Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ИНДИКАЦИЯ ЛИЗОЦИМСОДЕРЖАЩИХ КЛЕТОК МОЛОЗИВА КОРОВ

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ВЕТЕРИНАРНАЯ АКАДЕМИЯ имени К. И. СКРЯБИНА

ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ИНДИКАЦИЯ ЛИЗОЦИМСОДЕРЖАЩИХ КЛЕТОК МОЛОЗИВА

КОРОВ

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология к микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

На правах рукописи

САТЮКОВА Людмила Григорьевна

УДК 619:576.8.077.3./636.2

Москва —

1983

~.Л>гп K-f. ! t •• ' <• - ' '

Работа выполнена а Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии 'нме»и -К. И.' Скрябина.

Научный руководитель — доктор ветеринарных наук, доцент Емельяненко П. А.

Официальные оопоненты:

1. Доктор 'ветеринарных наук, профессор Архангельский И. И.

2. Кандидат 'ветеринарных наук, доцент Стрельников А. П.

Ведущая организация: Всесоюзный ордена Ленина научно -н-сс л ад паз тел ьох н if институт экспериментальной ветеринарии им. Я- Р. Коваленко.

Защита состоится «/У^» /¿Л?¿$£,¿3 J983 г. ичасов 'на заседании -опециализнр^ан^ого совета К-120.36.06 по присуждению ученой стелен и кандидата н амк в Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии им. К. И. Скрябина (109472, Москва, ул. Академика Скрябина, '23, тел. 377-93-83).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке MB А.

Автореферат разослан «/К » 1983 г.

Ученый секретарь специализированного совета / v Глушков А. А,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В 'Продовольственной программе СССР, принятой -майским {1982 г.)" Пленумом ЦК КПСС, большое внимание уделяется развитию 'молочного скотоводства. Однако 'болеэн-и (вымени значительно снижают удой и ухудшают с а янтарное качество молока, привадят ж развитию 'энтеритов у телят, получающих 'молозиво и молоко этих коров. Важную роль в ¡поддержании нормального функцио», тгрования ¡молочной железы 1коров исследователи, отводят лизощтму (Григорян Г. С., 1967, 1968, 1974; Мутошга В. И., 1969, 1974 и другие). Установлена (прямая корреляция адеж-ду уровнем лизоцима в секретах, вымени и воспалительным ггроцеосом ¡в 1 иголочной (железе новотельных коров, что указывает на (принципиально новую возможность ранней диагностики :маст>итс>в еще молозианьш мер и ад. Л нэоцим моло-: зива имеете с секреторными шуму нот лобул и н ам и оказывает - коррегирующее шлиячгме и на шикрофлору ¡кишечника ново-, рожденных телят. При дефиците этих- двух факторов в-опаиваемом молозиве у телят развеваются острые желудоч-„ но-чсицгечньге заболевания. Лизоцим обладает иммуностимулирующим действием и отражает функциональное -состояние фагоцитов. Следовательно, (полнее ¡представление о лизоциме секретов вымени коров и (прежде -всего о -его продуцентах поможет более быстро и объективно .оценить лемму н об поло-тичеакое состояние молочной железы и иммунные свойства молозива. Однако до сих дар не определены антигенные 'свойслэа лизоцима молозива «аров, не оценен 'клеточный ¡пул с учетом функционального 'состояния форменных элементов, не установлены «летки, синтезирующие и сегрегирующие лизоцим, ■что связано с отсутствием информации об определен;!« данного фермента у даров на уровне отдельных клеток.

Цель и задачи исследований. Учитывая важное значение 'клеток-шродуцентов лизоцим а -для иммунологической характеристики молочной железы и ее секретов, шеред нам« была поставлена цель — испытать (возможность иммунохн-мического .выявления лизоцим'содержацшх клеток в молозн-

©е коров первых трех дней лактации. Для достижения указанной цели необходимо было решить 'Следующие задачи:

1. Определить оптимальные условия выделения гомогенного препарата люзоцима -из молозива коров.

2. 'Получить .специфическую антисыворотку к лизоциму ■молозива торов.

3. -Провести цитологический анализ молозива -коров лер-*вых трех иней лактации.

4. В сравнительных опытах попытать индикационные возможности метода флуоресцирующих антител и иммунофер-ментного метода с целью обнаружения лиэощдасощврвкащих клеток молозива.

Научная новизна работы. 1. Впервые тол учен очищенный ¡препарат лизоцнма молозива коров. Установлено, что для выделения его" с ¡помощью аффинной хроматографии необходима •предварительная обработка молозива раствором сычужного ферм«1"1,3 (Госкомшобретений СССР принято •положительное решение о «выдаче авторакого свидетельства ято заявке 3395786/28—>13 «Способ »выделения дизошша из молозива»)'.

