Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Моноклональные антитела в диагностике инфекций, вызванных микобактериями

'У/> С) Л /у../ о ._о

/, / 4 ч ) / и,} о

-Г' * ' V/ ч*' ^ / / / ^ ¿7

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ТУБЕРКУЛЕЗА

На правах рукописи

Черноусова Лариса Николаевна

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ МИКОБАКТЕРИЯМИ

(14.00.36 - АЛЛЕРГОЛОГИЯ И ИММУНОЛОГИЯ)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук

зидиуа

VI К А

присудил ученую степень Д 0*0

В

Научный консультант: член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор В. И. Литвинов

МОСКВА, 1998 г.

! /

Содержание

Список сокращений......................................................................................................................................................................................4

Введение..........................................................................................................................................................................................................5

Часть I. Обзор литературы................................................................................................................................................................11

Глава I. Иммунный ответ на микобактерии и его эндогенная

регуляция......................................................................................................................................................................................................................11

1.1. Субпопуляции клеток-помощников (Тх)............................................................................................12

1.2. Эффекторные функции продуктов Тх1 и Тх2..............................................................................16

1.3. Роль цитокинов в развитии заболеваний, вызванных микобактериями................................................................................................................................................................................................18

1.4. Специфические механизмы иммунитета к микобактериям..................................19

1.5. Клиническое значение динамики антителообразования к определенным антигенным детерминантам микобактерий........................................................24

Глава 2. Серодиагностика туберкулеза и других микобактериозов..............................28

2.1. Иммуноферментный анализ в диагностике туберкулеза............................................28

2.2. Механизм развития ложноотрицательных и ложноположительных антительных реакций................................................................................................................................................................................39

Глава 3. Анализ экспрессии эпитопов, выявляемых МкАТ на антигенах

микобактерий........................................................................................................................................................................................................42

Часть II Собственные исследования.....................................................................................................................50

Глава 4. Материалы и методы....................................................................................................................................................50

Глава 5. Получение и характеристика моноклональных антител (МкАТ)..........67

5.1. Получение МкАТ к Mycobacterium tuberculosis complex............................................67

5.2. Получение МкАТ к Mycobacterium bovis..........................................................................................74

5.3. Получение МкАТ к Mycobacterium avium..........................................................................................77

5.4. Получение МкАТ к атипичным микобактериям.......................... .... 79

5.4.1. Оптимизация первичного скрининга гибридом, продуцирующих антитела к атипичным микобактериям........................................................................................................................79

5.4.2. Получение МкАТ к Mycobacterium kansasii и Mycobacterium smegmatis......................................................................................................................................................................................................................83

5.5. Характеристика панели МкАТ к антигенам микобактерий..................................90

Глава 6. Использование МкАТ для определения антител и антигенов при диагностике заболеваний, вызываемых микобактериями.............................. 98

6.1. Определение антител в сыворотках больных туберкулезом легких к аффинноочищенным на МкАТ антигенам....................................................... 98

6.2. Эффективность использования конкурентного ИФА с МкАТ 1D3

для серодиагностики M.avium - инфекции у людей........................................ 103

6.3. Определение антигенов микобактерий туберкулеза в спинномозговой и плевральной жидкостях больных туберкулезом

методом ингибиции с МкАТ 10D6................................................................... 106

6.4. Обнаружение антигенов микобактерии в культуральной среде методом «двойного антительного сэндвича» с МкАТ 10D6........................... 110

Глава 7. Видовая идентификация микобактерий методом Western blot с моноклональными антителами......................................................................... 113

Глава 8. Изучение особенностей антигенной структуры микобактерий туберкулезного комплекса методом Western blot с моноклональными антителами......................................................................................................... 117

Часть III. Обсуждение результатов.................................................................. 122

Глава 9. Повышение эффективности серодиагностики микобактериозов с помощью моноклональных антител................................................................. 122

Глава 10. Эпитопное картирование микобактериальных антигенов - новый подход в идентификации микобактерий.......................................................... 136

Выводы............................................................................................................... 147

Практические рекомендации............................................................................ 149

