Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСА ЯЩУРА С КЛЕТКАМИ КУЛЬТУР ТКАНЕЙ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ

-шаг

~ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО« ВЕТЕРИНАРИИ ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ИМЕНИ В. И. ЛЕНИНА

На правах рукописи ГОГОЛЕВ Михаил Михайлович

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСА ЯЩУРА С КЛЕТКАМИ КУЛЬТУР ТКАНЕЙ РАЗЛИЧНЫХ .. ВИДОВ ЖИВОТНЫХ

(16.00.03 - .-¿геология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва — 1975

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ ВСЕСОЮЗНО» ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ИМЕНИ В. И, ЛЕНИНА

На травах рукописи ГОГОЛЕВ Михаил Михайлович

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСА ЯЩУРА С КЛЕТКАМИ КУЛЬТУР ТКАНЕЙ РАЗЛИЧНЫХ

видов животных

(1G.00.03 — вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата -ветеринарных наук

--^Москва-—г 19.75 ■

Работа вы,полнена в лаборатории по изучению ящура Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии (директор института — академик ВАСХНИЛ, заслуженный деятель науки РСФСР, доктор ветерндарных наук, профессор Коваленко Я. Р.)

Диссертадия изложнеа на 159 страницах машинописного текста, из них; 3 странницы введение, 34 — обзор литературы, 70 — собственные исследования, 16 — обсуждение, 4 — выводы н предложения, 29 — -список литературы, содержащий 289 источников, в том числе 214 — иностранных. Работа иллюстрирована 30 таблицами, 5 рисунками и 9 фотографиями.

Научные руководители:

Кандидат ветеринарных наук — Е. Л. Салажов;

Кандидат .ветеринарных паук — А, И. Лебедев,

Официальные оппоненты:

1) доктор биологических наук — Скалинский П. И.

(ВГНКИ),

2) .кандидат биологических наук — Сурин Б. И, (ВИЭВ).

Ведущее научно-исследовательское учреждение — Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт.

Автореферат разослан « Хъ» гМАЛ 1975 г<

Защита диссертации состоятся 1975 г.

с 14 часов >на заседании специализированного Ученого совета Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной эетеринарин. Отзывы на автореферат диссертации просим направлять по адресу: 109472, Москва Ж-4'2, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Ученый секретарь ВИЭВ — -кандидат биологических наук В. В. Калугин.

ВВЕДЕНИЕ

Со времени открытия вируса ящура ведутся исследования по изучению его биологических свойств, химического состава и строения. В этих вопросах за последние годы достигнуты значительные успехи. Однако для радикального решения .проблемы ликвидации ящура необходимо изыскание более эффективных биологических препаратов, в связн'с чем ■приобретают большое значение исследования по изучению структуры вируса, функции его компонентов и механизма взаимодействия вируса с клеткой.

Исследованиями показано, что различные клеточные системы по-разному реагируют с определенными вирусами, однако, до сих пор нет достаточных данных, объясняющих это явление. Данные, касающиеся взаимодействия вирусов, в том числе и вируса ящура, с чувствительной клеткой, довольно разноречивы. Чувствительность или резистентность клеток к определенным вирусам объясняется по-разному. Некоторые исследователи считают, что невосприимчивость клеток к определенным вирусам связана с неспособностью их синтезировать компоненты вируса. Другие авторы отмечают, что чувствительность клеток зависит от возможности вирусов адсорбироваться и проникать в них.

Значительное внимание уделяется изучению взаимодействия вирусов с клетками под твердым покрытием. Способность вирусов и их нуклеиновых кислот образовывать бляшки в культуре тка.нн не одинакова н зависит от целого ряда еще не полностью изученных факторов.

Важным вопросом в изучении взаимодействия вируса с клеткой является понимание начальной стадии этого процесса — адсорбции и проникновения вируса в клетку. Однако, несмотря на многочисленные исследования (Н. L. Bachracli, 1952; R. F. Sellers, 1955, 1959; R. A. Pledger, 1960; H. V. Thome, B. F. Carhvright, 1961; F. Brown et a!., 1963; B. A. Сергеев, 1966; А. И. Лебедев, 1967; С. H. Campbell, 1967, 1968, 1970; Б. В- Горский, 1968; Е. А. Гринева, 1972), многие стороны этого процесса изучены недостаточно. Мало извест-

но о характере п времени адсорбции вируса ящура на клетках, факторах, влияющих па нее.

Учитывая изложенное, перед нами были поставлены следующие задачи:

1. Изучить бляшкообразующне свойства вируса ящура и его РНК в различных культурах клеток, а также влияние некоторых факторов па образование бляшек.

2. Изучить динамику репликации вируса ящура и его РНК в различных клеточных системах, отличающихся .по чувствительности к вирусу,

3. Изучить начальные стадии шзаилюденст/вия вируса рщура с 'различными клетками и факторы, обусловливающие п влияющие на адсорбцию и .проникновение вируса в клетку.

4. Выяснить меха.низмы, обусловливающие чувствительность и резистентность клеток различных 'видов животных к вирусу ящурра.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В опытах использовали эпизоотические штаммы вируса ящура типа А, варианта Агг (№ 432, 470, 490), .полученные в виде афтозн-ого материала от больного крупного рогатого скота; варианта Ау (штамм № 103) и один лаборатор-иый штамм типа С (С ст ), поддерживаемый в течение ряда лет на .морских свинках.

Все штаммы были адаптированы к культуре неровнвае-мых клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), а штаммы № 432, 470 и 4§0 также и к культурам ткани почек телят (ПТ, КПТ) и эмбрионов свиней (ПЭС).

