Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Получение и характеристика моноклональных антител против микобактерий бычьего вида и антиидиотипов к ним

4 г» и Г1 о о Ч

ГОСКОМИТЕТ САНЭПИДНАДЗОРЛ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ имени Г. Н. ГАБРИЧЕВСКОГО

АВДИЕНКО Вадим Григорьевич

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВМИКОБАКТЕРИЙБЫЧЬЕГО ВИДА ИАНТИИДИОТИПОВ К НИМ

(14.00.36 — аллергология и иммунология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

На правах рукописи

Москва — 1992

Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза Российской АМН.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор В. И. Литвинов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук М. С. Бляхер

доктор медицинских наук, профессор А. А. Ярилин

Ведущее учреждение: Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Защита диссертации состоится «¿^¿О» октября 1992 г. в « » часов на заседании специализированного совета К-084.18.02 при Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского Госкомитет Санэпиднадзора Российской Федерации.

Адрес: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского.

Автореферат разослан 7 сентября 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

О. В. Котельникова

"¡•'/ - I -

Актуальность проблемы. Гуморальная регуляция иммунологических реакция осуществляется множеством растворимых агентов, включая гормоны, интерлейкины, антитела и т.д. В изучении роли этих агентов при туберкулезе чередовались периоды, когда глазное внимание исследователей, занимавшихся проблемами противотуберкулезного иммунитета, было приковано к разным грушам таких веществ. Вполне понятно, что в течение первой половины текущего столетия основным предметом изучения среди гуморальных факторов являлись антитела, однако веских доказательств, что они играют какую-либо существенную роль в защите организма от данной инфекции не получено.

После того, как было установлено, что главное звено в защите организма от туберкулеза - взаимодействие Т-лимфоцитов и макрофагов, силы исследователей были сконцентрированы на изучении факторов, способствующих дифференцировке иммунокомпэтентных клеток, межклеточном взаимодействии, а впоследствии на кнтерлеакинах (Авербах М.М.,1976,1880,1985; Mittler R. et.al.,1985; Sharon M.,1986). Значению антител при этих процессах в последнее время уделяется значительно меньшее внимание. Вместе с тем, столь тонкий инструмент кммунорегуляции как анггителообразование, едва ли конйт быть запушен вхолостую. Кроме того, действие антител на обязательно должно быть направлено непосредственно на сами мико-бактерии, существуют более обширные возможности для балансировки противотуберкулезного иммунитета, например путем идкоткп-ангги-идаотипических взаимодействий. Действительно, наличие этого компонента иммунитета при ?«®обзктериальных инфекциях продемонстрировано (Сайра М. et.al.,1986; Collizl V. et.al., 1983), а также получены сами антиидаотипические глтитела (анти-ЭД) против идио-типов противотуберкулезных антител (Praputpittaya К. et.al..

1987a, 1987b). При этом и непосредственное определение современными методами уровня и спектра противотуберкулезных антител далеко не исчерпало себя в качестве средствэ иммунодиагностики и характеристики особенностей течения туберкулеза, а сами препараты противотуберкулезных антител, в том числе моноклональных, еще в недостаточной степени используются для характеристики микобакте-риальных антигенов, приготовления диагностикумов и других целей.

Изучению ряда аспектов этой проблемы и посвяшэна настоящая работа. При этом, основное внимание было уделено изучению гуморального иммунного ответа, индуцированного микобактериями бычьего вида, исходя из того положения,что данный вид микобактерин является основным возбудителем туберкулеза у крупного рогатого скота (и довольно часто у людей), а также из того, что этот вид мико-бактериз вызывает заболевание у животных (в том числе у линейных мышея) (Crange J.M., Collins С. Н., 1937) в большей степени напоминающее туберкулез у человека, чем при инфицировании другими видами микобактерий, что важно при моделировании туберкулезной инфекции в эксперименте.

. Целью настоящего исследования являлся анализ антителообразо-вания против М.bovis 8 и изучение вдиотипических взаимодействий, характеризующих антимикобактериальные моноклональные антитела и их антиидиотипы. В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Охарактеризовать структуру комплексных антигенов М.bovis 8, выделенных различными способами - ультразвуковые дезинтеграты (УЗД) и клеточные гтенки (КС).

2. Изучить различия в спектрах специфических антител к фракционированным антигенам М.bovis 8 у больного и здорового крупного рогатого скота.

3. Разработать способ иммунизации мышей антигенами М.bovis 8 для создания оптимального гуморального иммунного ответа. Получить и охарактеризовать моноклональные антитела против М.bovis 8.