2. Доказана гомогенность лнзоцима молозива коров, антигенная общность его с лизоцимом других секретов организма крупного рогатого окота и ««идентичность антигенным детерминантам лнзоцима других видов животных.

3. Показано, что основной пул клеток молозива «представлен нейгрофил-а'ми, уровень -которых не (подвержен существенным -сезонным колебаниям.

4. При обнаружении лизоцимоодержавдих клеток молозива коров ©первые установлены индикационные преимущества иммун оф ерментното метода »перед иммунофлуорес-центньгм.

.: 5. Доказана преимущественная локализащия лиэоцима в цитоплазме толиморфнюяд ер н ы х и моионгуклеарных фагоцитов молозива коров. Лизсщим также содержится на внешней мембране части лимфоцитов молозива.

Практическая ценность работы."Разработана технология выделения гомогенного 'препарата лизоцим'а молозива коров н изготовления а'нтисъгвороткн, .пригодной для иммунше-раксидазного определения лиэощшсадержашкх клеток, которая может быть ишользована игри определении иммунобиологического состояния -молочной железы и иммунные •свойств молозива коров.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены я ■одобрены на научных конференциях ветеринарного фа-куль-тета Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии им. К. И. Скрябина (1981 и 1982 гг.), 2

на конференции молодых учёных ВНИИВС (1982 г.), на совместном заседании сотрудников асафедр микр обж>лк>ги и, вирусологии, эпизоотологии, акушерства и искусственного осеменения сел ьюко'хоз я и спве иных животных МВА (1983 г.), ■а та'иже на' заседании игроблемной научно-методической ко-■миосни это инфекционным й инвазионным болезням животных (1982 т.-), у ч ебно - м ет од нч ее ком совете ветеринарного факул&тета МВА (1982 т.).

Публикация. По теме догосертаццги опубликованы 3 научнее работы.

Объем работы. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста, иллк&трнровайа 12 фотографиями, ГО таблицами, 2 графиками и состоит из следующих разделов': введение,' обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и атрактлчё-бкие (предложения. Список литературы «включает 198 источ-йгков, из них — ИЗ иностранных.

СОБСТВЕННЫЕ КС С Л ЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования

Данная работа является фрагментом комплексной разработки диатиостокумов и создания специфических препаратов для диагностики и (профилактики <пновмоэктерлтов телят, - проводимого сотрушшками кафедры <и лаборатории'микробиологии (МВА шод руководством доцента Емельяненко П. А.

Ра'бота выполнялась на кафедре микробиологии Москов-. екой ветеринарной академии и на базе учебно-опытного хозяйства «Леоновское» Воскресенского района Московской области. В опытах попользовали клинически здоровых животных без признаи«зв мастита. Клиническое обследование и диагностическое исследование молока на скрытое течение болезни проводили согласно «Методтечеаким указаниям по диагностике, лечению и профилактике маститов у коров» (Утв. Главветулром МСХ СССР, 1973). От коров (подопытной труппы брали ■МОЛОЗИ1ВО в первые три дня лактации для выделения лизоцима, цитологических исследований и инди-jiaifHH лиэоцимсодержащих клеток. Молозиво (получали в осезгне-зи'мний и весенне-летний сезоны от коров чержмпест-рой и холмогорской шорсцд 1—6 лактации. В .пробах молозива исключали примесь крови качественной реакцией с реактивом «БО» ^Козырев Ю. А., 1972).

Лиэощпм выделяли колоночной -аффинной хроматографией с напользов ан нем дезаминированного хитина дальневосточных крабов по 'методу Черкасова И. А. и Краечен-

ко Н. А. (1966). Подготовку исходного молозива проводили тго опоообу Chandan, Parry, Shahaní(1965) в сочетании с обработкой сульфатом аммония или осаждением казеина раствором сычужного фермента. При тол-учен ни сыворотки ■молозива вторым способом иопользовали промышленный трап&рат ВНИИВС, ■который соответствовал техническим условиям ТУ 49211'—72, (производства завода сычужного фермента Московского (производственного объединения. «Молоко»,

Определение литической активности лизоцюма проводили ■согласно «Методнчесжим указаниям но тестированию естест-,вен[?ой резистентности телот» (1930). , .