При проведении исследований использовали 'препараты вируса 5—42 пассажей в культуре этих клеток, а также линии его, получение путем двукратного клонирования методом изоляции негативных колоний — бляшек по схеме вирус— РНК—бляшка—вирус (А. И, Лебедев, 1965).

Для репродукции вируса, изучения биологических свойств и взаимодействия его с клетками использовали ,пер-внчно -трипсинизир0ван:ные культуры клеток почек телят (ПТ), эмбрионов свиней (ПЭС), эмбрионов коров (Т7ЭК), морских свинок (ПМС), цыплят (ПЦ), котят (ПК), жеребят (ПЖ), культуры фи-бробластов эмбиолов кур (ФЭК), перевиваемые линии клеток тточек телят (КПТ), хомячков (ВНК), поросят (ПП), эмбрионов свиней (СПЭВ) и фибро-бластов эмбрионов мышек (Ь), а также морских свинок 'Весом 400—450 грамммов и белых мышат-сосунов 7-дпеытго возраста.

Первично трштспннзнровапые культуры клеток ПЦ, ПМС, ФЭК Ii ПК готовилн 'по общепринятой методике (R. F. Sellers, 1955; R. F. Seilers, L. M. Burt et al., 1959; О. Г. Анджапаридзе, В. И, Гаврилов п др-, 1962; В. А. Сергеев, 1966), а суспензии клеток ПТ, ПЭК, ПЭС, а также перевиваемые линии получали в лаборатории культур тканей и питательных сред ВИЭВ.

Инфекционную РНК выделяли из культуралыюго вируса методом холодной фенольной депротеиннзацпи .по Гнреру н Шрамму (1956), модифицированным А, И. Лебедевым (1965) применительно к вирусу ящура. Контроль препаратов РНК на отсутствие ннтактных вирусных частиц осуществляли с помощью теста с рибонуклеазой.

При определении инфекционной активности вируса и выделенной РНК «а культурах клеток и мышатах-сосунах титр вируса вычисляли по м.етоду Рида н Менча (1938) и выражали показателем степени десятичных логарифмов в ТЦДзо/'МЛ или ЛДзо/мл.

Для титрования вируса и инфекционной РНК методом негативных колоний использовали культуры клеток, выращенные в 50-мпллилнтровых флаконах, используя агаровое покрытие по .проннси Хюна п Мельника (1955) с добавлением аминонептнда—2 (О, Г. Анджапаридзе, Л. Г. Степанова, 1961) и 5% раствора гидролизата лакталыбумииа (R. F. Sellers, D. L. Stewart, 1959).

В отдельных опытах применялн агаровое покрытие без нейтрального красного. Для выявления бляшек клеточный монослой фиксировали и о-крашнвали по методике J. Crick, А, 1, Lebeaev et al. (1966). Титр вируса н РНК выражали числом бляшкообразующих единиц в одном миллилитре (БОЕ/мл).

Тил осп ециф и чес кую и вариалтную принадлежность изучаемых штаммов вируса определяли в реакции связывания комплемента, которая проводилась согласно действующего наставления.

Для инактивации ¡внеклеточного вируса лриме-нялн 0,2 М ацетатный буфер с pH—5,3.

Субклеточные фракции (ядра, .митохондрии, микросомы, нсстмиюросомальная фракция) получали методом дифференциального центрифугирования в 0,25 М растворе сахарозы по W. С. Schneider (1948) и А. А. Покровскому (1968).

Полученные данные подвергали статистической обработке, вычисляя среднее квадратическое отклонение и среднюю ошибку — п]. Оценку достоверности средней величины выборочной совокупности проводили iio таблице критериев

Сгьюдента. Результаты считались достоверными при Р<0,05, то есть в том случае, когда вероятность «выпадения» результатов измерений из заданного интервала ие превышала 5%.

В необходимых случаях проводили оценку существенности различий средних величин.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Бляшкообразующие свойства вируса ящура А2г и влияние на образование бляшек некоторых факторов.

Многие вирусы, в том числе и вирус ящура, способны образовывать под агаровой средой бляшки,, различные по морфологии и размеру. Количество и .морфология ¡бляшек зависят. от целого ряда факторов, включая и предварительную адаптацию вируса к культуре ткани (Z. Dinter, М. Sibalin, 1958; Rv F. Sellers, L. M. Burt et al„ 1959; G. E. Coltral, R. E- Patty et al., 1965, 1966; А. И. Лебедев, 1967; И. E. Ско-рип, А. И. Лебедев, 1968),

В опытах использовали вирус ящура штаммов № 432, 470 и 490. Проведенное изучение антигенных свойств этих штаммов вируса показало, что они связывались вариантиой сывороткой А.22, частично реагировали с сыворотками других вар и ан то в гомологичного типа (AiT и А7) и не реагировали с сыворотками гетерологичных типов.

Однако, несмотря на принадлежность к одному и тому же варианту А22 указанные штаммы обладали различной вирулентностью для мышат-сосунов и неодинаковым цитопато-геиным действием в культуре ткани. Наибольшей вирулентностью для мышат-сосунов 7-дневного возраста, а также способностью к размножению ® культуре клеток (вирусы 6 пассажей в культуре ПТ) обладал штамм '№ 432 (7,4 lg ЛДк>/мл, 7,5 lg ТЦДбо/мл). У вируса штамма ^ 470 указанные признаки вьпражены слабее (5,4 lg ЛДэо'мл, 6,0 lg ТЦД50/МЛ). Вирус штамма № 490 занимает промежуточное положнеие между ними (7,2 lg ЛДбо'мл, 6,0 lg ТЦД5о/мл).

