Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Использование белково-полисахаридного антигена для выявления антител к микобактериям туберкулеза

На правах рукописи

РГБ ОД 3 С ».'¿Я 2ЛСЗ

Шимолина Надежда Олеговна

1спользование белково-полисахаридного антигена для выявления антител к микобактериям туберкулеза

16.00.03 - ветеринарная микробиология,вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Новосибирск 2000

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока

СО РАСХН

Научный руководитель

доктор ветеринарных наук, профессор В.М. Чекишев Научный консультант

кандидат ветеринарных наук,

старший научный сотрудник H.A. Донченко

Официальные оппоненты

доктор ветеринарных наук,

старший научный сотрудник Ю. И. Смолянинов кандидат ветеринарных наук, доцент С.Н. Магер

Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исследовательский

институт бруцеллеза и туберкулеза животных ВНИИБТЖ, г. Омск

Защита диссертации состоится «/^» июня 2000 г.

в_часов на заседании диссертационного совета Д.020.23.01. Института

экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН (630500, Новосибирская область, п. Краснообск, ИЭВСиДВ)

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО РАСХН Автореферат разослан « » 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор ветеринарных наук иг-с-^—/ " ' A.A. Самоловов

/7 /73. Я/Ь, 9tl~ Ь<0

1. Характеристика работы.

1.1. Актуальность темы.

Из инфекционных болезней крупного рогатого скота туберкулез наносит значительный экономический ущерб за счет снижения продуктивности животных, ухудшения качества продукции, преждевременной выбраковки больных животных и высоких затрат на противотуберкулезные мероприятия.

Проблема профилактики и ликвидации туберкулеза актуальна для многих регионов России, несмотря на осуществляемые ветеринарно-санигарные мероприятия ежегодная заболеваемость крупного рогатого скота туберкулезом составляет около 2% от имеющегося поголовья (В.М. Авилов, В.Ф. Пылинин, 1992).

Одной из особенностей возбудителя туберкулеза является бактерионосительство. Клинические признаки болезни у крупного рогатого скота проявляются при длительном течении инфекции, особенно при неблагоприятных условиях содержания животных.

Для прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в нашей стране используется аллергический способ выявления сенсибилизированных возбудителем туберкулеза животных путем внутрикожного введения ППД туберкулина для млекопитающих. Недостатком способа является выявление значительного количества животных, неспецифически реагирующих на внутрикожное введение туберкулина из-за инфицирования организма животных атипичными микобактериями. При этом для постановки диагноза, особенно в благополучных по туберкулезу хозяйствах, необходимо проведение пато-морфологических и бактериологических исследований с учетом эпизоотических данных и клинических наблюдений. При послеубойном осмотре реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота не всегда удается установить специфические для этой болезни изменения во внутренних органах и тканях животного (А.И. Кузин, 1980).

Бактериологические исследования на туберкулез проводятся в срок до 3-х месяцев, а в некоторых случаях они могут занимать более длительное время.

Из серологических методов диагностики туберкулеза животных наиболее апробирована в ветеринарной практике реакция связывания комплемента с антигенами СибНИВИ и УкрНЙВИ р. Д. Лакман, 1980; IOJL Кассич, 1984). Однако эта реакция из-за невысокой чувствительности является ориентировочной и для массовых исследований не нашла применения (АХ Найманов и др., 1990).

В связи с этим создание высокочувствительных экспресс-методов выявления инфицированных возбудителем туберкулеза животных продолжает оставаться актуальной проблемой и является одним из важнейших направлений научных исследований по туберкулезу.

Высокочувствительный непрямой вариант иммуноферментного анализа (ИФА) для серологической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота апробирован отечественными и зарубежными исследователями (Е.В. Маслов и др., 1986), однако широкого применения в ветеринарной практике не нашел.

Возможность выявления иммуноферментным методом малых количеств антигена в исследуемом материале, а также специфических антител в сыворотке крови представляет большой интерес при использовании ИФА для диагностики туберкулеза (Т.Р. Якупов, 1991).

Для получения достоверных результатов с помощью высокочувствительных методов исследования необходимо использование высокоспецифичных реагентов, основными из которых в ИФА являются антиген и конъюгат антивидовых антител.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлась разработка нового способа диагностики туберкулеза крупного рогатого скота на основе ИФА и моноклональных антител. Исходя из этого на разрешение ставились задачи:

1) Разработать методику изготовления специфических антигенов из микобакте-рий туберкулеза бычьего вида, из вакцинного штамма БЦЖ и атипичных ми-кобактерий.

2) Дать сравнительную оценку чувствительности и специфичности различных вариантов ИФА с полученными микобактериальными антигенами, а также с бактериологическим методом, включающим биопробу на морских свинках.

3) Определить оптимальные условия для проведения ИФА с полученными реагентами, а также возможность понижения интенсивности фоновых реакций.

4) Определить место экспресс-метода диагностики туберкулеза с использованием ИФА в системе дифференциальной диагностики туберкулеза в стадах крупного рогатого скота.

1.3. Научная новизна. Получен комплексный белково-полисахаридный антиген из М.Ьктэ, обладающий высокой активностью в ИФА с контрольной положительной сывороткой. Непрямой вариант ИФА с указанным антигеном апробирован при исследовании сыворотки крови из неблагополучных по туберкулезу хозяйств Новосибирской области.

Разработан и- апробирован новый комбинированный иммунопреципита-ционный тест на основе ИФА.

Показана высокая специфичность и информативность ИФА сыворотки крови крупного рогатого скота при выяснении эпизоотической ситуации хозяйств по туберкулезу.

1.4. Практическое значение работы. Разработана методика изготовления специфических антигенов из микобактерий бычьего вида и вакцинного штамма БЦЖ. Белково-полисахаридный антиген из вакцинного штамма БЦЖ дает минимальные фоновые реакции в непрямом варианте ИФА.

Экспресс-метод серологической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в ИФА может быть использован для оценки эпизоотической ситуации в благополучных по этой инфекции хозяйствах, где отмечены случаи реагирования животных на ГТПД туберкулин для млекопитающих

1.5. Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы ветери-

нарии» ( г.Новосибирск, 1997); на международной научно-практической конференции «Зооантропонозные болезни, меры профилактики и борьбы» (г.Гродио, 1997); Научно-практической конференции «Основные научные исследования по проблеме туберкулеза и бруцеллеза сельскохозяйственных животных, профилактика и организация мероприятий по ликвидации болезней в регионе Сибири» ( Новосибирск, 1995); на научно-практической конференции «Молодые ученые времени. Проблемы Сибирской аграрной науки» (Новосибирск, 1997); на III Межвузовской научно-практической конференции «День земли» (г. Бийск, 1997); на научной конференции, посвященной 50-летию Алтайской НИВС (г. Барнаул, 1997); на заседании секции инфекционной патологии ИЭВСиДВ (Новосибирск, 1997).

1.6. Публикации результатов исследований.

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ.

1.7. Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 131странице машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, заключение, выводы, практические предложения, литература и приложение.

Список литературы содержит 296 отечественных и зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами.

Работа была выполнена в лаборатории биотехнологии и лаборатории по разработке мер борьбы с туберкулезом животных ИЭВСиДВ СО РАСХН с 1994 по 2000 гг., сотрудникам вышеназванных лабораторий выражаю глубокую благодарность и признательность за техническое содействие на всех этапах выполнения работы.

1.8. Основные положения, выносимые на защиту.

1) Режим изготовления белково-полисахаридного антигена из бычьего штамма микобактерий туберкулеза и его использование для выявления антител к возбудителям туберкулеза в серологических реакциях (РИД, ИФА).

2) Усовершенствование техники выполнения непрямого варианта иммуно-ферментного анализа с разработанным антигеном для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

3) Результаты сравнения ИФА и бактериологического исследования, включающего биопробу на морских свинках при постановке диагноза на туберкулез.

2. Материалы и методы исследований. Работа выполнена в 1994 по 2000 гг. в лаборатории биотехнологии, лаборатории по разработке мер борьбы с туберкулезом животных ИЭВСиДВ СО РАСХН и в хозяйствах Новосибирской области (Куйбышевский, Усть-Таркский, Карасукский и Новосибирский районы), Северо-Казахстанской области республики Казахстан (г. Петропавловск).

Использовали пробы сывороток крови крупного рогатого скота (реагирующего и нереагирующего на туберкулин) из благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйств.