4. Разработать метод индукции сингенного антиидаотишческого иммунного ответа против антимикобактериальных моноклональных антител и изучить взаимодействие антиидиотипических антител с противотуберкулезными антителами и сенсибилизированными лимфоцитами мышей, иммунизированных антигенами М.bovis 8 и анти-ИД.

Научная новизна.

Впервые охарактеризованы спектры антимикобактериальных антител сыворотки здорового и больного туберкулезом крупного рогатого скота. Установлено,что для больных животных характерны антитела реагирующие с детерминантами антигенов молекулярной массой 19, 22-24, 25 и 27кДа.

Разработан способ иммунизации мышея линии BALB/c для индукции первичного гуморального иммунного ответа против М. bovis 8, высокого по уровню и широкого по спектру антител, оптимального для получения моноклональных антител (МАТ)(его основным моментом явилась иммунизация в подушки лап). При получении гибридом в случае использования разработанной схемы, частота слияния составила 31,71Ж, а эффективность слияния 27,7%.'Получена серия МАТ, реагирующих как с микобактериями М.tuberculosis complex, так и преимущественно с М.bovis, ши перекрестно с целым рядом микобактерий. Три МАТ реагировали с рекомбинантным белком 19кДа.

С помощью МАТ в сингенной системе был индуцирован антиидио-типическиа иммунный ответ. С повышением степени очистки анти-ИД антисыворотки повышалась активность связывания анти-ИД антител с гомологичными МАТ. Очищенные анти-ИД реагировали более активно с сыворотками больного туберкулезом, чем здорового крупного рогато-

го скота. Анти-ИД вызывали дозозависимую стимуляцию пролиферации клеток лимфоузлов мьгшея, иммунизированных как этим ш анти-ИД, так и "исходным" антигеном М.bovis 8. Пролиферацию ингибировал ИД МАТ, использованный для индукции анти-ИД антител.

Практическая значимость.

Изучены спектры противотуберкулезных антител у больного туберкулезом и здорового крупного рогатого скота, выявлены иммуно-доминантные антигены, которые наиболее перспективны для иммунодиагностики туберкулеза у крупного рогатого скота.

Разработана оптимальная схема иммунизации мышей микобактери-альными антигенами, позволяющая сократить сроки иммунизации для получения моноклональкых антител еще в процессе первичного ответа.

Получен ряд новых пропаратов моноклональных антител и их ан-тиидиотипов, индуцированных в сингенных мышах и имеющих потенциальную диагностическую значимость.

Положения, выносимые на защиту.

1. Качественная характеристика спектра антимикобактериальных антител сыворотки крупного рогатого скота позволяет выявлять у больных животных антитёла, реагирующие с иммунодоминантными антигенами М.bovis 8, иными чем у здоровых особей.

2. Способ однокрзтной иммунизации мышей линии BAIB/c в подушки лап антигеном клеточных стенок М.bovis 8, позволяет получить высокий по урозкю и разнообразный по спектру первичный гуморальный иммунный ответ, оптимальный для получения моноклональных антител к этим антигенам.

3. Индукция анти-ИД антител антимикобактериальными МАТ в сикгонноа системе позволила получить антиидаотипическиа препарат, распознаваемый противотуберкулезными антителами и лимфоцитами, иммунными к антигенам микобзктерия.

Апробация работы Основные положения диссертации доложены: на конференции молодых ученых "Актуальные вопросы фтизиатриии и пульмонологии" (г. Москва, 1988 г.), на XI республиканской конференции по фтизиатрии и пульмонологии (г.Таллин, 1988),на Симпозиуме "Фундаменталь-но-прикладныв исследования во фтизиатрии" (г.Москва, 1989 г.), на научно-практической конференции по туберкулезу (г.Самарканд, 1989 г.), на 2-ом Всесоюзном симпозиуме "Реабилитация иммунной системы" (г.Дагомыс, 1990г.),на отраслевом совещании "Разработка диагностикумов для выявления туберкулеза у людей и крупного рогатого скота" (г.Оболенск, 1989 г.), на съезде фтизиатров Молдовы (г.Кишинев, 1991г.),на заседании отдела иммунологии ЦНИИ туберкулеза РАМН (1992г.), на XI съезде фтизиатров (г.Санкт-Петербург, 1992 г.).

Объем работы.

Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, приложения к обзору литературы и указателя литературы, включающего 297 работ. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 4 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методики исследования Исследования были проведены на 150 мышах линии ВАЬВ/с и 116 сыворотках крупного рогатого скота (КРС).

Мышея иммунизировали антигенами М.bovis 8 подкожно: в ß точек, либо в подушечки лап или внутривенно. Каждая мышь получала за I инъекцию ЮОмкг белка антигена в виде ЮОмкл суспензии (содержащей половинный объем неполног адъюванта Фрейнда). Кровь для исследований забирали из венозного синуса глаза.

- е -

Из разных видов микобактерия, (М.tuberculosis H37Rv, М.bovis 8, М.bovis Vallee, M.bovis BCG, M. scroiulaceiun, M.avium, M.intracellular, M.kansasll, M.phlel, M.marlnun, M.phlel) и Escherichia coli готовили комплексные препараты антигенов. Основным объектом исследования были препзраты, полученные из M.bovisS, а остальные, главным образом, служили в качестве контроля. Бактерии подвергали облучению (2,5 млрд рад) и далее обрабатывали 2-мя способами: а) дезинтеграцией на ультразвуковом дезинтеграторе (Bransonic 1500, США) при 300Вт 1-2 мин - так получали ультразвуковой дозинтеграт (УЗД), б) пассированием бактериальной массы через тонкую иглу на клеточном прессе Риби (Rlbl Cell Tractionator RF-1, Ivan Sorvall, США) под давлением 30000 psl получали антигенный препарат клеточных стенок (КС) микобактврий.

.Для фракционирования антигенов примэняли электрофоретическиэ методы - градиентный нативный электрофорез (градиент полиакрил-гмидного геля - 4-ЗОЖ) и диск-электрофорез (градиент пористости 10-17% в присутствии додецилсульфата натрия, при редуцирующих условиях) (ДСН-ПААГ). Электрофореграммы антигенов микобактерий и ихмуноблоттинги сканировали на лазерном денситометре Ультроскан XL (LKB, Швеция).

Для характеристики актителообразования, отбора гибридом (скрининга), определения изотипа МАТ использовали прямые и непрямые методы иумуноферментного анализа, в качестве метки использовали пероксидазу хрена, коньюгированную с иммуноглобулинами (коммерческие или самостоятельно приготовленные препараты), цветная реакция развивалась за счет ортофенилендиамина (Sigr.a, США). Реакция вырзжалась в единицах оптической плотности, при считывании се' на ридэро Titertek Uniskan II (Flow, Великобритания).

При качественной характеристике антител сывороток КРС, мы-

шей, а также мококлональных антител использовали метод иммуно-блоттинга. Для этих целей проводили ДСН-ПААГ электрофорез УЗД М. bovis 8 с последующим электропереносом разделившихся фракций на шпроцеллюлозную мембрану полусухим методом на приборе Trans-Blot® SD (Bio-Rad, США) в трех-<5уферноя системе (Kyhse-Andersen J., 1984). Вторыми антителами служили антитела против иммуноглобулинов исследуемой сыворотки, коньюгированные с пероксидазой хрена, в качестве субстрата цветной реакции использовали 4-хлоро-I-нафтол (Sigma,США).

Для очистки препаратов иммуноглобулинов применяли аффинную хроматографию на белок-глкггаральдегидном сорбенте и сорбенте, приготовленном на основе BrCN-активированноа сефарозы 4В (Pharmacia, Швеция).

Пролиферативные тесты проводили культивированием клеток лимфоузлов мышей в плоскодонных планшетах (Nunc, Дания) в количестве

с

5x10 на лунку в среда KPMI 1640 с необходимыми добавками и с добавлением стимулирующих агентов. Активацию оценивали по включению % тимвдина в ДНК пролиферирующих клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Для решения первой из поставленных задач было проведен электрофорез антигенных препаратов УЗД и КС М. bovis 8, с последующей дэнситометриэй. Установлено, что основные белковые компоненты УЗД и КС, разделенные натавным электрофорезом, находятся в области Ю-ЮОкДа. УЗД являются более богатыми по содержанию белка, однако в КС содержится ряд белков, отсутствующих или находящихся в меньшей концентрации в УЗД, например в области 14-22кДа и 50-бОкДа, КС не содержат низкомолекулярных компонентов (ниже 5кДа.), представляющих собой продукты денатурации белков. В УЗД, фракционированных в ДСН-ПААГ диск-электрофорезе было обнаружено около

50-ти белковых фракций, локализованных в области IO-IOO кДа. При ДСН-ПААГ электрофорезе КС не удалось добиться качественного разделения отдельных компонентов, вероятно потому, что КС содержат большое количество нерастворимых соединений (липиды, миколатные комплексы и пр.), а белки КС связаны в белок-пептидогликановыэ комплексы, которые с вышеуказанными соединениями образуют жесткую структуру оболочки микобактериг (Barnes Р.Г., et.al.,1989). Существует ряд методов экстракции для очистки белков КС, однако в результате такой очистки иммуногенность препаратов резко снижается и поэтому в настоящей работе использовали "нативные" КС.

