.

Исследования адгезии клеток перевиваемой линии почки овцы ПО(ВНИИВВиМ) через 60 и 120 минут после их инокуляции показали, что увеличение содержания ЦСЖ в среде культивирования несколько снижает способность клеток прикрепляться к субстрату. Полученные данные характеризуют специфические биологические свойства ЦСЖ и, по-видимому, имеет определенное физиологическое значение in vivo, что согласуется с мнением

исследователей, работающих в данном направлении (Буеверова с соавт., 1983; Юрков и др., 1985).

Считается, что наиболее информативным и отвечающим практическим интересам является метод оценки клонообразующей способности клеток. Известно, что при низкой плотности клеточной популяции снижается роль кооперативных взаимодействий клеток, увеличиваются их требовательность к микроокружению, и к содержанию необходимых ростовых факторов среды культивирования (Панкова, 1976; Мирютова и др, 1984; Колбасова и др., 2000)

Способностью формировать клоны обладают не все клетки перевиваемых линий, а лишь некоторая их часть, которую называют клоногенными клетками, т.е. формирующими клоны, состоящие из 100 и более клеток. Известно, что доля клоногенных клеток в культуре может меняться при изменении условий культивирования (Колбасова, Юрков, Дмитренко, 2000).

Величина фракции клоногенных клеток тем больше, чем лучше условия культивирования и при неблагоприятных условиях клоногенные клетки в культуре могут вообще не выявляться (Бахтин, 1974).

В наших исследованиях изучение ростовых свойств ЦСЖ КРС проводили модифицированным микрометодом на модели ПЛК ПО(ВНИИВВиМ), ПС(ВНИИВВиМ), MDBK и VERO. В среде с добавлением ликвора КРС для всех четырех испытанных культур отмечается увеличение способности к кло-нальному росту клеток при сниженной посевной плотности (в 4-5 раз) с образованием фертильных клонов.

В наших исследованиях показано также, что введение в состав ростовой среды ЦСЖ КРС повышает выход фертильных клонов и это открывает новые возможности для более полного клонального анализа гетерогенных популяций клеток, каковыми и являются перевиваемые линии клеток.

2.2.3. Оценка биологических характеристик перевиваемых линий клеток

Проведена оценка морфологических характеристик перевиваемых линий клеток применяемых в настоящих исследованиях - ПО(ВНИИВВиМ), ПС(ВНИИВВиМ), MDBK и VERO.

При оценке характеристик перевиваемой линии клеток почки сайги установлено, что культура представлена клетками эпителиоподобного типа полигональной формы с четко различимыми границами. Цитоплазма клеток прозрачная, не зернистая, ядра клеток округлой формы с 1-4 ядрышками, что в полной мере соответствовало их каталожным характеристикам (Зуев и др,. Коллекция культур клеток, 1997; Юрков и др.. Каталог коллекции клеточных культур, 2000).

При оценке сублинии перевиваемых клеток ПО(ВНИИВВиМ) клетки были эпителиоподобные с четкими границами и гомогенной или слабозернистой цитоплазмой (рис.2).

» и i f ♦ --V e ^ - ' . * . 4 * + % - . * "ei * i Le * * f* - •• 1 с i * г fr « ++ л í . * - . » " • * При соблюдении стандартных условий культивирования биологические характеристики данной сублинии перевиваемых клеток сохраняли стабильность на протяжении 30 пассажей, что соответствовало их стандартным характеристикам (Зуев и др. Коллекция культур клеток, 1997; Юрков с соавт). Исследования характеристик перевиваемой линии

Рис.2.Перевиваемая культура клеток ПО, х 600

клеток почки теленка MDB К также показали, что культура представлена клетками эпителиоподобного типа полигональной формы с четко различимыми границами. Цитоплазма клеток прозрачная, не зернистая, ядра клеток округлой формы с 1-4 ядрышками, что также соответствовало их стандартным музейным характеристикам.

Цитоморфологические исследования перевиваемой линии клеток почки африканской зеленой мартышки VERO показали, что культура представлена клетками эпителиоподобного типа полигональной формы с четко различимыми границами. Цитоплазма клеток прозрачная, не зернистая, ядра клеток округлой формы с 1-4 ядрышками, что в полной мере соответствовало их стандартным характеристикам.