С целью выяснения эпизоотического состояния хозяйств по туберкулезу крупного рогатого скота, в которых проводились исследования, изучали данные Карасукского, Петропавловск-Казахского мясокомбинатов и результаты аллергических исследований скота за 1994-1997 гг. в 27 хозяйствах Новосибирской области.

Кровь брали из яремной вены животного. Отстаивали в течении 10-12 часов в темном месте, сыворотку отделяли от сгустка крови и хранили ее при +4°С.

Бактериологически исследовали биоматериал, полученный из Карасукского и Куйбышевского районов, в соответствии с «Наставлениями по диагностике туберкулеза животных» (утв. ГУВ Госагропрома СССР 1976, 1986) и согласно «Указаниям по лабораторной диагностике туберкулеза» (М., 1988).

Биоматериал исследовали от 58 животных. Бактериологическое исследование его проводили с целью выделения возбудителя туберкулеза. Исследуемый биоматериал получили от 40 коров, поступивших на Карасукский мясокомбинат (г. Карасук), а также пробы, поступившие для анализа в Куйбышевскую ветеринарно-бактериологическую лабораторию (г.Куйбышев, Новосибирской области). В опытах были использованы морские свинки живой массой 300-500 грамм (20 голов). Для культивирования микобактерий туберкулеза использовали плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена, Финн-2 и Фаст (любезно предоставлена ВНИИБТЖ, г.Омск), а также глицериновый картофель по Павловскому и безбелковую жидкую среду Сотона.

Порядок и правила отбора проводили согласно «Наставлению по диагностике туберкулеза животных» (ГУВ МСХ СССР 25.02.86).

В качестве тест-сывороток использовали положительную в РСК сыворотку Курской биофабрики и сыворотки крови искусственно инфицированных животных из ВНИИБТЖ и ИЭВСиДВ.

Отрицательным контролем служили эмбриональная сыворотка и сыворотка крови коров из благополучных по туберкулезу хозяйств Новосибирской области (совхоз «Пашинский», ОПХ «Элитное»).

Конъюгаты были изготовлены из моноклональных антител к Н-цепям крупного рогатого скота. ИФА выполняли на иммунологических полистироловых планшетах отечественного производства (химкомбинат «Енисей», г.Красноярск).

Белково-полисахаридный антиген из БЦЖ выделяли с помощью методики, разработанной в лаборатории биотехнологии ИЭВСиДВ (лизирование в щелочной среде, кислотный гидролиз и последующее осаждение спиртом).

Для изготовления антигенов использовали 14 и 8 штаммы М.ЬоуЬ (ВНИИБТЖ), атипичные штаммы М.аушт, М.тиасе11и1агае, М.БП^тайз, М.5эгиийШ1 (ВГНКИ) и вакцинный штамм БЦЖ (Ставропольский НИИ вакцин и сывороток).

Атипичные штаммы микобактерий выращивали на среде Павловского (глицериновый картофель) и Сотона (безбелковая) в лаборатории по разработке мер борьбы с туберкулезом сельскохозяйственных животных ИЭВСиДВ.

В исследованиях использовали непрямой вариант ИФА (А.М. Егоров и др., 1991). К иммобилизированному антигену добавляли исследуемую сыворотку и после инкубации и удаления не связавшихся компонентов сыворотки, специфические иммунные комплексы выявляли с помощью меченных ферментом (пероксидаза хрена) антивидовых антител (антитела мыши к крупного рогатого скота).

Данная схема является одной из наиболее распространенных для ИФА и обладает универсальностью меченного реагента, что дает возможность выявлять атигела к различным антигенам. Антивидовой конъюгат из моноклональных антител получен в лаборатории биотехнологии ИЭВСиДВ (Р.З. Файзулин, 1996).

В РИД использовали 1% бактоагар (Германия) и 0.8% агар отечественного производства. Антиген использован в РИД в разведении 1:50 (белково-полисахаридный антиген из вакцинного штамма БЦЖ и атипичных микобактерий : M.aviит, М.1п1гасе11и1агае, М.Бп^тайз, М.ГоПшШт) по 20 мкл, положительным контролем служила РСК положительная сыворотка.

Исследуемые сыворотки и контроль вносили по 40 мкл. После помещения во влажную камеру учет реакции проводили через 24 и 48 часов.

При проведении непрямого варианта ИФА лунки иммунологического планшета-сенсибилизировали белково-полисахаридным антигеном (1:100) в карбонатном буфере, содержащим ЗМ №С1, рН 12.0 в течение 15 минут. После удаления сенсибилизирующего раствора планшет отмывали дистиллированной водой трехкратно. В каждую лунку вносили по 10 мкл блокирующего буфера (цельный молочный блокатор, рН - 8.6), затем вносили исследуемые пробы сывороток крови в разведении 1:50 в 10% ЫаС1 на 30 минут. После 3-х кратного отмывания дистиллированной водой в лунки вносили рабочее разведение конъюгата. Разводили конъюгат 1:1000 бикарбонатным буфером с твином (рН -9.6) и вносили по 100 мкл в каждую лунку. Через 30 минут лунки планшета отмывали 3-х кратно дистиллированной водой и 2-х кратно ФСБ с 0.05% Твин-20. В лунки вносили по 100 мкл субстратной смеси 0.05 %-го раствора ортофе-нилендиамина в 0.5 М №-цитратном буфере, рН-5.2 (перед применением на 10 мл раствора вносили 3 мкл 33%-ной перекиси водорода).

Реакцию останавливали после четкого окрашивания положительного контроля внесением в каждую лунку 50 мкл 6М раствора серной кислоты. Учет реакции проводили визуально и спектрофотометрически при 490 км.

Бактериологический посев из пораженных заглоточных лимфатических узлов делали по общепринятой методике.

Обработку биоматериала проводили по методу А.П. Аликаевой в лаборатории по разработке мер борьбы с туберкулезом сельскохозяйственных животных (ИЭВСиДВ).

Мазки окрашивали по Цилю-Нильсену и микроскопировали. Для биопробы использовали морских свинок, предоставленных лабораторией туберкулеза (ИЭВСиДВ). Вводили суспензию из пораженных лимфатических узлов коров подкожно в области паха в объеме 1 мл, через 2 месяца свинок исследовали в аллергической пробе с ППД туберкулином для млекопитающих в дозе 25 МЕ в объеме 0,1 см3 стерильного физического раствора. Наблюдали за свинками 90 суток, оставшихся живыми убили и провели их патологоанатомическое и бактериологическое исследование.

Исследуемая сыворотка считалась положительно реагирующей в ИФА, если титр специфических противотуберкулезных антител в 2 или более раз превышал показатель контрольной отрицательной сыворотки.

Специфичность полученных антигенов изучали в динамике в РИД в агаровом геле с РСК - положительной сывороткой крупного рогатого скота, а также комбинированном нммунопреципитационном тесте (КИТ). 3. Результаты собственных исследований.

3.1. Факторы, влияющие на специфичность и чувствительность непрямого варианта ИФА и их оптимальное сочетание.

Общепринятые серологические методы диагностики туберкулеза не используются в ветеринарной практике из-за недостаточной чувствительности.

Наиболее специфичные реагенты для иммуноанализа готовят на основе моноклональных антител.

Перед нами стояла задача определить факторы, влияющие на специфичность и чувствительность непрямого варианта ИФА. Дальнейшая работа проводилась в трех направлениях: увеличение чувствительности реакции, устранение неспецифических реакций в исследуемых пробах от инфицированных животных, усовершенствование методики постановки реакции. Критерием оценки была избрана прежде всего воспроизводимость результатов реакции.

Специфическую активность антигена проверяли в непрямом твердофазном варианте ИФА, основанном на определении специфических иммунных комплексов.

Рабочее разведение конъюгата готовили после предварительного титрования нормальной сыворотки крови крупного рогатого скота в прямом варианте ИФА. Титр конъюгата определяли в реакции с антигеном .

В горизонтальные ряды планшета в течение 30 минут при комнатной температуре сорбировали разведения нормальной сыворотки крупного рогатого скота в бикарбонатном буфере (карбонат-бикарбонатный буфер: 5.28 г/л №2Со3, 4.2 г/л ЫаНСОЗ вносили до полного растворения в небольшой объем дистиллированной воды и доводили до 1000 мл дистиллированной водой) в разведениях 1:10, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 и 1:1000. Последний ряд-контроль конъюгата. В вертикальные ряды вносили разведения конъюгата 1:100, 1:200,1:400,1:800, 1:1000,1:1600,1:3200.