На следующем этапе работы методом иммуноблоттинга изучали спектр антител к разным антигенам микобактерий в сыворотках крупного рогатого скота (63 здоровых и 53 больных туберкулезом). Был вычислен процент встречаемости антител к антигенам микобактерий в диапазоне молекулярных масс от 10 до ЮОкДа, разбитом на 90 классов с шагом 1кДа (рис.1). Были обнаружены существенные различия встречаемости антител к ряду антигенов в группах больного и здорового КРС:14-15кДа (28,30 и 0%), 16-17кДа (33,96 и 1.58Ж), 19-20кДа (54,71 и 6,34%), 22-23кДа (73 , 5835 и 9,528), 25-28кДа (69,81 И 19,042), 27-28кДа (50,94 и 12,69%), 56-57кДа (18,86 и 1.58%), 63-64кДа (7,54 и 0%), 70-71кДа (9,43 и 0%). 94-95кДа (7,54 и 0%)., Из этих антигенов наибольший интерес представляют антигены с молекулярной массой 14, 19, 22-24, 25, 56 и 94 кДа, к которым определяются антитела почти у всех больных и значительно реже здоровых животных. Кроме того, эти белки содержат специфические антигенные детерминанты для М.tuberculosis complex, а в ряде случаев ввдоспецифическио для М.bovis (Morris J.А., et al, 1985; Wood P. R., et.al.,1988). Другие антигены, к которым определялись антитела у больных в большем проценте случаев, чем у здоровых, содержат

- 9 -

Г i

Г :

Г :

Г : .......?

Г : , а

V» г

..........;........... '//Ул. ..+Ж * ж., ж..?.*. 1.

ш

Ii

р

j......i

VAirr

___Jitili^iöQ

O lo 20 30 40 SO 60 70 80 30 J.OO

Молекулярная масса <кДа>

Рисунок KI. Гистограмма процента встречаемости антител против антигенов М.bovis 8, различной молекулярной массы, в сыворотках больного и здорового КРС.

перекрестные антигенные детерминанты <к ним относятся так называемые белки теплового шока) (Balrd P.N.,1988; Shinnik Т.М. et.al., 1989). К ряду антигенов антитела обнаруживались в одинаковом проценте случаев у больных и здоровых (29-30, 30-31, 31-32, 35-36, 55-56кДа) и даже чаще у здорового КРС (38-39, 39-40, 45-46, 47-48 кДа). Вышеприведенные данные дают указание на то, какие антигенные компоненты могут быть использованы в качестве диагностических препаратов, а также использованы для иммунизации с целью получения антител (в том числа моноклональных) и стимуляции Т-клеток.

На следующем эташ были испытаны различные схемы иммунизации мышей для получения оптимального гуморального иммунного ответа и противотуберкулезных моноклональных антител. Анализ литературы по данному вопросу позволил рассмотреть ряд способов иммунизации растворимыми и корпускулярными антигенами микобактериа М.tuberculosis complex, кроме того использованы результаты более рзнних работ по получению МАТ, выполненных в лаборатории биотехнологии Центрального НИИ туберкулеза АМН России. На основании этого ана-

лиза были выбраны два метода иммунизации мышей: а) в подушечки лап; б) в 2 точки спины и в подаышечные и паховые области (всего 6 точек). Уровень сывороточных антител определяли в ИФА и иммуно-блоттинге (Рис.2 и 3). Содержание антител было достоверно выше при введении антигена в подушечки лап, особенно существенны эти различия были через 2 недели после начала иммунизации и менее выражены через 4 недели. При этом после иммунизации в подушечки лап была достигнута большая специфичность гуморального ответа - значительно более высокий уровень реакции с гомологичным антигеном КС М.bovis 8, использованным дм иммунизации, чем с гетерологич-ными микобактериальными антигенами. В этом случае наибольшая специфичность была обнаружена также через 2 недели, поело однократной инъекции. Анализ спектра антител сывороток мышея в иммуно-блоттинге с последующей денсигометрией показал, что через 2 недели после начала подкожной иммунизации антитела к денатурированным белкам М.bovis 8 практически отсутствовали , а при иммунизации в подушечки лап определялись антитела к антигенам в областях: 1719, 23-27, 33-40 , 48-54 кДа, последующие иммунизации не изменяли спектра антител, а лишь повышали интенсивность реакции в указанных областях. В случае подкожной иммунизации, повторное введение антигена давало менее интенсивный и менее широкий спетр антител (основные денсигометрические пики в области 22-30кДа) (Рис.3).

