Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Влияние цереброспинальной жидкости и квантового излучения на качество спермы хряков и потомство

На правах рукописи

ХЛРЛЛШКИН АЛЕКСАНДР ВАСИЛЬЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ ЦЕРЕБРОСПИНАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ И КВАНТОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА КАЧЕСТВО СПЕРМЫ ХРЯКОВ И ПОТОМСТВО

16.00.02- патология, онкология н морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

0 9 АП

САРАНСК-

2009

003466510

Работа выполнена на кафедре незаразных болезней и радиологии Аграрного института Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева.

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Зенкин Александр Сергеевич доктор сельскохозяйственных наук профессор

Горбачева Нина Николаевна доктор ветеринарных наук, профессор Молев Аркадий Иванович Кандидат ветеринарных наук, заслуженный ветеринарный врач РФ, президент Ассоциации ветеринарных врачей Республики Мордовия Денисов Василий Георгиевич

Ведущее учреждение: Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана

Защита диссертации состоится2009 года в часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.117.15 в Мордовском государственном университете им. Н.П. Огарева

Адрес: 430005 г. Саранск, ул. Большевистская, 68

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Мордовского государственного университета им. Н.П.Огарева

Автореферат опубликован на сайте Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева www.mrsu.ru e-mail: dsovet@mrsu.ru

Автореферат разослан « Ж » марта 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

Т.А. Романова

1. Г ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы

Эффективность использования клеточных систем (в том числе и сперматозоидов) в биотехнологии определяется их биологическими свойствами, основными из которых являются потенциальное «бессмертие», чувствительность к широкому спектру вирусных патогенов, возможность применения микробиологической техники для промышленного культивирования, криоконсервация и возможность заблаговременного, всестороннего контроля клеточного субстрата (Миронова и др., 1994; Бектемиров, Горбунов, 1995; РеШса'аш, 1988).

Успех искусственного осеменения зависит от жизнеспособности спермиев, их устойчивости во внешней среде и в половом аппарате самки, а также активности участия в оплодотворении (Студенцов и др., 1986; Ильинский и др., 2002; Небогатиков, 2005 и др.). Активность движения спермиев зависит от их зрелости, возраста, возбудимости, а также от влияния внешних факторов и в частности жидкой среды, в которой они находятся.

Одним из компонентов питательной среды или среды разбавителя, значительно обогащающим ее биологически активными веществами может служить цереброспинальная жидкость (ЦСЖ) крупного рогатого скота (Лащ, Зенкин, 2001). Введение в состав среды цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота повышает выход фертильных клонов, и это открывает новые возможности для размножения и сохранения популяций клеток (Макаров, 2004).

Роль квантовых излучений в функционировании клеток (Штемлер, Колесников, 1978; Киселева и др., 1999; Туманов и др., 1994 и др.) сводится в основном к поддержанию или восстановлению гомеостаза. Так лазерное излучение низкой интенсивности изменяет процессы перекисного окисления липидов в направлении образования меньших количеств конечных продуктов окисления (Гринштейн, 1997; Золотарева, Олешко А.Я., Олешко Т.И., 2001). Однако такие исследования проведены только для улучшения качества спермы быков перед криоконсервацией (Балковский, Христофоров, 2000).

Имеющаяся отечественная и зарубежная информация по вопросам использования цереброспинальной жидкости в сочетании с квантовым излучением в клеточной биотехнологии немногочисленна, вместе с тем чрезвычайно перспективное направление. Эта проблема требует серьезной экспериментальной базы и адаптации применительно к конкретным условиям и, безусловно, является важным научным направлением, что определило цель и задачи настоящих исследований.

1.2. Цель н задачи исследований

Целью настоящей работы явилась оценка влияния цереброспинальной жидкости и квантового излучения на биологические свойства спермы хряков и качество получаемого потомства.

Для достижения указанной цели решались следующие задачи:

1. Провести оценку влияния цереброспинальной жидкости на качество спермы хряков.

2. Изучить влияние квантовых излучений на качество спермы хряков.

3. Оценить влияния сочетаний цереброспинальной жидкости и квантового излучения на качество спермы хряков.

4. Провести оценку полученного приплода от свиней, осемененных спермой с добавлением оптимальной дозы цереброспинальной жидкости.

1.3. Научная новизна

Впервые изучено влияние цереброспинальной жидкости, квантового излучения и их сочетаний на качество спермы хряков. Определены оптимальные дозы цереброспинальной жидкости и диапазоны квантового излучения для улучшения качества разбавленной спермы хряков. Проведена оценка оплодотворяющей способности спермы хряков с добавлением в разбавленную сперму цереброспинальной жидкости и полученного потомства. Новизной обладает разработанное в процессе исследований «устройство для отбора цереброспинальной жидкости» - (Патент на полезную модель №64512 от 11.12.06), а также способ хранения свежеполученной спермы хряков (Решение Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам (Роспатента) о выдаче патента от 9.10. 2008).

1.4. Практическая значимость работы

Полученные в настоящих исследованиях данные показывают перспективность использования цереброспинальной жидкости и квантового излучения в технологии искусственного осеменения свиней. Результаты исследований представляют интерес для специалистов, занимающихся конструированием питательных сред и сред разбавителей для культур клеток. Результаты исследований могут быть использованы в учебном процессе на биологическом, ветеринарном и медицинском факультетах.

1.5. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Биологические критерии оценки влияния цереброспинальной жидкости на качество спермы хряков.

2. Результаты влияния различных диапазонов квантовых излучений на качество спермы хряков.

3. Показатели качества спермы при воздействии сочетаний цереброспинальной жидкости и квантового излучения на сперму хряков.

4. Качество полученного приплода от свиней, осемененных спермой с добавлением оптимальной дозы цереброспинальной жидкости.

1.6. Реализация результатов исследований

Основные научные результаты диссертационной работы достаточно полно отражены в 7 опубликованных научных работах и патенте на полезную модель.

1.7. Апробация работы.