Изучаемые штаммы отличались друг от друга также и по бляшкообразующей способности. Так, вирус штамма № 432 и выделенная из него РНК регулярно образовывали в культурах клеток КПТ, СПЭВ и ВНК ограниченные, четкие негативные колонии диаметром соответственно !—5, 5—45 и 2 — G мм ,а в субкультуре ПТ — мутные бляшки с размытыми краями. В тех же условиях культивирования вирус штамма jNs 490 и его РНК образовывали в субкультуре ПТ и в культурах СПЭВ и ВНК четкие, ограниченные негативные коло-6

и mi диаметром 1—4, 2—8 и 2—7 мм, а то время как в культуре КПТ — мутные бляшки диаметром 1—3 мм.

Анализ морфологии и количественного состава бляшек, образованных виру-сом штамма iM70 и выделенными из него клонами, показал, что вирусная популяция этого штамма генетически неоднородна, так как образовывала в культуре ГТП бляшки различные по размеру. Так, исходный вирус образовывал 55% бляшек размером до 1 мм, 33,6% — размером от I до 2 мм, 11% — от 2 до 4 мм и лишь 0,4% — от 4 до 6 мм. Вирус второго пассажа образовывал уже 61,7% бляшек размером от 2 до 4 мм.

Различные клоны, выделенные из исходного вируса, давали в основном мелкие (до 1 мм) бляшки. Однако, после проведения 1—2 пассажей в культуре клеток изолированные клоны стали отличаться друг от друга по размером образуемых бляшек. Это указывает па неодинаковую способность отдельных впру-сных частиц популяции к размножению в определенной .культуре клеток.

Полученные результаты позволяют считать, что штаммы вируса ящура варианта Ааг — № 432, 470, 490 и выделенная из них инфекционная РНК неоднородны по своему составу н отличаются по бляшкообразующим свойствам па различных культурах клеток. Метод бляшек позволяет проводить разделение генетически неоднородных популяций штаммов вируса щур а на однородные линии для изучения биологических свойств и .может быть использован для .отбора и получения более полной характеристики производственных и новых эпизоотических вариантов вируса ящура.

Помимо вида культур клеток п штаммов вируса на размер образуемых бляшек оказывают влияние и другие факторы. В литературе имеются данные, указывающие на ингиби-рующее действие нейтрального красного, вносимого в агаровое покрытие. Так, R. F. Sellers, D. L. Stewart (1959), R. А. Pledger (1960) показали, что нейтральрот ингибирует размножение вируса ящура типа 0 в культуре клеток телят и. свиией, при этом размер и количество образующихся бляшек уменьшается.

В своих опытах мы использовали клонированные линии вируса № 432 и 490, выделенные изолированием негативных колоний, полученных на субкультуре ПТ. Агаровое покрытие готовили с наличием и без нейтрального красного.

Результаты опытов показали, что нейтральрот не оказывает существенного влияния на репродукцию вируса типа А № 432 под твердым покрытием. Титр его (в присутствии нейтрального красного составляет 1,0x10е БОЕ/мл, а при пекл ю-

ченип его — 1,2Х)06 БОЕ/мл. По-иному влияет нейтральный красный «а вирус штамма типа А № 490. Если в присутствии нейтрального красного титр вируса составляет 2,0Х 10s БОЕ/мл, то без пего титр Вируса значительно выше — 1,5x10е'БОЕ/мл.

Таким образом, результаты .наших исследований не подтвердили данных R. F, Sellers и других. Ингибирующее действие нейтральрота проявляется не на все штаммы вируса ящура даже одного варианта (Агг). Это еще раз подчеркивает неоднородность различных эпизоотических популяций вируса. Ингибирующее или неипгиби'рующее действие нейт-ральрота на вирус ящура может служить одним из признаков для биологической характеристики популяции вируса..

Изучение влияния днэтиламнноэтил-декстрана (ДЭАЭ-Д) и декстраи-еульфата (ДС) ira бляшкообразующую способность вируса ящура показало неодинаковую чувствительность различных штаммов к этим веществам. Так, присутствие в среде ДЭДЭ—Д повышает бляшкообразующую активность испытанных штаммов вируса в 1,25—75 раз и увеличивает размер образуемых ими бляшек па 1—3 мм. В то же время действие ДС в этих условиях оказывается иным. Если число бляшек, образованных вирусом Ass (штаммы № 432, 490), в присутствии 'названного соединения увеличивается в 1,1—3,5 раза, то активность типа С (штамм Сгт ) понизилась в 2,9 раза, а варианта А7 (штамм 103) — в 27 раз то сравнению с контролем (агаровое покрытие без.ДС). Необходимо отметить, что как ДЭАЭ—Д, так и ДС практически ле влияли на форму (вирусных бляшек, обусловливая, однако, изменение их размеров. Так, .размер бляшек, образованных штаммом № 103, был в среднем на 3 .мм больше после введения в агаровое покрытие ДЭАЭ—Д, чем <в контроле.

При изучении влияния полиионных соединений на РНК. выделенную -из вируса А^ штаммов № 432 и 490, установлено, что добавление ДЭАЭ—Д, не влияя значительно на морфологию бляшек, обеспечивало увеличение числа их в 2—3 раза. При этом отмечено,-что ДЭАЭ—Д повышает инфекционный титр РНК только-з изотоническом растворе и теряет эту способность в гипертоническом.

Повышение инфекционного титра РНК вируса ящура с помощью ДЭАЗ—декстрана имеет большое значение при вирусологических исследованиях, в частности может значительно повысить вероятность выделения мутантов после воздей-вие на нее физическими или химическими факторами и может быть использовано при изучении генетической однородности 'популяций вируса и селекции и.п.гнбитороустойчивых вирусных штаммов.