2.2.4. Изучение цитоморфологических, кариологических и биотехно-логическнх показателей культур клеток, культивируемых в среде с цереброспинальной жидкостью

В серии опытов результаты исследования проб ЦСЖ КРС как компонента ростовой питательной среды для культур клеток показали, что она, как и все биологические жидкости (сыворотка, плазма, эмбриональные экстракты) имеет индивидуальные биологические свойства, по-видимому, обусловленные возрастными, физиологическими и генетическими характеристиками доноров.

Изучение морфологии и ростовых свойств перевиваемых линий клеток, длительно (30 пассажей) культивируемых в питательной среде с ЦСЖ КРС показало, что, даже при значительной концентрации (2,5%), ЦСЖ КРС не оказывает существенного влияния на основные биотехнологические характеристики перевиваемых линий клеток -почки сайги ПС(ВНИИВВиМ), почки овцы ПО(ВНИИВВиМ), почки теленка MDBK, почки африканской зеленой мартышки (VERO), при достаточно высоком (5%) содержании сыворотки крови КРС в стандартных условиях монослойного стационарного культивирования (рис. 3,4,5,6).

>= s

80

60

ii— -

|| □Контроль ¡D С ликвором

Ж

ПС

MDBK

Культуры клеток

ох

¡Ü £ 3

с о.

§ о

0,8 0,6

0,4

□Контроль I ВС ликвором I

ПС

MDBK

Культуры клеток

Рис. 3. Урожай клеток с литрового _матраса_

Рис. 4. Ростовые показатели различных сублиний клеток в матрасах

И

Si

0 U

1 s

О «3

0,5

□ Контроль

□ С ликвором

ПО MDBK VERO Культуры клеток

Рис. 5. Ростовые показатели различных сублиний клеток в роллерных сосудах

Рис.6. Кариотип перевиваемой куль__туры клеток ПО х 1400_

Морфологические исследования перевиваемых линий клеток почки сайги ПС(ВНИИВВиМ) и почки овцы ПО(ВНИИВВиМ), длительно культивируемых в среде с ликвором КРС, проведенных на уровне 6-30 пассажей показали, что они в целом соответствуют паспортным характеристикам данных линий клеток и полученным ранее сведениям (Пинаев, 1985; Тарасов, 1991; Жестерев, Каламина, Балышева, Кушнир, 1996; Зуев, Юрков, Курносое. Коллекция культур клеток, 1997; Юрков, Чермашенцева, Смыслова и др., 1998; Герасимов, Куляшбекова, Гусев, Герасимова и др., 1999; Юрков, Зуев, Сидоров и др.. Каталог коллекции клеточных культур,...2000). В республиканском конкурсе научных докладов в области естественных наук, научная работа «Использование цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота в качестве компонента питательной среды, используемой для приготовления вакцин, сывороток и диагностикумов в ветеринарной медицине» награждена дипломом.

В исследованиях по изучению влияния ЦСЖ КРС на частоту патологических митозов в качестве основных моделей использованы клеточные культуры почки овцы ПО(ВНИИВВиМ) и почки сайги ПС(ВНИИВВиМ). Культуры

15

поддерживали методом последовательных пересевов в среде с 2,5% ликвора (опыт) и в паспортной среде культивирования каждой культуры (контроль). В целом исследования, проведенные на уровне 6 пассажа, не выявили существенного повышения уровня патологических митозов в клетках, культивируемых в среде с цереброспинальной жидкостью, в сравнении с контрольными культурами клеток. Уровень патологических митозов составлял 17-18% в обеих культурах, что согласуется с данными других исследователей как соответствующих норме (Новохатский, Михайлова, Хижнякова, 1985; Герасимов и др., 1999; Юрков, Зуев, Сидоров, 2000). Полученные в этих исследованиях данные также свидетельствуют о возможности внесения в ростовую питательную среду цереброспинальной жидкости, без существенных нарушений не только ростовых свойств питательной среды, но также и морфологических и кариологических показателей культуральных клеток.

Известно, что хромосомный набор клеток в условиях in vitro, где на клеточный геном воздействуют ряд неконтролируемых факторов и он подвергается разнообразным количественным и качественным изменениям, уровень ка-риотипической изменчивости значительно выше, чем in vivo.