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Международных научных конференциях (Оренбург, 2008, Саратск, 2008), научных конференциях (Огаревские чтения, 2007, 2008; Лапшинские чтения,

2006, 2007, 2008; Молодых ученых, 2008) Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева.

1.8. Объем н структура работы.

Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических предложений, списка использованной литературы и приложений. Диссертация иллюстрирована 21 таблицами и 15 рисунками. Список используемой литературы включает 243 источников, в том числе 18 на иностранных языках.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Материалы н методы исследовании

Исследования по теме диссертационной работы проводились на базе учебно-научной лаборатории кафедры незаразных болезней и радиологии Аграрного института МГУ им. Н.П. Огарева в рамках темы «Морфогенез и закономерности индивидуального развития организмов (в норме и при патологии)» (№ государственной регистрации 01200704777) в период с 2005 по 2009 гг.

Всего проведено 4 серии опытов. Общая схема исследований представлена в табл. I.

В первой серии опытов оценивали качество спермы хряков в хозяйстве, а также проведена оценка влияния цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота на биологические характеристики спермы хряков.

Взятие цереброспинальной жидкости осуществляли от крупного рогатого скота на базе предприятия ГУП РМ Развитие села «Пищекомбинат Саранский» Республики Мордовия. ЦСЖ получали перед убоем от клинически здоровых животных, что подтверждалось ветеринарными документами и после-убойным осмотром туш и органов.

Цереброспинальную жидкость получали путем цистернальной пункции. При отборе ЦСЖ система для отбора цереброспинальной жидкости (Система, патент на изобретение № 2125470), нами была модернизирована (патент на полезную модель №64512 от 11.12.06).

Полученную ЦСЖ расфасовывали в стерильные флаконы и замораживали при -18°С (Пильгаев, 1999). Консервированную ЦСЖ использовали для дальнейших опытов.

Сперму получали в ООО «Агрофирма Октябрьская» Республики Мордовия от хряков основного стада породы крупной белой и ландрас мануальным методом в одноразовые полиэтиленовые спермоприемиики с фильтром. Све-жеполученную сперму оценивали по общепринятым методикам.

Объем эякулята определяли в мерном стакане сразу же после фильтрации. Он колебался в пределах от 150 до 900 мл. Запах спермы слабо специфический. Цвет спермы хряков был молочно-белым, серо-белым. Консистенция исследуемой спермы хряков молочная или молочно-водянистая.

Таблица 1. Общая схема исследований

Серия Вид Группа Количество

опытов объекта объектов Наименование исследований

Быки 1 3 Отбор цереброспинальной

I Коровы 3 жидкости

Хряки 7 Исследование качества спермы хряков в хозяйстве Оценка влияния различных

Сперма хряков 186 доз доз ЦСЖ коров и быков на качество спермы хряков

II Сперма хряков 34 дозы Оценка квантовых излучений Рикта МБ на качество спермы хряков

Сперма хряков 78 доз Оценка квантовых излучений «Рикта -02/1 »(Ml) на качество спермы хряков

III Сперма хряков 15 доз Оценка влияния сочетаний цереброспинальной жидкости и квантового «Рикта -02/1 »(Ml) излучения на качество спермы хряков.

IV Свиноматки породы крупной белой 6 Оценка оплодотворяющей способности спермы с добавлением оптимального

Свиноматки 6 количества ЦСЖ и полу-

помеси поро- ченного приплода(119

ды крупной поросят).

белой и ланд-

рас

Определение рН спермы проводили при помощи универсального индикатора и по окраске смешанной капли определяли рН спермы. Сперма окрашивалась в желто-зеленый и зеленый цвет, что соответствует рН=7 и 8, то есть исследуемая сперма имела слабо щелочную и нейтральную реакцию.

Микроскопическую оценку спермы проводили - не позднее 15 минут после ее получения. Для этого стерильной пипеткой наносили на чистое, теплое, сухое предметное стекло каплю спермы и накрывали ее покровным стеклом, переносили на нагревательный столик, расположенный на предметном столике микроскопа и проводили ее оценку.

Подвижность (активность) определяли при 300-кратном увеличении. При этом вычисляли процент подвижных спермиев по десятибалльной шкале и

форме их движения. Каждый балл равен 10 % сиермиев, обладающих прямолинейно-поступательным движением.

Густоту оценивали в зависимости от количества спермиев в поле зрения микроскопа. Сперма имеет следующую оценку:

- густая сперма (Г) - поле зрения густо заполнено спермиями. Свободные промежутки между ними меньше длины спермия. Соответствует концентрация 200 млн. и больше в 1 мл;

- средняя сперма (С) - промежутки между спермиями больше длины спермия. Соответствует концентрации 100...200 млн. в 1 мл;

- редкая сперма (Р) - промежутки между спермиями допускают свободное передвижение спермиев. Соответствует концентрации меньше 100 млн. в 1 мл.

Концентрацию оценивали в счетной камере Горяева следующим способом - над сеткой (в средней части камеры) плотно притирали покровное стекло до появления радужных колец. Камера и стекло были чистыми и абсолютно сухими. Сперму проверяли по способу, разработанному К.Л. Левиным (1974). Сперму разбавляли в зависимости от густоты в 20, 30, 40 и 50 раз с тем, чтобы в счетной камере (при оценке пробы) подсчитать около 50... 100 спермиев. Для оценки их концентрации в 0,1 мл спермы применяли микропипетки и флаконы (колбочки) объемом 10...25 мл. В зависимости от нужной степени разбавления спермы (20, 30, 40, 50 раз) в них наливали с помощью пипетки соответственно 1,9, 2,9, 3,9 или 4,9 мл 3 % раствора хлористого натрия. Затем микропипеткой вносили в колбочку с раствором хлористого натрия 0,1 мл перемешанной спермы. После этого в пипетку набирали 2-3 раза указанный раствор из флакона, чтобы смыть остатки спермы с ее стенок. Далее флакон встряхивали для лучшего перемешивания спермы с раствором. Каплю разбавленной спермы для нанесения на счетную камеру отбирали с помощью глазной пипетки (Левин, 1980). Под микроскопом подсчитывали число спермиев по диагонали камеры в 5 больших квадратах сетки. Учитывали только головки спермиев, лежащие внутри квадрата.