Изучение динамики репликации вируса ящура и его РНК в чувствительных и резистентных к нему клетках.

Ранее при изготовлении вакцин учитывали в основном инфекционный титр вируса. Однако В. иЬегЫгН и. а. (1956), Е. Л. Салажовым, М. В. Загородновым и др. (1964) была отмечена зависимость в накоплении комплемептсвязывающего и иммунизирующего антигенов. Впоследствии при репродукции вируса стали учитывать этот фа'ктор при изготовлении пакцнн по Френкелю и из лапицитированного вируса. В связи с этим представляло интерес изучить динамику инфекционного титра и комплемептсвязывающего антигена вируса ящура А22 'В различных однослойных клеточных системах, а также определить время появления в инфицированных клетках новых биологически активных вирусной РНК и зрелых вири-онов.

Исследования проводили с клонированным, культураль-ным вирусом ящура тина А, штамм 432, клон 432/6.

Во всех инфицированных культурах клеток (ПТ, ПЭК и СПЭВ) титр вируса в течение первых сроков инкубации снижался, Максимальное снижение титра его отмечали при репродукции вируса в культуре СПЗВ — через 60 минут, а в культуре ПЭК и ПТ через 40 минут после адсорбции. Накопление вируса в максимальном' титре {8,0 и 7,66 ТЩЬо/мл) наблюдали через 4 и 6 часов соответственно в культурах ПЭК н СПЭВ. В последующие 2 часа титр его существенно не изменялся. Однако позднее отмечалось постепенное снижение титра. Это происходило, по-видимому, за счет тепловой инактивации, поскольку к этому времени монослой полностью разрушался и живых клеток, необходимых для репродукции вируса, уже не было.

Методом РСК установлено, что антигены, ^приготовленные из вируссодержащей культуральной жидкости к разрушенных клеток после 2-часовой инкубации вируса, комплемент-связывающимн свойствами не обладали, хотя вирус в этот период накапливался в пределах 7,1 ТЦДю/мл. Выраженными комплементсвязывакыцими свойствами обладал вирус, полученный через 6 часов культивирования и позднеее. После 22 часов культивирования вирус обладал комплементсвя-зывающей активностью даже в разведении 1:2 и 1:4, в то время как инфекционный титр к этому времени снизился на 1,5 ТЩЫмл.

Таким образом, полученные нами данные об отсутствии корреляции в накоплении инфекционного титра и компле-ментсвязьивагощего антигена подтверждает данные В. иЬег-Ыт (1956), Е. Л. Салажова, М. В. Загородного и др. (1964),

9

А. А. Сюсюкипа с соавт. (1968) и свидетельствуют, что инфекционный титр вирусного сы>рья еще не может быть показателем.для определения его качества при изготовлении вак-шш.

Исследование инфекционной вирусной РНК, выделенной в различные сроки культивирования вируса, показало, что наименьшее количество РНК (0,05—0,5 '\g ТЦД$о'мл) обнаружено в пробах, взятых через.20 минут после адсорбции вируса. Увеличение титра вирус,ной РНК (до 1,0 ТЦД50/мл) .наблюдали к 60 минутам культивирования, а заметное увеличение количества вируса лишь к 80 минутам.

Эти данные подтверждают опыты с рибонуклеазой. Обработка культур рнбонуклеазой показала, что ® период 60—80 минут культивирования указанный фермент значительно понижал их инфекционность. В частности, в культурах, снятых через 60 минут после инкубации, титр инфекционности равнялся 4,16 ТЦД50/мл, В тех же пробах после обра|ботки РНК*азой он снижался на 95%- Таким образом, в этот период инкубации инфекционность зараженных культур обусловлена в основном за счет вирусной РНК. Накопелние же вируса не чувствительного к действию РНК-азы происходит через 80 минут ин-кубацш.

На основании полученных данных можно заключить, что синтез новой инфекционной РНК осуществляется через 1 час., а формирование нового зрелого вируса начинается через 80— 90 минут после его адсорбции на клетках. Об аналогичном явлении сообщал в 1966 и 1971 годах В. И. Агол при изучении других вирусов.

В биологии до настоящего ¡времени не дано научного объяснения видовой невосприимчивости к вирусным заболеваниям. Причины различной чувствительности клеток к заражению вирусами точно те установлены. Отдельные исследователи считают, что невосприимчивость тех или других клеток животных к определенному вирусу связана с неспособностью их синтезировать компоненты вирусной частицы. Однако, Р. (1е Эошег е* а1. (1959), Л. Л. НоПап<1 е1 а1. (1962), Ю. 3. Гендон (1963), В. Д. Соловьев с соавт. (1969) показали возможность вирусной РНК индуцировать репликацию полноценного вируса полиомиелита в резистентных к нему клет-. ках. В связи с этим мы поставили перед собой задачу изучить различия в спектре действия вируса ящура и его РНК.

В качестве чувствительных к вирусу ящура использовали ПТ, КПТ и СПЗВ; в качестве нечувствительных—ПЦ, ПЖ, ФЭК и Ь.

Нативным вирусом и выделенной из него инфекционной

РНК параллельно инфицировали указанные культуры клеток. При этом на разных стадиях изучали способность вируса размножаться в клетках по наличию или отсутствию цитопа-тоге,иного эффекта. При отсутствии ЦПЭ титрованием определяли степень инфекционное™ зараженных культур. Клетки -при этом разрушали замораживанием н отташванием.