Список литературы........................................................................................... 150

Список сокращений

АГ антиген

АТ антитело

БСА бычий сывороточный альбумин

ГАТ гипоксантин, аминоптерин, тимидин

ГЗТ гиперчувствительность замедленного типа

ГКГ главный комплекс гистосовместимости

ГМ-КСФ грануло-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ГТ гипоксантин, тимидин

ДАТ диацилглицерол

дмсо диметилсульфоксид

ДСН додецилсульфат натрия

иг иммуноглобулин

ИЛ интерлейкин

ИНФ интерферон

ИФА иммуноферментный анализ

ЛА латекс-агглютинация

ЛАМ липоарабиноманнан

МАГ микобактериальный антиген

МкАТ моноклональные антитела

НАФ неполный адъювант Фрейнда

ПААГ полиакриламидный гель

ПХ пероксидаза хрена

РИГА реакция пассивной гемагглютинации

РРБ очищенный белковый дериват микобактерий

СБ кластер дифференцировки

Тгзт Т-эффекторы гиперчувствительности замедленного типа

ТЕМЕД 1,2-бисдиметиламиноэтан

ТРФ фактор роста тромбоцитов

Тх субпопуляция лимфоидных Т-клеток хелперов

ТХУ трихлоруксусная кислота

ФН фибронектин

ФИО фактор некроза опухоли

ЭДТА этилендинитротетрауксусная кислота

Введение

Заболеваемость туберкулезом и смертность от него в России снижались в текущем столетии до конца 70-х годов, когда оба показателя вышли на плато. Задача ликвидации туберкулеза к 2000 году сейчас не ставится, это заболевание остается серьезной проблемой для всего человечества. По утверждению академика А.Г. Хоменко это обусловлено многими причинами - эпидемией ВИЧ-инфекции, широким распространением алкоголизма и наркомании, растущей нищетой, волной иммиграции из регионов с высоким риском туберкулеза, снижением качества программ по борьбе с туберкулезом (26). В настоящее время в мире насчитывается около 1,7 млрд. больных туберкулезом, ежегодно от него умирают около 3 млн. человек. По мнению G.Barlett инфицирование Mycobacterium tuberculosis - ведущая причина смерти от инфекционных заболеваний, на долю которой приходится 6% от общего числа смертельных исходов (6).

Однако, помимо указанных факторов, проблема туберкулеза, как отмечает академик А.Г. Хоменко (28), существует до сих пор в силу сложности надежной ранней лабораторной диагностики, значение которой в последнее время возросло в связи с преобладанием экстрапульмонарного туберкулеза (до 70%) у ВИЧ-инфицированных лиц и полирезистентного туберкулеза (26, 306, 364).

Известно, что у лиц со СПИДом наибольшее поражения вызывает микобактериальная инфекция (115). Из крови, фекалий, лимфоузлов и других тканей таких больных выделяют кроме М. tuberculosis, М. avium, такие атипичные микобактерии, как М. kansasii, М. xenopi, М. scrofiilaceum, М. fortuitum и другие (329, 379). По данным М. Salfinger (1995 г) за шестилетний период наблюдения в клинике число случаев выделения нетуберкулезных

микобактерий увеличилось с 0,4 до 0,9 на 100 тысяч человек, причем легочные микобактериозы преобладали у пожилых, женщин (79%) и некурящих (88%) пациентов (329, 390).

По мнению ведущих исследователей в области фтизиатрии и микобактериологии ранняя диагностика - основной фактор, определяющий исход лечения (357).

На современном этапе в лабораторной диагностике микобактериозов помимо комплекса традиционных бактериологических, морфологических и цитологических методов, широко внедряются новые, основанные на достижениях биотехнологии и молекулярной генетики. К ним относятся иммунохимический анализ, ДНК-гибридизация, полимеразная цепная реакция (10, 328, 352)

Иммунохимический анализ, основанный на выявлении у больных как антигенов микобактерий, так и антител к ним, получил широкое распространение в силу его доступности, достаточной чувствительности и специфичности (16, 126, 155, 205). Эффективность иммунохимических методов зависит от чистоты реагентов (препаратов антигенов и антител). С развитием гибридомной технологии появилась реальная возможность получения моноклональных антител, которые являются идеальным реагентом для иммунохимических реакций. Успех использования их связан с накоплением большого разнообразия моноклональных антител по специфичности и с созданием банка гибридом.