В настоящих исследованиях при кариологическом анализе клеток, длительно культивируемых в среде с ликвором изучалось ее стабилизирующее воздействие на хромосомные характеристики культивируемых клеток, что оценивалось величиной модального класса клеток за счет снижения уровня экстракопирования хромосом.

ЦСЖ, в отличие от сыворотки крови, более консервативна по биохимическому составу и, в то же время установлено, что по уровню свободного тироксина, а также гормонов центрального происхождения (АКТГ) она превышает сыворотку крови (Лабинов, 2000; 2003; Лащ, 2003). В связи с этим особый поэтому практический интерес представляет вопрос стабилизации основных биологических характеристик клеток в процессе длительного культивирования при введении в состав питательной среды ликвора крупного рогатого скота.

Критерием стабильности ПЛК при их длительном культивировании служат показатели модального числа хромосом клеточной популяции, его величина и размах варьирования числа хромосом. Увеличение числа клеток стволовой линии гетероплоидных культур ПС и ПО повышает генетическую однородность клеточных популяций, и должно повысить воспроизводимость результатов исследований, полученных с использованием таких культур.

В связи с этим, целью исследований, представленных в настоящем разделе, явилось изучение влияния ЦСЖ на цитокариологические показатели ПЛК.

В работе нами были использованы две перевиваемые линии клеток: почки сайги ПС(ВНИИВВиМ) и почки овцы ПО(ВНИИВВиМ), которые поддерживали в монослойной культуре в соответствии с рекомендациями, изложенными в паспортах на каждую культуру. Изучение влияния ликвора КРС на кариоти-пические показатели этих клеток проводили на уровне б, 12 и 30 пассажа

В целом кариологические исследования показали, что ЦСЖ КРС оказыва-

ет стабилизирующее воздействие на хромосомные характеристики культивируемых клеток, выражающееся в увеличении величины модального класса клеток за счет снижения уровня экстракопирования хромосом (рис.7 -12).

30 -г-

25 •■

го ■ ■

15 ••

ю 45 О

38 40 41 42 43 44 45 46 47 48

Рис. 7. Гистограмма распределения числа хромосом в клетках субликии ПС(ВНИИВВиМ) - 6 пассаж в среде с лик-вором КРС_

,.„1

I V ■ I I I I I I I

38 39 40 43 44 45 46 47 49

Рис.8. Гистограмма распределения числа хромосом в клетках сублинии ПС(ВНИИВВиМ) - 12 пассаж в среде с ликвором КРС._

45 т 40 35 30 25 20 15 10 5 О

Щп

р "Ч1' и1 'I—I

40-г 35 •• 30 25 20 15 10 5 0

шжь

|ЕЗ|Ш|ЬМ|иЯ|1

|У|1.1|Е]|ГП|

37 38 40 42 43 44 45 4Й 47 48

Рис. 9. Гистограмма распределения числа хромосом в клетках сублинии ПС(ВНИИВВиМ) - 24 пассаж в среде с лик-вором КРС._

42 44 45 48 51 52 53 55 58 60 62

Рис. 10. Гистограмма распределения числа хромосом в клетках сублинии ПО(ВНИИВВиМ) - б пассаж в среде с ликвором КРС.

да

.ЕЗ.И.В-

50т 40 30 •■ 20 10 0

44 45 43 61 52 63 535753 61 63

44 45 46 47 48 51 52 53 54 55 58 62

Рис. 11. Гистограмма распределения числа хромосом в клетках сублинии ПО(ВНИИВВиМ) - 12 пассаж в среде с ликвором КРС._

Рис. 12. Гистограмма распределения числа хромосом в клетках сублинии ПО(ВНИИВВиМ) - 24 пассаж в среде с ликвором КРС._

Вирусрепродуцирующие свойства культур клеток в среде с ликвором исследовали на базе специализированной лаборатории «Биологии и культивирования вирусов». Проводили исследования по репродукции вируса бешенства в клетках ПС(ВНИИВВиМ), а изучение вирусрепродуцирующей способности ПЛК ПО(ВНИИВВиМ) по отношению к вирусу оспы овец.

Установлено, что ЦСЖ КРС не обладала вирусингибирующим действием и не оказывала отрицательного влияния на репликацию вирусов бешенства и оспы овец в адаптированных культурах клеток. Полученные в настоящих исследованиях данные удовлетворительно согласуются с исследованиями других авторов, использовавших другие штаммы (Сергеенко с соавт., 19S2; Черма-шенцев и др., 1982; 1990; Дьяконов, 1994; Юрков с соавт., 1995,2000).