Проведенные опыты показали, что чувствительные и нечувствительные клеточные системы по-разному реагируют с интактным вирусом и его рибонуклеиновой кислотой. РНК и эквивалентное по инфеюционности количество вируса регулярно вызывали ЦПД в культурах СПЭВ, ПТ, КПТ.

Иная картина отмечена при заражении культур клеток ПЦ, ФЭК, ПЖ и L. Если РНК была способна реплицироваться в этих культурах, а в некоторых опытах вызывала специфическое ЦПД, то нативиый вирус в них не размножался, что установлено отсутствию ЦПД, а также по .сравнительному определению количества вируса в культуре до и после инкуйации при температуре 37° и .поэтапного титрования материала.

Сравнительное изучение динамики репродукции вируса в нечувствительных клетках показало, что /при инфицирования клеток вирусной РНК через 5—б часов после культивирования при температуре 37е титр «»руса возрастал на 3 логарифма и выше. Репродукция вируса в этих культурах происходила только в течение одного цикла. Вновь образовавшиеся вирусные частицы сохраняли основные генетические признаки и свойства родительского штамма (способность к размножению и бляшкообразованию в чувствительных клетках, патогеность и вирулентность для лабораторных животных, антигенные свойства). При ивфициррваяии нечувствительных клеток нативным вирусом его титр оставался 'Прежним или несколько уменьшался относительно внесенного в культуру при заражении, то есть репродукция вируса не .происходила.

Таким образом, -проведенные исследования показали, что как чувствительные, так и нечувствительные клет;ги способны синтезировать компоненты вируса ящура, то есть нечувствительность клеток к вирусу ящура нельзя объяснять неспособностью их синтезировать компоненты вируса. Нами впервые показана возмЬжность инфицирования клеток почек жеребят рибонукелиновой кислотой вируса ящура.

Начальные стадии, взаимодействия вируса ящура .с клетками и факторы, влияющие на эти процессы

По данны-м ряда авторов (J. J. Holland, L. С. McLaren, 1961; Ю. 3. Гендона, 1963; М..И. Бисеновой и др., 1969) эн-

теровирусы способны адсорбироваться только на тех клетках, в которых они размножаются. Такого же мнения придерживались в отношении вируса ящура F. Brown (1962) и В. А. Сергеев (1966), Однако имеются сообщения о том,что некоторые вирусы н фаги сравнительно одинаково адсорбируются и на чувствительных и на резистентных клетках (К. Hodak, М- Nernec, 1973; Р. М. Артн-рова и др., 1974). Также разноречивы и данные по влиянию на процесс адсорбции температуры, периода контакта вируса с клетками, множественности инфицирования и ряда других факторов.

Для изучения этого вопроса проводили опыты с вирусом ящура типа А (вариант As?, клон 432/6), В качестве чувствительных к вирусу ящура использовали перевиваемые линии клеток СПЭВ, КПТ, первично т р ime и н и зи р о в a i ш ы е и субкультуры ПТ, ПК; в качестве нечувствительных — первично трипсиннзнрованные клетки ПЦ, ФЭК, ПЖ, а также эритроциты барана и морской свинки.

.Вирус адсорбировали на суспендированных клетках при 37° в течнене 1 —1,5 часов. Адсорбционную способность определяли по разнице количества его до и'после адсорбции, что выявляли путем титрования вирусного материала. Исследования показали, что чувствительные к вирусу клетки (СПЭВ, ПТ, КПТ), малочувствительные (ПК) и совсем нечувствительные (ФЭК, ПЦ, ПЖ, эритроциты) адсорбируют, примерно, одинаковое количество вируса. Так, клетки ПТ, КПТ и ПЖ адсорбировали соответственно 96, 93 и 93%, а клетки СПЭВ, ПК, ФЭК — 90% вируса. Клетки почек цыплят и эритроциты адсорбировали 84 и 80% внесенного вируса. Однако характер адсорбции был различным. Если на чувствительных клетках вирус адсорбировался необратимо (специфическая адсорбция) и не ннактивпровался ацетатным буфером, то па резистентных клетках он адсорбировался обратимо (неспецифическая адсорбция) и мог быть инактивиро-ван ацетатным буфером.

Опыты ло изучению влияния температуры на процесс адсорбции вируса на клетках показали, что титр (вируса, адсорбированного на клетках СПЭВ и ФЭК .при 37° составлял 5,0 Ig ТЦД50/мл, на -клетках ПЖ — 4,2 lg ТЦДго/мл, а при 4° — соответственно 5,0; 4,5 и 4,2 Ig ТЦД5о/.чл. Следовательно, вирус ящура примерно одинаково адсорбировался при 37 и 4° на чувствительных и нечувствительных клетках. Однако характер адсорбции был различным. После обработки клеток ацетатным буфером инфицированными оказались лишь клетки СПЭВ, инкубированные с вирусом при 37°> -а при 4° инфекционный вирус не обнаружен ни в клетках СПЭВ, ни в клетках ФЭК и ПЖ-12

Влияние периода контакта вируса с клетками на процесс их взаимодействия изучали на клетках СПЭВ методом бляшек, по проявлению ЦПД и конечному накоплению вируса. После определенного срока адсорбции вируса три 37° клеточный моиослой трижды отмывали ацетатным буфером и однократно .раствором Хенкса (рН—7,6). Затем'во флаконы с инфишированой культурой вносили агаровое покрытие и инкубировали лри 37°. Опыты показали ,что за 5 минут количество адсорбированного вируса достигло 5,2 БОЕ/мп. Для максимальной адсорбции вируса {5,87 ^ БОЕ/мл) потребовалось 60 минут. Необходимо отметить, что даже за 5 секунд происходила необратимая адсорбция вируса, то есть он проникал внутрь клеток и реплицировался, однако сроки появления цитопатического действия и лолиого разрушения монослоя затягивались, а количество образовавшегося вируса было сравнительно небольшим (титр 4,5 ^ ТЦД^мл)! С увеличением периода адсорбции сроки начала и полного развития ЦПД сокращалась. Опыты с суспендированными культурами клеток КПТ показали, что адсорбция «а них вируса заканчивалась в основном в течение 5 минут. За этот срок около &5% вируса связывалось с клетками. Увеличение лери-ода контакта до 60 минут существенно не влияло на результаты адсорбции вируса "на клетках.

