Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммунобиологические свойства культуральных вариантов вакцинных штаммов вирусов инфекционного ларинготрахеита птиц и Ньюкаслской болезни

ЭСТОНСКАЯ СШШСШКШЙСТЗШ1АЯ АКАЖ'Ш

На правах рукописи я кз. J,6

СКОВОРОДКИ . Владимир Александрович

...' УДК: 619:578; 085.23:613.988:636.5.

Ш'ШОБИОЛОПШСКШ СВОЙСТВА ШЬТУРАШШХ ВАРИАНТОВ МЩШНЫК. ШТАМШ® ВИРУСОВ ШШОЩ»ИОГО ЛАРШГОТРАХЕМТА ШЩ И КЬЮКАСДСКОЙ БОЛЕЗНИ

16.00.03. - ветеринарная шкоойиология,.вирусология, '■ . ЭПИЗООТОЛОГИЯ, МИКОЛОГИЯ я патология

- АВТОРЕФЕРАТ v/

диссертации на -соискание ученой степени кандидата 'ветеринарных наук '-

ТАРТУ I9S0

Работа выполнена' во Всесоюзном научно-исследовательском ветеринарном институте птицеводства

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук, профессор В.В.Малушко

Официальные оппоненты - доктор ветеринарных наук, профессор

И.Г.Скутарь

- кандидат ветеринарных наук Э.Я.Аавер

Ведущая организация - Ленинградский ветеринарией институт

Зашита диссертации состоится " " 1990

в " М " часов на заседании специализированного совета К. 120.33.03." Эстонской сельскохозяйственной академии по адресу;

202400, г.Тарту, ул.Рийа, 12.

С диссертацией мотао ознакомиться в библиотеке Эстонской сельскохозяйственной академии.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат ветеринарных наук

■ С

Очп&Ь^/чя 1990 г.

'ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

' Актуальность исследования. В современных условиях успехи в развитии ветеринарной вирусологии и биотехнология неразрывно связаны с использованием.биологической модели рлеточивх культур. Клеточнне "культуры являются уцобннш биологическими моделями в проведении 'вирусологических исследований / К.З.Н^ез, МУсте?, .1988; С.В.РКза^кг, 1989/ к когут случить основой идя ттеоизвоц--.ства-многих препаратов епешйической -шо&илактики. вярусних заболеваний /Всешгоная организация зпяавоохранения, ,1985; Т.А.Бек-темиров, 19Ь7/. В основе производства средств ■ специфической профилактики. ютТемгаонного ларинготпахеята птин АШ1/, а такие ныокаслской болезни /НБ/ на протяжении многих лет используются коммерческие;развивающиеся куриные эмЗрионн • /РКЭ/. •' В.настоящее время элективное ведение хозяйствования требует использования . в'основе производства средств специфической профилактики био- . логической модели С11Ф развивающихся. кушннх эмЗрионов, что в > -.свои очередь связано с дополнительным затратами на. содержание СШ стада кур несушек. В то же время использование перевиваемых культур клеток в качестве биологической модели позволяет получить препататн, свавнише" с препаратами, полученными' на биологической модели. СПф развивающихся куриных эмЗрионов. Ранее про-водише гатолн н^коплени-я, способн культивирования вакшнннх штатов КйТ ИБ в перепиваем« кяеточнтос культурах не 'получили достаточно4 нвучио"» разработки1,' сравнительной опенки и ивгоо-кого практического "щттщнйя /В.®.Макогон, 1975; В.К.Смоляни- ■ нов с соачт., 1981; Т.Эотокаим 'Л 1985/.. Остается актуаль—

но*, проблема разработки, способов культивирования вирусов в пере-ваваешх культурах клеток, обеспечивающих стабильность иммунобиологических свойств вакгашных штаммов.

Цель к задачи исследований. Учитывая вшеизложенное, цель работы 'опре целилась поучением ишгтобислоглческих свойств куль-туральннх вариантов вакпинннх штаймов вирусов инфекционного ле-рянготрахеита птиц и ньюкаслско? болезни. В свчзи с указанно!* целью-перец наш бшш поставлена следующие задачи:

- определить чувствительность различных -культур клеток к •вирусу инТеюдлонного ларкнготоатеита птип;

- изучить репооцуктога и оптиначьнне гооамвтон культивяпо-ваюш вагатагашх штаммов вирусов инфекционного ларинготэахеита

. шит и ньюкаслской болезни в клеточннх культупях;

- изучить идауногеннне. свойства вирусов, оеггроцупирован-ннх в клеточннх культурах;

- изучить возможности профилактики ин^ехшониого ларинго-тратепта птии и ньюкаслской болезни • препаратом!, иолученнкш на основе биологической модели перевиваемых клеточных культур.