Подсчитанное в каждом большом квадрате число спермиев записывали, данные суммировали и высчитывали концентрацию спермиев (млн. в 1 мл) по формуле:

С=п/ 1000

где С - концентрация спермиев (млн. в 1 мл);

п - число спермиев в 80 малых квадратах.

Для большей точности подсчет спермиев в камере производили дважды и вычисляли среднее из обоих показателей.

Определение живых и мертвых спермиев по окраске. Определяли по методу, основанному на том, что живые спермии с поступательным движением не воспринимают красок, а мертвые и с колебательным движением легко окрашиваются. Для этого на обезжиренное спиртом и эфиром предметное стекло наносили небольшую каплю спермы, добавляли к ней каплю 5%-ного водного раствора эозина, 1-2 секунды перемешивали их и делали тонкий ма-

зок, который подсушивали в течение не более 1 мин. Высохший мазок просматривали под микроскопом. Живые спермин на розовом фоне выделялись белой неокрашенной головкой, мертвые же спермин окрашивались в розовый цвет. Подсчитывали подряд 500 спермиев, отмечая из них число окрашенных и неокрашенных, и вычисляли процент живых и мертвых. Процент живых спермиев соответствовал идентичному показателю определения их активности (например, 80 % живых спермиев = 8 баллам активности).

Определение числа патологических форм спермиев. На конец чисто вымытого и обезжиренного предметного стекла наносили небольшую каплю спермы и покровным стеклом делали тонкий мазок в противоположную сторону. Подсохший в течение 1-2 мин мазок фиксировали в 96%-ном спирте, окрашивали 6%-ным водным раствором эозина через фильтровальную бумагу в течение 10-20 мин. После этого краску сливали, бумагу снимали, мазок промывали дистиллированной водой и сушили. Мазок просматривали под микроскопом при увеличении в 600 раз. В нескольких полях зрения подсчитывали не менее 500 спермиев, в том числе нормальных и патологических по форме (гигантские и карликовые, с деформацией головки и бесхвостые, с надломом у шейки, с закручиванием и искривлением хвоста, спермии с каплей и утолщением и др.), после чего вычисляли процент патологических форм спермиев.

Определение степени микробной контаминации спермы. Устанавливали по количеству микробных клеток в 1 мл спермы. Дйя этого 1 мл спермы выливали на чашки Петри с агаром, после суточного инкубирования в термостате при 37°С подсчитывали количество выросших микробных колоний и вычисляли их количество в 1 мл спермы. После этого путем соответствующих микробиологических исследований определяют видовой состав и патогенность микрофлоры спермы.

Биологическая проба спермы. Перечисленные выше методы являются лишь косвенными, т.к. позволяют лишь судить об оплодотворяющей способности спермы. Решающее значение для оценки спермы имело прямое определение оплодотворяющей способности спермы путем биологической пробы, т.е. осеменением здоровых молодых зрелых свиноматок.

Оценку влияния квантовых излучений на биологические свойства спермиев проводили при помощи ветеринарного и медицинского аппаратов «Рикта».

Аппарат магнитно-инфракрасный, лазерный терапевтический ветеринарный Рикта МБ работает от источника питания силой тока 0,8 А, напряжением 12В. Воздействует пульсирующим красным светом, постоянным магнитным полем, лазерным и инфракрасным излучениями в диапазоне волн 0,83 мкм и 0,92-0,96, мощностью 8-16 вт. Частота воздействия 4 ГЦ, 64 Гц, 512 Гц, 4096 Гц.

Аппарат магнитно-инфракрасный, лазерный терапевтический «Рикта -02/1»(М1) работает от сети переменного тока, напряжением 220±10% В. Аппарат обеспечивает одновременное, проникающее воздействие на биообъект когерентного и некогерентного световых потоков инфракрасного и красного

диапазонов в сочетании с поверхностным воздействием на него постоянного магнитного поля, в диапазоне волн лазерного 0,8-0,91 мкм инфракрасного светодиодного 0,86-0,96 мкм красного светодиодного 0,6-0,7мкм., импульсной мощностью лазерного и инфракрасного излучения не менее 4 Вт. Частота воздействия 5 ГЦ, 50 Гц, 1000 Гц и переменной частоты. Оборудован таймером и индикатором времени на 1, 2, 5, 10 минут.

Данными аппаратами сперму хряков обрабатывали дистантно на расстоянии 1-2см.

Оценку оплодотворяющей способности разбавленной спермы хряков с добавлением оптимальной дозы ЦСЖ проводили посредством искусственного осеменения свиноматок данной спермой. Осеменение проводили двукратно: первый раз при выявлении половой охоты, второй - через сутки после первого. Факт оплодотворения зафиксирован на 21 день при помощи УЗИ. Проведена оценка полученного приплода от свиноматок, осемененных спермой с добавлением ЦСЖ.. При этом изучали количество поросят в помете, росто-весовые показатели полученного приплода, биохимические показатели крови поросят на базе и методикам испытательной лаборатории контроля физиологического состояния животных Аграрного института МГУ им. Н.П. Огарева

Статистическую обработку цифровых данных проводили на компьютере с помощью программы STAT (Торопов, 1993). Элементарную статистику выборок проводили вычислением средней арифметической и ее ошибки.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Приступая к выполнению настоящей работы, мы исходили из следующих теоретических предпосылок и практической значимости выбранного направления:

- эффективность использования клеточных систем (в том числе и сперматозоидов) в биотехнологии определяется их биологическими свойствами, основными из которых являются потенциальное «бессмертие», которое зависит как от свойств самих клеток, так и от внешних и внутренних экологических факторов на них воздействующих (Студенцов, 1986, 1999, 2005; Ильинский, 2002; Небогатиков, 2005 и др.);

