Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка метода культивирования патогенных микобактерий на перевиваемой культуре клеток

Па правах рукописи

АЛЕКСЕЕВ АЛЕКСАНДР ЮРЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕТОДА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПАТОГЕННЫХ МИКОБАКТЕРИЙ НА ПЕРЕВИВАЕМОЙ КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология.

эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2004

Работа, выполнена в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор». Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН

Научные руководители; кандидат биологических наук

ШЕСТОПАЛОВ Александр Михайлович, кандидат биолргических наук РЕПИН Владимир Евгеньевич

Официальные оппоненты:доктор биологических наук

АЛИКИН Юрий Серафимович, доктор ветеринарных наук, профессор ЛУНИЦЫН Василий Герасимович

Ведущая организация: Государственное научное учреждение

Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных СО РАСХН (г. Омск)

Защита состоится « /с » ' 2004 г. в /ч. на

заседании диссертационного совета Д.006.045.01 в ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН по адресу: 630501, Новосибирская обл.. Новосибирский р-н, п. Краснообск, СО РАСХН, ГНУ ИЭВСиДВ

"С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО РАСХН

I

Автореферат разослан «_Л>>

Ученый секретарь диссертационного совета

2004 г.

Логинов С.И.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Туберкулез - заболевание человека и животных, представляющее одну из первостепенных проблем здравоохранения и приводящее к большим потерям среди поголовья сельскохозяйственных животных [Донченко A.C., 1998]. По данным ВОЗ, от туберкулеза ежегодно умирает около 3 млн. людей (каждые 10 секунд от туберкулеза умирает 1 человек) [Global tuberculosis control // World Health Organization report, 2003]. Среди инфекционных заболеваний животных удельный вес туберкулеза составляет более 30% [Шаров А.Н., 1989].

В России основным этиологическим фактором туберкулеза являются микобактерии, относящиеся к Mycobacterium tuberculosis complex. Помимо микобактерий данной группы иногда заболевание туберкулезом у животных и людей вызывается видом Mycobacterium avium [Романенко В.Ф. и др., 2002].

Основы бактериологической диагностики туберкулеза разработаны еще в 30-50 годы XX века и с тех пор они не претерпели существенных изменений. В настоящее время для культивирования микобактерий используют плотные и жидкие питательные среды, имеющие свои достоинства и недостатки.

Нужно отметить, что современные методы долгого поддержания коллекционных штаммов в живом, биологически неизмененном культивируемом состоянии являются неэффективными, так как накоплено достаточно данных об изменениях их свойств в процессе длительного культивирования (даже через 2-3 пассажа) на общепринятых питательных средах [Caldwell D.E. et al., 1997; Ramirez E., Villaverde A., 1997; Олескин A.B. и др., 2000; /Ъловлев ЕЛ., 2001].

Общепризнанно, что длительное культивирование патогенных микобактерий на стандартных питательных средах приводит к снижению вирулентности [Кузяев В.А 1972; Благодарный Я.А., Блехман И.М., 1976; Голышевская В.И., 1995; Пушкарева В.И., Боев Б.В., 1997; Романенко В.Ф. и др., 2002; Вишневский Б.И. и др., 2002]. Несмотря на то, что для длительного культивирования рекомендовано большое количество питательных сред и способов культивирования, ни один из них не позволяет сохранять биологические свойства Mycobacterium tuberculosis complex неизменными [Донченко A.C., Донченко В.Н., 1994; Романенко

В.Ф. и др., 2002; Вишневский Б.И. и др., 20' 2$ос.национальна» ¡

БИБЛИОТЕКА | IHttTCJ

В связи с вышеизложенным, разработка метода, позволяющего сохранять биологические свойства Mycobacterium tuberculosis complex неизмененными в процессе длительного культивирования, является актуальной проблемой биологической науки.

Цель и задачи исследований. Целью работы явилась разработка метода длительного культивирования патогенных микобактерий на основе перевиваемой культуры клеток и изучение сохранения биологических свойств микобактерий при его применении.

Для достижения основной цели решались следующие задачи:

1. Изучить возможность использования метода культивирования на основе перевиваемой культуры клеток для длительного культивирования Mycobacterium tuberculosis.

2. Изучить морфологические и культуральные характеристики Mycobacterium tuberculosis complex при замене ростовых сред и линий перевиваемых культур клеток.

3. Изучить сохранность вирулентных свойств и лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis при длительном культивировании на перевиваемой культуре клеток

4. Изучить чувствительность метода культивирования на культуре клеток к внесенной дозе инфицирующего агента - микобактерии туберкулеза.

5. Определить локализацию Mycobacterium tuberculosis во время роста на перевиваемой культуре клеток.

Научная новизна работы. Впервые для приближения условий культивирования Mycobacterium tuberculosis complex к естественным условиям в качестве компонента в рреде использована перевиваемая культура клеток.

Впервые достигнуто сохранение биологических свойств (морфологических, культуральных, вирулентных) Mycobacterium tuberculosis complex в процессе длительного культивирования при совместном культивировании микобактерий и перевиваемых культур клеток.

Впервые показано, что микобактерии туберкулеза не проникают в клетку во время роста на перевиваемой культуре клеток Vera.

*j -у«* >/'-4«i { 1 U» vr 4Й< '

Теоретическая if практическая значимое! i. работы.

Результаты .поведенных исследований являкпея

•зкспериментальи'меопегической базой для решения проблемы сохранения биологических свойств выделенных и хранящихся штаммов патогенных микобактерий в изменяющихся условиях существования.

Разработан метод длительного культивирования микобактерий туберкулеза на перевиваемой культуре клеток, позволяющий сохранять биологические свойства микобактерий неизмененными в процессе культивирования. На метод культивирования получен патент РФ "Метод культивирования микроорганизмов Mycohaclerium luhercuiosis" № 2209829, от 10.08.2003г.

Проведенные исследования позволяют использовать разработанный метод для сохранения биологических свойств пато1енпых микобактерий разных видов (Mycohaclerium luhercu/osis. Mycohaclerium hovis, Mycohaclerium avium) неизмененными в процессе длительного культивирования.

Разработаны методические рекомендации "Метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток". Рекомендации у!всрждены Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол №7 от 30 сешнбря 2003 г.), и подсекцией "Инфекционная патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" ветеринарной медицины Росссльхозакадемии (протокол № 19 от 30 сентября 2003 i.)

Апробация работы. Полученные роулыягы были представлены в виде стендовых сообщений на:

- Congress оГ 1-ССО XIX (European Culture Collections' Organi/ation), The Biological Ressource Centcrs and Genetics, May 1112, 2000;

- 5-м Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов в области бтнехнологин "Биотехнология - 2001", Россия, Пущино, 25-27 сентября. 2001 i

- Всероссийской научной конференции "Клинические перспективы в инфектологии", посвященной 125-летию со дня рождения профессора П.К. Розенберга и 105-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии, Россия, Сапкт-Петербур!. 17-18 октября, 2001 г.;

- International Conference "Molecular Mechanisms of Genetical Processes and Biotechnology", Russia-Byelorussia, Moscow-Minsk, 1824 november, 2001;

- Второй научной конференции с международным участием "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Россия, Новосибирск, 29-31 мая 2002 г.;

- International Symposium "Integrative medicine" in International Congress "Progressive Scientific Technologies for Human Health", Ukraine, Kara-Dag, Feodosia (Crimea), june 8-19, 2003;

- II Международной научно-практической конференции "Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья сельскохозяйственных животных", Россия, Ставрополь, 22-24 октября, 2003 г.;

Результаты были доложены на:

- IX International Conference "New Information Technology in Medicine and Ecology", Ukraine, Gursuf (Crimea), june 1-10, 2001;

- Конференции молодых ученых CO РАМН по проблемам фундаментальной и прикладной медицины, Россия, Новосибирск, 14-15 июня, 2001 г.;

- VIII Съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 26-28 марта 2002 г.;

- Satellite Symposium "New Technologies in Medicine and Biology of the 3-rd Millennium" in I International Symposium "Stress and Extreme Conditions", Ukraine, Kara-Dag, Feodosia (Crimea), june 5-14, 2002;

- Межрегиональной научной конференции, посвященной 100-л^етию со дня рождения академика АМН (ГССР С.П. Карпова, Томск, Россия, 7-10 октября 2003 г.