Работа проводилась в соответствии с планок■научных исследований ВНИЗШ по заданиям СЗ.СЗ.М "Создать и освоить тэоичвои-ство усовершенствованной' виоус-взкшган против инфекционного ла-ркнготрахеита птиц" и 0I.I9.OT "Разработать.и внедрять ассоциированные вагашны против вирусных болезяе» птии /ньюкаслской, ЙЛТ, ГамЗоро, ССЯ-76, ин^егашонного бронхита/", а та;окв совместного советско-индийского исследования усовершенствования средств спет^ическоЧ про^вяактики ньюкаслской.болезниРабота. ' зарегистрирована в государственной книге № 41 от 01.03.89.

внивип.

Научная новизна т>а6очя. Изучены иммунобиологические свойства четырех вакшяннх. штаммов вируса ин^еяодояного ларннготра-хеита птздт и явух вглсшпишх штаммов вируса ньтокаслской болезни в перв!тао-трипстшзгооваимнх и перевиваемых плеточных культурах. '

Вперше использована сыворотка крови северных оленей длй' стикуляшп репродукции вируса ньшаспскс$ болезни в культуре перев'изаег-нх 'меток СПЭВ.

Повттотяп способ куаьтавяррвания вакгашного штамма "Р^В" в перевивав го Ч линии клеток СПЭВ. .

Определены различия биологических свойств- гаташов "Н" я ■ ."PjjB"' "вируса ньчкаслско^ болезни в перевиваешх юге точна* культурах VERO и СГОВ. •

Предложен кнтер<Т'ероносодержаш8 препарат для прск^илактики. инфекционного ларинготрахеита /ШТ/ и устранения поствакщналь-них осложнений при аэрозольной вакцинации от этой болезни.

Практическое значение .работа. На основе полученных даянн* предложен способ культивирования вакцинного итзмка "F2B" в культуре перевиваемых клеток С1ГЭЗ с целью получения препарата для споиМтгческой профилактики ньюкаслской болезни. Предложено • использование сыворотки крозя северных оленей яля куяьтявяро-ваняя перевиваекдх клеток СШШ. Получены кптер'Терокосоцержа-пшэ препарата на основе, перевиваемой линия клеток V-79 и ментов? селезенки. Предложено использование лнтерФероносодеряащих ' препаратов дня профилактики ИДТ птиц и сличения ностваяшналь-ного отхода при аэрозольной вакцинации вирусвакгошной. из штампа "ВНИИЕП". Материал-'- научных исследований используятся в па-боте вирусологически?: лэйорэторкЯ ВНИЗИП,- а .таете в учебном

процессе на'курсах повышения квалификации ветеринарных врачей.

Апробация "работы. Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены: на 32 Всесоюзном конференции молодых ученых «и'аспирантов по птицеводству ВШТИП/г.Загорск, май 1989г./;' на'25 Всесоюзной конференции.'"Комплексная система ветеринарных ■шроприятий в птицеводстве. - резерв повышения эффективности производства" ВРЗИВЩ /г.Ленин-град", октябрь 1989 г./; на Всесоюзном семинаре по применению препаратов интерферона в ветеринарии, в институте микробиологии и вирусологии им.Д.К.Эаболотного, АН УССР, ВДНХ УССР /г.Киев, ноябрь 1989 г./; на методическом и ученом совете ВНИВИП /г.Ленинград, декабрь 1989 г./.

'Публикации результатов исследований. По результатам дис-=свртации опубликовано 5 работ, в которых изложено основное ее ' содержание.

Структура и объем .диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, собственных исследований,-обсуждения, • выводов, практических 'Й^е.цловдний я. списка литературы. Изложена на 112 листах шжнописного текста/ Содержит 13 таблиц,' 6 -схем и иллюстрирована 16 пютограйиями. Список литературы включает 212 наименований, в том числе III инострачнкх апторов. ,

Основные положения. виносимне на защиту.

'I. Сравнительная характеристика льмунобггологических свойств . вакцинных штаммов вирусов инфекционного лагш;го?оахекта пткц и Л нызкаслской болезни в, биологических моделях- развивающихся куриных эмбрионов и.;;перввиваешх клеточных; культур:,: ' v : • - инфекционных. тигаов культивируемых закщшннх: тташов;.;''•.".■; . вирусов на различных иассапах;

'.'0--' ■'.:■'■•. — сравнительная опенка некоторых t-w"ctb -вш^соя»

- сиавнительнэя океяга лшуиогешшх свойств киоусов.

•• II. Получение татевсГсроксопержергсх препаратов я их э(№егс~ тгвность в лио-Тглактако ш*екгаонного лашяготрпхеита птип. .