- одним из компонентов питательной среды или среды разбавителя, значительно обогащающим ее биологически активными веществами может служить цереброспинальная жидкость крупного рогатого скота. Введение в состав среды цереброспинальной жидкости открывает новые возможности для интенсивного размножения и длительного сохранения популяций клеток (Зенкин, 1997, 1998,2004; Лащ, 2003; Макаров, 2004);

- роль квантовых излучений в функционировании клеток сводится в основном к поддержанию или восстановлению гомеостаза. Так лазерное излучение низкой интенсивности изменяет процессы перекисного окисления липидов в направлении образования меньших количеств конечных продуктов окисле-

ния и активирует физиологические процессы (Штемлер,1978; Киселева, 1999; Туманов, 1994 и др.). Ведущее направление сформулировано крупным отечественным ученым радиобиологом A.M. Кузиным, (1991) как радиационный гормезис и стимулирующее действие биогенных излучений;

- квантовые излучения в сочетании с цереброспинальной жидкостью оказывают стимулирующее воздействие на развитие и размножение клеток организма. Связано это, вероятнее всего, с активизацией биологических свойств цереброспинальной жидкости после поглощения ей энергии квантового излучения. Подобные эффекты продемонстрированы рядом исследователей (Бур-лакова и др., 1999; Кузин, 1991; Бычковская и др., 2002; Калязина, 2002).

2.2.1. Оценка влияния цереброспинальной жидкости на качество спермы хряков

Исследования проведены на сперме хряков основного стада породы крупной белой и ландрас ООО «Агрофирма Октябрьская» мануальным методом. Установлено, что свежеполученная сперма в хозяйстве соответствует принятым стандартам качества спермы хряков.

При добавлении различных доз ЦСЖ коров, органолептические и микроскопические (кроме выживаемости спермиев) свойства свежеполученной спермы не изменились. Добавление определенных количеств ЦСЖ приводит к изменению выживаемости спермиев (как к снижению, так и к увеличению), по видимому за счет ее состава. Так присутствие в ЦСЖ практически всех гормонов, присутствующих в сыворотке крови (тироксина, трийодтиронина, ад-ренокортикотропного гормона, кортизола и т.д.), и даже увеличенное их количества (адренокортикотропного гормона, инсулина и т.д.) приводит к обогащению среды разбавителя биологически активными веществами (Лабинов, 2000; Лащ, 2003; Лащ, Юрков, Макаров, 2003; Макаров 2004).

Установлено, что разбавление свежеполученной спермы хряков цереброспинальной жидкостью коров в соотношении 1:1 увеличивает выживаемость спермиев до 12 часов, что не имеет особой практической ценности. Из дальнейших исследований мы исключили исследования с неразбавленной спермой и проводили исследования с разбавленной спермой.

При добавлении к разбавленной сперме хряков больших (11- 233%) количеств цереброспинальной жидкости жизнеспособность спермиев была понижена (рис. 1). Следовательно цереброспинальная жидкость в больших количествах способна угнетать физиологические процессы, что соответствует данным, полученным в опытах А.И. Леткина (2000). В своих опытах он изучал влияние больших доз ЦСЖ на морфофункциональные показатели семенников хрячков и установил, что применение ЦСЖ коров вызывает деструктивные процессы в семенниках хрячков (кастрационный эффект).

Вместе с тем в наших исследованиях установлено, что введение в разбавленную сперму хряков 1% ЦСЖ коров, увеличивает выживаемость спермиев на 3-е -4-о суток. Жизнеспособные спермии при окраске 5%-м водным раствором эозина представлены на рис. 2. Дальнейшие исследования показали, что добавление к разбавленной сперме хряков ЦСЖ коров в количестве 1% увеличивает сроки выживаемости сперматозоидов до 8-и суток, по сравнению с контролем 5-ть суток, а сроки возможного использования спермы для осеменения свиней до 6-и суток (контроль - 3-е суток).

Стимулирующее действие ЦСЖ, установленное в ходе опытов, согласуются с исследованиями проведенными Ф.П. Пильгаевым (1999) и Н.Ю. Калязи-ной (2002). Так парентеральное введение ЦСЖ животным не вызывает выраженного пирогенного действия, токсической реакции и безвредна как для лабораторных так и сельскохозяйственных животных. В определенных дозах ЦСЖ обладает как ростостимулирующим действием, так и стимулирует гемо-поэз.

Исследованиями по добавлению в разбавленную сперму хряков ЦСЖ бычков установлено, что ЦСЖ в количестве 1% увеличивает сроки выживаемости сперматозоидов до 8-и суток, по сравнению с контролем 5-ть суток, а сроки возможного использования спермы для осеменения свиней до 6-и суток (контроль - 3-е суток), т.е. результаты сопоставимы с исследованиями ЦСЖ коров, что наглядно можно видеть на рис. 3.

Следовательно, в данной серии исследований установлено, что при добавлении к разбавленной сперме 1% ЦСЖ коров и бычков сохраняется выживаемость спермиев до 8-ми суток (без добавления цереброспинальной жидкости -контроль до 6-ти суток), т.е. влияние ЦСЖ коров и бычков на выживаемость спермиев хряков существенно не различается. Добавление к разбавленной сперме хряков ЦСЖ как коров, так и бычков в количестве 1% увеличивает

Рис. 2 Жизнеспособные спермии окрашенные эозином (ок. 15*об.40)

Сроки исследования, сутки

Рис.3 Выживаемость спермиев при добавлении ДСЖ коров и бычков в разбавленную сперму хряков

также сроки возможного использования спермы (количество живых спермиев 70%) для осеменения свиней до 6-и суток, по сравнению с контролем - 3-е суток. По данным, полученным в результате опытов разработан «Способ хранения свежеполученной спермы хряков».

Полученные нами данные о стимулирующем эффекте небольших количеств ЦСЖ согласуются с исследованиями других авторов.