Публикация результатов диссертации. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка используемой литературы и приложения. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 30 рисунками.

Список использованной литературы включает 173 источника, в том числе 6! иностранных.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Разработан новый метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток, позволяющий сохранять морфологические, культуральные, вирулентные характеристики и лекарственную устойчивость микобактерий Неизмененными в процессе длительного культивирования.

\ - Метод культивирования на перевиваемой культуре клеток

чувствительнее культивирования на жидких питательных средах в 10- 100 раз.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Работа выполнялась с 1999 по 2003 год в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ГНЦ ВБ «Вектор») и в Государственном научном учреждении Институте экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока (ГНУ ИЭВСиДВ).

В работе исспользовались выделенные автором и задепонированные в Институте коллекции культур микроорганизмов ГНЦ ВБ «Вектор» штаммы возбудителя туберкулеза Mycobacterium tuberculosis В-891, М. tuberculosis В-"892, М. bovis В-909, М. avium В-910. Перевиваемая линия культуры клеток Vero была получена из. Института клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор». Перевиваемая линия культуры клеток П!ч-91 [патент РФ 2121501] была любезно предоставлена владельцем Дурымановым А.Г.

Все питательные среды и лекарственные препараты, использованные в работе были коммерческого производства.

Мазки культур с жидких и плотных питательных сред фиксировали и окрашивали по методу Циля-Нильсена.

Для изучения сохранения вирулентности микобактерий проводили подкожное заражение здоровых морских свинок весом 250-300 г. в дозе 1 мл бактериальной взвеси 5 ЕД бак.стандарта мутности.

Для оценки распространения и характера туберкулезных поражений у морских свинок была использована модифицированная схема Ю.К. Вейсфейлсра [1975].

Для определения высеваемости микобактерий отбирались образцы из внутренних органов морских свинок, обрабатывались по ГОСТ 26072-89 и проводился высев на среду Левенштейна-Иенсена. На 30 сутки подсчитывались визуально видимые характерные колонии микобактерий туберкулеза.

Образцы для электронной микроскопии были залиты фиксатором (10% формалин) и переданы заведующему лабораторией патофизиологии и микроскопии Института молекулярной биологии ГНЦ ВБ «Вектор» Рябчиковой Е.И.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Изучение сохранения морфологических и культуральных свойств Mycobacterium tuberculosis при длительном культивировании на перевиваемой культуре клеток

В предварительных исследованиях были отработаны условия поддержания перевиваемой кльтуры клеток Vero в виде монослоя в течение 40-50 суток без смены ростовой среды. Авторским коллективом [Дурыманов А.Г., Рассадкин Ю.Н., Алексеев А.Ю., Шестопалов A.M., Репин В.Е.] было предложено использовать совместное культивирование микобактерий туберкулеза и перевиваемой культуры клеток в виде долгоживущего монослоя. Предполагалось, что использование данною подхода позволит сохранять биологические свойства микобаюерий неизменными при длительном культивировании.

Для проверки данной гипотезы было проведено культивирование М. tuberculosis с использованием ростовой среды BSK-I1 и культуры клеток Vero в течении 5 пассажей. Сравнивались 2 штамма микобактерий туберкулеза (таблица 1). Несмотря на некоторые различия в характере роста штаммов, можно отметить, что при росте микобактерий туберкуле ja в этой системе культивирования наблюдаются только ншчатыс формы. Наблюдаемые конгломераты клеток скреплены этими нитчатыми формами и выглядят как друзы грибов.

Характерной особенностью культивирования М tuberculosis предлагаемым методом является сохранение скорости рои я клеи л При выращивании микобактерий традиционным!' меюдами

(культивирование на плотных и жидких питательных средах), наблюдается процесс их адаптации к питательной среде, что выражается в изменении морфологии клеток, увеличении скорости роста, либо остановкой роста. Одновременно происходит изменение биологических свойств штамма. В предлагаемой системе культивирования, при внесении одинаковых инфицирующих доз, максимальное накопление биомассы мы получали на 28 сутки в каждом из 5 последовательных пассажей.

Таблица I. Динамика роста Mycobaderium tuberculosis с ; использованием среды BSK-I! и культуры клеток Vero

Сутки Штамм №В-891 Штамм №В-892

7 На части клеток в монослое темные шероховатые пятна, идентифицирующиеся как нитчатые образования, связанные плотно с поверхностью этих клеток. 10-20 темных зон, размерами 30-50 клеток.

14 Темные образования увеличились и стали выступать над поверхностью монослоя клеток, оставаясь прикрепленными к монослою.

21 Смешанная картина: - темные образования шаровидной формы находятся в питательной среде во взвешенном состоянии; - формы, связанные с монослоем клеток; - отдельные темные образования. Смешанная картина: - темные образования шаровидной, вытянутой, эллипсовидной и неправильной формы находятся в питательной среде во взвешенном состоянии; - формы, связанные с монослоем клеток; - отдельные темные образования.

28 40% монослоя клеток разрушено. Большое количество темных шаровидных образований размером 200-400 мкм взвешенно в среде. Края образований выглядят неровно. 100% разрушение монослоя клеток. Большое количество темных образований разных форм и размерами 100 - 800 мкм взвешенно в среде. Края образований выглядят неровно.

Картина развития процесса по контрольным точкам (7, 14, 21 и 28 сутки культивирования) совпадала в каждом пассаже с точностью до ! суток. Клетки микобактерий туберкулеза сохраняли свои морфологические и культуральные характеристики в течение всех пассажей.

Таким образом, представленный метод позволяет сохранять морфологические и культуральные характеристики штамма неизмененными при длительном культивировании.

2.2.2. Изучение морфологических и культуральных свойств микобактерий туберкулезного комплекса при культивировании на перевиваемой культуре клеток

Для определения роли ростовой среды и культуры клеток в разработанном методе культивирования М. tuberculosis была изучена возможность замены ростовой питательной среды и перевиваемой культуры клеток. Использовали ростовые питательные среды: среда Игла МЕМ-МД и среда BSK-II; а также перевиваемые культуры клеток Vero и ПК-91.

Оценивая результаты проведенного эксперимента можно сделать заключение, что в случае замены перевиваемой культуры клеток линии Vera на перевиваемую культуру клеток линии ПК-91 при использовании одинаковой ростовой среды (либо BSK-II, либо Игла МЕМ-МД) существенных различий в характере роста М. tuberculosis штамм В-891 не наблюдали (таблица 2). Кроме того, показано, что при замене ростовой среды BSK-II на ростовую среду Игла МЕМ-МД меняются только сроки роста М. tuberculosis, но морфология роста микобактерий остается неизменной.