Изучение влияния .множеств ем мост и инфицирования лро-водили на суспендированных клетках КПТ. Для заражения брали дозы вируса от 0,0003 до 31,62 ТЩЬо/кл, Результаты исследований локазали, что лри увеличении множественности инфицирования количество адсорбированного вируса увеличивается. В то время (процентное отношение его к исходному вирусу снижается. П>ри увеличении дозы вируса, взятого для ззражения, в 100 тыс. раз, количество адсорбированного вируса увеличивается лишь в 2 тыс- раз. Следовательно, вирус ящура имеет определенный предел адсорбции для каждой дозы заражения на чувствительных клетках.

Опыты ло многократной адсорбции новых порций вируса на одних и тех же клетках (5 циклов по 1 часу при множественности заражения 0,! ТЦД50/кл) «оказали, что с увеличением числа адсорбций количество неадсорбированнога вируса после каждой последующей адсорбции увеличивается. После первой адсорбции количество неадсорбированнопо вируса составляет 0,15%, после второй — 3,13%, а после пятой — уже 10,0%. Суммарное же количество вируса, адсорбированного -клетка-ми и лроникшего в них, увеличивается госле каждого цикла адсорбции. Таким образом, с возрастанием числа адсорбций уменьшалось количество адсорбированного вируса в каждой последующей новой порции, одна-

ко суммарное количество вируса, адсорбированного па клетках к проникшего в них, увеличивалось с каждым циклом адсорбции.

Опыты по изучению влияния целостности оболочек клеток на способность их адсорбировать вирус ящура 'Проводили ;на суспензионных культурах клеток КГ1Т, СГ1ЭВ, ФЭК и ПЖ. Клетки разрушали 4-кратным замораживанием и оттаиванием, ультразвуком или путем растирания в фарфоровой ступке с песком, В качестве контроля использовали неразрушенные живые клетки. Исследовашиям.и установлено, что чувствительные н нечувствительные как живые (неразрушенные), та.к и разрушенные клетки (детрит) сравнительно одинаково адсорбируют вирус ящура. Однако определение характера адсорбции обработкой* живых клеток и их детрита ацетатным буфером показало, что чувствительные клетки п их детрит способны необратимо связывать вирус, в то время как резистентные клетки и их детрит связывают вирус обратимо.

Таким образом, проведенные исследования .позволяют заключить, что целостность оболочек клеток не оказывает существенного влияния на их адсорбирующую способность по отношению к вирусу ящура.

Результаты изучения вопросов адсорбции и репродукции вируса ящура можно использовать при создании оптимальных условии для получения и наибольшего ■накопления вируса ящура в культуре клеток лрн производстве противо-кщу.риых вакцин.

Изучение механизмов, обусловливающих чувствительность и резистентность клеток различных видов животных к вирусу ящура.

а) Изучение наличия и природы вирусных рецепторов у клеток,

В. Яоктап (1962), I. га]ас, И. Ь. Сго\уе11 (1965), В. М. Жданов, С. Я. Гайдамовнч (1966), Ь. РЫНрйоп а1. ((968) в своих работах показали, что у клеток животных существуют рецепторы и обработка лротеолитическими ферментами подавляет их функциональшоу активность, приводя к нарушению или прекращению адсорбции энтеровнрусов и аденовирусов.

В связи с тем, что по указаному вопросу, применительно к вирусу ящура, данные отсутствуют, перед нами была поставлена" задача изучить имеются ли такие рецепторы у клеток к вирусу ящура и выяснить их природу и местонахож-14

дение. С этой целью вирус ящура адсорбировали на ¡слетках, обработанных различными ферментами животного и растительного происхождения. В опытах использовали следующие протеолитическне ферменты: трипсин кристаллический, тер-рнзин ПК (шт. 3374) в концентрациях 1—10 мг/мл, ори-зин ПК (шт. 472—И) в концентрации 1—1,5 мг/.мл и проназу в концентрации 1 мг/мл. Клетки инкубировали с ферментами при температуре 37° в течение 90 мим. при постоянном перемешивании на мапнитной мешалке. По истечении срока инкубации центрифугированием удаляли растворы ферментов, клетки отмывали раствором ГЛА и заражали вирусом ящура в дозе 1—3 ТДДи/кл. Адсорбцию вируса проводили в течение 60 мин. при температуре 37° и постоянном перемешивании- Зараженные клетки после адсорбции отмывали раствором ГЛА или ацетатным буфером (рН—5,3) 12—15 мин. и разрушали ультразвуком. В качестве контроля использовали необработанные ферментами клетки.

, Опыты доказали, что после обработки различными ферментами клетки утрачивают способность связывать вирус. Обработка же клеток одновременно или после адсорбции вируса не оказала' существенного влияния на инфицирование их.