В соответствии с показателями оптической плотности при раститровке нормальной сыворотки в прямом варианте ИФА оптимальным титром конъю-

гата являлось разведение 1:1000. Все последующие исследования с применением непрямого варианта ИФА проводили с использованием конъюгата в этом разведении.

Хранили конъюгат в виде суспензии в полунасыщенном растворе сульфата аммония при 4°С или под 20% раствором глицерина при -16°С ( Angel Montoya ant Jose V.Casstell, 1987).

Титр антигена определяли в ИФА с контрольной положительной сывороткой. В качестве тест-сывороток использовали положительную в РСК сыворотку Курской биофабрики и сыворотки крови искусственно инфицированных животных (предоставлены ВНИИБТЖ, г. Омск). Отрицательным контролем служили эмбриональная сыворотка крови телят и коров из благополучных хозяйств Новосибирской области (совхоз «Пашинский», ОПХ «Элитное»).

В вертикальные ряды планшета вносили разведения белково-полисахаридного антигена из БЦЖ в бикарбонатном буфере, рН-9.6 и сорбцию антигена проводили при 4°С в течение 16 часов.

В горизонтальные ряды планшета вносили оптимальное разведение контрольной положительной сыворотки крупного рогатого скота в бикарбонатном буфере, рН-9.6 и инкубировали 30 минут при комнатной температуре.

Наилучшие показатели мы получили при разведении антигена 1:100.При разведении антигена меньше 1:100 наблюдали незначительное увеличение чувствительности реакции, но понижение специфичности, а при повышении титра более 1:100 - значительное снижение её чувствительности.

Установив титр антигена, мы определили оптимальное время связывания антигена с планшетом. Описанные в литературе pH буфера для антигена соответствуют значению 9.6, которые мы взяли за исходный (табл. 1).

Дальнейшее увеличение времени инкубации не повышает чувствительность реакции, а, напротив, ведет к повышению фоновой окраски и, следовательно, к понижению чувствительности.

Оптимальное разведение антигена 1:100 сорбировали в течение периода от 5 минут до 16 часов при 4°С в бикарбонатном буфере с pH - 9.6 ирН -12.0. При длительности инкубации антигена (I час и более) наблюдали снижение чувствительности реакции. Оптимальный результат получали при инкубации антигена до 15 минут при pH -12.0, после чего чувствительность реакции снижалась.

После установления оптимальных титров конъюгата и антигена для получения стабильных результатов с заведомо известными сыворотками от положительно- и отрицательно реагирующих на туберкулез животных, отработали режим выполнения непрямого варианта ИФА. Буфер для сорбции антигена (рН-12,0) позволяет увеличить специфичность анализа почти в 2 раза по сравнению с обычным бикарбонатным буфером для сорбции антигена (pH- 9.5, сорбция 16 часов при t +4°С), причем оптимальный период сорбции при использовании указанного буфера составляет 15 минут.

Таблица 1

Интенсивность проявления ИФА с положительной контрольной сывороткой в зависимости от времени сорбции антигена на планшет (единицы оптической

плотности)

Время сорбции (мин) Буферные системы

РН 9.6 РН 12,0

5 - 0,932

10 0,348 1,113

15 0,370 1,248

30 0,540 1,238

45 0,634 0,832

60 0,877 0,655

16 час 1,266 0,322

Разработка и применение высокосолевого щелочного буфера (ЗМ ЫаС1, рН - 12.0) для сенсибилизации планшет белково-полисахаридным антигеном из БЦЖ увеличило интенсивность положительной реакции сорбции и чувствительность реакции в сравнении со стандартными условиями.

Высокая концентрация №0 в сорбирующем буфере при значительном повышении чувствительности не стимулировала появление фоновых реакций. Различия интенсивности окраски при исследовании положительных и отрицательных сывороток крови были настолько велики, что легко поддавались визуальной оценке.

Для понижения показателей фоновых реакций с контрольными сыворотками мы увеличили титр исследуемой сыворотки до 1:50, ввели в схему обработку блокатором сорбированного на планшет антигена, изменили состав субстратной смеси, увеличили кратность отмывания на всех этапах анализа до 3-х дистиллированной водой. При этом мы достигли некоторого понижения уровня фоновых реакций, но значительно понизилась и чувствительность реакции с положительными контролями.

Для снижения интенсивности неспецифических реакций, особенно при использовании недостаточно очищенных компонентов, мноше исследователи рекомендуют использовать блокаторы. При использовании в ИФА растворов с низкими концентрациями реагентов, остающиеся свободными центры на поверхности носителя необходимо блокировать для уменьшения фонового сигнала. В качестве блокагоров чаще всего используют различные сыворотки крови и детергенты, а также очищенные белковые препараты, которые не могут понлиять на специфическую реакцию антиген-антитело. Блокирующий раствор по 10 мкл вносили в каждую лунку после отмывания от несвя-завшихся антигенов.

Наилучшие результаты были получены при использовании в качестве блокатора обезжиренного молока из благополучного по туберкулезу хозяйства (ОПХ «Элитное») (табл.2).

Таблица 2

Влияние блокаторов на появление фоновых неспецифических реакций _ (единицы оптической плотности) _

Исследуемые пробы ФСБТ с 10% Стерил.сыворот. свиньи Сыворотка крупного рогатого скота, переваренная пепсином Молочный блокатор с детергентом рН-8.6

1 .Слабополож-ая в ИФА сыв-ка крови 0,832 0,692 1,219

2. Слабополож-ая в ИФА сыв-ка крови 0,617 0,804 1,002

3. Слабополож-ая в ИФА сыв-ка крови 0,679 0,709 1,024

4. Отриц-ая в ИФА сыв-ка крови 0,176 0,340 0,114

5. Отриц-ая в ИФА сыв-ка крови 0,182 0,327 0,012

6. Отриц. контроль 0,292 0,325 0,184

7. Полож.контроль 0,917 1,146 0,718

Реакция исследуемой пробы интерпретируется как положительная при превышении оптической плотности в лунке с положительной сывороткой над контрольной отрицательной - более чем в 2 раза и, как сомнительная при соотношении от 1.5 до 2.0. В комбинированном иммуннопреципитационном тесте наибольшую эффективность в качестве блокатора показала сыворотка крови свиньи в разведении 1:200. В непрямом варианте ИФА для этих целей использовали сыворотку крови крупного рогатого скота из благополучного по туберкулезу хозяйства, переваренную пепсином в разведении 1:3. При использовании в качестве блокатора обезжиренного молока из благополучного по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйства (ОПХ «Элитное») был получен стабильный и воспроизводимый вариант ИФА.

При исследовании 255 проб сыворотки крови из благополучного по туберкулезу хозяйства (учхоз «Тулинский») с блокатором из молока, не обработанного пепсином, выявлено 2 пробы, давшие положительную реакцию. При последующей туберкулинизации, проведенной через неделю после серологического исследования, у этих же животных зарегистрировали положительную кожную реакцию. В дальнейшем в качестве блокатора использовали только молочный буфер.

Молочный блокатор готовили по следующей схеме: молоко от здорового животного центрифугировали при 4000 об/мин 20 минут (при температуре 5°С. Образовавшийся слой сливок осторожно удаляли с помощью шпателя и в обезжиренное молоко добавляли азид Ыа до 0.1%, детергент (тритон х 100) до 0.1%, ЮмМтрисаминометана и доводилирН 1МИаОНдо 8.6.

Значительного снижения интенсивности неспецифических реакций мы смогли добиться при использовании указанного выше блокатора и разведении исследуемой сыворотки 1:50 в 10% -ном растворе ЫаС1

В процессе отработки техники постановки ИФА с выше описанными реагентами нами не установлено разницы на всех этапах отмывки планшет отмывающим буфером или дисгилированной водой.

Определение кинетики связывания иммунореактантов позволило нам определить оптимальные длительности стадий: сорбции антигена — 15 минут; сорбции исследуемой сыворотки - 30 минут; связывание конъюгата - 30 минут, что позволило снизить показатель фоновых реакций в разрабатываемом нами варианте ИФА.

Традиционно используемые длительности всех стадий в ИФА от 1 часа и более, как показали наши исследования, не только избыточны, но и приводят к усилению неспецифических реакций.

Мы апробировали варианты с использованием ОФД в концентрации от 0.093 мг/мл до 0.5 мг/мл и установили, что оптимальная концентрация красителя в субстратной смеси находится в пределах от 0.4 - 0.5 мг/мл. Исследования показали, что окрашивание максимально при рН субстратной смеси 5.2 и в конечном варианте ортофенилендиамин растворяли в Ка-цитратном буфере рН-5.2 (50 мкл концентрированного красителя ОФД на 10 мл Ыа-цитратного буфера, содержащего 3 мкл Н2О2).