Была оценена возможность использования метода для культивирования других патогенных микобактерий, вызывающих туберкулез. В работе использовались коллекционные штаммы трех видов микобактерий: Mycobacterium tuberculosis штамм В-89!, Mycobacterium bovis штамм В-909, Mycobacterium avium штамм В-910.

Наблюдаемая динамика роста различных микобактериальных штаммов при культивировании на перевиваемой культуре клеток была сходной с динамикой М. tuberculosis штамм В-891, наблюдаемой на среде Игла МЕМ-МД с культурой клеток Vero, представленной в табл. 2.

Таблица 2. Динамика роста Mycobacterium tuberculosis штамм В-891 с использованием среды BSK-II или Игла МЕМ-МД и культур клеток Vero и ПК-91

сутки Культура клеток Vero | культура клеток ПК-91

7 (3) На части клеток в монослое обнаруживаются темные шероховатые пятна, идентифицирующиеся как нитчатые образования, связанные плотно с поверхностью этих клеток. 10-30 темных зон, размерами 30-50 клеток.

14 (5) Темные образования увеличились, приобрели шаровидную форму и стали выступать над поверхностью монослоя клеток, оставаясь прикрепленными к монослою.

21 (7) Смешанная картина: - темные образования шаровидной и неправильной формы находятся в питательной среде во взвешенном состоянии; - мелкие и другие более крупные формы, связанные с монослоем клеток; - отдельные темные образования.

28 (10) 40-100% разрушение монослоя клеток. Большое количество темных образований разных форм взвешенно в среде. Края образований выглядят неровно. Размеры образований 200-400 мкм (около 100 мкм).

() - динамика роста с использованием среды Игла МЕМ-МД

При использовании предлагаемого метода- культивирования наблюдается несколько фаз в процессе роста микобактерий туберкулезного комплекса, которые являются общими и не зависят от используемой ростовой среды и перевиваемой культуры клеток (рисунок I).

Рисунок 1. Схема изменения фаз в процессе роста микоба-ктерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток

1. Обязательно присутствует фаза прикрепления микобактерий туберкулеза к клеткам монослоя.

2. Второй фазой является фаза роста микобактерий на клеточном субстрате с видимым увеличением биомассы.

3. Третья фаза - смешанная, когда присутствуют элементы, растущие на субстрате и во взвешенном состоянии.

4. Четвертая фаза -частичное или полное разрушение монослоя и продолжение роста во взвешенном состоянии.

При использовании разных ростовых сред, разных линий перевиваемых культур клеток и разных видов микобактерий туберкулезного комплекса

наблюдается только изменение сроков роста и размеров конгломератов, но количество и порядок перечисленных фаз остается неизменным.

2.2.3. Изучение сохранения вирулентности и лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза при длительном культивировании на перевиваемой культуре клеток

Было изучено сохранение вирулентности патогенных микобактерий (на примере М. luberculosis штамм В-891) в процессе длительного (13 пассажей) культивирования на среде с культурой клеток Vem. Для сравнения проводилось культивирование того же штамма микобактерий туберкулеза на рекомендуемой ВОЗ питательной среде Левенштейна-Йенсена.

Изменение вирулентности оценивали но изменению степени пораженности внутренних органов морских свинок, зараженных выращенными на выбранных питательных средах микобактериями с каждого пассажа.

Таблица 3. Оценка патологических изменений внутренних органов морских свинок, зараженных микобактериями туберкулеза, выращенными на разных средах, среднее по группе (поЮ.К. Вейсфейлеру, /975)

Органы Среда Левенштейна-Йенсена

пассажи

1 2 3 4 5

Легкие 4 1 1 0 0

Печень 4 2 1 1 0

Селезенка 4 3 3 4 0

Паховые л/у 4 3 3 1 0

Органы Среда 1гла МЕМ-МДс культурой клеток Vero

пассажи

1 2 3 5 7 13

Легкие 2 4 3 3 3 3

Печень 4 3 4 4 4 3

Селезенка 4 4 4 4 4 4

Паховые л/у 3 3 3 2 3 3

4, 3, 2, I -наличие видимых, макроскопических, характерных при туберкулезе патологических изменений органа на + + + +, + + +, + +, + (соответственно); О - отсутствие характерных при туберкулезе патологйческих изменений органа.

При оценке наличия патологических изменений внутренних органов морских свинок, зараженных микобактериями, выращенными на среде Левенштейна-Йенсена (таблица 3), наблюдалась постепенная элиминация патологических изменений, до полного их исчезновения - 5 пассаж.

Напротив, при оценке внутренних органов морских свинок, зараженных микобактериями, выращенными на среде с культурой

клеток Vero наблюдалось сохранение патологических изменений до 13 пассажа (срок наблюдения).

Кроме этого оценивалась бактериальная обсемененность внутренних органов опытных морских свинок.

Полученные результаты (таблица 4) показали постепенное снижение количества колоний микобактерий из органов морских свинок, зараженных М. tuberculosis штамм В-891, выращенный на среде Левенштейна-Йенсена.

Обсемененность внутренних органов морских свинок, зараженных М. tuberculosis штамм В-891, выращенном на среде Игла МЕМ-МД-Fm; более высока и не снижается от пересева к пересеву. Наблюдалась стабильно высокая высеваемость микобактерий (50 и выше колоний), более чем в 90% случаях.

Таблица 4. Высеваемость микобактерий из органов морских свинок, зараженных Mycobacterium tuberculosis штамм В-891, выращенным на разных средах, количество колоний, среднее

Органы Среда Левенштейна-Иенсена

пассажи

1 2 3 4 5

Легкие 50-100 20-25 2-3 0 0

Печень >100 18-27 11-26 12-30 0

Селезенка >100 50-100 50-100 >100 0

Паховые л/у >100 50-100 50-100 6-22 0

Органы Среда 1гла МЕМ-МД с культурой клеток Vero

пассажи

1 2 3 5 7 13

Легкие 37-64 >100 50-100 32-94 50-100 50-100

Печень >100 50-100 >100 >100 >100 50-100

Селезенка >100 >100 >100 >100 >100 >100

Паховые л/у 50-100 50-100 50-100 23-48 50-100 50-100

Таким образом, при культивировании микобактерий туберкулезного комплекса с помощью стандартного метода - на среде Левенштейна-Йенсена, вирулентность микобактерий уменьшалась. При заражении лабораторных животных микобактериями выращенными на перевиваемой культуре клеток

наблюдалась полная обсемененность исследуемых органов в отличие от выращенных на среде Левенштейна-Иенсена.

Так как изменения лекарственной чувствительности микобактериальных штаммов имеют важное значение, была изучена степень изменения лекарственной чувствительности выбранного штамма после длительного культивирования на перевиваемой культуре клеток -18 пассажей; Штамм изначально на втором пассаже после выделения из биоматериала был устойчивый к рифампицину и стрептомицину и чувствительный к канамицину, изониазиду, пиразинамиду, этамбутолу в рекомендованных концентрациях.

Биомасса микобактерий 18 пассажа на среде с культурой клеток была собрана, освобождена от старой среды промыванием физиологическим раствором, разведена и мерно высеяна на среды Игла МЕМ-МД с культурой клеток Vero с противотуберкулезными препаратами. Для контроля и оценки роста также был проведен в той же дозе посев на среды Сотона и Школьниковой.

Оценка характера роста М. tuberculosis в течение 10 дней показала на средах с изониазидом, пиразинамидом, этамбутолом и канамицином только прикрепление внесенных микобактерий. Динамики в росте не обнаруживалось. На средах с рифампицином и стрептомицином наблюдался рост и накопление биомассы.