Таким образом, ЦСЖ КРС не обладает вирусингибирующим действием и не оказывает отрицательного влияния на репликацию вирусов бешенства и оспы овец в адаптированных культурах клеток, что свидетельствует о перспективности ее применения в биотехнологии клеточных культур.

В целом проведенные исследования показали, что цереброспинальная жидкость крупного рогатого скота может использоваться в качестве ростости-мулирующей добавки в культурах клеток при их клонировании (повышение уровня клонооброзования). Для оценки ликвора КРС в культуре клеток предлагаются методы определения индекса цитотоксичности, адгезивных свойств, уровня клонооброзования клеток, причем эти показатели определяются индивидуальными потребностями клеток каждого типа.

Полученные в настоящих исследованиях данные позволили сформулировать основные выводы и практические предложения.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что стерилизация цереброспинальной жидкости через мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм, приводит к тому, что она не содержала бактерий, грибов и микоплазм, а ее хранение при температуре минус 20°С сохраняет исходную биологическую активность в течение двух лет.

2. Вирус диареи КРС методом флуоресцирующих антител, с использованием перевиваемой линии клеток почки теленка MDBK, чувствительной к вирусу BVD, не обнаружен ни в одной из исследуемых проб цереброспинальной жидкости. В ликворе не обнаружено антител к вирусу диареи КРС, в то время как в сыворотке крови титры антител составляли от 1:16 до 1:64. Показано также, что ЦСЖ не обладает вирусингибирующим действием и не оказывает отрицательного влияния на репликацию вирусов бешенства и оспы овец в адаптированных культурах клеток.

Выявлено, что индекс цитотоксичности различен для каждой пробы цереброспинальной жидкости.

3. Изучено влияние различных концентраций ликвора КРС на адгезию клеток перевиваемой линии ПО и показано что увеличение концентрации ликвора в среде культивирования адекватно снижает способность клеток прикрепляться к субстрату. Активный характер воздействия ликвора на адгезивные

свойства клеток характеризует биологические свойства ликвора и имеет физиологическое значение in vivo.

4. Установлено на перевиваемых линиях клеток почки теленка MDBK и почки сайги ПС, что введение в состав ростовой среды ликвора КРС повышает выход фертильных клонов. Это открывает новые возможности для более полного клонального анализа гетероплоидных линий клеток и получения новых оригинальных клональных линий клеток.

5. Изучение морфологии и ростовых свойств перевиваемых линий клеток, длительно (30 пассажей) культивируемых в питательной среде с цереброспинальной жидкостью КРС показало, что, даже при значительной концентрации (2,5%), ликвор не оказывает существенного влияния на основные биотехнологические характеристики перевиваемых линий клеток (почки сайги ПС(ВНИИВВиМ), почки овцы ПО(ВНИИВВиМ), почки теленка MDBK и почки африканской зеленой мартышки VERO), при высоком (5%) содержании сыворотки крови КРС в стандартных условиях монослойного стационарного культивирования.

6. Выявлено, что ЦСЖ КРС не оказывает отрицательного воздействия на цитоморфологические характеристики культивируемых клеток на протяжении 24 пассажей. Исследования, проведенные на уровне 6 пассажа, не выявили существенного повышения уровня патологических митозов в клетках, культивируемых в среде с цереброспинальной жидкостью. В сравнении с контрольными культурами клеток уровень патологических митозов составил 17-18%.

7. Кариологический анализ перевиваемых линий клеток почки сайги и почки овцы показал, что ликвор КРС в составе ростовой среды (2,5%) оказывает стабилизирующее воздействие на кариотипическую изменчивость длительно (25 пассажей) культивируемых клеток, выражающуюся в повышении величины модального класса. Увеличение числа клеток стволовой группы, а, следовательно, генетической однородности гетероплоидных этих клеточных популяций должно повысить воспроизведение результатов научных исследований, полученных с использованием таких культур.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложена принципиально новая схема подготовки и стерилизующей фильтрации цереброспинальной жидкости КРС , включающая этапы замораживания, оттаивания, центрифугирования и последовательной мембранной фильтрации через систему фильтров АР-15, AW-06, HVWP (0,45 мкм) и GSWP с величиной пор 0,22 мкм (фирмы «Millipore», США).