Активные фра(КЦ№и вьдделенж*го препарата лизоцима кон-центрироэали с (помощью окугаэти л енглшоля ■mjm. 35000 (Loba chemie, Austranal).,

Гомогенность "выделенного отрет арата лизоцима тодтвер-ЖД£-'гн д и с кэл ек трофорезом (R-eisfield et aL, 1962) ® 15%-дам ■по л и акр ил а м ид ном геле, иагтользуя установку и реактивы для электрофореза фирмы «Реанал» (ВНР). С целью лолу-•чения специфической шгтисыворотки выделенным ¡препаратом молознвнопо лизоцима иммунизировали 6 кроликов породы шиншилла 1—3-летнего возраста шо четырем схемам: Кио-Chung-Juan (1960), Joung et al: (1970), Selsted, Martinez (1978), Takagaki, et al, (1980), дополненным -. нно-куляцией'нЕтивното препарата лизоцима.

Лиофнлизацню 'irp-en арата лизоцима молозива и сстецн- «-фичеокой антисыворотки 'К лизошг.чу 'Проводили в ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи на сублимационной -установке ТР-15 (ГДР) яюсле предварительного замораживания (препаратов (при —40° аз течение 72 часов. "

Цитолог)гчесжий анализ н индикацию лизоцимсодержа-щнх клеток (проводили .в молозиве первых трех дней лактации от 25 здороюых .коров. Приготовление мазкоио-осадоч-ных -препаратов для этих исследований осуществляли <в щадящем режим«, иапользуя <си ли ко 11 иров энную етасуду, центрифугирование отобранных (проб молозива при 150 g .15— 20 мин. н двукратное тромьгеание осадка раствором Версена с (последующим ополаскиванием забуференным изотоническим раствором хлорида натрия. Окраску фиксированных охлажденным ацетоном и метиловым спиртом мазков проводили шромильными .растворами азура П-эозина в соответствии с «Методическими указаниями по тестированию естественной резистентности телят» (1980). Для исследования мазково-осадоч-ных ттрепа'ратов из <молозива -применяли световой мдароскап типа МБР-3 и люминесцентный микроскоп

мл-г.

Им м-у н охнм ич еоку ю индикацию клеток молозива коров осуществляли двумя методами — с помощью непрямого двухэтажного 'варианта -метода флуоресцирующих антител (МФА) и непрямого (варианта иммуноперокотдазного метола (ИМП), как это описано Зубжицким Ю. Н. (1964) и Авиловым В. С. с сотрудниками (1981), соответственно. Для исследования адаэково-осадочных ¡препаратов молозива МФА в качестве сыворотки второй ступени мспользовали ослиную сухую люминесцирующую сыворотку лроттгв глобулинов кролика серии 386 производства ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи, При наследовании м аэково-ос ад оч ] i ы х препаратов с и-агюль-эаванием ИПМ на втором sxaine примеияли оижъгагат — у-глобулиновую фракцию к lg G.кролика (Производства фирмы «Сер®а» (ФРГ), -меченную -пероксидазой хрена, этой же фирмы. Кюнъюгат бьгл любезно предоставлен научным сотрудником ВНИИВВпМ МСХ СССР Щегникодаой Л. А. Перок с ид аз у выявляли раствором диа-минобензидина (производства фирмы «Серва» (ФРГ). , . -

Фаггоцитарную активность клеток молозива определяли •но захватывающей и переваривающей тест-mi краб функции в соответствии с «Методическими указаниями по тестиров з-* нию естественной резистентности телят» (ВАСХНИЛ, 1980), О захватывающей активности судили тагmpoueirry фагоцитоза и фагоцитарному индексу моноцитов и -нейтр-офилов, о " (переваривающей функции — то индексу завершенности-фагоцитоза лейкоцитами.

Результаты хроматографии лнэоцима обрабатывали по -формулам, приведенным в монографии Кочетова Г. А. (1980); среднюю арифметическую, разницу между средними арифметическими и коэффициент -корреляции вычисляли <по формулам, приведенным -в монографии Рокицкого П. Ф. (1961). Достоверность найденных величин определяли то таблицам Стъюдента. Обработку проводили на электронно-вычислительной машине «Нанр-н С> (оператор Кушнир-ская А. М.).

Микросъемки -выполняли на микроскопе. Nu-2 Carl Zeiss Jena (ГДР) с фогонасадкой «mf>, объектив планохромат Е 100X1,30. Для -получения негативов попользовали высококонтрастную фотопленку «Микрат-200».