Таким образом, лекарственная устойчивость штамма при длительном культивировании его на среде Игла МЕМ-МД-Fm; не изменилась.

2.2.4. Изучение характеристик роста микобактерий туберкулеза на различных питательных средах

Было проведено сравнение различных способов Культивирования М. tuberculosis В-891 и выяснение зависимости сроков роста от количества внесенной инфицирующей дозы. На среды проводился посев исходным раствором культуры микобактерий в физиологическом растворе и стократными разведениями исходного раствора: 10'2,10"4,10 .

При оценке динамики роста (таблица 5), можно увидеть, что на твердой среде Финн-2, начало роста при исходной дозе посева наблюдали на 21 сутки культивирования. В дальнейшем было получено 2-3 выросших колонии.

На среде Игла МЕМ-МД-Few было отмечено начало роста при исходной, 10 \ I0"4 дозах посева на 7 сутки культивирования. Далее происходило бурное накопление биомассы до 21 дня культивирования и в дальнейшем замедление роста микобактерий туберкулеза.

Таблица 5. Динамика роста микобактерий туберкулеза на изученных средах

Сут -ки Разведения Фиин-2 Сотона Школьн ико-вой Игла МЕМ-МД с Ус'го Игла МЕМ- мд Игла МЕМ-МДс лизатом Уего

7 Исходное 10'2 10"* 10" - - - + + + - -

14 Исходное m2 ю-4 10"" - + + + -н-++ ++ + + + + + + +

21 Исходное m-2 Ю"4 10* + ++ + ++ + +++ ++ ++ + + + + + + +

29 Исходное 10'3 Ю"4 Ю-" + ++ + ++ + +++ ++ ++ + + + + + + +

- - отсутствие роста; + - начало роста; ++ - средний рост;

+++ - быстрое накопление биомассы.

Важно отметить, что при Ю"6 дозе посева видимый рост М. 1иЬегси1о.\м штамм В-891 был обнаружен только на среде Игла МПМ-МД-Ит; (на 14 день культивирования). Это говорит о том, что в разведении I О"6 присутствовали единичные клетки

микобактерий, для заметного роста которых необходимо было длительное время и благоприятные условия.

Таким образом, экспериментальная среда с монослоем перевиваемой культуры клеток являлась более чувствительной среди изученных сред к внесенной дозе инфицирующего агента -микобактерии туберкулеза. Большее количество клеток или мелких конгломератов клеток микобактерий туберкулеза проявляло свой рост в данной системе культивирования. Быстрее всего наблюдался рост микобактерий туберкулеза на среде с культурой клеток Vero.

Для определения количества КОЕ с 2-х сред (Сотона и Игла МЕМ-МД с культурой клеток Vero) был проведен высев суспензии растущих микобактерий одного возраста и одинаковым объемом на плотную питательную среду Левенштейна-Иенсена.

Из полученных результатов (таблица 6) видно, что в среде Сотона отмечено присутствие чрезвычайно низкого количества КОЕ, в сравнении со средой Игла МЕМ-МД-Нт;. Разница исчисляется 1-2 порядками, т.е. в 10-100 раз. Также необходимо отметить, что в изученных жидких средах кроме небольшого количества конгломератов средних размеров, которые более быстро проявились в виде видимых колоний на плотной среде, присутствовало значительное количество более мелких скоплений микобактерий, которые проявились в виде видимых колоний на плотной среде через длительных промежуток времени (до 4 недель).

Таблица 6. Количество видимых колоний Mycohacterium tuberculosis штамм В-891 на плотной среде Левенштейна-Иенсена, __среднее _

посев со среды 14 суток культивирования 28 суток культивирования

Сотона 0,2+0,13 8,7+1,16

Игла МЕМ-МД с культурой клеток Vero 16,6+4,32 136+11,2

Р<0,001

2.2.5. Изучение локализации Mycohacterium tuberculosis штамм В-891 во время роста на культуре клеток Vero

Была изучена пространственная локализация Mycohacterium tuberculosis при культивировании его совместно с живой системой

- перевиваемой культурой клеток Vera. Для этого, монослой клеток, освобожденный от микобактерий, не прикрепившихся или не проникших в клетки Vera, был собран и передан для электронной микроскопии. Дополнительно, для электронной микроскопии была подготовлена суспензия растущих Mycobacterium tuberculosis штамм В-891 на среде Игла МЕМ-МД-Fm; на 10 сутки культивирования. Монослой был уже разрушен, и все конгломераты находились в толще среды.

Рис. 2. Среда Игла МЕМ-МД-Ктл 3 сутки культивирования.

1- клетка Mycobacterium tuberculosis штамм В-891;

2- клетка Vero (х 42000).

Рис. 3. Среда Игла МЕМ-МД-Fcw. 10 сутки культивирования . I- клетка Mycobacterium tuberculosis штамм В-891 (х 52000).

Результат, представленый на рисунках 2 и 3, показал, что Mycobacterium tuberculosis не проникают в клетки Vero, а прикрепляются к их поверхности.

В дальнейшем происходит размножение микобактерий и их рост на поверхности перевиваемой культуры клеток - 1-я фаза роста.

В толще среды наблюдаются конгломераты микобактерий с живыми и мертвыми клетками Vero - 4-я фаза роста. По-видимому, когда при размножении микобактерии покрывают собой всю поверхность клетки Vero в монослое, то она теряет свои функциональные свойства из-за изменения питательного баланса, открепляется от монослоя, но остается живой (2-я, 3-я фаза роста). В дальнейшем, присутствуя в конгломерате в живом виде, она стареет и постепенно отмирает. При этом процессе рост микобактерий туберкулеза сохраняется.

3. ВЫВОДЫ

1. Впервые разработан уникальный метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток, позволяющий сохранять их морфологические, культуральные, вирулентные характеристики и лекарственную устойчивость неизмененными в процессе длительного культивирования.

2. Установлено, что при использовании Предлагаемого метода культивирования наблюдается четыре фазы в процессе роста туберкулезных микобактерий (М tuberculosis штамм В-891, М. tuberculosis штамм В-892, М. bovis штамм В-909, М. avium штамм В-910), которые являются общими, и не зависят от используемой ростовой среды (BSK-II или Игла МЕМ-МД) и перевиваемой культуры клеток {Vero или ПК-91).

3. Выявлено, что патологическая картина и бактериальная обссмсмснность внутренних органов у животных, зараженных микобактериями, культивируемыми на перевиваемой культуре клеток и микобактериями, выросшими на стандартной среде Лсвснштсйна-Йснсспа существенно отличается.

4. Разработанный метод культивирования на перевиваемой культуре клеток чувствительнее к внесенной дозе инфицирующего агента - микобактерии туберкулеза, чем метод культивирования на жидких питательных средах (Сотона, Школыжковой, Игла МЕМ-МД, Игла МЕМ-МД с лизатом Vero) в 10-100 раз.

5. Показано, что Mycobacterium tuberculosis штамм В-891 при культивировании разработанным методом не проникает в клетки перевиваемой культуры (Vero), а прикрепляется к их поверхности.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработан метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой кулыуре клеток. Материалы диссертации использованы при разработке методических рекомендаций "Метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток". Рекомендации утверждены Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол №7 от 30 сентября 2003 г.), и подсекцией "Инфекционная патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" ветеринарной медицины Россельхозакадсмии (протокол № 19 от 30 сентября 2003 г.).

5. СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

I. Problem of tuberculosis in Siberia, Russia / Co-author: V.E. Repin, A.P. Duntau, V.V. Bakaev et al. //Congress of ECCO XIX (European Culture Collections' Organization): Proceedings - The Biological Ressource Centers and Genetics. 2000. - P. 130. 2 Метод культивирования микобактерий туберкулеза на основе культуры клеток / Соавт.: A.M. Шестопапов, Ю.Н. Рассадкин, А.Г. Дурыманов и др. // Клинические перспективы в инфектологии: Всерос. науч. кон(Ь., посвящ. 125-летию со дня рождения проф. Н.К. Розенберга и 105-летию каф. инфскцион болезней Воен.-мед. академии: Матер, конф. - Россия, Санкт-Петербург, 2001. - С. 220.

3. Новые возможности в культивировании микобактерий туберкулеза / Соавт.: А.Г. Дурыманов, Ю.Н. Рассадкин, A.M. Шестоналов и др. // Биотехнология - 2001: 5-й Международный семинар-презентация инновационных научно-технических проектов в обаастч био(е\ноло1 ии: Материалы - Пущино, 2001. -С. 207-208.

4. Новый подход к культивированию микобактерий туберкулеза // Конференция молодых ученых СО РАМН по проблемам фундаментальной и прикладной медицины: Сб. тез. Новосибирск, 2001. - С. 4-5.

5. A New Method for Mycobacterium tuberculosis Cultivation / Coauthor: A.G. Durimanov, Yu.N. Rassadkin, N.A. Donchenko et al. // IX International Conference "New Information Technology in Medicine and Ecology": Proceedings - Ukraine, Gursuf (Ciimea), 2001.-P. 158-160.

!

6. Method for Mycobacterium tuberculosis Cultivation on a Continuous Cell Culture Basis / Co-author: A.G. Durimanov, Yu.N. Rassadkin, A.M. Shestopalov // International Conference "Molecular Mechanisms of Genetical Processes and Biotechnology": Proceedings -Russia-Byelorussia, Moscow-Minsk, 2001. - P. 325-326.

7. Использование нового метода культивирования для изучения свойств микобактерий туберкулеза / Соавт.: А.Г. Дурыманов, Ю.Н. Рассадкин, A.M. Шестопалов // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: Вторая научная конференция с международным участием: Тез. докл. - Новосибирск, 2002. - С. 178.

8. Метод культивирования для изучения физиологии микобактерий / Соавт.: А.Г. Дурыманов, Ю.Н. Рассадкин, A.M. Шестопалов и др. // Материалы VIII Съезда Всеросс. общества эпидемиологов, микробиол. и паразитологов: Сб. статей в 4 томах, т.З.-Москва, 2002.-С. 186-187.

9. Influencing of Infection Mediums Conditions on Mycobacterium tuberculosis Cultivation / Co-author: A.G. Durimanov, Yu.N. Rassadkin, A.M. Shestopalov // Satellite Symposium "New Technologies in Medicine and Biology of the 3-rd Millennium" in I International Symposium "Stress and Extreme Conditions": Proceeding - Ukraine, Kara-Dag, Feodosia (Crimea), 2002. - P. 95.

10. Изучение чувствительности методов культивирования Mycobacterium bovis / Соавт.: А.Г. Дурыманов, A.M. Шестопалов, П.В. Бушмелева и др. // Актуальные вопросы зоотехнической

' науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и

здоровья сельскохозяйственных животных: Материалы II > Международной научно-практической конференции.

Ставрополь, 2003. - С. 252-253.

11. Метод культивирования микроорганизмов Mycobacterium tuberculosis / Соавт.: А.Г. Дурыманов, Ю.Н. Рассадкин, A.M. Шестопалов и др. // Патент РФ №2209829, БИ 22, 10.08.2003.

12. Определение лекарственной устойчивости . штаммов микобактерий туберкулеза с помощью нового метода культивирования / Соавт.: А.Г. Дурыманов, Ю.Н. Рассадкин, A.M. Шестопалов // Межрегиональная научная конференция, посвященная 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П. Карпова: Тсз. докл. - Томск, Россия, 2003. - С. 172-173.

13. Сравнение характеристик роста микобактерий туберкулеза на различных питательных средах / Соавт.: А.Г. Дурыманов, Ю.Н. Рассадкин, A.M. Шестопалов // Межрегиональная научная конференция, посвященная 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П. Карпова: Тез. докл. - Томск, Россия, 2003. - С. 51-52.

14. Change Virulence Mycobacterium tuberculosis complex at Long Cultivation on Various Mediums / Co-author: A.G. Durimanov, Yu.N. Rassadkin, N.A. Donchenko et al. // International Symposium "Integrative medicine" in International Congress "Progressive Scientific Technologies for Human Health": Proceeding - Ukraine, Kara-Dag, Feodosia (Crimea), 2003. - P. 23-24.

ГНЦ ВБ «Вектор», 3.11, T. 100, 2004 r.

f

í

í î

1

'i

'i

I

k

i

с

i

i j

i, ь

i* i

¡I

I

il

# -50531

РНБ Русский фонд

2004-4 33312

Актуальность.

Туберкулез представляет одну из первостепенных проблем здравоохранения, а также приводит к большим потерям среди поголовья сельскохозяйственных животных [Донченко А.С., 1998]. В связи с широким распространением туберкулеза во всем мире ВОЗ считает совершенствование диагностических средств и способов его лечения приоритетной проблемой [Global tuberculosis control // World Health Organization report, 2003].

Традиционные методы культивирования микобактерий туберкулеза все меньше удовлетворяют нуждам клиники, так как информативность микробиологических исследований явно недостаточна. Применяемые методы малоэффективны и не позволяют составить представление об истинном состоянии микобактериальной популяции, вегетирующей в организме больного [Головлев E.JI., 1998-6; Дорожкова И.Р., 1996].

При переходе во внешнюю среду из организма человека или животного или при резком изменении условий существования в этой среде патогенные бактерии с помощью различных сенсорных и регуляторных механизмов перестраивают работу своего генетического аппарата, что позволяет им сохранять жизнеспособность. [Roszak et. al., 1984; Гинцбург A.JI., и др., 1997; Young D.B., 2002]. Еще в 1953 г. Heinmets F. с соавторами [Heinmets F. et al., 1953] предположил, что в условиях стресса, особенно при голодании, аспорогенные бактерии существенно изменяют свою морфологию (клетки "мельчают"), темпы деления и метаболизм. Позже это было подтверждено исследованиями Е.Л. Головлева, Ю.М. Романовой и др. [Головлев Е.Л., 1998-в; Романова Ю.М. и др., 1998],. В связи с тем, что интенсивная химиотерапия повреждает различные метаболические системы микробной клетки, часть микобактериальной популяции утрачивает способность нормально развиваться на питательных средах. Жизнеспособность микобактерий снижается, что может проявляться потерей его способности к росту на общепринятых питательных средах, а также возникновением потребности в осмотически сбалансированных питательных средах [Дорожкова И.Р., 1996].