Для приготовления рабочего раствора субстратной смеси к 10 мл субстратного буфера добавляли 50 мкл концентрата красителя. Предлагаемые нами детали приготовления субстратной смеси позволяют стандартизировать условия проведения анализа и использовать одни и те же реагенты длительный промежуток времени, а также представляют возможность избежать ошибок при взвешивании незначительного (мкг) количества красителя.

Для получения воспроизводимых результатов ИФА в различных тест-системах большое значение имееп отработка режимов инкубации исследуемого материала (сыворотка крови, молоко и др.) с сорбированным на планшете антигеном.

В большинстве используемых тест-системах рекомендуемое время инкубации от 30 минут до 1 часа (Р.А. Хамзин., 1988). Мы определяли зависимость интенсивности изменения единиц оптической плотности при завершении реакции от времени инкубации и разведения исследуемой сыворотки.

Установлено, что наиболее интенсивное взаимодействие антител исследуемых сывороток крови с антигеном осуществляется в первые 30 минут вне зависимости от степени их разведения.

Наиболее удовлетворяющие нас результаты были получены при постановке анализа по следующей схеме: антиген, разведенный 1:100 в карбонатном буфере, рН 12.0 сорбировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем планшет отмывали 3-х кратно дистиллированной водой. После отмывания во все лунки планшета вносили по 10 мкл блокирующего молочного буфера рН -8.6 , затем по 100 мкл исследуемой сыворотки в разведении 1:50 в 10% -

ном растворе №С1. Планшет с внесенными пробами инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут и отмывали 3-х кратно дистиллированной водой. После внесения рабочего разведения коньюгата и инкубации при комнатной температуре 30 минут, проводили 2-х кратное отмывание ФСБТ и 3-х кратное отмывание дистиллированной водой (ФСБ, рН - 7.4 (концентрированный раствор) - 2 г КН2Р04 + 2 г КС1 + 80 г КаС1 + 28.86 г №2НР04 х 12 Н20, растворяли в 500 мл дистиллированной воды). В лунки отмытых планшет вносили субстратную смесь по 100 мкл и инкубировали при комнатной температуре в темном месте 20-30 минут. Для остановки реакции в каждую лунку вносили 50 мкл 6М НгЗОд.

Для определения специфичности отработанной схемы выполнения ИФА исследовали сыворотку крови из благополучного по туберкулезу крупного рогатого скота ОПХ «Элитное». При этом показатель оптической плотности при 490 нм был во всех исследованных пробах в 3-5 раз ниже, чем с положительным контролем.

Отработанная схема выполнения непрямого варианта ИФА была комиссионно апробирована в ИЭВСиДВ. Пробы сыворотки крови из неблагополучных по туберкулезу хозяйств Новосибирской области были зашифрованы и исследованы в РИД, ИФА и КИТ (комбинированный им-мунопреципитационный тест).

Оптимизация условий выполнения непрямого варианта ИФА для выявления инфицированных микобактериями туберкулеза животных позволила в большинстве случаев получать вполне воспроизводимый результат.

3.2. Использование белково-полисахаридного антигена для выявления антител к микобактериям туберкулеза,

3.2.1.Способы получения различных антигенов для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

В 1994 г. был выделен первый антиген из микобактерий, который работал с контрольной положительной сывороткой в РИД в разведении 1:16. Этот антиген, в сравнении с ультразвуковым дезинтегратом ВНИИБТЖ (г.Омск), использовали для сенсибилизации иммуннологических планшет.

За основу получения антигенов был взят способ лизирования микобактерий в щелочной среде додецилсульфатом Ж в присутствии хлороформа. Ли-зирование проводили в течение 20 минут, 3 и 6 часов. Для повышения выхода антигена и его специфичности, частично лизированные микобактерии подвергали гидролизу в 2% -ном растворе уксусной кислоты. Гидролизат и щелочную фазу после лизиса объединяли и из них выделяли антиген с помощью спиртового осаждения. Лизирование в течение 3 и 6 часов приводило к полной утрате антигенной активности в РИД и ИФА. Поэтому в дальнейших исследованиях использовали только антигены из вакцинного штамма БЦЖ, полученные при лизировании в течение 20 минут.

В РИД с полисахаридным антигеном не реагировали сыворотки крови из благополучного по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйства Новосибирской области (учхоз «Тулинский» - 225 проб).

Для проверки чувствительности РИД с белково-полисахаридным антигеном исследовали 208 проб сыворотки крови неблагополучных хозяйств Севе-ро-Казахстанской области, и из них 48 сывороток крови было получено при убое на мясокомбинате от больных животных , 7 из них были с видимыми туберкулезными изменениями. Из 48 сывороток крови, полученных при убое на мясокомбинате, в РИД положительно реагировала одна, а из 160 проб неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйств этой же области — 12. В непрямом варианте ИФА с белково-полисахаридным антигеном выделено 8 положительно реагирующих из 48, полученных на мясокомбинате и 27 из 160 - неблагополучных по туберкулезу хозяйств.

Полисахаридный антиген через 8 месяцев после получения утратил способность к преципитации, но резко повысил чувствительность в ИФА и по этому показателю превысил ультразвуковой антиген (ВНИИБТЖ Л.М.Ходуна). Аналогичные результаты были получены в НИИКТИБАВ (М.М. Пустошилова), которые по договору о научном сотрудничестве, проводили параллельные исследования по отработке непрямого варианта ИФА.

На основании проведенных исследований окончательным вариантом получения белково-полисахаридного антигена был взят следующий способ:

Навеску вакцинного штамма БЦЖ (Ставропольский НИИ вакцин и сывороток) - 100 мг суспендировали в 120 мл 0.2 MNaOH, затем прибавляли 1% ДСН (додецилсульфатнатрия), нагревали до растворения ДСН при t +70°С , добавляли 120 мл хлороформа и лизировали 20 минут, нагревая при перемешивании до 70°С . Осадок отделяли центрифугированием 1 час при 3.5 тыс. об/мин. После нейтрализации супернатанта эквимолярным объемом 1М НС1, белково-полисахаридный комплекс осаждали 3 объемами охлажденного 96°-ного спирта и осадок разводили 10% NaCl. Нерастворившийся осадок отделяли дополнительным центрифугированием при 10000 об/мин в течение 1 часа и су-пернатант использовали в качестве антигена.

По аналогичной схеме получили белково-полисахаридные антигены из атипичных микобактерий: M.fortuitum, M.avium, M.intracellularae и M.smegmatis.

Использовали полученные антигены при выполнении ИФА и РИД.

В качестве контрольных использовали сыворотки крови из совхоза «Па-шинский», благополучного по туберкулезу крупного рогатого скота. ИФА с полученными белково-полисахаридными антигенами проводили по схеме: сорбировали планшет ультразвуковым антигеном ВНИИБТЖ, (г. Омск) в рабочем разведении 1:400 , в течение 24 часов при t +4°С, отмывали КББ, рН -9.6; затем в лунки планшет вносили контрольные сыворотки по 100 мкл в разведении 1:100 в бикарбонатном буфере с Твином при рН 8.О..

Для определения возможного устранения фоновых или неспецифических реакций в лунки планшет, сенсибилизированных ультразвуковым антигеном, после внесения контрольных сывороток, вносили по 10 мкл антигена из атипичных микобактерий (4 антигена). Антигенами из атипичных микобактерий удалось частично снять фоновые реакции при окрашивании, но не решить проблему фоновых реакций.

3.2.2. Использование белково-полисахарндного антитела в непрямом варианте ИФА.

При исследовании сывороток крови коров (16 проб) из благополучного по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйства (ОПХ «Элитное», Новосибирской области) не выявлено положительно реагирующих в ИФА с белково-полисахаридным антигеном из вакцинного штамма БЦЖ.

При проведении комплекса противотуберкулезных мероприятий в Карасукском районе Новосибирской области, в 1996 году для уточнения диагноза были доставлены пробы сыворотки крови от реагирующих на ППД туберкулин в каждой пробе коров и лимфатические узлы для бактериологического исследования.

При исследовании 278 сывороток из неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйств Карасукского района Новосибирской области в РИД с белково-полисахаридным антигеном из вакцинного штамма БЦЖ через 24 часа было выявлено 2 положительно реагирующих пробы сыворотки крови, а через 48 часов - еще 2 . РИД выявил 2 пробы сыворотки крови животных, лимфатические узлы которых имели морфологические изменения. Все пробы сыворотки крови коров, положительно реагировавшие в РИД, положительно реагировали и в непрямом варианте ИФА.