Так А.П. Лащ (2003) в своих исследованиях показал, что цереброспинальную жидкость можно использовать в качестве компонента ростовых питательных сред для культивирования перевиваемых линий клеток. Он добавлял ЦСЖ в объеме 0,5% в ростовую среду с содержанием 2,5% сыворотки крови, при этом обеспечивается увеличение роста и пролиферации клеток.

A.B. Макаров (2004) в культуральной среде с содержанием 5% сыворотки крови при добавлении 2,5% ЦСЖ отмечал увеличение способности испытанных культур к клональному росту клеток. Введение в состав ростовой среды цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота повышает выход фер-тильных клонов, и это открывает новые возможности для более полного кло-нального анализа гетерогенных популяций клеток. Цереброспинальная жидкость крупного рогатого скота оказывает стабилизирующее воздействие на хромосомные характеристики культивируемых клеток.

Таким образом, присутствие 0,5-2,5% ЦСЖ в культуральных средах способствует лучшей сохранности и функционированию клеточных культур. В целом анализ собственных и литературных данных свидетельствует о перспективности использования ЦСЖ в биотехнологии клеточных культур, как для улучшения сохранности клеток, так и для их размножения.

2.2.2. Оценка влияппя квантовых излучений на качество спермы хряков

При оценке влияния квантовых излучений на качество спермы хряков использовали медицинский и ветеринарный аппараты «Рикта».

Исследования показали, что при использовании инфракрасного спектра ветеринарного аппарата «Рикта» возникает тепловой эффект, и спермин в скором времени погибают от перегрева, либо от быстрого расходования питательных веществ и накопления в сперме продуктов распада.

Из литературных данных известно, что при температуре 46,5°С белки спермиев переходят в состояние, близкое к необратимой денатурации (Сту-денцов и др., 2005). Так же известно, что энергию необходимую для движения н других жизненных процессов спермин получают при расщеплении (окислении) жиров, белков и углеводов, но преимущественно спермин окисляют простые сахара - фруктозу и глюкозу. В процессе гликолиза происходит выделение молочной кислоты, чем выше температура спермы и интенсивнее движение спермиев, тем более кислой становится реакция спермы, это приводит к замедлению движения и гибели спермиев (Михайлов и др., 1990).

Перед нами встал вопрос о необходимости исключения воздействия инфракрасных лучей, которые присутствуют в ветеринарном приборе «Рикта», или использовать другие аппараты - типа медицинского аппарата «Рнкта», что сделано в дальнейших исследованиях.

При воздействии на разбавленную сперму хряков магнитно-лазерным излучением различных режимов медицинского аппарата «Рикта» в течение 1 минуты наблюдается существенное увеличение двигательной активности спермиев, однако сроки их выживаемости снижались.

Основным механизмом действия лазерного излучения является фотофизический механизм резонансного поглощения с синтезом электронных возбужденных состояний и их последующими фотохимическими реакциями. Преимуществом лазерного излучения является его высокая спектральная мощность даже при малых суммарных мощностях луча. Возбуждение молекулы сопровождается увеличением объема молекулы. При одновременном поглощении миллионов квантов импульса лазерного излучения создается мощный механический удар по среде. Причиной возникновения механических колебаний в среде является увеличение объема вещества без изменений его фазового состояния в результате электронного возбуждения и нагрева (Журавлев, 2006). По мнению автора, ряд практических аспектов применения лазера сопряжен с его достаточной эффективностью в борьбе с гипоксическими состояниями, особенно в плане нормализации антиоксидантного статуса тканей и стабилизации мембранного компонента клеток.

При воздействии магнитно-лазерным излучением в течение одной минуты на сперму хряков снижается вероятность перекисного окисления липидов мембран спермиев, однако при этом спермии длительное время находятся в возбужденном состоянии и быстро расходуют свои энергетические запасы, что приводит к быстрой гибели спермиев. Возникла необходимость снижения

времени экспозиции.

Значение экспозиции для биологического эффекта НИЛИ исследовано

В.А. Трофимовым, А.П. Власовым (1997). Например, облучение продолжи- j

тельностью 10 мин. способствует улучшению метаболизма и росту функцио- { нальной активности нейтрофилов «in vivo» и «in vitro», а более длительная

экспозиция снижает функциональные возможности клеток (Казимирко, Клод- I

ченко, 1993). j

При снижении времени воздействия магнитно-лазерным излучением мощ- 1

ностью ЛИ 0,25 Вт и частотой излучения 5 Гц (опыт 1) и 50 Гц (опыт 2) на i

сперму до 10 секунд мы наблюдали повышение двигательной активности !

спермиев. При этом сохраняется их подвижность в первые сутки на уровне 9 J

баллов, а на 3-й сутки 6-и баллов, что наглядно видно на рис. 4. [

ГШ.

4

сутки

□ контроль

□ опыт 1

□ опыт 2

Рис.4. Изменение подвижности спермиев при воздействии квантовыми излучениями медицинского аппарата «Рикта» на сперму хряков.

Следовательно, воздействие на сперму хряков магнитно-лазерным излучением частотой 5 и 50 Гц и мощностью ЛИ 0,25 Вт приводит к увеличению двигательной активности спермиев в течение 12 часов после воздействия излучения. В дальнейшие сроки двигательная активность и подвижность спермиев подвергшихся воздействию квантовых излучений снижается. Настоящими исследованиями показано, что сперму хряков для улучшения двигательной активности необходимо подвергать обработке квантовыми излучениями не более чем за 12 часов до использования, так как снижение количества спермиев с прямолинейным поступательным движением приводит к снижению оплодотворяющей способности спермы.

2.2.3. Оценка влияния оптимальной дозы цереброспинальной жидкости в сочетании с оптимальной дозой квантового излучения медицинского прибора «Рикта» на качество спермы хряков.