С0БСТБ81ЕНШ. КССЛНДОВАНИЯ I. Материал» и методы

FeöoTa выполнена, в лаборатории инфекционного лэрлнготра-' хеита*отдела виэуспнх болезней пттт-ЗШВИП I98S-I990 гг. В работе бдаи использованы ваютяннне шташа вируса МТ птяи: ВНййШ, SA -2, эпизоотически«.штамм 24®, а так-

же'-вайпшшие втамш нконаслсчой болезни "Н" и "PgB". Для ре-изоляции и "оггоецеленяя биологической активности югоусов использовали С® оазвивашиеся'куриные зиЗрионн, полученнве с Прибалтийской зонально» научно-исследовательской ветереташой лаборатории. йт*екнаошадй титр вируса опрепеляля по питолатя-ческоад цействию титрэлкей на культурах клеток как в пробирках, так и мккромйто^оя в 96-луночных шгаадатах.

В работе использовались перевиваеше клеточные культуры BHK-2I,V£E0, 8GM, СПЭВ, V-79, полненные из Всесоюзной коллекции соматических клеток позвоночник АН СССР института Цито--догии г.Ленинграда. Культуры клеток готовили- и культивировали' общепринятым методом с использованием пятательннх сред 199, Игла, о-ва.Хенкса, 0,02.3 р-ра. вепсена, 0,25% р-иа трипсина, а -тэяа» сыворотки,крови северных оленей, сыворотки кпови плодов коровы.

; .Кдауногениуэ активность кучьтуральннх вариантов-вакцинных

штаммов'изучали иммунизацией 15-45-днзвнцх цкплят яичных и мясных пород по уровню' образования взруснейгрализугощих антител и результатам контрольного заражения. . - '

Интертероносодержащие препараты получали на основе перевиваемой культуры клеток. У-79 и кцвток селезенок 'переболевшей птиды инфекционным ларинготрахеитом. В качестве индукторов интерферона использовали вакцинные шта«щ вирусов и»'еюшонного ларинготрахеита птиц и ньгокасяскоЯ болезни. Титратт интерферона определяли шкрометодок) по подавлению ЦЩ вируса индикатора, в'культуре клеток фибробластов зОриона кур /ФЭК/. ' '

3№к.тивность интерфероносодержацих препаратов в профилактике инфекционного ларинготрахеита птиц определяли по результату •» контрольного .заражения эпизоотическим штаммом'вируса ,'ИЛТ.'• > ПТИЦ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССВЩОНАНИЙ

' '

2. Сравнительная оценка сыворотки крови плодов корова и, сыворотки крови северных оленей при культивировании перевиваема линий клеток .

Трудно прецставить биологическую лабораторию или биотехнологическое предприятие, где бн не использовались кудьтурц кяе-> •• ток; Их использование превратилось в технологический компонент, многих биологических исследования и проитеопственннх поодассда Приготовление биологических препаратов требует культивирование клеточных культур с наименьшими экономическими зя-тпатами. Нал-: более дорогостоящим компонентом ростовой прелн,'необходимом для

культивирования клеток, является сыворотка кровп гшвотянх. В натай стоаие широко используется сывсротка кропи плодоз корбвм /СХ1К/, стоитость'о 300-380 рублей за литр. Сыворотка яровп северных оленей /СКСО/ рекомендуемая Госагропромом СССР для биотехнических работ, в той числе и для работы с культурами клеток, имеет стоимость 160-180 рублей за лито. В нашем опыте изучалась возэд-чность использования сыворотки крови северных оленей .для' культивирования перевиваемых культур клеток: ВНК-21, В6М, VE.R0, СПЭВ, V-?9. Клетки указанных перевпваешх культур, внвэлш-нюс на питательной среде с добавлением СКПК, пассировали- в отношении 1:2, в один из двух новых йдаконов с кяеткаш- вносили ростовую среду с СКПК, в другой вносили.питательную среду с' сывороткой крови северных оленей. -Концентрация клэтоя в обоях счучеях составляла 400 тыс. клеток в ет. Кяеткя пассировали в течение се?я пассажей с одинаковыми условия»«. Опит показал, что из всех исследувшх линий только культура клеток ШВ сохранила способность к росту в питательной среде с добавлением сыворотки крови северных оленей. В то же время пассируемая: в . питательной среде с добавлением сыворотки крови северных' оленей культура перевиваемых клеток СПЭВ обрела достоинство необходимое в вирусологической практике. Репродукяия вакцинных шта'л-нов вируса* ньякаслской болезни на клетках, выращенных - с испаль- ■ зо.ваяиеп сеторотии крова северных• оленей, возросла в 10 и более раз. Максикзльнкй титр юташэ "Н" на 52-56 час составил на'ютеткак, шрадеянкх с СКПК 6,22 + 0,3 в ш» а на

клетках, внрапенных с СКСО 8,49 + 0,2 ^ ТЦ%о в Мак- -скшшшй тжгр штампа- "Е^З" отучался на 56-62 час после за-раченая п.составлял на метках, шрацепдагс с СКПК .5,76 + 0,4 ■

*n%0 в'мл, а на клетках, выращенных с GKOO 7,28 + 0,5 •ЗЗДдр.'в ми. Эти данные показывают достоверно значимое повышение чувствительности клеток С11ЭВ, выращенных с использованием сыворотки крови северных; оленей, к изученным штаммам вируса. Сыворотка крови северных оленей уд&цевляет получение перевиваемых культур клеток, но уступая по конташлаши сывороткекро-■ви-" плодов коровы.