При проведении исследований поступившей сыворотки крови были апробированы 4 варианта ИФА.

В первой схеме постановки ИФА мы сорбировали полученный нами белково-полисахаридный антиген в разведении 1:100 в КББ с рН - 9.6 в течение 16 часов при I +4 С , но блокирующий буфер рН - 8.6 не вносили. В результате из 278 сывороток крови животных из Карасукского района положительно реагировали 50 проб, причем из этого числа у 20 животных были выявлены морфологические изменения в заглоточных лимфатических узлах,, т.е. в половине от всех полученных из Карасукского района. Но, при учете результатов наблюдали небольшой фон с отрицательным контролем, и поэтому для снижения интенсивности фоновой окраски во второй схеме внесли блокирующий буфер. В результате из 278 сывороток положительный результат был получен с 38, и из этого числа 10 животных были с туберкулезными изменениями

В третьем варианте постановки ИФА решили изменить рН сорбирующего карбонатного буфера до 12 и повысили концентрацию ЫаС1 до 10%. При этом белково-полисахаридный антиген перед сорбцией также довели до рН — 12.0, а продолжительность сорбции сократили до 15 минут.

Вносили белково-полисахаридный антиген, увеличивая рН до 12.0 (10 мл антигена + 0.740 г КаС1 + 1М НаОН).

Высокая концентрация №С1 в сорбирующем буфере при значительном повышении чувствительности не стимулировала появления фоновых реакций. Различия интенсивности окраски крови были настолько велики, что легко поддавались визуальной оценке (табл. 3).

В результате из 278 исследуемых сывороток - 45 реагировали положительно, из них у 11 животного были изменения в лимфатических узлах.

После того, как какое-то время белково-полисахаридный антиген с рН -12.0 постоял в холодильнике (10 дней при 1 +4°С), резко упала его специфичность и при постановке ИФА по третьей схеме, описанной выше, результаты не воспроизводились. Наблюдали очень сильный фон, окрашивание контрольных положительных лунок было очень незначительное.

Таблица 3

Влияние продолжительности сорбции антигена на планшет на показатель фоновых реакций при рН - 12.0 и введение в сорбирующий буфер ИаС1 до ЗМ

Время Контроль Положительные в РИД сыворотки

крови коров {№ шифра/Порядковый №)

сорб- поло- Огри- 94 97 67 137

ции жител. цател. 1 2 3 4

3 мин 0,470 0,002 0,546 0,877 0,608 0,706

5 мин 0,874 0,007 0,821 0,976 0,803 0,827

10 мин 0,978 0,008 1,216 1,112 0,882 0,963

15 мин 0,976 0,100 1,123 0,914 0,853 0,877

18 час 0,714 0,116 0,858 0,9 0,681 0,633

По четвертой схеме белково-полисахаридный антиген вносили в разведении 1:100 на КББ с pH -12.0, сорбировали 15 минут. Перед внесением исследуемых сывороток вносили блокирующий буфер, pH - 8.6. В результате из 278 сывороток крови крупного рогатого скота положительно прореагировали 38, и из них у 10 животных этой группы были выявлены морфологические изменения в заглоточных лимфатических узлах.

При проведении этой схемы непрямого варианта ИФА уровень оптической плотности в лунках положительных контрольных сывороток составил от 0.857 o.e. до 0.938, и отрицательных от 0.238 до 0.284 o.e.

По чувствительности непрямой вариант ИФА значительно превосходит РИД, которая выявила 4 пробы положительно реагирующих, тогда как ИФА -38, причем из них 10 сывороток были от животных с патоморфологическими изменениями в лимфатических узлах, тогда как в РИДе всего 2 пробы (табл. 4).

Таблица 4

Результаты сравнительного исследования сыворотки крови коров из Карасукского района НСО

Наименование Исследовано всего В РИД В ИФА

хозяйства кол- соот- кол-во соот- кол-во соот-

во ветству- проб ветству- проб ветству-

проб ющие им сыв-к ющие им сыв-к ющие им

сыв-к лимфо- крови лимфо- крови лимфо-

крови узлы узлы узлы

1. с-з «Калиновский» 224 39 4 2 38 10

2. дер.Кукарка 12 - - - - -

З.с-з им.Ленина 18 - - - -

4. с-з «Дзержинский» 18 1 - - - -

5. дер.Александровха 6 - - - - -

Учитывая результаты сравнительного анализа 4 вариантов ИФА, нами для последующих исследований избран последний, который включал: сорбцию антигена в разведении 1:100 в 1М карбонатном буфере, содержащем ЗМ ЫаС1 рН - 12.0 в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем планшет 3-х кратно отмывали дистиллированной водой и вносили молочный блокирующий буфер, рН - 8.6, (изготовленный в лаборатории биотехнологии ИЭВСиДВ) по 10 мкл в каждую лунку. Б локатор вносили с целью снижения показателей фоновых реакций. После этого в лунки вносили исследуемые сыворотки в разведении 1:50 в 10% №С1, сорбция длилась 30 минут при комнатной температуре. В качестве положительного контроля использовали РСК положительные сыворотки Курской биофабрики (контроль №31 и №39), а отрицательным контролем служила сыворотка от здорового животного из благополучного по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйства Новосибирской области (ОПХ «Элитное»). Затем планшет трехкратно отмывали дистиллированной водой и вносили рабочее разведение конъюгата. Разводили конъюгат 1:1000 бикарбонатным буфером с твином, рН - 9.6 и вносили по 100 мкл в каждую лунку. Через 30 минут при комнатной температуре проводили 3-х кратное отмывание дистиллированной водой и 2-х кратное ФСБ с 0.05% твин - 20 и в каждую лунку вносили по 100 мкл субстратной смеси (0.05% раствор ортофенилендиамина в 0.5 М цитратном буфере, рН - 5.2). Реакцию останавливали при полном окрашивании в контрольных лунках 6М раствором НгБО^ по 50 мкл в каждую лунку.

3.3. Результаты использования белково-полисахаридного

антигена в ИФА и других серологических тестах.

Отработанная схема непрямого варианта ИФА с полученным нами бел-ково-полисахаридным антигеном была комиссионно апробирована в ИЭВСиДВ. Пробы сыворотки крови из хозяйств Новосибирской области, СевероКазахстанской области с различной эпизоотической ситуацией по туберкулезу

и лейкозу были зашифрованы и подвергнуты исследованию в РИД и ИФА, а также комбинированном иммунопрецшгатальном тесте.

33.1. Испытания непрямого варианта ИФА.

В ИФА и РИД были исследованы 177 сывороток крови крупного рогатого скота из хозяйств Куйбышевского района, где животные реагировали на туберкулин. Параллельно от этих же животных был взят биоматериал для бактериологического исследования.

В непрямом варианте ИФА по вышеописанной схеме положительно реагировало 17 проб сывороток, а в РИД - 3. Реагирующие в РИД совпали с реагирующими в ИФА.

При бактериологическом исследовании групповой пробы лимфатических узлов получен положительный результат.

Также были исследованы 208 сывороток из неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота районов Северо-Казахстанской области. Из них 48 сывороток было получено на Петропавловском мясокомбинате, 160 - из неблагополучных хозяйств. Исследование проводили в РИД, ИФА и КИТ (комбинированном иммунопреципитационном тесте). При исследовании в РИД (по общепринятой схеме) с белково-полисахаридным антигеном выявили 12 положительно реагирующих, в КИТ - 36 проб и в ИФА — 35. Хотя чувствительность КИТ превышала таковую в РИД и ИФА в дальнейших исследованиях мы его не применяли, из-за трудоемкости и из-за незначительных различий по чувствительности и специфичности

Из 48 проб сывороток крови коров, полученных при убое на мясокомбинате, у 7 животных были зарегистрированы патморфологические изменения, характерные для туберкулеза.

Из них в РИД, положительно реагировала 1, в КИТ - 12, в ИФА - 10. Все пробы сыворотки крови, положительно реагирующие в РИД , были резко положительны в ИФА и КИТ (табл. 5).

Величина оптической плотности положительных сывороток (ОП^эд) варьировали в пределах 0.457 o.e. до 0.938, а в отрицательных - от 0238 до 0.284 o.e. Связывание белково-полисахаридаого антигена с полистиролом было максимальным при рН-12.0 в карбонат-бикарбонатном буфере, содержащем ЗМ NaCl.