Сочетанное влияние ЦСЖ и квантового излучения на костный мозг кроликов стимулирует эритробластический росток кроветворения (Калязина, 2002). Особый интерес вызывают полученные автором данные о повышении активности ЦСЖ при воздействии на нее квантовыми излучениями. Выявленный эффект позволяет предположить, что предварительное насыщение фармакологических средств энергией квантового излучения позволит существенно снизить применяемые дозировки. Это объясняется эффектом потенцирования. В настоящее время на данном эффекте основано применение лекарственных средств с содержанием малых дозировок основного действующего вещества (Эпштейн, 2008).

Установлено, что при воздействии на разбавленную сперму хряков с добавлением 1 % цереброспинальной жидкости магнитно-лазерным излучением частотой 5 и 50 Гц и мощностью ЛИ 0,25 Вт отмечается увеличение двигательной активности спермиев (рис. 5).

л ц

с;

03

ю

□ контроль 1

□ контроль 2

□ контроль 3 контроль 4

И опыт I

□ опыт 2

сутки

Рис.5. Изменение подвижности спермиев при воздействии квантовыми излучениями медицинского аппарата «Рикта» на сперму хряков с добавлением 1% ЦСЖ. Контроль 1 - разбавленная сперма хряков; контроль 2 - разбавленная сперма хряков с добавлением 1% ЦСЖ; контроль 3 и 4 - разбавленная сперма хряков при воздействии магнитно-лазерным облучением частотой 5Гц и 50Гц, мощностью ЛИ 0,25 Вт и экспозиции 1 Осекунд; опыт 1 и 2 - разбавленная сперма хряков с добавлением 1% ЦСЖ при воздействии магнитно-лазерным облучением частотой 5Гц и 50Гц, мощностью ЛИ 0,25Вт и экспозиции Юсекунд.

При этом подвижность спермиев увеличивается, по сравнению с пробами

разбавленной спермы без добавления ЦСЖ, обработанной магнитно-лазерным излучением того же диапазона. По сравнению с разбавленной спермой без добавления цереброспинальной жидкости и обработки квантовым излучением, исследуемая сперма практически не изменяет подвижности, но увеличивается двигательная активность спермиев. По сравнению с разбавленной спермой с добавлением цереброспинальной жидкости в исследуемой сперме снижается активность спермиев, но возрастает их двигательная активность, что также наглядно представлено на рис. 5.

В целом в данной серии опытов установлено, что разбавленную сперму хряков с добавлением 1 % ЦСЖ для улучшения двигательной активности необходимо подвергать обработке квантовыми излучениями не более чем за 36 часов до использования при искусственном осеменении свиней, так как дальнейшее хранение облученной спермы приводит к снижению количества спермиев с прямолинейным поступательным движением, а следовательно потенциальному снижению оплодотворяющей способности.

2.2.4. Оценка оплодотворяющей способности спермы с добавлением оптимальной дозы цереброспинальной жидкости и полученного приплода.

В заключительной серии опытов проведены исследования оплодотворяющей способности разбавленной спермы хряков с добавлением 1% цереброспинальной жидкости, а также оценка полученного приплода от свиноматок крупной белой породы и помесей пород крупная белая и ландрас, осемененных спермой хряков с добавлением ЦСЖ.._

■Я

к

>ч

о

г./

е./

з./

¡53

□ контроль О опыт

количество средняя масса средняя масса поросят,шт при рождении,кг при отъеме,кг

>1 О

-ГШ

Г !

□ контроль О опыт

ш

пям

когмчеслао средняя массасредняя масса поросят, шт при рождении, при о

Рис. 6. Качество приплода свиноматок крупной белой породы осемененных разбавленной спермой хряков с добавлением 1 % ЦСЖ.

Рис. 7. Качество приплода свиноматок помесей крупной белой породы и породы ландрас осемененных разбавленной спермой хряков с добавлением 1% ЦСЖ.__

Из 6-ти свиноматок осемененных двукратно с интервалом в 1-й сутки

спермой с добавлением 1% ЦСЖ оплодотворились 100% свиней, также как и в контрольной группе. При этом количество поросят в помете недостоверно превышало контроль.

Показатели качества приплода свиноматок крупной белой породы и помесей пород крупной белой и ландрас представлены на рисунках 6-7.

Применение цереброспинальной жидкости как компонента среды разбавителя для спермы хряков позволяет увеличить сроки хранения и использования спермы хряков, сохраняя активность и жизнеспособность спермиев, не ухудшая при этом оплодотворяющей способности спермиев. Применение для осеменения свиней не зависимо от породы спермы с добавлением цереброспинальной жидкости позволит увеличить количество поросят в помете на 4-13% (р>0,05) и массу поросят при рождении и отъеме на 1-1,5% (р>0,05).

Таким образом, применение цереброспинальной жидкости как компонента среды разбавителя для спермы хряков улучшает качество биологических характеристик спермы (сохранение активности и жизнеспособности), не ухудшая при этом оплодотворяющей способности спермиев, и не влияет на качество потомства, полученного после осеменения такой спермой свиноматок независимо от породы.

ВЫВОДЫ

1. Добавление к разбавленной сперме хряков цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота (коров и бычков) в соотношении 1% к объему спермы с разбавителем (оптимальная доза) увеличивает сроки возможного использования спермы (количество живых спермиев 70%) для осеменения свиней до 6-и суток, по сравнению с контролем (3-е суток).

2. Для улучшения двигательной активности разбавленную сперму хряков целесообразно подвергать обработке квантовыми излучениями (магнитно-лазерным излучением частотой 5 и 50 Гц и мощностью ЛИ 0,25Вт). Использовать ее для искусственного осеменения свиней в течение первых суток после облучения.

3. Сочетанное воздействие магнитно-лазерным излучением на разбавленную сперму хряков с добавлением 1 % цереброспинальной жидкости приводит к улучшению двигательной активности сперматозоидов. При этом сроки использования разбавленной спермы для искусственного осеменения свиней увеличивается до 2-х суток, в сравнении с разбавленной спермой, подвергшейся только квантовому облучению.