Исходя из результатов анализа вышеприведенных исследования душ получения моноклональных аЕтател была проведена однократная инъекция 100 мкг белка КС М.bovis 8 в неполном адьюванте Фрейнда в подушки лап мышей-самок BAIB/c. У иммунизированных таким образом мышей через 2 недели в сыворотках (в разведении 1:1000) определялись антимикобактериальные антитела более 1,0 ед.опг. плот-кости при 0^донм, что является своеобразным критерием развития

Рисунок №2. Профили уровней антимикобактериальных антител, измеренных методом иммуноферментного анализа, в сывороках двух груш мышей, иммунизированных КС М.bovis 8, в зависимости от срока и способа иммунизации - подкожно, gg - в подушки лап), микобактериальным антигеном и разведения сыворотки.

Н-явш» KMxvRHMtom!

Sa. з. & 3.4-

3

о io го 23 - адк£ют(по»ы»н:

ЗО 40 so со

Хояекзглярная vaпса < кЛа >

О

Рисунок

30 30 40 SO 60 70 ео 90 iOO Холскалярная кваоа <кЛа>

КЗ. Совмещенные денситограммы иммуноблоттинга с пулиро-ванными сыворотками мылэа двух групп, кммуниктаоБэкль.'Х КС М.bovis 8, в зависимости от срока и спсссЗз иммунизации (П - подкожно в 6 точек; gg - в подудхи лап), по реакции с денатурированными и рсакциониссванзыми в ДСН-ПААГ-электрофорезе* антигенами УЗД М. bcvls 8.

иммунного ответа достаточного для использования иммунных клеток в гибридизации. Клетки подколенных лимфатических узлов мышей (с наиболее высоки;,1 уровнем антител) забирали на 15 день после введения антигена и пйридизовали с клетками миеломы РЗ-ХбЗ Ag8.5.6.3 в соотношении 4:1 в 50% полизтиленгликоле 4000. Гибридные клоны культивировали в С02-инкубаторе, клонировали и реклонировали методом лимитирующих разведений сначала в HAI-содержащей среде, затем в НТ-среде и после этого в "полной" среде без НАГ и HT. На всех этапах культивирования супернатанты гибридных клонов скрини-ровали методом ИФА на панели микобактериальных антигенов и Е. coli. Отобранные клоны, реагирующие с М.tuberculosis complex, сла-бореагирующие с другими микобактеридаи и не реагирующие с I. coli, наращивали в больших объемах в клеточных культурах и в асцитах (в перитонеальной полости сингенных мышей) и замораживали. Ре;.,/льтаты гибридизации были следующими: частота слияния - число лунок с клеточными колониями по отношению к общему числу лунок -31,7%, эффективность слияния специфических B-клеток лимфатических узлов (% положительных лунок) - 27,7%. Получено 15 устойчивых гибридом, они выращены в асцитах-и в культуральных супернатантах.

Изучена специфичность связывания МАТ с антигенами микобакта-рия. Для этого ira асцитов и супернатантов культур гибридных клонов сульфатом аммония БОЖ-насыщения высаливали фракции иммуноглобулинов, затем, эти фракции подвергали дополнительной очистке на кммунсСорбенте с кроличьими иммуноглобулинами против Ig мыши. Очищенные таким образом МАТ исследовали в ИФА с УЗД и КС различ-/ных микобактерия, а также-Е.coli и лизогенного штамма E.coli, содержащего плазмиду рМГ-2 <pUCî19), зкспрессирующую ген рекомби-нантного бежа 19 кДа М. tuberculosis (Рис.4). Глобулины МАТ разводили в концентрациях: 10нг, ЮОнг, 1мкг, 10мкг, ЮОмкг, 1мг и

2мг на мл раствора. Было установлено, что MAT 3G8D5 реагировали только с клеточными стенками микобактерий М.bovis 8 и М.bovis BCG. Остальные МАТ были направлены против антигена 19кДа М.tuberculosis complex, что подтверждалось их особенно активным связыванием с рекомбинантным белком 19кДа. При этом MAT 1D2C4 продемонстрировали довольно высокую степень перекрестной реактивности с антигенами разных видов микобактерий, MAT 3F1D9D11 реагировали с М.tuberculosis complex и M.kansasii, а антитела 4B5B7G3G6H1 практически только с антигенами микобактерий М. tuberculosis complex.