Результаты сравнительных исследований показали, что:

- из 16 проб сывороток крови из хозяйства, благополучного по туберкулезу, положительно реагирующих в ИФА проб сывороток крови не выявлено.

- По данным анализа образцов сыворотки крови от животных из хозяйств, неблагополучных по туберкулезу установлено совпадение результатов ИФА в материалах от одного и того же животного в разных серологических тестах.

Таблица 5.

Результаты сравнительного исследования в ИФА, РИД и КИТ проб сыворотки крови из неблагополучных по туберкулезу хозяйств Се-веро-Казахстанской области.

Наименование хозяйства Исследовано всего кол-во сыв-к Из них реагировали положительно

РИД кол-во сыв-к ИФА кол-во сыв-к КИТ кол-во сыв-к Бак.исслед. Кол-во лимф-в

2. мясокомбинат (Петропавловск-Казахский) 48 1 10 12 !

2. неблагополуч. хозяйства Севере- Казахтан. области 160 11 25 24

3.3.2. Испытание комбинированного нммунопрецнпитационпого теста (КИТ).

В 1995 году нами был апробирован комбинированный метод серологической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота, который включал на первом этапе исследования модифицированный тест Кумбса, а на заключительном этапе - ИФА. Способ заключается в специфической сорбции антител к бактериальной взвеси микобактерий путем их физического сближения центрифугированием и последующего трехкратного отмывания комплекса антиген -антитело также с помощью центрифугирования. Наличие антител к микобакте-риям выявляются с помощью пероксидазного коньюгата моноклональных антител к Н-цепям иммуноглобулина крупного рогатого скота. Наиболее полно сущность предлагаемого метода раскрыта в примере конкретного выполнения. 1 мг вакцинного штамма микобактерий (БЦЖ) суспендировали в 5 мл 10%-ного ИаС1 и переносили в разовые пластиковые пробирки емкостью 1 мл, по 200 мкл в каждую. В качестве антигена использовали цельные бактериальные клетки из вакцинного штамма микобактерий (БЦЖ Ставропольского биокомбината). Ми-кобактерии разводили в 10%ном растворе №С1 до 10 млрд микробных клеток в см3. Для блокировки неспецифических сайтов микобактерий в каждую пробирку вносили по 200 мкл разведения 1:200 сыворотки крови свиньи, не реагирующей на туберкулин. Пробирки помещали в центрифугу и бактериальную взвесь осаждали на дно пробирки при 4000 об/мин в течение 10 минут. Надоса-дочную жидкость сливали и в пробирки вносили исследуемую сыворотку крови в разведении 1:50 по 200 мкл и подвергали 3-х кратному центрифугированию и отмыванию 10%-ным раствором ИаС1. После отмывания в пробирки вносили пероксидазный конъюгат. После 30-минутной инкубации при комнатной температуре вновь проводили 2-кратное отмывание 0.1М бикарбонатным буфером

рН 8.6, содержащем 0.05 твин 20 с помощью центрифугирования. По завершению отмывания в пробирки вносили субстратную смесь. Реакцию останавливали при появлении четкого окрашивания в пробирке с положительным контролем, добавлением 50 мкл 6М Н2804. Содержимое пробирок переносили в лунки иммунологического планшета и проводили учет реакции визуально и спек-трофотометрически при 490 нм, причём каждую пробу исследовали в триплете.

При исследовании сыворотки крови коров из благополучного по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйства Новосибирской области (ОПХ «Элитное») положительно реагирующих не выявлено. По чувствительности тест значительно превосходит РИД с белково-полисахаридным антигеном и не уступает ИФА.

В комбинированном методе серологического исследования получены стабильно отрицательные результаты при 3-кратном исследовании 43 сывороток крови из благополучного по туберкулезу хозяйства.

Из 45 проб сыворотки крови неблагополучного по туберкулезу хозяйств Куйбышевского района Новосибирской области выделено 12 положительно реагирующих в комбинированном методе. В числе реагирующих оказались 4 коровы из совхоза «Булатовский», у которых зарегистрированы при ветеринарной экспертизе на мясокомбинате патоморфологические изменения, характерные для туберкулеза.

Также были исследованы 208 сывороток крови из неблагополучного хозяйства Северо-Казахстанской области. При исследовании в РИД выявили 12 положительно реагирующих, в КИТ - 36 проб, в ИФА - 35 проб. Все пробы сыворотки крови, положительно реагирующие в РИД, были резко положительны в комбинированном иммунопреципитационном тесте.

Приемлемый для ветеринарной практики серологический метод исследования на туберкулез должен сочетать при высокой чувствительности специфичность. РИД с белково-полисахаридным антигеном при высокой специфичности обладает низкой чувствительностью.

3.4. Результаты сравнения бактериологического исследования с показателями ИФА.

Бактериологически исследовали бакматериал от 58 животных Карасук-ского и Куйбышевского районов.

Исследуемый материал (заглоточные, брыжеечные лимфатические узлы) получили от 40 животных, поступивших на Карасукский мясокомбинат, а также 18 проб, поступивших для исследования в Куйбышевскую ветеринарную бактериологическую лабораторию (г. Куйбышев). В опытах были использованы 20 морских свинок живой массой 300-500 грамм.

Были получены пробы 278 сывороток крови и 40 лимфатических узлов от крупного рогатого скота из Карасукского района. Животные из неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйств были убиты на мя-

сокомбинате и у них были взяты лимфатические узлы с туберкулезными изменениями. Подготовленный для исследования биоматериал из 10 заглоточных лимфатических узлов от животных, сыворотки которых реагировали положительно в ИФА, посеяли отдельно (каждая суспензия из отдельного лимфатического узла на 5 пробирок с Финн-2). Из оставшихся 30 лимфатических узлов биоматериал посеяли сдвоенными пробами.

В мазках-отпечатках, окрашенных по Цилю-Нильсену наблюдали рост микобактерий в 12 пробах. Из них в 4 одинарных пробах получен совпадающий результат при иммунноферментном анализе. Из 8 сдвоенных проб, в которых выделена культура М.Ытэ, сыворотки крови не реагировали в ИФА.

Одновременно была проведена биопроба на морских свинках (19 свинок). Животные были заражены суспензией из пораженных лимфатических узлов. Через 14-28 дней на месте введения у свинок сначала появилось уплотнение, затем язва с казеозным некрозом.

Было проведено вскрытие свинок, из 17 зараженных свинок только у двух были отмечены туберкулезные поражения в селезенке, печени и легких. У остальных 15 свинок наблюдали генерализованную форму туберкулеза. На месте введения была язва с казеозным некрозом, на брюшине и печени установлены очаги некроза, селезенка и почки увеличены с казеозными очажками, в легких - очаги некроза величиной с просо.

ИФА выявил 10 животных из 40, у которых лимфатические узлы имели характерные для туберкулеза изменения. Биопроба на морских свинках подтвердила туберкулез у 38 животных. И лишь у двух коров из лимфатических узлов культура возбудителя туберкулеза не выделена.

Значительно уступая по чувствительности биопробе, которая выявила практически всех животных с туберкулезными изменениями в лимфатических узлах, ИФА превосходит по этому показателю бактериологический метод исследования (выделение культур микобактерий на питательных средах) и другие серологические методы.

Выводы

1. Получен высокоспецифичный белково-полисахаридный антиген из вакцинного штамма БЦЖ (М.Ьоу1з) для непрямого варианта ИФА, обладающий высокой активностью и специфичностью при исследовании заведомо известных контрольных проб сыворотки крови крупного рогатого скота.

2. Оптимизирована схема выполнения ИФА с полученными нами реагентами, позволяющая не только инструментально, но и визуально отличать положительный и отрицательный сигнал при обнаружении специфических антител к M.bovis в исследуемых пробах сыворотки крови крупного рогатого скота.

3. Разработан комбинированный иммунопреципитационный тест (КИТ), который позволяет в ИФА в качестве антигена использовать цельную бактериальную клетку без неспецифической сорбции ее к лункам иммуно-

логических планшет. По чувствительности и специфичности метод не уступает непрямому варианту ИФА, может быть использован при отсутствии водорастворимых антигенов, изготовленных специально для этих целей. КИТ позволяет изучать гуморальный иммунный ответ к поверхностным антигенам цельной бактериальной клетки, а не к ее отдельным фрагментам.

3. Рекомендуемый нами вариант ИФА может быть использован для оценки эпизоотической ситуации благополучных по туберкулезу стад, в которых регистрируются единичные случаи положительного реагирования животных на ППД туберкулин.