3. Чувствительность клеточных'культур к вакцинным штаммам вир уса инфекционного , .

ларянготрахеита :

Для определения чувствительности клеточных культур к за-., ратанию /вакцинными' штаммами /ВНИИ БП, ¿i-iwXjtíhtewet; Sft -2/ . вируса МТ использовались первично-грипсиницированные культуры клеток: почки эмбриона рур /ЛЭК/, Либробластов эмбриона кур /40К/, а таюке перевиваемые линии клеток почечной, ткани млекопитающих: эмЗриона свиньи - СПЭВ, обезьяны - VERO . , хомяка -ВНК-#Г. Чувствительность клеточных культур покаяана^в таблице I.

Данные таблицы I показывают наибольшую чувствнтельн0сть..к. вирусному заражению пеоготно-тоинс'ланзкрованиоЧ г-леточно!' культуры почки эмЗриона кур /ШК/ и перевиваемой куль туры; клеток почки ■ обезьяны / t/ERO /. Также, данные таблицы. показывают зна- .. чительнуга культуральную активность штамма ¿t-itfoix'' по •'сравнений'.' с другими ваюпшннш шташами вируса ШТ птиц-.";'i;':V'

Таблица I

Сравнительная характеристика ирЛакционннх титров вакпинних штаммов штруса ШТ в клеточных куньтурах

Культуры- клеток Титл вакшшрх ита»я.ч>в виоуоа ИЯТ /в Ц 1ВД50 в га/

BíffiH-Efl ¿t-itfa-к eSwtexve'k SA -2 .

ПТКК-ПЭК 2,08+0,5 3,71+0,07 2,65+0,1 2,35+0,1

ПТКК-ФЭК - 2,51+0,С6 -

ПКК-VERO.. - 3.CS+0,3 1,38+0,2 - ■

ПКК-СНЭВ . - 1,83+0,1 - -

. ПКК-ВНК-21 . - ■ ■ - -

Замечание: ПТКК -"йервжчно-трипслнязированкчо культуры клеток;

ПКК - перевиваемые культуры клеток.

4. Иммунобиологическая характеристика ктльтуралышх вариантов вакцинных штаммов вируса инфекционного ларинготрахеита птиц

В.налшх исследованиях болкаой интерес представляет изучение радиобиологических свойств вируса ИЯТ культивируемого в перевиваешх клеточных культурах. Исходя из данных таблицы I, показывавших чувствительность клеток VERO к впитанному штамму ■ cCt-iiwc , перевгяазмые клетки VERO были взятн за основу ■ биологической модели изучения тлмунобяологическях свойств' вакцинного штазка <tt-<irax вируса Ж 'птиц. Оказалось, что при отчетливо ггроявлящемся ЩЩ в культуре перевиваевдх клеток VERO , .. реггоодупиропаким''* вирус утоачта.^ет свойства■ образования хавэк-

'териых'для вируса ИЯТ птиц узелковых поражений на хориоаллан-тоисной меиЗране развивающихся куриных эмбрионов. 'Дальнейшее пассирование вируса Ш1Т вакцинного штамма «Й-ши* показало снижение инфекционной активности и отчетливости проявления .ЦОД в:клеточных культур ас. Динамика, накопления вируса при пассировании■в клеточных культурах показана в таблице 2.

Таблица 2 .

• Зависимость инфекционного титра культурального варианта Еакпинного штамма ¿ОЫтох . вируса ИЯТ от количества проведенных.пассажей .

Культура >клеток ИнгТеюшонннй титр в Ь^ .'ВД50/МЛ

.пассаж .1 пассачс 2 пассаж 3 пассат; 4 пассаж 5

пткк пэк ПКК *ЕЮ 3,^0,07 3,08+0,05 2,69+0,05 1,65+0,1 •—— 2,42+0,1 1,94+0,5 1,55+0,3

Проявление цитопатичеекогодействия./1Щ/наблюдалось'в первом пассаже на 72-96 час после заражения, в последующих пассажах на 96-120 час. Характер иитоплазматических изменений в ••' той и другой культуре клеток был. однотипным. Уже через 56 часов после заражения /первый пассах/ ионослойтя культура клеточного пласта становилась менее однородной, отдельные метки . принимали более вытянутую (Торму, в результате чего к' 72 часу в монослое образовывались пустотк, .часть клеток приобретала статута вытянутую окорму. К. 96 часу проиЬхорло' образование.■ ци-топлазматических соединений, переходящих"'я клеточные конгломераты с^ отчетливо ггооярляошикися лучяш питомази; елче не раз-:

рушенных /меток. Процесс.дагонеранш клеточного монослоя заканчивался через 120 часов, большая часть клеток отторгалась от стекла, что было заметно макроскопически. Контрольная культура меток, не зараженная вирусом ШТ, представляла собой ровный монослой без видимых тштоплазматических изменений. Специфичность плтопатического действия подтверждалась в реакции нейтрализации с гипериммунной аитисивороткой. Реакции нейтрализации проводили на перевиваемой культуре клеток VERO . В первом пассаже штамма ' индекс нейтрализации равнялся 1,85 fig

ТЦЦ. Штамм ¿t-inwc показал наиболее выраженную культуральную активность из всех исследованных вакщшних штатов вируса ШТ, что'несомненно связано с методом его получения /чередующими пассатами в культуре клеток и в развивающихся куриных эмбрионах/.