Был определен изотип вышеуказанных МАТ, для этого в ИФА использовали панель кроличьих антител против мышиных подклассов иммуноглобулинов и их легких цепей. MAT 3G8B5 и 1В2С4 были IgG2b-изотипа, 3F1D9D11 - IgG2a и 4B5B7G3C6H1 относились к IgM- классу, все МАТ имели легкие «-цепи.

Молекулярную массу антигенов, с которыми реагировали" МАТ, определяли в иммуноблоттинге с антигенами УЗД М.bovis 8. Было показано, что 3 из этих МАТ реагируют с белком 19кДа М.bovis 8 и М. tuberculosis H37Rv. При этом они не распознавали антигенов других микобактерий, что может быть обусловлено меньшей чувствительностью иммуноблоттинга, чем ИФА и/или изменением стереохимических свойств антигенных детерминант МАТ на антигенах атипичных микобактерий под влиянием редуцирующих условий в ДСК-ПААГ диск- электрофорезе .

Другим большим разделом работы было получение сингекнсго зн-тиидиотипического иммунного ответа против противотуберкулезных МАТ. Для этих целей первоначально отработана схема имм/кизэцки: сингенным мышам BALB/c 7 раз с интервалом в недолга вводили ЮОмхг иммуноглобулинов MAT 3F1B9D11 внутривенно, подкожно в 6 течек и з подушечки лап. Антиидиотипическиэ антитела (знти-КД) определяли

3F1D9DJJL

Рисунок к 4. Тиграционныв кривые уровня связывания МАТ в ИФА с Щ - КС и [В] - УЗД микобактериа: Рек.белок 19кДа -

рекомбинантный белок 19кДа М.tuberculosis; M.bov - М. bovis 8; H37Rv - М.tuberculosis H37Rv; M.BCG - M.bovis BCG; M.kans.- M.kansasii; M.avl. - M.avium; M.scr.- M. scroíulaceum; M.lnt.- M.intracellulare; M.oth. - M. .iortuitum, M.marinum и M.smegmatls.

на 14, 28 и 42 день в прямой реакции ИФА сыворотки мышей в разве-дании 1:100, 1:1000 и 1:4000 с MAT 3F1D9D11, моченным пероксида-зоя хрена (Рис.5).

Наиболее высокие уровни анти-ИД определялись у мышей, иммунизированных в подушки лап, при этом наблюдались достоверные раз-

od492tim 1

0.8 0.6 0.4

È :

Е :

| :

"^smamx-rJ^

■ ■ ■ ■ ..........'

lliOO lllOOO H4000

Р«вВВДВВИ1 омворотки

il 100 lllOOO 1 14000

Рйфведкниа dusopdtkh

1HOO 1HOOO 1 l-iOOO

CilsopoTKK

Рисунок № 5. Уровни антиидиотипических антител в сыворотках мышея, иммунизированных MAI 3F1D9D11: А - в подушечки лап, В - подкожно в 6 точек, С - внутривенно; 5= - на 14 день, § - на 28 день и 3 - на 42 день после начала иммунизации.

личия с другими группами мышея, особенно значимы эти различия были на 28 день иммунизации. При внутривенной и подкожной иммунизации уровни реакции с МАТ едва превышали уровень неспецифического связывания с нормальной машинной сывороткой.

В последующем анти-ВД ант/тела были подвергнуты последовательной очистке трехкратным переосаждениэм сульфатом аммония 50% насыщения и аффинно на колонке с иммуносорбентом, содержащим'кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыли. Затем проводили ис-тощениз полученных иммуноглобулинов с помощью болск- глхггаральдо-гидного иммуносорбента, приготовленного из иммуноглобулинов ин-тактных мышея. Активность связывания препаратоз анти-ДЦ антител на разных этапах очистки сравнивали з ¡©А с меченными пороксндэ-зой MAT 3F1D9D11 и 3G3E5. По мере очистки происходило достоверное обогащение иммуноглсбулияовых фракция знти-ДД антителами <Рис.в).