2. Определены критерии биологической оценки цереброспинальной жидкости КРС для культур клеток, включающие определения индекса цитоток-сичности и клонообразующей способности для каждого типа клеток.

3. Исследования кариотипической стабильности и биотехнологических показателей перевиваемых линий клеток, культивируемых в среде с цереброспинальной жидкостью КРС, могут быть использованы в учебном процессе на биологическом и ветеринарном факультетах высших учебных заведений при

чтении лекций и проведении практических занятий.

4. Материалы диссертационной работы могут быть полезны исследователям, занимающимся вопросами использования цереброспинальной жидкости в качестве добавки при выращивании культур клеток, биогенного стимулятора и лекарственного средства.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лащ А.П. Исследование кариологических показателей перевиваемых линий клеток почки африканской зеленой мартышки CV-1 (ВНИИВВиМ)-Л/ А.П Лащ., С.Г. Юрков, А.В.Макаров // XXXI Огаревские чтения. Матер, на-учн. конф. - Саранск, 2003.В. 3. Ч. 2. - С. 108-109.

2. Лащ А.П.Сравнительная характеристика питательных сред при культивировании сублинии перевиваемых клеток почки африканской зеленой мартышки CV-1/ А.П. Лащ, A.C. Зенкин, A.B. Макаров // Естественно-науч. ис-след.:теория, методы, практика. Межвуз. сборник науч. трудов. -Саранск, 2003. -С. 55.

3. Макаров A.B. Изучение влияния цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота на биологические свойства перевиваемых линий клеток./ A.B. Макаров, A.C. Зенкин, А.П. Лащ // Материалы VIII научной конференции молодых ученых.- Саранск, 2003. - С. 148.

4. Макаров A.B. Изучение кариологических характеристик перевиваемых линий клеток.// Материалы VIII научной конференции молодых ученых.- Саранск, 2003.-С. 149.

5. Макаров A.B. Влияние цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота на цитокариологическую характеристику перевиваемых линий клеток./ A.B. Макаров, А.С.Зенкин, С.Г.Юрков и др. // Труды междунар. науч.-практ. конф. посвящ. 45-летию ВНИИВВиМ. - Покров, 2003 - С. 567-570.

6. Юрков С.Г. Оценка биологических свойств ликвора крупного рогатого скота в культуре клеток./ С.Г. Юрков, A.B. Макаров, A.C. Зенкин // Труды междунар. науч.-практ. конф. посвящ. 45-летию ВНИИВВиМ. - Покров, 2003 - С. 571-575.

7. Зенкин A.C. Научные и практические аспекты применения цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота в качестве биологически активного средства. / A.C. Зенкин, В.П. Лабинов, A.B. Макаров и.др. // Сборник материалов регион, науч. пракг. конф. Совр. сельскохоз. технологии в РМ. Саранск, 2004. -С. 328-335.

8. Зенкин A.C. Цереброспинальная жидкость крупного рогатого скота как биологически активное средство./ A.C. Зенкин, В.П. Лабинов, A.B. Макаров и др. // «Практик».№ 1-2. Санкт-Петербург.2004. - С. 52-55

Подписано в печать 23.11.04. Объем 1,25 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 2230.

Типография Издательства Мордовского университета 430000, г. Саранск, ул. Советская, 24

РНБ Русский фонд

2007-4

1.1 Актуальность темы

Перевиваемые линии клеток (ПЛК) считаются наиболее удобной моделью для изучения биологии клетки в культуре, морфо-функциональных взаимоотношений, факторов, влияющих на пролиферацию, дифференциров-ку и старение клеток и других общих и частных вопросов биологической науки клеток (Гаврилов, 1964; Бектемиров, 1991; Миронова и др., 1994; Бек-темиров, Горбунов, 1995; Pirtle, Woods, 1968; Petricciani, 1988).

В медицинской и ветеринарной вирусологии ПЛК служат тест-системой для выделения и идентификации многих вирусов. Большое применение они получили в производстве вакцинных и диагностических препаратов в качестве клеточных субстратов для накопления вирусной биомассы, причем в ветеринарии их внедрение идет опережающими темпами (Царева и др., 1990; Мищенко, 1995; Балышева и др., 1999).