4. Применение цереброспинальной жидкости как компонента среды разбавителя для спермы хряков улучшает качество биологических характеристик спермы (сохранение активности и жизнеспособности), не ухудшая при этом оплодотворяющей способности спермиев, и не влияет на выход молодняка и их росто-весовые показатели независимо от породы.

5. Разработано устройство для отбора цереброспинальной жидкости (патент №64512 на полезную модель, модернизирующую систему для отбора це-

реброспинальной жидкости - патент на изобретение № 2125470).

6. Исследования по оценке качества спермы хряков показали перспективность использования цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота и магнитно-лазерного излучения и их сочетаний в технологии искусственного осеменения свиней.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработанное устройство для отбора цереброспинальной жидкости (патент №64512 на полезную модель, модернизирующее систему для отбора цереброспинальной жидкости — патент на изобретение № 2125470) может использоваться в практической ветеринарии и используется при научных исследованиях при получении цереброспинальной жидкости.

2. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности применения цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота в качестве компонента среды-разбавителя для спермы хряков для увеличения сроков использования спермы.

3. Данные о влиянии цереброспинальной жидкости и квантовых излучений, а также их сочетаний на сперму хряков, могут использоваться в учебном процессе на биологическом и ветеринарном факультетах высших учебных заведений.

4. Материалы диссертационной работы рекомендуются использовать исследователям, занимающимся вопросами применения цереброспинальной жидкости в качестве компонента при выращивании культур клеток, как биогенного стимулятора и лекарственного средства.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Харлашкин, A.B. Проблемы криоконсервации спермы животных для искусственного осеменения / A.B. Харлашкин, A.C. Зенкин // Ресурсосберегающие экологически безопасные технологии получения сельскохозяйственной продукции. Лапшинские чтения. Матер, научн. конф., посвященной памяти д.с.-х. и., проф., заслуженного деятеля науки РФ и РМ Сергея Александровича Лапшина. - Саранск, 2006. - С. 169-171.

2. Харлашкин, A.B. К методикам определения биологических свойств спермы хряков / A.B. Харлашкин // XXXV Огаревские чтения. Матер, научн. конф. - Саранск, 2007. - С. 67-69.

3. Харлашкин, A.B. Применение квантовых излучений в практике искусственного осеменения / A.B. Харлашкин, A.C. Зенкин // Ресурсосберегающие экологически безопасные технологии получения сельскохозяйственной продукции. Лапшинские чтения. Матер, научн. конф., посвященной памяти д.с.-х. н., проф., заслуженного деятеля науки РФ и РМ Сергея Александровича Лапшина. - Саранск, 2007. - С. 320-322.

4. Зенкин, A.C. Перспективы использования цереброспинальной жидкости при искусственном осеменении свиней / A.C. Зенкин, A.B. Харлашкин // Роль

биологии и ветеринарной медицины в реализации государственном программы развития сельского хозяйства на 2008-2012 гг. Матер. Международной научно-практической конф., посвященной 100-летию со дня рождения профессоров Жеденова В.Н., Удовина Г.М., Садовского Н.В. - Оренбург, 2008. - С. 39-45.

5. Харлашкин, A.B. Вопросы улучшения качества спермы хряков / A.B. Харлашкин, A.C. Зенкин // XXXVI Огаревские чтения. Матер, научн. конф. -Саранск, 2008.-С. 157-158.

6. Харлашкин, A.B. Оценка влияния цереброспинальной жидкости на биологические свойства спермы хряков / A.B. Харлашкин, A.C. Зенкин, Н.В. Козырев // Ресурсосберегающие экологически безопасные технологии получения сельскохозяйственной продукции. Лапшинские чтения. Матер. Международной научно-практической конф., посвященной памяти, проф., С.А. Лапшина. -Саранск, 2008. - С. 402-404.

7. Харлашкин, A.B. Использование цереброспинальной жидкости при искусственном осеменении свиней / A.B. Харлашкин // Материалы VIII научной конференции молодых ученых. - Саранск, 2008. - С. 69-70.

8. Зенкин, A.C. Устройство для отбора цереброспинальной жидкости./ A.C. Зенкин, НЛО. Калязииа, A.B. Харлашкин // Патент на полезную модель № 64512. Заяв. № 2006144087 Приоритет от 11 декабря 2006г. Зарегистрировано 10 июля 2007г.

Подписано в печать 23.03.09. Объем 1,0 п. л. Тираж 100 экз. Заказ X» 397. Типография Издательства Мордовского университета 430005, г. Саранск, ул. Советская, 24

1.1 Актуальность темы

Эффективность использования клеточных систем (в том числе и сперматозоидов) в биотехнологии определяется их биологическими свойствами, основными из которых являются потенциальное «бессмертие», чувствительность к широкому спектру вирусных патогенов, возможность применения микробиологической техники для промышленного культивирования, криоконсервация и возможность заблаговременного, всестороннего контроля клеточного субстрата (Миронова и др., 1994; Бектемиров, Горбунов, 1995; Petricciani, 1988).

Успех искусственного осеменения зависит от жизнеспособности сперми-ев, их устойчивости во внешней среде и в половом аппарате самки, а также активности участия в оплодотворении (Студенцов и др., 1986; Ильинский и др., 2002; Небогатиков, 2005 и др.). Активность движения спермиев зависит от их зрелости, возраста, возбудимости, а также от влияния внешних факторов и в частности жидкой среды, в которой они находятся.

Одним из компонентов питательной среды или среды разбавителя, значительно обогащающим ее биологически активными веществами может служить цереброспинальная жидкость (ЦСЖ) крупного рогатого скота (Лащ, Зенкин, 2001). Введение в состав среды цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота повышает выход фертильных клонов, и это открывает новые возможности для размножения и сохранения популяций клеток (Макаров, 2004).

Роль квантовых излучений в функционировании клеток (Штемлер, Колесников, 1978; Киселева и др., 1999; Туманов и др., 1994 и др.) сводится в основном к поддержанию или восстановлению гомеостаза. Так лазерное излучение низкой интенсивности изменяет процессы перекисного окисления липидов в направлении образования меньших количеств конечных продуктов окисления (Гринштейн, 1997; Золотарева, Олешко А.Я., Олешко Т.И., 2001). Однако такие исследования проведены только для улучшения качества спермы быков перед криоконсервацией (Балковский, Христофоров, 2000).