• Микробные системы обычно входят в более«сложные экологические системы, включающие как микро-, так и макроорганизмы, и члены микробной популяции часто функционируют именно в связи с процессами, идущими в макроорганизмах. Культивируя микроорганизм на искусственной среде, мы тем самым вынимаем его из процесса взаимоотношений с макроорганизмом и запускаем процесс изменения стабильности генотипа. Важно отметить, что современные методы долгого поддержания коллекционных штаммов в живом, биологически неизмененном культивируемом состоянии неэффективны, так как накоплено достаточно данных об изменениях свойств штаммов в процессе г длительного культивирования на общепринятых питательных средах. Свойства многих бактериальных патогенов изменяются уже через 2-3 пассажа при культивировании на традиционных средах [Caldwell D.E. et al., 1997; Ramirez E., Villaverde A., 1997; Олескин A.B. и др., 2000; Головлев Е.Л., 2001].

Общепризнанно, что длительное культивирование патогенных микобактерий на стандартных питательных средах приводит к изменению вирулентности (снижению) [Кузяев В.А 1972; Благодарный Я.А., Блехман

И.М.-, 1976; Голышевская В.И., 1995; Пушкарева- В.И., Боев Б.В., 1997;

Романенко В.Ф. и др., 2002; Вишневский Б.И. и др., 2002]. Несмотря на то, что для длительного культивирования рекомендовано большое количество питательных сред и способов культивирования, ни один из них не позволяет сохранять биологические свойства Mycobacterium tuberculosis complex неизменными [Донченко А.С., Донченко В.Н., 1994; Романенко

В.Ф.'и др., 2002; Вишневский Б.И. и др., 2002].

В связи с вышеизложенным, разработка метода, позволяющего сохранять биологические свойства Mycobacterium tuberculosis complex неизмененными в процессе длительного культивирования, является актуальной проблемой биологической науки.

Целью настоящей работы является разработка метода длительного культивирования патогенных микобактерий на основе перевиваемой культуры клеток и изучение сохранения биологических свойств микобактерий при его применении.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. Изучение возможности использования метода культивирования на основе перевиваемой культуры клеток для длительного культивирования Mycobacterium tuberculosis.

2. Изучение морфологических и культуральных характеристик Mycobacterium tuberculosis complex при замене ростовых сред и линий перевиваемых культур клеток.

3. Изучение сохранения вирулентных свойств и лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis при длительном культивировании на перевиваемой культуре клеток.

4. Изучение чувствительности метода культивирования на культуре клеток к внесенной дозе инфицирующего агента — микобактерии туберкулеза.

5. Определение локализации Mycobacterium tuberculosis во время роста на перевиваемой культуре клеток.

Научная новизна работы.

Впервые для приближения условий культивирования Mycobacterium tuberculosis complex к естественным условиям в качестве компонента в среде использована перевиваемая культура клеток. *

Впервые достигнуто сохранение биологических свойств (морфологических, культуральных, вирулентных) Mycobacterium tuberculosis complex в процессе длительного культивирования при совместном культивировании микобактерий и перевиваемых культур клеток.

Впервые показано, что микобактерии туберкулеза не проникают в клетку во время роста на перевиваемой культуре клеток Vero.

- Теоретическая и практическая значимостб работы. г

Результаты проведенных исследований являются экспериментально-теоретической базой для решения проблемы сохранения биологических свойств выделяемых и хранящихся штаммов патогенных микобактерий в изменяющихся условиях существования.

Разработан метод длительного культивирования микобактерий туберкулеза на перевиваемой культуре клеток, позволяющий сохранять биологические свойства микобактерий неизмененными в процессе культивирования. На метод культивирования получен патент РФ "Метод культивирования микроорганизмов Mycobacterium tuberculosis" № 2209829, f от 10.08.2003г.

• Проведенные исследования позволяют использовать разработанный метод для сохранения биологических свойств патогенных микобактерий разных видов (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium) неизмененными в процессе длительного культивирования.

Разработаны методические рекомендации "Метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток". Рекомендации утверждены Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол №7 от 30 сентября 2003 г.), и подсекцией "Инфекционная патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 19 от 30 сентября 2003 г.). Апробация работы.

В процессе работы полученные результаты были представлены в виде стендовых сообщений на:

- Congress of ЕССО XIX (European Culture Collections' Organization), The Biological Ressource Centers and Genetics, May 11-12, 2000;

- 5-м Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов в области биотехнологии "Биотехнология -2001", Россия, Пущино, 25-27 сентября, 2001 г.;

- Всероссийской научной конференции "Клинические перспективы в икфектологии", посвященной 125-летию со дня рождения профессора Н.К. Розенберга и 105-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии, Россия, Санкт-Петербург, 17-18 октября, 2001 г.;

- International Conference "Molecular Mechanisms of Genetical Processes and Biotechnology", Russia-Byelorussia, Moscow-Minsk, 18-24 november, 2001;

- Второй научной конференции с международным участием "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, .дальнего Востока и

Крайнего Севера", Новосибирск, Россия, 29-31 мая 2002 г.;

- International Symposium "Integrative medicine" in International Congress "Progressive Scientific Technologies for Human Health", Ukraine, Kara-Dag, Feodosia (Crimea), june 8-19, 2003;

- II Международной научно-практической конференции "Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики *как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья животных", Россия, Ставрополь, 2224 октября, 2003 г.;

В процессе работы полученные результаты были доложены на:

- IX International Conference "New Information Technology in Medicine and Ecology", Ukraine, Gursuf (Crimea), june 1-10, 2001;

- Конференции молодых ученых CO РАМН по проблемам фундаментальной и прикладной медицины, Россия, Новосибирск, 14-15 июня, 2001 г.; • '

- VIII Съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и'паразитологов, Москва, 26-28 марта 2002 г.;

- Satellite Symposium "New Technologies in Medicine and Biology of the 3rd Millennium" in I International Symposium "Stress and Extreme Conditions", Ukraine, Kara-Dag, Feodosia (Crimea), june 5-14,2002;

- Межрегиональной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П. Карпова, Томск, Россия, 7-10 октября 2003 г. ,*

Разработан метод культивирования микроорганизмов Mycobacterium tuberculosis, и получен патент РФ №2209829, БИ 22, 10.08.2003

Разработаны методические рекомендации "Метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток". Рекомендации утверждены Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол №7 от 30 сентября .2003 г.), и подсекцией "Инфекционная патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 19 от 30 сентября 2003 iv). !

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработан новый метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток, позволяющий сохранять морфологические, культуральные, вирулентные характеристики и лекарственную устойчивость микобактерий неизмененными в процессе длительного культивирования.

2. Метод культивирования на перевиваемой культуре клеток чувствительнее культивирования на жидких питательных средах в 10-100 раз.

Публикация результатов исследований.

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 143 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов,, выводов, практических предложений, списка используемой литературы и приложения. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 31 рисунком. Список* используемой литературы включает 173 источника, в том числе 61 иностранных авторов.

4. ВЫВОДЫ

1. Впервые разработан уникальный метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток, позволяющий сохранять их морфологические, культуральные, вирулентные характеристики и лекарственную г устойчивость неизмененными в процессе длительного культивирования. 2. Установлено, что при использовании предлагаемого метода культивирования наблюдается четыре фазы в процессе роста туберкулезных микобактерий (М tuberculosis штамм В-891, М. tuberculosis штамм В-892, М bovis штамм В-909, М avium штамм В-910), которые являются общими, и не зависят от используемой ростовой среды (BSK-II или Игла МЕМ-МД) и перевиваемой культуры клеток (Vero или ПК-91).

3. Выявлено, что патологическая картина и бактериальная обсемененность внутренних органов у животных, зараженных г микобактериями, культивируемыми на перевиваемой культуре клеток и к* микобактериями, выросшими на стандартной среде Левенштейна-Йенсена существенно отличается.