Эффективность использования клеточных систем в биотехнологии определяется их биологическими свойствами, основными из которых являются потенциальное «бессмертие», чувствительность к широкому спектру вирусных патогенов, возможность применения микробиологической техники для промышленного культивирования, криоконсервация в жидком азоте и возможность заблаговременного, всестороннего контроля клеточного У; субстрата. Совокупность этих свойств ПЛК обеспечивает высокую степень надежности технологии и качества конечных продуктов.

В то же время, ПЛК гетерогенны, т.е. состоят из генетически неоднородных клеток, длительное последовательное пассирование которых часто сопровождается ненаправленными селективными процессами, приводящими к снижению, а иногда и полной потере клеточной популяцией требуемых биологических свойств. С целью повышения стабильности ПЛК и отбора наиболее эффективных субпопуляций проводят клонирование и реклонирование, однако выход фертильных клонов во многом определяется составом клеточного микроокружения. Одним из компонентов питательной клеточного микроокружения. Одним из компонентов питательной среды для ц клонирования, значительно обогащающим ее биологически активными веществами может служить цереброспинальная жидкость крупного рогатого скота (ЦСЖ КРС) (Лащ, Зенкин, Юрков, 2002, 2003). Имеющаяся отечественная и зарубежная информация по вопросам использования ликвора в клеточной биотехнологии немногочисленна, критерии оценки самого ликвора для использования в клеточной биотехнологии не разработаны, не изучено его влияние на кариотипическую стабильность культивируемых клеток, определяющую воспроизводимость биотехнологических показателей. Использование ликвора для этих целей представляется чрезвычайно перспективным направлением исследований.

Однако эта проблема требует серьезной экспериментальной базы и 4$ адаптации применительно к конкретным условиям культивирования определенных клеток и вирусов и, безусловно, является важным научным направлением, что определило цель и задачи настоящих исследований.

1.2. Цель и задачи исследований

Целью настоящей работььявилось изучение влияния, цереброспинальной жидкости КРС на кариотипические показатели перевиваемых линий клеток, стабильность их биологических характеристик и разработка критериев оценки ликвора как компонента питательных сред культивируемых клеток.

Для достижения указанной цели решались следующие задачи: ц 1. Изучить токсичность и ростостимулирующие свойства цереброспинальной жидкости в культурах клеток различного видового происхождения.

2. Изучить морфологические показатели перевиваемых линий клеток, культивируемых в среде с ликвором.

3. Оценить кариотипическую стабильность перевиваемых линий клеток различной видовой принадлежности в процессе длительного культивирования в среде с ликвором.

4. Оценить влияние цереброспинальной жидкости на уровень репродукции вирусов различных таксономических групп в клетках перевиваемых линий.

1.3. Научная новизна

Впервые изучено влияние ЦСЖ КРС на стабильность кариотипа ПЛК различной видовой принадлежности и их биологические свойства в процессе длительного культивирования. Разработаны критерии оценки ликвора КРС для использования в культуральной практике и показаны различия в интенсивности биологического воздействия цереброспинальной жидкости на клетки перевиваемых линий различного видового происхождения.

1.4. Практическая значимость работы

Полученные в настоящих исследованиях данные показывают перспективность использования ЦСЖ КРС в биотехнологии перевиваемых линий клеток. Результаты исследований представляют интерес для специалистов, 4? занимающихся конструированием ростовых питательных сред для культур клеток, а также разработкой диагностикумов и вакцинных препаратов. Результаты исследований могут быть использованы в учебном процессе на биологическом, ветеринарном и медицинском факультетах.

1.5. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Биологические критерии оценки цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота в культуре клеток: индекс цитотоксичности, коэффициент клонообразования, уровень патологических митозов.

2. Кариотипическая стабильность перевиваемых линий клеток различ-ц ного видового происхождения, длительно культивируемых в питательной среде, содержащей цереброспинальную жидкость крупного рогатого скота.

3. Морфологические показатели перевиваемых линий клеток, культивируемых в питательной среде с цереброспинальной жидкостью крупного рогатого скота.

4. Вирусрепродуцирующие свойства перевиваемых линий клеток почки овцы ПО(ВНИИВВиМ) и почки сайги ПС(ВНИИВВиМ), культивируемых в среде с ликвором, в отношении адаптированных вирусов.