о

О, 8 О,7 О.6 О,5 О, Л О.Э О.2 О.Х

уУ-л-■У/у//,

-1-й

Рисунок КЗ. Динамика очистки анти-ИД сывороток мышей, иммунизированных МАТ ЗПБЭОП, по данным ИФА с □ - ЗПБЭБИ и

^ - ЗС8Б5, меченными пероксидазой хрена; А - иммуно-глобулиновая фракция сьворотки интактных мышей линии . ВА1В/с; В - иммуноглобулиновая фракция исходной анти-ИД сыворотки мышей; С - аффинно-выделенные анти-ИД иммуноглобулины из исходной фракции; Б - анти-ИД иммуноглобулины, истощенные на сорбенте из нормальных иммуноглобулинов мышей ВАЬВ/с.

Анти-ИД антитела были исследованы в тестах гуморального и клеточного иммунитета. Так, с их помощью в ИФА определяли антитела ;о специфическим вдиотипом МАТ ЗГШБП в сыворотках КРС (20 больных и 20 здоровых, в разведении 1:100), в качестве вторых антител использовали пероксвдазный конъюгат кроличьих антител против иммуноглобул.шов крупного рогатого скота, истощенных на иммуноглобулинах мыши. Было отмечено, что у всех больных животных определялись антитела, реагирующие с анти-ИД МАТ ЗГ1Б9Б11 (М±с: 0,253±0,076), у части здоровых они также присутствовали (0,150± 0,052), однако различия между группами были недостоверны. Наряду с зтим обнаружены значительные различия в уровне реакции стандартных (промышленного производства для проведения реакции связывания комплемента) положительной (содержащей противотуберкулезные антитела) и отрицательной- сывороток КРС (0,445±0.038 и 0,187± 0,023, соответственно). Недостоверные различия между группами

О,9

возможно объясняются тем, что MAI 3F1B9D11, использованные для индукции анти-ИД антител, не являлись абсолютно специфическими по отношению к М.bovis 8 и реагировали с антигенами M.kansasii.

Анти-ИД антитела использовали для изучения их сткмуляторноя активности на клеточные культуры лимфатических узлов сингенных мышея. Для этих целей мышей линии BAIB/c иммунизировали в подушки лап КС М.bovis 8 и очищенными анти-ВД антителами против идиотипа 3F1D9D11 ЮОмкг белка на мышь. Через 2 недели из подколенного лимфоузла выделяли клетки и стимулировали рядом антигенов: УЗД Ii. bovis 8, анти-ИД антителами и МАТ 3F1D9D11 H.3G8D5. Результата этих исследований продемонстрировали, что стимуляцию пролиферация клеток лимфатических углов мышей, иммунизированных анти-ИД или КС М.bovis 8, вызывают как антиген, так и анти-ИД, что служит косвенным доказательством наличия "внутреннего образа" антигена на вариабельных участках анти-КЦ антител. Отмечено повышение уровня стимуляции на препараты последовательной очистки знти-ИД антител.

В последующие исследованиях изучали дозсзависетую стимуляция анти-ИД клеток лимфоузлов мышей, иммунизированных КС М.bovis 8. Параллельно исследовали дозозависимый эффект при стклуляшш УЗД М.bovis 8 и действие второго антигенного стимула (УЗД М.bovis 8 25 мкг/мл) при стимуляции различными дозами анти-ИД (в пределах 0-30 мкг/мл). Отмечен дсзсзэбисиуый эффект стимулирующего д.^гст-вия анти-ИД и антигена на клетки лимфоузлов и показано отсутствие блокировки антигенами УЗД М.bovis 8 стимуляция клэток знтк-ИД.

Для изучения специфической идиотипическоя супрессии, клетки лимфатических узлоз мышея, иммунизированных КС М.bovis о, сг.'у.у-лирсвали гомологичным антигеном или анти-ИД (з дезе 10 ккг/Ул) и добавляли второй агент- ициотип МАТ 3F1I9D11 сразу посла Бнес?::;:л в культуру первого стимула или через два часа (Рис.7).

Рисунок is 7. Влияние второго стимула на пролиферацию клеток лимфоузлов мышей BAIB/c, иммунных к KÖ М.bovis 8; А -спонтанная пролиферация, В - действие первого стимула: □ - КС М.bovis 8 и ig - анти-ИД MAT ЗГ1D9D1 1 ; вторые

стимулирующие агенты: С - MAI 3F1D9D11, добавленные одновременно с первым стимулом, D - MAT 3F1D9D11. добавленные через 2 часа после первого стимула.