Для'изучения иммунобиологических свойств кулътупвльных - вариантов вакцинного штамма <Ci-itífc* использовался вируссоцер-.кшций материал клеточного субстрата первнх пассажей, представляющий собой суспензию разрушенных клеток в поддерживающей питательной среде. Опыт сравнительного изучения ижуногенных ..свойств вакцинного штамма. <ít-i«ax , полуденного на основе различиях биологических'моделей, показал впсокуто ишуногенность штамма,-■ полученного на биологической модели разтва-ощегося куриного- эмбриона,' • состгтяяйуо ЬВ;?. щ>а контрольном заражении эпизоотическим штампом.■' ймщиогенность мташа, полученного в .птвично-трнпсикизтсоианно'-'' культуре меток 1ТЭК составила 64'?, . а полученного п' нет^аляеьюй культуре клеток VERO 38f. ifoo-рент и'«'уногркиосте: коорря^ро^л ..с ко.ч"чествог/ лтоусноттраи- .. зто'1!к < ■;1п'Г,1те.11 .к ачмпоат.р -reсум «»крржтюнге'июс ш-пиг-тт. Iftsty-

ногеняость культурального штамма коррелировала с концентрацией вгфуса в вируссодержащем материале клеточного субстрата. Прово-вдшя'ват стимуляция репродукция вируса в клеточных культурах протеолятяческим Ферментом трипсином./10-15-20ют на нл под-деряииате^й среди/ не имела. значимых результатов.

5. Сравнительная характеристика кшунобиологическгк

свойств культуральннх вариантов 'вакпящшх' татоп .

"И" и "Р2В" вируса икокрхлской болезни

.Известна высокая культура.льнал ахтяваость • паруса -ньчкася-ской болезни. Однако" в производственном ншшенешш средств специфическом лоаТюгактикн используются взрусвакшета, получаете 'на биологической модели -раэшвадошхся курвотх* эмйряоноз; Существует ряд исследований, указнватаох на рзгдаяекке етстунобио-логяческях свойств культуральных вариантов пакаипикх »iaiw в результате пассирования, но не да-опгах паяного представления об иммуногеяности кчяьтувальнкх ватщаятов. С пель'о изучения, иммунобиологических свойств культуральннх вйряадтов.в.тоуса НБ использовались две линии перевиваемых клеток: перевиваемая культура клеток VERO , отмечающаяся шсоко** чтастоптелБиость» к втоусаи различных групп, и перевиваемая культура -кле-ток СПЭВ, адзлтяров&кнаяк экономичной ростовой спеда. Обе .культури кле-. ток не имели хоятаданащй и бнли щигоднн для пооизвояства- био-.препаратов.' Перед проведением опыта вакш-таше surferai "Н" и пассировали на Ю-суточных CUS разшвгтакхся купганх э»лбтаоках /РКЭ/. Би.олйнеская активность вяруссодер-хашего материала хоря-г оаллЕНтоисноч .жидкости: РКЭ в третьем пассаяе составляла у

штамма "Н" - 9,76 + 0,3 ЭЛД50дм, У штамма "Р2В" - 8,03 + + 0,5 ЭЛД50дш гибель эмбрионов наблюдалась от штамма "II" на 48-54 час, а от штамма "Р^В" на 52-58 час после заражения.

При заражении клеточных культур вакцинными штаммами "Н" и "Р2В" отмечалась высокая стабильность ин^екпионньх титров на протяжении пяти пасса«ей. Ник максимального накопления вируса НБ в клетках СЛЭВ наблюдался-у штамма "Н" на 52-56 час, а у штамма "Р2В" на 56-62 час. Проявление цитопатического действия культуральных вариантов вируса НБ совпадало с временем максимального накопления вируса в юге точной культуре и характеризовалось полной деструкцией клеточного монослоя. В начальной стадии ЦОД отмечалось образование округлых Форм клеток, появление свободного пространства истцу клетками,.в дальнейшем происходило образовшше. клеточных конгломератов, синцития.

Проявление иитопатичестого действия в разных клеточных культурах от штамма "Н" или штамма "Р2В" ие имело значительных отличий по характеру*.