Исходя из этого, целью настоящего исследования было получение моноклональных антител к антигенам микобактерий и использование их для повышения эффективности лабораторной диагностики инфекций, вызываемых микобактериями. При этом были поставлены следующие задачи:

1. Получить и охарактеризовать моноклональные антитела (МкАТ) к микобактериям различных видов;

2. Аффинно на моноклональных антителах выделить узкоспецифические микобактериальные антигены (МАГ);

3. Оценить эффективность использования МАГ в диагностике туберкулеза легких и МкАТ - в диагностике M.avium-микобактериоза при определении антител в сыворотках больных;

4. Изучить диагностическую ценность МкАТ при выявлении микобактериальных антигенов в плевральном экссудате и спинномозговой жидкости больных туберкулезом;

5. Исследовать возможность раннего обнаружения с помощью МкАТ микобактериальных антигенов в культуральной среде при посеве мокроты больных туберкулезом легких;

6. Изучить особенности антигенной структуры микобактерий методом Western blot с моноклональными антителами;

7. Провести видовую идентификацию микобактерий, основанную на Western blot анализе с моноклональными антителами.

Научная новизна данной работы заключается в том, что:

- Создана панель моноклональных антител к Mycobacterium tuberculosis complex и к некоторым видам атипичных микобактерий.

- Показано, что использование моноклональных антител в различных вариантах иммуноферментного анализа повышает специфичность определения антител в сыворотках больных, инфицированных микобактериями (M.tuberculosis и М.avium), а также антигенов микобактерий в спинномозговой и плевральной жидкостях больных туберкулезом.

- Выявлены наибольшие перекрестные реакции у антигенов микобактерий следующих видов: у M.bovis с M.tuberculosis, М.avium, M.kansasii; у M.avium с M.leprae, M.bovis, M.tuberculosis; у M.kansasii с M.bovis, M.smegmatis; у M.smegmatis с M.tuberculosis, M.bovis, M.kansasii.

Показаны особенности антигенной структуры микобактерий туберкулезного комплекса методом Western blot с моноклональными антителами.

- Создана эпитопная карта антигенов микобактерий М. tuberculosis, М. bovis, М. avium, М, kansasii и М. smegmatis.

Научная значимость работы заключается в обосновании целесообразности использования метода эпитопного картирования для идентификации микобактерий и исследования их штаммовых особенностей. С помощью данного метода показано, что экспрессия эпитопов на полипептидах определенной молекулярной массы является характеристическим признаком, уникальным для конкретного вида микобактерий.

Практическая значимость работы заключается:

- в получении уникальных специфических реагентов - МкАТ к микобактериям и узкоспецифических МАГ .

- в оптимизации первичного скрининга гибридом к атипичным микобактериям, заключающейся в выбраковке не только негативных клонов, но и клонов, продуцирующих антитела к антигенам с максимальной перекрестной реактивностью.

- в создании тактики лабораторной диагностики туберкулеза с применением МкАТ и МАГ, позволяющей повысить специфичность диагностики и сократить сроки постановки диагноза;

- в разработке высокочувствительных и специфичных иммунологических методов идентификации микобактерий и исследовании их штаммовых особенностей.

Основные положения, которые выносятся на защиту

1. Получена панель моноклональных антител к микобактериям .tuberculosis, М. bovis, М. avium, М, kansasii и М. smegmatis, направленных к эпитопам, общим для широкого спектра микобактерий, к эпитопам, характерным для М. tuberculosis complex, и к эпитопам, уникальным для M.bovis bovinus 8, М. avium, М. smegmatis.