4. При инфицировании животных М.ЬоУ1$ лишь незначительная их часть

25%)синтезируют специфические антитела, которые могут быть установлены с помощью высокочувствительного ИФА. Большая же часть животных генетически детерминирована на клеточную иммунную защиту. В связи с этим дальнейшие попытки разработать серологические тест-системы для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота мало перспективны.

Практические предложения.

1. Способ получения высокоспецифичного белково-полисахаридного антигена путем лизирования микобактерий туберкулеза бычьего вида (вакцинный штамм БЦЖ) в щелочной среде додецилсульфатом натрия в присутствии хлороформа, с последующим гидролизом в кислой среде и осаждением белково-полисахаридного комплекса этиловым спиртом. Антиген может быть использован для сенсибилизации иммунологических планшет в иммуноферментной тест-системе для выявления антител к микобактсршш туберкулеза крупного рогатого скота.

2. Новый комбинированный иммунопрепиципитационный тест, не уступающий по чувствительности и специфичности ИФА, но позволяющий в качестве антигена использовать цельные бактериальные клетки, а не водорастворимые антигены.

3. Экспресс-метод серологической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в ИФА может быть использован для оценки эпизоотической ситуации в благополучных по этой инфекции хозяйствах, где присутствуют животные, реагирующие на ППД туберкулин для млекопитающих.

Материалы работы рассмотрены и одобрены на заседании подсекции

"Ин-фекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего

Востока" отделения ветеринарии СО РАСХН от 25 ноября 1997 г.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Арсентьева (Шимолина) Н.О., Кабанцев А.И. Новая тест-система для серологической диагностики туберкулеза.// Гез.докл.науч.практ.конф., Новосибирск,- 1995.- 32 с.

2. Шимолина Н.О., Теш А.И., Чекишев В.М. Использование белково-полисахаридного антигена для выявления антител к микобакгериям туберкулеза.// Тез.междун.науч.-практ.конф. « Зооантропонозные болезни, меры профилактики и борьбы.»: Минск.- 1997.- С.80-81.

3. Шимолина Н.О., Теш А.И., Чекишев В.М. Использование белково-полисахаридного ангагена для выявления анпггел к микобакгериям туберкуле-заЛ Тез.докл.участ.конф.научн.молодежи . «Молодые ученые в решении проблем сибирской аграрной науки», Новосибирск.-1977 - С.58-59.

4. Шимолина Н.О., Теш А.И., Чекишев В.М. Ценность ИФА-теста в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота .// Тез.научн.конф., посвященной 50-летию Алтайской НИВС « Ассоциативные инфекции

с.-х. животных и новые подходы к их ликвидации и профилактшсе».-Барнаул.- 1997.-С.23-25.

5. Шимолина Н.О., Теш А.И., Чекишев В.М. Использование белково-полисахаридного антигена для выявления антител к микобактериям туберкулеза.// « День Земли: Экология и Образование»./ Материалы III Межвузовской научно-практ.конф.- Бийск.-1-997.

6. Шимолина Н.О., Теш А.И., Чекишев В.М. Использование ИФА с белко-во-полисахаридным антигеном для выявления антител к микобактериям туберкулеза.// Докл. на заседании секции инфекционной патологии ИЭВ-СиДВ.- Новосибирск,- 1997.

Подписано в печать 3.05.2000 г. Формат 60x84/16. Объем 1,5 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 116. Отпечатано в типографии ООО «Ревик-К» 630500, п. Краснообск Новосибирской области.

Из инфекционных болезней крупного рогатого скота туберкулез наносит наиболее значительный экономический ущерб за счет снижения продуктивности животных, ухудшения качества продукции, преждевременной выбраковки больного поголовья и высоких затрат на противотуберкулезные мероприятия.

Проблема профилактики и ликвидации туберкулеза актуальна для многих регионов России и, несмотря на осуществляемые ветеринарно-санитарные мероприятия ежегодная заболеваемость крупного рогатого скота туберкулезом составляет около 2% от имеющегося поголовья (В.М. Авилов, В.Ф. Пылинин, 1992).

Одной из особенностей туберкулеза является преобладание латентных форм бактерионосительства. Клинические признаки болезни у крупного рогатого скота проявляются при длительном течении инфекции и при неблагоприятных условиях содержания.

Для прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в нашей стране используется аллергический способ выявления сенсибилизированных микобактериями туберкулеза организма животных при внутрикожном введении туберкулина. Недостатком этого способа является выявление значительного количества животных, неспецифически реагирующих на внутрикож-ное введение туберкулина из-за сенсибилизирования сапрофитными формами микробактерий. При этом для постановки диагноза , особенно в благополучных по туберкулезу хозяйствах, необходимо проведение бактериологических и пат-морфологических исследований с учетом эпизоотологических данных и клинических наблюдений. При послеубойном осмотре реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота не всегда удается установить туберкулезные изменения во внутренних органах и тканях животного (А.И. Кузин, 1980). Бактериологические исследования на туберкулез проводятся в срок до 3-х месяцев, а в некоторых случаях - до 6 месяцев. Кроме того, выявление инфекционного агента при туберкулезе может быть осложнено наличием ультрамелких и Л-форм ми-кобактерий (И.Г. Мальков, 1993).

Из серологических методов диагностики туберкулеза животных делались попытки апробации в ветеринарной практике реакции связывания комплемента с антигенами СибНИВИ и УкрНИВИ (Э.Д. Лакман, 1980; Ю.Я. Кас-сич, 1984).

Однако, эта реакция из-за невысокой чувствительности является ориентировочной и для массовых исследований не нашла применения, хотя некоторые исследователи использовали ее для уточнения диагноза и отбора животных для диагностического убоя с последующим бактериологическим исследованием биоматериала животных (А.Х. Найманов и др., 1990).

В связи с этим создание высокочувствительных экспресс-методов выявления инфицированных микобактериями туберкулеза животных до сих пор продолжает оставаться актуальной проблемой и является одним из важнейших направлений научных исследований по туберкулезу.

Высокочувствительный непрямой вариант иммуноферментного анализа (ИФА) для серологической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота апробирован отечественными и зарубежными исследователями (Е.В. Маслов и др., 1986), однако широкого применения в ветеринарной практике еще не нашел.

Возможность выявления иммуноферментным методом малых количеств антигена в исследуемом материале, а также специфических антител в сыворотке крови представляет большой интерес при использовании ИФА для диагностики туберкулеза (Т.Р. Якупов, 1991).

Для получения достоверных результатов с помощью высокочувствительных методов исследования необходимо использование высокоспецифичных реагентов, основными из которых в ИФА являются антиген и коньюгат антивидовых антител.

Цель и задачи исследований.

Целью данной работы являлась разработка нового способа диагностики туберкулеза крупного рогатого скота на основе ИФА и моноклональных антител. Исходя из этой цели для выполнения ставились задачи:

1) Разработать методику изготовления специфических антигенов из ми-кобактерий бычьего вида, вакцинного штамма БЦЖ и атипичных.

2) Дать сравнительную оценку чувствительности и специфичности различных вариантов ИФА с полученными микобактериальными антигенами, а также с бактериологическим методом, включающим биопробу на морских свинках.

3) Определить оптимальные условия для проведения ИФА с полученными реагентами, а также возможность понижения интенсивности фоновых реакций.

4) Определить место экспресс-метода диагностики туберкулеза с использованием ИФА в системе противотуберкулезных мероприятий.

Научная новизна.

Получен комплексный белково-полисахаридный антиген из М.Ымб, обладающий высокой активностью в ИФА е контрольной положительной сывороткой. Непрямой вариант ИФА с указанным антигеном апробирован при исследовании сыворотки крови из неблагополучных по туберкулезу хозяйств Новосибирской области.

Разработан и апробирован новый комбинированный иммунопреципита-ционный тест на основе ИФА.

Показана высокая специфичность и информативность ИФА сыворотки крови крупного рогатого скота при выяснении эпизоотической ситуации хозяйств по туберкулезу.

Практическое значение работы.

Разработана методика изготовления специфических антигенов из мико-бактерий туберкулеза бычьего вида и вакцинного штамма БЦЖ. Белково-полисахаридный антиген из вакцинного штамма БЦЖ дает минимальные фоновые реакции в непрямом варианте ИФА.