^■■'.'¿•■^'•./ПрИ' сравнении инйекшганного титра вакиинннх гаташов вируса ньзкасдско'- болезни в биологических моделях РКЭ и в культурах :клеток отмечались, более высокие титры при использовании РКЭ. Инфекционный, титр мруссоцержащего материала хориаллзятоисной чя!(костй превышал ин(?«кционнвй" титр вирус сод ержэдего материала клеточного субстрата. Инфекционный титр неточного субстрата пятого пассата" в. перепиваемой культуре клеток У££0 у штамма ."И"-, составил 6,07 + 0,56^ Т1Щс/чч, а-у штата "Р^В" 5,78 ± + 0,56. Ц /ТЦЦ-^/мч.

■ Зирус Ш1гоо1упиро!^ннн4 в развипададакся куриных >»*5рионах • не-С1ЙГЛЧЛ гетатг^т:«!»:!!^^:^г.ктигностп и т^Ч'чяие пяти пассатеГт,

гешггдотттрЛпая активность вкруссодерггэшего материала хорио-аллантоксноК» гапкоста штажа "Н" с эватроипташ петуха составила 1:8 - I : 32, а ктааа "PgB" I : 16 - I : 64,..Гекаггля-тчпивуогавя активность нвсо^се репротчшротжяиого в пзпевивавчо?. клеточной йужьггов OiOB с:1"':-а.тась и в пяток пассется ■ составляла для пгтй'Л'Лг "П" 0-1 : 4, а для штампа "Р.ДЗ". .1:2 - 1: 8.

Импуиогол'нгге свойства культуоальних. вариантов вакшгшых штатов опоеделяли на гаштах старте 30-суто'гкого возогста, яичной пород", по уровня со5»т>т®Ш1К вирурнеЯтралязутеях антн- • тел в опворотке кпови чеоез 20 щтип после шоведеншгйзкпина-Шй. Данные опчта показали, что - низкая гемаггл'отштрукяая тивность культуральш-tx взппекто-в вагавшшх штаммов не отразилась на hkmvhhom ответе вактанированно» птиш, рэяняча количества образующихся виоуснвйтролязувних антител ве'имйла зна-•чшяс расхождений, что подтверждает тсакуэ нтлчуногенкость лс-пытуешх штаммов. Исходя из данных лптератупннх источников о полно?' ксгореляцки количества вгруонеЯтрвляззпюкх антител с устойчивостью 'к контрольному зг'рэтенпю ш ггдасодим к выводу о целесообразности. получения культураньно?.. вкиуовакшни, из клеточных субстратов перевиваемой линии клеток СШВ в третьем,' четвертом и пятом ttaccaié вакшнких ят»адав "И" п "PgB". Спав-пятельаые характеристики. гатагаювнх различи^ "Н" и "Р^У" хгоед-ставлегш в таблице' 3.

• Хэрактёвгзуи .иммунобиологические свойства культуральнтс вариантов вэкдинннх'итадаов "Н" к "Р^В" вкоуса иь'окаащо'" болезни в перегашгтгх культтоах клеток СШЗ и VERO , необходимо отметить усто'/чивуя стабильность .лкД'евдчтонного титоа вяоуса

' Таблица 3

Сравнительная характеристика биологических свойств итам«а "Н" и штамма "Р^В" вируса кыокаслског. болезни

ВЗИШН— ннЧ штамм Биологическая модель Время максимального накопления вируса /час/ Инйектюннцп' титр вируса /\/ Гемаггло-тинирута-щий титр вируса /V

н РКЭ /ХАЖ/ 48 - 54 9,76+0,3 3 - 6

• н- ПКК /КС/, 52 - 56 8,49 + 0,3 1-3

Р2В РКЭ /ХАМ/ 52-58 8,03 + 0,5 4-7

р2в; ПКК /КС/ 56 - 62 7,28 + 0,5 2-5

Примечание: ХАЖ хориоаллантоисная жидкость; КО - клеточный субстрат. '.

в пятя пассажах. Несмотря на то, что интекшгонный титр вируса ньякасяокой болезни в биологической, модели развивающихся куриных эмЗрионов превнгаает инфекционный титр вируса в биологической модели перевиваемых клеточных культур, обе модели обеспечивают' высокие ившекционные титрн вактганннх штаммов,- Составлявшие в РЭК у штамма "Н" 9,76 + 0,3 ,ЭЛД^/мя, у ишиа' ''^2®" 8.03 +-0,5*6^' ЭДдоДта, в 'культуре перевиваем-« клеток СШб.-б-й пас'са^.у.ишада "Н" Б,49 +.0,3 ^ ТЦЦд0/га, У штам-^.•'"Р^В"..' 7,28 +.0,5' •ЙШ5£,М и в перевиваемых клетках УЕРО 5-й прссач у штамма "Н" 6,67 + 0,5 ^ 'Ш50/т, "Р2В" 5,78 + + 0,5 ^ ТЦДд(/ш.'- »йт гзучг.няп шлмузоЙро^огпчссигх свойств кугёг^ятач.ч 'вротт'шч- мтй^Г.ЮВ -"Н".-' И "РоВ" ОТмОЧП-