2. Использование полученных моноклональных антител и очищенных микобактериальных антигенов в иммуноферментном анализе существенно повышает эффективность лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых микобактериями (туберкулеза легких, туберкулезного плеврита и менингита, микобактериоза, вызванного М. avium), и сокращает сроки обнаружения роста микобактерий в культуральной среде.

3. Western blot микобактерий с полученными моноклональными антителами позволяет изучить особенности антигенной структуры и создать эпитопную карту антигенов M.tuberculosis, M.bovis, M.avium, M.kansasii , M. smegmatis.

4. Анализ экспрессии эпитопов на антигенах определенной молекулярной массы выявляет штаммовые различия микобактерий M.tuberculosis complex.

5. Эпитопное картирование микобактерий с помощью моноклональных антител позволяет иммунологически идентифицировать клинические изоляты микобактерий M.tuberculosis, M.bovis, M.avium, M.kansasii, M.smegmatis в 62,2 -100% в зависимости от вида микобактерий.

Апробация диссертации

Материалы диссертации были доложены на 7 Иммунологическом конгрессе, г. Берлин (1988 г.), 1 Всесоюзном съезде иммунологов, г. Дагомыс (1989 г.), 2 Всесоюзном симпозиуме «Реабилитация иммунной системы» г. Дагомыс (1990 г.), 13 Конференции европейского общества микобактериологов, г. Регенсбург (1992 г.), 14 Конференции европейского общества микобактериологов, г. Куопио (1993 г.), 4 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания, г. Москва (1994 г.), II (XI) съезде фтизиатров, г. Саратов (1994 г.), научно-практической конференции «Молекулярные основы патогенеза и диагностики туберкулеза и другой легочной патологии» г. Москва (1995 г.), Всероссийской конференции «Иммунологический мониторинг патологических состояний и иммунореабилитация», г. Москва (1995 г.), VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И. Мечникова (1997 г.), заседаниях секции микробиологии и иммунологии туберкулеза Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И. Мечникова (16 декабря 1996 г.,16 июня 1997 г.), объединенной конференции отделов иммунологии, микробиологии, патоморфологии и биохимии ЦНИИТ РАМН 23 марта 1997 г.

Объем и структура диссертации.

Диссертационное исследование состоит из введения, трех глав обзора литературы, пяти глав собственных исследований, двух глав обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 199 страницах машинописи, иллюстрирована 30 таблицами и 16 рисунками. Список литературы содержит 29 отечественных и 400 зарубежных источников.

Часть I. Обзор литературы

Глава I. Иммунный ответ на микобактерии и его эндогенная регуляция.

Эффективный иммунный ответ на инфекционные агенты, противоопухолевый иммунитет, аллергические реакции зависят от активации соответствующих иммунных эффекторных функций. Они обусловлены двумя типами реакций - клеточно-опосредованным иммунитетом и продукцией антител. Клеточно-опосредованный иммунный ответ определяется макрофагальным звеном и активацией цитолитических CD8 клеток и CD4 эффекторов гиперчувствительности замедленного типа; гуморальный -антителами, продукция которых начинается при действии на В лимфоциты соответствующих ростовых и дифференцировочных факторов. В начале 70-х годов были получены первые факты реципрокных взаимоотношений между реакциями ГЗТ и антителообразованием (49, 327). Основной феномен заключался в том, что у подопытных животных, иммунизированных тимус -зависимым антигеном - ксеногенными эритроцитами, развивался либо тот, либо другой тип иммунного ответа (49, 166). Первоначально эти данные объясняли регуляторными свойствами иммуноглобулинов - продуктов В клеток или самими В клетками, затем формированием Т супрессоров, которые индуцируются при развитии иммунного ответа параллельно с эффекторными Т лимфоцитами и активированными В клетками (166, 368). И только при использовании в качестве модели иммунного ответа на живые бактерии были получены доказательства независимой активации этих ветвей иммунитета и их

регуляции двумя различными субпопуляциями С04-позитивных Т клеток-помощников, названных Тх1 и Тх2, продуцирующих различный набор цитокинов (111, 269, 282, 283).

Именно цитокинным профилем определяется тип иммунного ответа и именно им определяется ингибиция активности оппозитной популяции Т