Утановлено, что при одновременном действии анти-ИД и МАТ имела место полная отмена пролиферации, снижение реакции (сушест-вепое, но неполное) отмечалось при одновременном воздействии антигена и МАТ. То,что супрессия была полной в случае анти-ИД и менее существенной при стимуляции антигеном, вполне понятно.так как антигенный спектр препарата УЗД M.bovi3 8, бесспорно шире, чем анти-ИД. Введение второго стимула через 2 часа не вызывало специфической супрессии, что свидетельствует о действии связывающего идиотипа на ранние этапы процессинга и презентации антигена мак-рофаг^льными клетками, длительность которых составляет 2 часа.

- 19 -В Ы В О Д.И

•I. Электрофоретиче с кие исследования УЗД и КС микобактерия bovis 8 продемонстрировали качественные и количественные различия этих препаратов.

2. Методом иммуноблоттинга выявлены иммунодоминантные антигены (19, 22-24, 25 и 27кДа), к которым преимущественно обнаруживались антитела в сыворотках больного крупного рогатого скота, и значительно реже - в сыворотках здоровых животных.

3. Иммунизация мышей КС М.bovis 8 в подушечки лап приводит к более интенсивному и разнообразному по спектру, антител гуморальному иммунному ответу, чем подкожная иммунизация. Специфичность первичного иммунного ответа по отношению к М.tuberculosis conplex выше, чем вторичного. Однократная иммунизация в подушечки лап является оптимальным методом для получения моноклональных антител (с использованием для слияния клеток лимфатических узлов).

4. Получена серия моноклональных антител, реагирующих с антигенами М.bovis (I МАТ), с М.tuberculosis complex (3 МАТ) и перекрестно с многими видами микобактерия (I МАТ). Три МАТ реагировали с антигеном 19кДа М.tuberculosis complex. Эти МАТ принадлежали к подклассам - IgG2a, IgG2b, классу Ig№ и имели изотип - к (каппа) легкой цепи.

5. Разработана оптимальная схема (с введением антигена в подушечки лап) иммунизации МАТ сингенных мышея для получения анги-идиотипическсго иммунного ответа. По мерз очистки анти-ИД антител активность и специфичность их связывания с соответствующими МАТ увеличивалась.

6. Антиидиотипические детерминанты знти-КД распознаются идиотипами антимикобактеризльных антител (реагируют с противотуберкулезными антителами сыворотки крупного рогатого скота).

7. Анти-ВД антитела являются дозозависимым стимулом для клеток лимфоузлов мышей, иммунизированных антигенами КС M.bovis 8 и самими анти-ИЦ. Исследование конкурентных взаимоотношений между антигенами M.bovis 8, МАТ к этим антигенам и анти-ИД к этим МАТ указывает на сходство процессинга микобактериальных антигенов и антиидиотипических антител при Т-клеточном ответе. Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Получение и испытание препаратов микобактериальных антигенов и аы-имикобактериальных антител с использованием методов иммунохимии и гибридомноа технологии./В.И.Литвинов., Л.Н.Черноусова, Б.Ш. Гильбурд, В.Г.Авдиенко, Н.В.Куликовская// Мат.1 Всесоюзного съезда иммунологов, г. Сочи.- 1989, T.I, с.159.

2. Серодиагностика туберкулеза с использованием методов микроанализа. /В. И. Литвинов, Л.Н.Черноусова, В.Г.Авдаэнко, А.В.Баенский// 5-и Съезд фтизиатров Белоруссии, Минск.- 1989, с.179-181.

3. Разработка диагностикумов для выявления туберкулеза у людей и крупного рогатого скота./В.И.Литвинов., Л.Н.Черноусова, А.Н.Марков, В.Г.Авдиэнко, Н.В.Куликовская, А.В.Баэнский// Труды ВНИИ Прикладной микробиологии, г.Оболэнск.- 1289, с.132.

4. Перельман Б.В., Авдиенко В.Г.,-Литвинов В.И. Получение генно-инженерных белков Mycobacterium tuberculosis./ Проблемы туберкулеза. - 1991, WI2, с.39-41.

5. Авдиенко В.Г.., Крамник И.Б., Алт А.С., Литвинов В.И. Получение и испытание сингенных аитиидиотшических антител против антимико-бактериальных моноклональных антител.// Проблемы туберкулеза. -1992, в печати.

Подписано и печать Qt. QQ 1

МАЛОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ПЕТИТ»

Зак. СМ Тир. /00