лось сшетеше- гэгиггладяш-фуящей .активности виоуса при пассировании в перевявае?,кх клеточных культурах, вплоть до получения вариантов не гетяагйгптапфуших яритрошты гаеколитаэдкх р .пищ, с сохранением ш^екшокноч акгивностя вируса. •

Ка основании т.шшых /8ШЫл, W¡e$nam, .' I97I; З.Н.Сирин с соявт., 1884/ об устойчивости гетлят к контрольному зара-•иегого с индексом нейтрализации сыворотки коови более 2 Ц , мы •приходим к выводу о возможности получения культуральной втзус-вагашнн из гатакма "Р^З" вируса ньюкаслскоч болезни, как на основе'• кучьтуры перевиваемых клеток СПЭВ, так и па основе культу-•рн ••пвревяваекюс меток VERO . Иннекс неЧтоаяизагаи сыворотки крови кшунизировананх тплят культуральнкми пари антами вак-пянкого итак»» "Р2В" первых пяти пасоа?.еч составил 3,88 - 4,13^.

6. Получение интвр?«роносодержаздп< 'препаратов .

п их эффективность в лройадактлке ИИ нтвц

Наиболее устойчивой культурой к'штопатийескоку действия вирусов МТ и НЕ из изучаемых наш.линий клеток оказалась куяь-тура перевиваемых клеток V-79. Цредсташм'скыш собой доревизае-•wyo лкпи*> клеток »3 тканей легкого -золотистого хомячка. Обнаруженная устойчивость к .вирусному зацаэтенич в два и более раз ■превышала устойчивость перевиваемых культур .клеток БНК-21, СШВ, VERO . Поставленный опыт по изучению концентрации 'катер-: февона в'культурах перевиваемых клеток, без -внесениявтаусннх -индукторов,'.-тек и при внесении вирусных нядуктооов вактткиык .• штаммов Ш и ЕВ показан ..в табяите 4. ■ - -

Таблица 4

Титр интерферона в культурах перевиваемых клеток

Культура перевиваемых клеток Титр интерферона

без внесения випусного индуктора индуктор li'-TDVC МТ в лозе 0,005 ЭВДзд/клетку индуктор вирус 1ПЗ в лозе 0,05 ТЩ50/клетку

V-79 - 1:64 - 1:256 • 1:34 - 1:512 1:128,- 1:1024

СПЭВ 0 - 1:4 1:2 - 1:16 1:4 -1:32

VERO 0 - 1:2 0 - 1:8 1:2 - 1:8

V; ■; По-данным таблицы 4 титрн интерферона в перевиваемой культуре, клеток •. V-79 значительно превнмамт тятш интерферона из клеток пепевиваёшх кульТур эпителия-почечной ткани. ; ' В опытах изучения' э<Г«£ектизп6сти штерйероносотержащх препаратов цл я профилактики йнтегагнонного ларинготоахеита птиц сравнивались препараты: . Wli IFWeC /KG-V-79 - клеточный субстрат перевиваемой линии клеток V -79/, fa- JFN<<, ДСС - клеточный, субстрат селезенок пепеболевией пгЕхш ШТ/, Hu-IFV* /препарат. -промышленного производства/. Препараты KC-V-79 содептагаие W« IFAf<c активностью 6-8 Е^. g ЕД я мл, уступали по э№'ективности профилактического действия препапататл HuIFWeC с ■активностью 10-11 i^g ВД в г.;л и поепвпатам Л lFA/e(, с активности) 9-10 в Эффективность янтерФероносоцержалдах тгойпэтжтов полученных на: основе' перевиваемой линии клеток V-79 йе превышала 5О'х за''ить'-.п.ого'гогвя птины при канттюльком" заражении,За.'Ц'гтни/) эФг-ект ?3i -показал .препарат получен-нч'Ч.-'из..клетск..сп-лезе'чоч freoRdoieB.'iieit Ш1Т пттда, Эффективность профилактического"1 де./ст?г1)> '-лротфята ХСС Av IFN ; прибликалясь к

эффективности препаратов -спешйической пооТтаэктикн - вгоусва иип, однако, профилактическое действие • препарата 'не превышало десяти' суток, что указывало на. образование пассивного иммунитета. В то т.е тоеш ври аэрозольной ищеттзащт вчпусвакпиной в птицеводческих хозяйствах наблюдается поствакплкаяышй отхо птипн, связанный с переболевшие?-.! птидн. Аэрозольное поимене-ние пвепарата KCG Av lFAi«c через 24-48 часов после аэрозольной вакцинации, вирусвакщтной из гатамг#а БЯИИ6П- уменьшало поствак пинальннй отход в опытах, усиливая иммунный ответ птипн. Виру вакцину применяли в дозе из расчета .3 ЭИДвд на оцну птипу, а препават КСС из расчета 0,3 гража-активного вещества на кубя ческий метр объема помещения при 20 минутной экспозиции.