Следовательно, указанные ферменты разрушают или ина-ктивнруют у клеток определенные структуры, ответственные за специфическую адсорбцию вируса ящура — вирусные рецепторы клеток

В ряде опытов изучали возможность восстановления (реактивации) инактнвированных оризином и трипсином вирусных рецепторов клеток. Для этой цели после обработки клеток ферментами последние удаляли, а суспендированные клетки инкубировали в среде ГЛА с 10% сыворотки крупного рогатого скота при температуре 37°. По истечении различных сроков инкубации клетки инфицировали вирусом ящура, отмывали ацетатным буфером и определяли количество вируса,, проникшего в клетки.

Исследования показали возможность восстановления (реактивации) рецепторов клеток. Сроки реактивации зависели от применяемого фермента. После инактивации рецепторов клеток трипсином, для полной их реактивации требовалось 8, а после инактивации оризином — до 24 часов.

Полученные данные показывают, что свежеизолпроваи-ные с применением протеолитнческих ферментов клетки не являются подходящими для использования с целью получения высоких урожаев вируса. Для более полной адсорбции

вируса -необходимо такие клетки выдерживать а питательной среде с сывороткой в течение 24 часов.

Опыты но определению природы рецепторов показали, что прогревание клеток при 56°, обработка оризином и этиловым эфиром приводит к подавлению их рецепторной активности. Эфир экстрагирует лишиды, а ори зил, трипсин и герризии обладают протеолнтпческнмп свойствами- Полученные данные позволяют полагать, что -вирусные рецепторы клеток представлены лнпонротендами.

Исследования по определению .местонахождения вирусных рецепторов клеток показали, что последние ограничиваются клеточной поверхностью, так как разрушение клеток не повышало вируссвязывающей активности и разрушенные после обработки ферментами клетки не обладали вируссвязывающей способностью.

Для подтверждения местонахождения рецепторов клеток ■проводили опыты с живыми и разрушенными клетками, а также с субклеточными фракциями (ядрами, митохондриями, мпкросомами), выделенны-ми методом дифференциального центрифугирования. Проведенные исследования показали, что вирус специфически адсорбировался на живых и 'разрушенных клетках. Клеточные фракции не обладали специфической адсорбцией.

Таким образом, .проведенные исследования показали, что чувствительные клетки имеют специфические рецепторы, способные необратимо связывать вирус ящура. Эти рецепторы имеют ли:по троте н д ну ю природу, так как их ннактивируют протеолнтические ферменты и этиловый эфир, растворяющий ЛИ.ПМДЫ. Местонахождение специфических рецепторов ограничено клеточной оболочкой.

По нашему мнению, видовая невосприимчивость с значительной мере зависит от отсутствия таких .рецепторов у клеток н неспособности вирусов необратимо адсорбироваться па клетках.

б) Изучение наличия специфических рецепторов у вируса ящура.

Для инактивации специфических рецепторов вируса ящура в опытах использовали протеолнтические ферменты: трипсин, орнзип и пролазу. После смешивания равных объемов предварительно отцентрнфугированной вирусной суспензии и раствора фермента определенной концентрации, смеси выдерживали при температуре 37° и постоянном пере-мешванни необходимое время. Результаты опытов показали, что оризин л концентрации от 50 до 1500 мкг/мл приводит к

значительному снижению ннфешиопности вируса (на 0,7 — 1,5 ¡5 ТЦДго/'Мл). Аналогичные результаты получены и при обработке вируса ящура другими протеолитпчсскими ферментами. Обработка вируса проназон понижала его инфек-цинность с 6,0 ТЦД50/мл до 5,0 ТЦД50/мл, то есть на 90%.

При изучении влияния на вирус ящура трипсина нами дополнительно изучено содержание в нем инфекционной РНК- Исследования ¡показали, что обработка вируса ящура трипсином (1000 мкг/мл) в течение 15 минут при температуре 37° привела к существенному снижению его пнфекцнонно-сти (на 96,89%). Адсорбция обработанного в тех же условиях вируса на клетках .показала, что в них проникает лишь незначительное количество его (0,25%) по сравнению с контролем. В то же время из вируса, обработанного трипсином, выделяли инфекционную РНК в титре незначительно отличающимся от контроля.

Та'ким образом, проведенные опыты показали, что обработка вируса протеолити чески ми ферментами приводит к значительному снижению его инфекциошюсти и способности проникать в чувствительные клетки, однако с сохранением биологической активности вирусной РНК, то есть такая обработка понижает не собственно инфекционность вируса, а его способность связываться и проникать в клетки за счет инактивации поверхностных протеиновых структур — рецепторов.

Полученные данные по изучению некоторых биологических свойств вируса ящура и его РНК, а также механизма их взаимодействия с чувствительпы-ми и резистентными клстка-мфожно попользовать для более эффективной репродукции вируса при изготовлении средств специфической профилактики. Кроме того, результаты исследований будут способствовать изысканию путей неспецифической профилактики и химиотерапии ящура.

ВЫВОДЫ

1- При культивировании вируса ящура А22 в однослойны,х культурах меток ПЭК, ПТ и СПЭВ синтез новой инфекционной РНК осуществляется через 1 час, а формирование но-бсго зрелого вируса начинается через 80—90 минут после ею адсорбции на клетках. Вирус в этих культурах накапливался в максимальном титре соответственно через 4 и 6 часов.

2. Корреляции между накоплением инфекционного титра

Д7

и к амл л е м с [ J тс в этз ы в а юще го антигена не установлено. С увеличенном сроков культивирования до 22 часов титр вируса понижался, а комплементсвязывающая активность повышалась.