Имеющаяся отечественная и зарубежная информация по вопросам использования цереброспинальной жидкости в сочетании с квантовым излучением в клеточной биотехнологии немногочисленна, вместе с тем чрезвычайно перспективное направление. Эта проблема требует серьезной экспериментальной базы и адаптации применительно к конкретным условиям и, безусловно, является важным научным направлением, что определило цель и задачи настоящих исследований.

1.2. Цель и задачи исследований

Целью настоящей работы явилась оценка влияния цереброспинальной жидкости и квантового излучения на биологические свойства спермы хряков и качество получаемого потомства.

Для достижения указанной цели решались следующие задачи:

1. Провести оценку влияния цереброспинальной жидкости на качество спермы хряков.

2. Изучить влияние квантовых излучений на качество спермы хряков.

3. Оценить влияния сочетаний цереброспинальной жидкости и квантового излучения на качество спермы хряков.

4. Провести оценку полученного приплода от свиней, осемененных спермой с добавлением оптимальной дозы цереброспинальной жидкости.

1.3. Научная новизна

Впервые изучено влияние цереброспинальной жидкости, квантового излучения и их сочетаний на качество спермы хряков. Определены оптимальные дозы цереброспинальной жидкости и диапазоны квантового излучения для улучшения качества разбавленной спермы хряков. Проведена оценка оплодотворяющей способности спермы хряков с добавлением в разбавленную сперму цереброспинальной жидкости и полученного потомства. Новизной обладает разработанное в процессе исследований «устройство для отбора цереброспинальной жидкости» - (Патент на полезную модель №64512 от 11.12.06), а также способ хранения свежеполученной спермы хряков (Решение Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам (Роспатента) о выдаче патента от 9.10. 2008).

1.4. Практическая значимость работы

Полученные в настоящих исследованиях данные показывают перспективность использования цереброспинальной жидкости и квантового излучения в технологии искусственного осеменения свиней. Результаты исследований представляют интерес для специалистов, занимающихся конструированием питательных сред и сред разбавителей для культур клеток. Результаты исследований могут быть использованы в учебном процессе на биологическом, ветеринарном и медицинском факультетах.

1.5. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Биологические критерии оценки влияния цереброспинальной жидкости на качество спермы хряков.

2. Результаты влияния различных диапазонов квантовых излучений на качество спермы хряков.

3. Показатели качества спермы при воздействии сочетаний цереброспинальной жидкости и квантового излучения на сперму хряков.

4. Качество полученного приплода от свиней, осемененных спермой с добавлением оптимальной дозы цереброспинальной жидкости.

1.6. Реализация результатов исследований

Основные научные результаты диссертационной работы достаточно полно отражены в 7 опубликованных научных работах и патенте на полезную модель.

1.7. Апробация работы.

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Международных научных конференциях (Оренбург, 2008, Саранск, 2008), научных конференциях (Огаревские чтения, 2007, 2008; Лапшинские чтения, 2006, 2007, 2008; Молодых ученых, 2008) Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева.

1.8. Объем и структура работы.

Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических предложений, списка использованной литературы и приложений. Диссертация иллюстрирована 21 таблицами и 15 рисунками. Список используемой литературы включает 243 источников, в том числе 18 на иностранных языках.

выводы

1. Добавление к разбавленной сперме хряков цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота (коров и бычков) в соотношении 1% к объему спермы с разбавителем (оптимальная доза) увеличивает сроки возможного использования спермы (количество живых спермиев 70%) для осеменения свиней до 6-и суток, по сравнению с контролем (3-е суток).

2. Для улучшения двигательной активности разбавленную сперму хряков целесообразно подвергать обработке квантовыми излучениями (магнитно-лазерным излучением частотой 5 и 50 Гц и мощностью ЛИ 0,25Вт). Использовать ее для искусственного осеменения свиней в течение первых суток после облучения.

3. Сочетанное воздействие магнитно-лазерным излучением на разбавленную сперму хряков с добавлением 1 % цереброспинальной жидкости приводит к улучшению двигательной активности сперматозоидов. При этом сроки использования разбавленной спермы для искусственного осеменения свиней увеличивается до 2-х суток, в сравнении с разбавленной спермой, подвергшейся только квантовому облучению.

4. Применение цереброспинальной жидкости как компонента среды разбавителя для спермы хряков улучшает качество биологических характеристик спермы (сохранение активности и жизнеспособности), не ухудшая при этом оплодотворяющей способности спермиев, и не влияет на выход молодняка и их росто-весовые показатели независимо от породы.

5. Разработано устройство для отбора цереброспинальной жидкости (патент №64512 на полезную модель, модернизирующую систему для отбора цереброспинальной жидкости - патент на изобретение № 2125470).

6. Исследования по оценке качества спермы хряков показали перспективность использования цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота и магнитно-лазерного излучения и их сочетаний в технологии искусственного осеменения свиней.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработанное устройство для отбора цереброспинальной жидкости (патент №64512 на полезную модель, модернизирующее систему для отбора цереброспинальной жидкости — патент на изобретение № 2125470) может использоваться в практической ветеринарии и используется при научных исследованиях при получении цереброспинальной жидкости.

2. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности применения цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота в качестве компонента среды-разбавителя для спермы хряков для увеличения сроков использования спермы.

3. Данные о влиянии цереброспинальной жидкости и квантовых излучений, а также их сочетаний на сперму хряков, могут использоваться в учебном процессе на биологическом и ветеринарном факультетах высших учебных заведений.

4. Материалы диссертационной работы рекомендуются использовать исследователям, занимающимся вопросами применения цереброспинальной жидкости в качестве компонента при выращивании культур клеток, как биогенного стимулятора и лекарственного средства.