4. Разработанный метод культивирования на перевиваемой культуре клеток чувствительнее к внесенной дозе инфицирующего агента -микобактерии туберкулеза, чем метод культивирования на жидких питательных средах (Сотона, Школьниковой, Игла МЕМ-МД, Игла МЕМ-МД с лизатом Vero) в 10-100 раз. 5. Показано, что Mycobacterium tuberculosis штамм В-891 при г культивировании разработанным методом не проникает в клетки перевиваемой культуры (Vero), а прикрепляется к их поверхности.

- 5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ. ^ t

Разработан метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток. Материалы диссертации использованы при разработке методических рекомендаций "Метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток". Рекомендации утверждены Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол №7 от 30 сентября 2003 г.), и подсекцией "Инфекционная патологии животных в регионе Сибири и

Дальнего Востока" ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 19 от 30 сентября 2003 г.).

1.3. Заключение

По словам профессора Дрожковой И.Р. [1996]: "В настоящее время традиционные методы выделения микобактерий туберкулеза все меньше удовлетворяют нуждам клиники, так как информативность микробиологических исследований явно недостаточна. Применяемые методы малоэффективны и не позволяют составить представление об истинном состоянии микобактериальной популяции, вегетирующей в организме больного". Для выделения, выращивания и определения лекарственной устойчивости микобактерий используют различные питательные среды: плотные, полужидкие, жидкие (синтетические и полу'синтетические). Однако ни одна из них не обладает качествами, предъявляемыми к ним современной бактериологической диагностикой туберкулеза [Головлев Е.Л., 1998-6; Дорожкова И.Р., 1996].

Жидкие среды, несмотря на их относительно простой состав, высокую чувствительность при культивировании микобактерий туберкулеза и довольно короткие сроки появления роста, имеют ряд существенных недостатков. Они легче подвергаются загрязнению, t применение их затрудняет количественную оценку роста, на них трудно получить первую генерацию микобактерий.

Более высокие показатели выделения микобактерий туберкулеза дают плотные, яичные питательные среды. При росте на них возможно получение чистой культуры, однако оптимальный рост возбудителя составляет достаточно длительный срок (8-12 недель).

Считается, что единственным достоверным методом диагностики туберкулеза в настоящее время является обнаружение микобактерий туберкулеза [Арсенин С.Л. и др., 1999]. Однако, несмотря на большое количество исследований в этой области, не существует простого, достоверного и быстрого бактериологического теста для диагностики активного туберкулеза. К сожалению, стандартные общепринятые методы бактериологического исследования при туберкулезе громоздки и часто неэффективны. Кроме того, наиболее широко применяемые методы требуют длительного времени и недостаточно чувствительны даже при мультибациллярном легочном туберкулезе, а при олигобациллярных формах процесса трудности его выявления возрастают во много раз.

Важно отметить, что указанные методы дают возможность получить информацию только о зрелой классической бактериальной (бациллярной) форме возбудителя, тогда как более ранние стадии его развития остаются вне поля зрения исследователя. Поэтому неадекватные культуральные методы могут быть причиной неудач в обнаружении ранних фаз заболевания или реактивации процесса. Кроме вышесказанного, большинство исследователей забывает, что микробные системы обычно входят в более сложные экологические системы, включающие как микро-, так и макроорганизмы, и члены микробной популяции часто функционируют именно в связи с процессами, идущими в макроорганизмах. Культивируя микроорганизм на искусственной среде, мы тем самым вынимаем его из процесса взаимоотношений с макроорганизмом и запускаем процесс изменения стабильности генотипа. Современные данные «говорят об изменении 9 свойств многих бактериальных патогенов через 2-3 пассажа при культивировании на традиционных средах[СаМ\уе11 D.E. et al., 1997; Ramirez Е., Villaverde А., 1997; Олескин А.В. и др., 2000; Головлев Е.Л., 2001].

Все это указывает на необходимость создания более совершенных способов культивирования возбудителя туберкулеза, позволяющих выделять, классифицировать, сохранять и поддерживать биологические свойства в течение нескольких пассажей для их изучения. Таким образом, разработка нового метода культивирования, 9 способного сохранять биологические свойства микобактерий туберкулеза неизменными при длительном культивировании, несомненно является актуальной целью работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ,'2.1. Материалы и методы *

2.1.1. Бактериальные штаммы.

Возбудители туберкулеза человеческого типа - Mycobacterium tuberculosis штамм В-891, Mycobacterium tuberculosis штамм В-892; возбудитель туберкулеза бычьего типа Mycobacterium bovis штамм В-909; возбудитель туберкулеза птичьего типа Mycobacterium avium штамм В-910 были выделены автором из биоматериала и задепонированы в коллекции микобактерий Института коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор".

При депонировании штаммов Mycobacterium tuberculosis В-891, *

Mycobacterium tuberculosis В-892 была отмечена их устойчивость к рифампицину 50 мг/мл и стрептомицину 50 мг/мл. Штаммы были заложены в коллекцию на 2 пассаже после выделения из биоматериала на среде Финн-2.

2.1.2. Перевиваемые культуры клеток.

Перевиваемая линия культуры клеток Vero (почка зеленой мартышки) была получена из Института клеточных культур ГНЦ ВБ "Вектор".

Перевиваемая линия культуры клеток ПК-91 (почка кошки) [патент РФ №2121501 от 19.12.94] была любезно предоставлена научным сотрудником Лаборатории изучения и мониторинга зоонозных инфекций Института молекулярной биологии ГНЦ ВБ "Вектор" Дурымановым А.Г.

2.13. Питательные среды.

Питательная среда для культивирования микобактерий туберкулеза -среда Левенштейна-Иенсена (Тюменское государственное предприятие по производству бактерийных препаратов) содержит следующие компоненты в 1 литре:

- калий фосфорнокислый однозамещенный 1,54 г.

- магний сернокислый 0,15 г.

- натрий лимоннокислый 0,38 г. аспарагин 2,31 г. ,

- глицерин 7,70 г. г малахитовый зеленый 0,26 г.

- яйцо куриное в виде яичной массы 600 мл

- дистиллированная вода до 1 литра.

Питательная среда для культивирования микобактерий туберкулеза -среда Финн-2 (Тюменское государственное предприятие по производству бактерийных препаратов) содержит следующие компоненты в 1 литре: т калий фосфорнокислый однозамещенный 0,0 г. г

- магний сернокислый 0,15 г. г натрий лимоннокислый трехзамещенный 0,3 г.

- железоаммонийные квасцы 0,015 г.

- аммоний лимоннокислый однозамещенный 1,5 г.

- натрий глютаминовокислый, кислый 3,0 г.

- глицерин 6,0 г.

- малахитовый зеленый 0,2 г.

- яйцо куриное в виде яичной массы 600 мл т дистиллиррванная вода до 1 литра. , г

Питательная среда для культивирования микобактерий туберкулеза -среда Сотона содержит следующие компоненты в 1 литре:

- аспарагин 4 г.

- глицерин 60 мл

- К-ацетил-О-глюкозамин 0,4 г;

- бикарбонат Na 2,2 г; т L-глютамина 0,1 г; «

I ,*

- сыворотка бычья (или кроличья) фетальная 0,08 л. г рифампицин 0,051 г (при необходимости добавления).

- налидиксовая кислота 0,1 г.