3. Штаммы вируса ящура варианта А^ — .Vi 432, 470, 490 и выделенная из них инфекционная РНК отличаются по своим бляшкообразующим свойствам на различных культурах клеток- Вирусные популяции штаммов генетически " неоднородны,

4. Поликатион ДЭАЭ—декстран повышает бляцгкообра-зевание ннтактного вируса и его РНК. Способность ДЭАЭ— дек-страна повышать инфекционный титр РНК проявляется только в изотонических растворах и утрачивается в гипертонических. Полиионные соединения оказывают влияние на оба компонента системы вирус-клетка. Они могут быть использованы [При изучении новых популяций вируса ящура и селекции ингнбнтороустойчнвых вирусных штаммов.

5. Резистентные к вирусу ящура Агг клетки, инфицированные вирусом, лишенным белкового капеида (РНК), способны синтезировать компоненты вируса ящура с последующем формированием полноценных биологически активных вирусных частиц. Репродукция вируса в таких культурах происходит только в течение одного цикла. Вновь репродуцированные вирусные частицы сохраняют основные генетические признаки и свойства родительского штамма.

6. Вирус ящура оди>Й4ово адсорбируется как при температуре 37®, так и при 4° на чувствительных и резистентных к нему клетках, прн этом целостность мембраны не влияет на процесс адсорбции. ,

7. Наивысшая скорость адсорбции вируса на чувствительных клетках отмечена ,в первые 5 минут. Для максимальной адсорбинн его достаточно 60 минут. Для каждой дозы вируса существует определенный предел адсорбции, который увеличивается с повышением ее, однако медленнее, чем возрастает доза вируса. Суммарное количество адсорбированного и троникшего в клетки вируса возрастает с каждым последующим циклом адсорбции на одни., и тех же клетках.

8. Чувствительность клеток к вирусу ящура обусловлена наличием па их поверхности специфических структур — рецепторов. Как ннтактные, так и разрушенные клетки способны адсорбировать вирус. На чувствительных клетках вирус ящура адсорбируется необратимо (специфическая адсорбция), а резистентные клетки н их детрит адсорбируют его обратимо. Отсутствие у нечувствительных клеток специфических вирусных рецепторов препятствует их инфицированию вирусом."

18

9. Вирусные рецепторы клеток СПЭВ имеют лишопротеид-ную .природу и ограничиваются клеточной поверхностью. Клеточные рецепторы вируса ящура комплементарны вирусным рецепторам клеток и имеют .протеиновую структуру.

10. Вирусные рецепторы клеток и комплементарные им рецепторы вируса инактивируются в результате воздействия протеолитических ферментов. Вирусные рецепторы способны регенерироваться в процессе жизнедеятельности клеток. Сроки регенерации зависят от применяемого для их разрушения протеолитичеекого фермента. На свежеизолированных клетках, полученных с использованием протеолитических ферментов, -опещкЬнчески адсорбируется и проникает в них незначительное ■количество вируса. Для более полной адсорбции и проникновения вируса в клетки, последние необходимо выдерживать определенный срок в питательной среде с добавлением нормальной сыворотки крови.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1- Результаты изучения адсорбции и динамики репродукции компонентов вируса ящура в культурах «леток необходимо учитывать в научных и производственных целях при создании оптимальных условий для репродукции вируса и изготовления вакцин.

2. Метод бляшек позволяет проводить разделение популяций вируса на однородные линии и может быть использован для получения более полиой характеристики производственных (вакцинных) и новых эпизоотических вариантов вируса ящура.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Факторы, влияющие на бляшкообразованне вируса ящура и его РНК в культуре ткани. В сб.: Вирусные болезни сельскохозяйственных животных. М., 19^0, ч. I, (соавторы — Лебедев А. И„ Орлов С. Д.).

2- Влияние ДЭАЭ—декстрана и условий культивирования вируса ящура и инфекционной РНК на их бляшкообразую-щую способность. Труды ВИЭВ, М., 1971, т. 39 (соавторы— Лебедев А, И., Орлов С. Д.)." -

3. Взаимодействие вируса ящура с клетками. Журнал «Ветеринария», 1971, 5. (соавтор Лебедев А. И.).

4- Факторы, влияющие на адсорбцию н проникновение

вируса ящура в клетку. Материалы второй Всесоюзной конференция молодых ученых ,по .ветеринарии. Тезисы докладов, М., 1971 (соавтор Лебедев А. И,).

5. Начальные стадии взаимодействия вируса ящура с клетками. Журнал «Сельскохозяйственная биология», 1972, т. VII, I, (соавтор Лебедев А. И.).

6. Особенности взаимодействия различных штаммов вируса ящура с клетками ъ присутствии полинонных соединений* Журнал «Доклады ВАСХНИЛ», 1972, 4, (соавтор Лебедев А. И.).

7, Динамика репликации вируса ящура А2г и его РНК в различных культурах клеток. Бюллетень ВИЭВ, 1972, вып. XIV. (соавторы — Лебедев А. И., Авилов В. С.).

8, Роль вирусных 1ка1псл:да и РНК при инфицировании резистентных к вирусу ящура клеток- Бюллетень ВИЭВ, 1972, вып. XIV.

Материалы диссертации доложены:

1. На 1-й Межвузовской ветеринарной вирусологической конференции, ноя.брь 1970.

2. На второй Всесоюзной конференции молодых ученых по'ветеринарии, декабрь 1971.

3. На заседании Ученого совета ВИЭВ, июнь 1973.

Ответственный за выпуск автореферата — кандидат ве терииарных наук Е. Л, Салажов,

Заказ 670 Тираж 200

Типография Московской ордена Тру да йог о Красного Знамени ветеринаркой академии имени К. И. Скрябина