Непрямой твердофазный вариант ИФА, как один из методов прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота, показал удовлетворительные результаты при предварительных исследованиях сыворотки крови из неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйств. Экспресс-метод серологической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в ИФА может быть использован для оценки эпизоотической ситуации в благополучных по этой инфекции хозяйствах, где отмечены случаи реагирования животных на ППД туберкулин для млекопитающих

Апробация работы.

Основные положения работы доложены и обсуждены на Научно-практической конференции «Основные научные исследования по проблеме туберкулеза и бруцеллеза сельскохозяйственных животных, профилактика и организация мероприятий по ликвидации болезней в регионе Сибири» ( г.Новосибирск, 1995); научно-практической конференции «Актуальные вопросы ветеринарии» (г.Новосибирск, 1997); на международной научно-практической конференции «Зооантропонозные болезни, меры профилактики и борьбы» (г.Гродно, 1997 ); на научно-практической конференции «Молодые ученые времени. Проблемы Сибирской аграрной науки» (Новосибирск, 1997); на Ш Межвузовской научно-практической конференции «День земли» (г.Бийск, 1997); на научной конференции, посвященной 50-летию Алтайской НИВС (г.Барнаул, 1997); на заседании подсекции инфекционной патологии ИЭВСиДВ (Новосибирск, 1997), межлабораторном заседании ИЭВСиДВ (2000).

Публикация результатов исследований.

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ.

Внедрение результатов исследований.

Результаты работы рассмотрены на подсекции инфекционной патологии ИЭВСиДВ и рекомендованы для производственной проверки с целью отбора реагирующих на туберкулин животных для диагностического убоя и последующего бактериологического исследования биоматериала животных в благополучных по туберкулезу хозяйствах .

На защиту выносится:

1) Режим изготовления белково-полисахаридного антигена из вакцинного штамма микобактерии (БЦЖ) и его использование для выявления антител к микобактериям туберкулеза в серологических реакциях (РИД, ИФА).

2) Усовершенствование техники выполнения непрямого варианта им-муноферментного анализа с разработанным нами антигеном для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

3) Результаты сравнения ИФА и бактериологического исследования, включающего биопробу на морских свинках, при постановке диагноза на туберкулез.

Структура и объем диссертации.

Материалы диссертации изложены на 131 странице машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, заключение, выводы, практические предложения, литература и приложение.

Список литературы содержит 296 отечественных и зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами.

Работа была выполнена в лаборатории биотехнологии и лаборатории по разработке мер борьбы с туберкулезом животных ИЭВСиДВ СО РАСХН с 1993 8 по 2000 гг. В выполнении ряда фрагментов работы принимали участие В.М. Чекишев, доктор ветеринарных наук, профессор; A.C. Донченко, доктор ветеринарных наук, профессор, чл.-корр. РАСХН; Р.З. Файзуллин, кандидат биологических наук и другие сотрудники вышеназванных лабораторий, которым автор выражает глубокую благодарность и признательность.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Туберкулез крупного рогатого скота, как заболевание, был известен задолго до открытия возбудителя. В связи с разнообразием форм его проявления, значительной устойчивостью возбудителя во внешней среде и опасностью для человека, занимает особое положение среди хронических инфекционных болезней крупного рогатого скота. Туберкулезом заболевают все виды животных, особенно восприимчив крупный рогатый скот. В.Н. Матвеев (1938) указывает, что туберкулез наблюдали у 46 видов млекопитающих животных и 25 видов птиц. К 1963 году список млекопитающих животных, болеющих туберкулезом составил 54 вида (Я.А. Благодарный, 1971). Для диагностики туберкулеза человека В.Г. Гутман (1891) предложил использовать реакцию замедленной кожной гиперчувствительности при внутрикожном введении вытяжки из бактерий туберкулеза. При последующем совершенствовании способов изготовления ту-беркулинов, схем их применения, данный метод до настоящего времени является основным для прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота (В.Г. Гутман, 1891),

Ряд исследователей доказали значение туберкулиновой пробы в прижизненной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота (С.Н. Вышелес-ский,1924; Н.Ф. Гамалея, 1953; В.П. Урбан, 1995; А.И. Кузин, 1987; A.C. Дон-ченко, 1980,1983; А.Ф. Кочмарский, 1982; Ю.Я. Кассич,1982, 1984; Н.П. Овди-енко, А.Х. Найманов, 1980; P.A. Barrow, 1981; B.V. Kollias, С.О. Thoen, 1982; S.W. Wilesmit, Т. Gnada, 1984; R. Gunning, 1985).

В ветеринарной практике в диагностических целях используют несколько методов: аллергический, клинический, патологоанатомический, гистологический, бактериологический, биологический, а в последнее время серологический. Кроме этого, учитывают эпизоотологические данные. В аллергической диагностике первоначально широкое применение получили подкожная и глазная туберкулиновые пробы, в дальнейшем - внутрикожная проба (С.Н. Вышелесский, 1924; П.П. Вишневский, 1937; М.К. Юсковец, 1963).

Установлено, что вследствие внутримакрофагального паразитирования микобактерии не доступны действию гуморальных факторов иммунитета. Сам туберкулезный процесс , сопровождающийся интоксикацией организма, напряжением всех звеньев системы иммунитета и развитием аутоимунных процессов (М.М. Авербах, 1980), является ложным фактором возникновения вторичных иммунодефицитных состояний , также сопровождающихся падением титров циркулирующих антител.

Познание иммунологических механизмов, основанных на этиологических и патогенетических принципах взаимодействия микро- и макроорганизма, является методической основой совершенствования средств и методов прижизненной диагностики заболевания (A.C. Донченко, В.А. Середин и др., 1984).

Совершенствование средств и методов прижизненной диагностики заболевания с учетом иммунной: системы организма, особенностей биологии возбудителя, будет способствовать, более, эффективному оздоровлению: животноводческих хозяйств от туберкулеза и возможно она путем применения в комплексе серологических и аллергических методов диагностики.

6. выводы

1. Получен высокоспецифичный бежово-полисахаридный антиген из вакцинного штамма БЦЖ (М.Ьомб) для непрямого варианта ИФА, обладающий высокой активностью и специфичностью при исследовании заведомо известных контрольных проб сыворотки крови крупного рогатого скота.

2. Оптимизирована схема выполнения ИФА с полученными нами реагентами, позволяющая не только инструментально, но н визуально отличать положительный и отрицательный сигнал при обнаружении специфических антител к М.Ьоу1з в исследуемых пробах сыворотки крови крупного рогатого скота.

3. Разработан комбинированный иммунопреципитационный тест (КИТ), который позволяет в ИФА в качестве антигена использовать цельную бактериальную клетку без неспецифической сорбции ее к лункам иммунологических планшет. По чувствительности и специфичности метод не уступает непрямому варианту ИФА, может быть использован при отсутствии водорастворимых антигенов, изготовленных специально для этих целей. КИТ позволяет изучать гуморальный иммунный ответ к поверхностным антигенам цельной бактериальной клетки, а не к ее отдельным фрагментам.

4. Рекомендуемый нами вариант ИФА может быть использован для оценки эпизоотической ситуации благополучных по туберкулезу стад, в которых регистрируются единичные случаи положительного реагирования животных на ППД туберкулин.

5. При инфицировании животных М.Ьоу1б лишь незначительная их часть (~ 25%) синтезируют специфические антитела, которые могут быть установлены с помощью высокочувствительного ИФА. Большая же часть животных генетически детерминирована на клеточную иммунную защиту. В связи с этим дальнейшие попытки разработать серологические тест-системы для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота мало перспективны.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Способ получения высокоспецифичного белково-полисахаридного антигена путем лизирования микобактерий туберкулеза бычьего вида (вакцинный штамм БЦЖ) в щелочной среде додецилсульфатом натрия в присутствии хлороформа, с последующим гидролизом в кислой среде и осаждением белково-полисахаридного комплекса этиловым спиртом. Антиген может быть использован для сенсибилизации иммунологических планшет в иммуноферментной тест-системе для выявления антител к микобактериям туберкулеза крупного рогатого скота.

2. Новый комбинированный иммунопрепиципитационный тест, не уступающий по чувствительности и специфичности ИФА, но позволяющий в качестве антигена использовать цельные бактериальные клетки, а не водорастворимые антигены.

3. Экспресс-метод серологической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в ИФА может быть использован для оценки эпизоотичес-кой ситуации в благополучных по этой инфекции хозяйствах, где присутствуют животные, реагирующие на 1111Д туберкулин для млекопитающих.

Материалы работы рассмотрены и одобрены на заседании подсекции «Инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарии РАСХН от 25 ноября 1997 г.