-ВЫВОДЫ

1. Из четырех изученных вакцинных итнжов вируса ик^екпи онного ларинготрахеита птиц наибольшая' культуральная .активное отшчена у штампа ft-i<ra.x, однако при дальнейнем пассировани вируса в клеточных культурах шташ не сохраняет характерных иммунобиологических свойств вируса инфекционного ларянготрахе ита птиц.

2. Куяьтураяьиые варианта вакцинных штатов "Н" я "PgB" вируса ньпкаслской болезни характеризуются висогопэд и стабиль ними 'ийЪекплонныш титоа'.и в перевиваемых культурах клеток' VE и СПЭВ с сохоаненяеч иммуногенннх.свойств в первых пяти пасса жах.

3. .Добавление Ю;.Й сыворотки крови северных оденек'в пита тельную спеду гая -вырадиваиия перевиваемых клеток'.СГОВ стиг-.ту-

.пирует последуоиуо за заражением репродукцию вируса ньякасл-ской болезни в этн:с клетках. .

4. Вкруссод9р~а!!.;иа материал клеточного субстрата переви-ваешх линиЯ меток первых пяти пзссатсей штаммов "Н" и "Р^В" кадет бить использован для производства препаратов -специЗя-деско:! профилактики ньтеасдсчой болезни. Следует отметить; что сакплянкй гаташ "Р^З" менее вирулентен, • чем штамм "Н".

б. Культуиальнне варианты• вэкиянних шташов "Н" и "Р.^" вируса ньюкаслскоЯ болезни - активные индукторы интерферона в суспензии клеток селезенки и в культуре перериваемнх клоМк' V -79.

• . 6. ИнтерД'ероносодер-ха'тай препарат клеточного субстрата' селезенок переболе же и Ю1Т птицы может использоваться для профилактики ДОТ птиц, а тагске для снижения поствакшнального отхода птигт при аэрозольной вакцинации против' инАекилопного Ла-ринготрэхеита.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЯ0ЖЕ1Ш '

На основании доведенных исследования предлагается: .1. Использование сыворотки крови северных оленей .для куль-'тярировапая перевиваемых клеток'СГОВ с целью увеличения последующей за заражением репродукции .вирусов.

2... Способ получения культурашюй вчрусвакцяны' от ньтокаал-ско? болезни яз пташа "Р^В".

3- Использование лерешвеекой культуры. клеток \7-79 и суспензяк клеток селезенки для получения иктроД'ероносоцеряаптх поепасатов.

4. Способ ягхуТ^лактпкя гоиТвкгаонного ларпкготрсчепта пре-пйсртст" клеточного субстрата селезенок птяпн лопчботйгкй:! ШТ.

5; Использование препарата клеточного субстрата селезенок . для-снижения-поствакщшального отхода птиц при аэрозольной аак-. тщйащии .'Против инфекционного ларинготрахеита. "■ : '

ОПУБЛИКОВАННЫЕ РАБОТЫ ПО ТЕ1ЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сковородкин В. А., .Котляр П.Ю. К вопросу о культивировав нии вируса ин^екпиокпого ларинготрахеита птиц в культуре'клеток1 // Тезисы докладов В1МВИП к научно-производственной кон<Т'(5рек®ш "Комплексная система ветеринарных мероприятий в птицеводстве*-1 резерв повышения эффективности производства" - Л., 1989. --C.5Q.

2. Котляр П.Ю., Сковородкин В.А. Влияние метода заражения* -. развивающихся куриных -эмбрионов на показатели биологической'aft-' тивности вирусвакцшш против инфекционного ларинготрахеита птиц // Тезисы Докладов ВНИВИПк научно-производственной конференций "Комплексная система ветеринарных мероприятий в птицеводстве -резерв повышения эффективности производства" - Л., 1989. - 0.5253: ■

3. Сковородкин В.А., Котляр П.Ю., Комиссаров К.П. Культиви-" рование перевиваемых линий клеток с использованием сывороткй 'крови северных оленей // Тезисы докладов ВНИВИП к научно-производственной конференции "Комплексная система ветеринарных меропри-.....

ятий'в птицеводстве - резерв повышения эффективности производства" -Л., 1989. - С.55-56. . ..

4. .Сковородкин В.А., Джавадов Э.Д., Виноходов В.О. Интер-1 Фероногенная. активности линии перевиваемых клеток V-79 // Тезисы докладов Республиканского- семинара■ "Использование' интер-.. (Теронре в ветеринарии" - Киев, 1989. - С.25-26.

.5. Котляр .II.Ю., Сковородкин В.А. Получение антисывороткп к вирусу инфекционного. ларинготрахеита птиц // Тезисы докладов Всесоюзной конференция молодых -ученых' и. аспирантов по птицеводству. ;- Загорск, 1989. - С.93-94.