1.6. Реализация результатов исследований

Основные научные результаты диссертационной работы достаточно полно отражены в 8 опубликованных научных работах.

1.7. Апробация работы.

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной научной конференции (Покров, 2003), Региональной научно-практической конференции (Саранск, 2004), научной конференции (Огаревские чтения) Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева (Саранск 2003), журнале Практик (Санкт-Петербург, 2004).

1.8. Объем и структура работы.

Диссертационная работа изложена на 165 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических предложений, списка использованной литературы и приложений. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 33 рисунками. Список используемой литературы включает 285 источников, в том числе 109 на иностранных языках.

выводы

1. Установлено, что стерилизация цереброспинальной жидкости через мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм, приводит к тому, что она не содержала бактерий, грибов и микоплазм, а ее хранение при температуре минус 20°С сохраняла исходную биологическую активность в течение двух лет.

2. Вирус диареи крупного рогатого скота методом флуоресцирующих антител, с использованием перевиваемой линии клеток почки теленка MDBK, не обнаружен ни в одной из исследуемых проб цереброспинальной жидкости. В ликворе не обнаружено антител к вирусу диареи крупного рогатого скота, в то время как в сыворотке крови титры антител составляли от 1:16 до 1:64. Цереброспинальная жидкость не обладала вирусингибирующим действием и не оказывала отрицательного влияния на репликацию вирусов бешенства и оспы овец в адаптированных культурах клеток.

Выявлено, что индекс цитотоксичности различен для каждой пробы цереброспинальной жидкости.

3. Показано что увеличение концентрации ликвора в среде культивирования адекватно снижает способность клеток перевиваемой линии почки овцы ПО(ВНИИВВиМ), прикрепляться к субстрату. Активный характер воздействия ликвора на адгезивные свойства клеток характеризует биологические свойства ликвора и имеет физиологическое значение in vivo.

4. Установлено на перевиваемых линиях клеток почки теленка MDBK и почки сайги ПС, что введение в состав ростовой среды ликвора крупного рогатого скота повышает выход фертильных клонов. Это открывает новые возможности для более полного клонального анализа гетероплоидных линий клеток и получения новых оригинальных клональных линий клеток.

5. Выявлено, что морфологические и ростовые свойства перевиваемых линий клеток, длительно (30 пассажей) культивируемых в питательной среде с цереброспинальной жидкость крупного рогатого скота (2,5%), она не оказывает существенного влияния на основные биотехнологические характеристики перевиваемых линий клеток почки сайги ПС, почки овцы ПО, почки теленка MDBK и почки африканской зеленой мартышки VERO, в стандартных условиях монослойного стационарного культивирования.

6. Исследования, проведенные на уровне 6 пассажа, не выявили существенного повышения уровня патологических митозов в клетках, культивируемых в среде с цереброспинальной жидкостью (17-18%).

7. Кариологический анализ перевиваемых линий клеток почки сайги и почки овцы показал, что ликвор крупного рогатого скота в составе ростовой среды (2,5%) оказывает стабилизирующее воздействие на кариотипическую изменчивость длительно (30 пассажей) культивируемых клеток, выражающуюся в повышении величины модального класса. Увеличение числа клеток стволовой группы, а, следовательно, генетической однородности гетеропло-идных этих клеточных популяций должно повысить воспроизведение результатов научных исследований, полученных с использованием таких культур.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложена принципиально новая схема подготовки и стерилизующей фильтрации цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота, включающая этапы замораживания, оттаивания, центрифугирования и последовательной мембранной фильтрации через систему фильтров АР-15, А\У-06, НУ\\ГР (0,45 мкм) и ОБХУР с величиной пор 0,22 мкм (фирмы «МПН-роге», США).

2. Определены критерии биологической оценки цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота для культур клеток, включающие определения индекса цитотоксичности и клонообразующей способности для каждого типа клеток.

3. Данные о кариотипических и биотехнологических показателей перевиваемых линий клеток, культивируемых в среде с цереброспинальной жидкостью, могут быть использованы в учебном процессе на биологическом и ветеринарном факультетах высших учебных заведений.

4. Материалы диссертационной работы могут быть полезны исследователям, занимающимся вопросами использования цереброспинальной жидкости в качестве добавки при выращивании культур клеток, биогенного стимулятора и лекарственного средства.