Питательная среда для культур клеток — среда Игла MEM в модификации Дульбеко (Каталог фирмы ISN, biochemicals and reagents catalog, 2002-2003 гг, с. 791, №1033220) с 0,2% BSA (V фракция) и 15тМ Hepes содержит следующие компоненты в 1 литре:

7 питательная среда DMEM (ISN, 2002-2003,,№1033220) - навеска на

9 ,'

1 литр г BSA V фракция (ISN, 2002-2003, №194772) - 2 г

- Hepes 1 М (ISN, 2002-2003, №1688449) - 15 мл

- рифампицин 0,051 г (при необходимости добавления).

2.1.4. Лекарственные препараты.

Для определения резистентности Mycobacterium tuberculosis штамм В-891 были выбраны наиболее распространенные противотуберкулезные препараты: рифампицин, канамицин, стрептомицин, изониазид, 9 пиразинамид, этамбутол. Концентрации препарата были взяты в соответствии с инструкцией [Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза, 2003]:

- Рифампицин - 50 мкг/мл (ЗАО "Брынцалов А", Москва, Россия);

- Канамицина сульфат - 50 мкг/мл (ОАО "Биохимик", Саранск, Россия);

- Стрептомицина сульфат - 50 мкг/мл (ЗАО "Брынцалов А", Москва,

Россия);

- Изониазид - 5 мкг/мл (Объединение "Мосхимфармпрепараты", Москва, Россия);

- Пиразинамид - 200 мкг/мл (Новарис Энтерпрайсиз Лтд., Ворли, Мумбай, Индия);

- Этамбутол - 10 мкг/мл (ЗАО "Макиз-Фарма", Москва, Россия). в ,*

2.1.5. Животные.

В работе использовали беспородных морских свинок весом 250300 г. Все животные были получены из питомника лабораторных животных Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН. Животные в питомнике содержались с соблюдением правил и норм кормления, содержания и гуманного обращения.

Для экспериментов использовали только здоровых животных, не контаминированных микобактериями туберкулезного комплекса. Перед заражением, случайно выбранным морским свинкам ставили реакцию

Манту по общепринятой методике [Дорожкова И.Р., 1996], вводя 0,02 мл «

ППД-туберкулина внутрикожно в наружную поверхность бедра. При отрицательной реакции через 48 часов свинок данной группы брали в опыт.

2.1.6. Культивирование микобактерий туберкулезного комплекса на плотных и жидких питательных средах.

Посевы, пассирование, наблюдения и оценка роста микобактерий туберкулезного комплекса на плотных яичных питательных средах о »

Левенштейна-Иенсена и Финн-2, а также на жидких питательных средах

Сотона и Школьниковой проводились по общепринятой методике t

Тогунова А.И., 1964; Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза, 2003].

Оценка роста проводилась визуально, а также при увеличении • ^

5 X Г2,5; 10 X 12,5; 20 X 12,5 на инвертированном микроскопе. I

2.1.7. Подготовка линий перевиваемых культур клеток к совместному культивированию.

Перевиваемую линию культуры клеток Vero (почка зеленой мартышки) культивировали в монослое, на роллерной установке в стеклянных флаконах на ростовой среде Игла MEM с добавлением 5 процентов сыворотки крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем, и 1 процента сыворотки плодов коровы. Кратность рассева: 1:3-1:5. Частота пересевов: по мере' образования плотного монослоя, как правило, один раз в 4-5 суток.

Перевиваемую линию культуры клеток ПК-91 (почка кошки) в лаборатории ведут в монослое, на роллерной установке в стеклянных флаконах на ростовой среде Игла MEM с добавлением 5 процентов сыворотки крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем, и 1 процента сыворотки плодов коровы. Кратность рассева: 1:4-1:7. Частота пересевов: по мере образования плотного монослоя, как правило, один раз в 5-6 суток. ^

В пластиковые флаконы с площадью поверхности 25 см 2 засевают по 1х106 (0,04x106 кл/см2) клеток на указанной ростовой среде в объеме 10 мл. Флаконы помещают в термостат при 37+0,5 °С. Через двое суток, при плотности монослоя клеток 10 кл/см , ростовую среду сливают и заливают среду BSK-II в объеме 10 мл или среду Игла МЕМ-МД в объеме 10 мл. Флаконы помещают в термостат при 37+0,5 °С. Визуальный осмотр культуры клеток проводят ежедневно с использованием инвертируемого микроскопа. Плотный монослой клеток при использовании среды BSK-II сохраняется до 21 суток. Плотный монослой клеток при использовании • • • среды Игла МЕМ-МД сохраняется до 14-18 суток.'

2.1.8. Техника заражения лабораторных животных.

Заражение морских свинок проводилось по общепринятой методике {Тогунова А.И., 1964] подкожно с правой стороны живота в дозе 1 мл бактериальной взвеси 5 ЕД бак. стандарта мутности (ГИСК им. Тарасевича). Доза для заражения была выбрана экспериментальным путем, как доза, позволяющая зараженным морским свинкам не погибать во время проведения эксперимента и наиболее точно проводить оценку внутриорганизменного распространения микобактерий.

2.1.9. Техника приготовления и окраски мазков.

Приготовленные по общепринятой методике [Биргер М.О., 1973] мазки из жидких культур, культур на плотных средах фиксировали в 95% этиловом спирте в течении 20 минут. Фиксированный мазок окрашивали по методу Циля-Нильсена [Биргер М.О., 1973}. При просмотре под микроскопом кислото- и спиртоустойчивые микобактерии красного цвета, все остальные микроорганизмы - синего.

2.1.10. Методика оценки патологических изменений внутренних органов морских свинок.

Для оценки распространения и характера туберкулезного поражения у морских свинок была использована модифицированная схема Ю.К. Вейсфейлера [1975]. По этой схеме специфические изменения в органах и лимфатических узлах оцениваются в зависимости от степени их выраженности плюсами, которые затем переводятся в цифровые показатели. Оценивалась степень пораженности легких, печени, селезенки, паховых лимфатических узлов определением количества и величиной измененных участков органа по схеме, согласно которой максимальное поражение составляет -н-н-, в цифровом выражении 4.Таким образом, максимальный индекс степени пораженности внутренних органов животного составляет 16 (100%). Далее общие индексы пораженности в цифровом или процентном виде вычислялись для общей группы животных в эксперименте. *

2.1.11. Методика определения КОЕ (колония образующих единиц).

В процессе культивирования микобактерий туберкулеза на жидких средах проводилось определение КОЕ, путем высева 35 мкл или 100 мкл суспендированной жидкой среды с микобактериями на плотную питательную среду Левенштейна-Иенсена, и подсчетом через 2 и 4 недели количества визуально видимых характерных колоний.

2.1.12. Методика определения высеваёмости микобактерий туберкулеза из внутренних органов морских свинок. »

Образцы для посева (10 мг.) отбирались из внутренних органов (паховый лимфатический узел, легкие, печень, селезенка) эвтаназированных морских свинок. Образцы обрабатывались по Аликаевой [ГОСТ 26072-89, СТ СЭВ 3457-81; Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза, 2003]. Далее их высевали о на плотную питательную среду Левенштейна-Иенсена. На 30 сутки культивирования подсчитывались визуально видимые характерные колонии микобактерий туберкулеза, t

Полученные экспериментальные данные обрабатывались с применением математической статистики [Усович А.Т., Лебедев П.Т. 1970].

2.1.13. Электронная микроскопия образцов микобактерий.

Образцы для электронной микроскопии были залиты фиксатором (10% формалин) и переданы заведующему лабораторией патофизиологии и микроскопии Института молекулярной биологии ГНЦ ВБ "Вектор"

Рябчиковой Е.И.