ПОЛУЧЕНИЕ ГОМОГЕННОГО ПРЕПАРАТА ЛИЗОЦИМА И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АНТИСЫВОРОТКИ

К НЕМУ

Молозиво пергеых трех дней после -отела в отличие от ¡других биологических жидкостей •обладает шысокой плотностью и содержит да 20% белка, что мешает проведению хроматографии. "Необходимо -было этодабрать оптимальные условия стредварительной обработки натлвнаго »молозива, ■максимально сохраняющие липгческую и антигенную аиггнв-ность лизошгма и /позволяющие 'провести аффданую хроматографию.

В результате подготовки ттроб молозива способом под-кислеиия в сочетании с высаливанием и различным походным уровнем лтадцкмной а-киюности (от 414,9 ел/мл до 4841,2 ед/мл), в ¡сыворотке молозива после тгодкисления, выезд ?гв ани я' -сульф'атом аммония и диализа лит ячеек а я активность лизоцима резко снижалась и составляла от 16,6 еш/мл ^о 691,6 ед/мл, т. е. гга 80—90%. Однако данный оггособ об еа л ¿чаевал высокую ¡степень очистки" исходного "'-молозива от'балла'стиых''белков, что игрив од и ло к снижению "плотности сиворонки и свободному протекай ню ее* сто адсорбенту. Боже дагр, при хроматографии (полученной сш^ороткл молозива на цолрике с ДХ дара^ав при ск<^гррсти ¡протек а'йря I "капля в 8 секунд оснавн а-я масс а'' л гооцим'а элюиравалась -при пропускании через'иолшмсу' фосфатного бункера"/на' хитине сорСдарогаалась 'лишь' незначительная часть' фермента. Таким * образом, подготовка проб молозива ж аффинной хроматографии (путем шодкисления в сочетании с (высаливанием оказалась непригодной из-эа трупдоемкости, снижения ферментативной азстивности и способности лдаоцима сорбиро^

субстрате.

Учитывая это, мы испытали пригодность для обработки обезжиренного ':молоэ1гва раствора сычужного фермента. Подготовка проб молозива с различным уровнем литической активности, .варьирующей от 155,6 ед/мл до' 17290 ед/мл по этому отоедбу дозволила полупить сьвв(оротку с лит^ческой активностью даэоцима'от 155.6 ед/мл до''6483,8 ед/мл. Остаточная активность фермента, таким образом, ■сохранялась на 40—90%, при этом сы^орот^а дфодно протекала ® 'колонке с'адсорбентом. Иагтользуя раствор сычужного' фермента' отадготовке' 'молозива"(для хроматографии^'* 'мы ' наблюдали 100%-иую сорбцию лизоцима на хитине,'актгшный препарат лиэощнма молозива деспрби-ровался р,2 М раствором уксус-6

«

sïlli*

тб Я и w «•ж*

m А ■ -

® e * _ _

w g 5 ¡

it i a oiE o -4? .g s«

Г-Д-Й ггй'

3! Я*3 w ; si

■s-tt-JS -i

-Í4 й-S'ï »

„ е S-E« Рв-й«

.¡я ЛИ

^ s"3 s g X üjss ■«> " '

giSfêèâBr

S a -

S ÍS'H s ъ -S" S »-§ --1-й 4. 3 -s s

■S S g ?

a E S .-■£

н"й m и (»У

a o s E Va v, » Ь ь a 5 S л ÄS tu .. О «

* w ö g t¡

s ч -а s &

Й Х'ЯГ я Ц Q-a и тз

ö.ß's я • » « в <

Щ §11 ■X о й ч

,<е Си

(С 8 .

00

-(л N м

<1

СП С4

| I 7967,5

СП

■ , ы

Я ■ гг

. £ А 8

Стадия очистки лизоцнма молозива

Общее количество белка, мгХобьем

Объем ферментного раствора, мл

Активность ед/мл

Общая активность, ед. 1 млх о&ът раствора

Удельная активность, ед. акт.

Степень очистки, кол-во раз

Выход фермента (%0т исходной активности)

геле. Цельная, антисыворотка в РДП выявляла до 0,76 мт/мл гомологичного антигена.

В реакции диффузионной преципитации лизоцим куриного яйца, -слюны человека и сыворотки жрови барана не реагировал с а'нтисьторогкой -к лизоцим у молозива коров, тогда как с лизоцимом :молозива, слюны, сыворотки -крови, молока и слез ¡круетного рогатого скота — полученная антисыворотка образовывала сану полосу отрешшиташш.

Результаты цитологического анализа молозива коров первых трех дней лактации

■При исследовании под микроскопом -маэково-осадочных ■препаратов из (молозива коров было- отмечено незначительное отклонение морфологической структуры лейкоцитов молозива от лейкоцитов крови (Крупного рогатого скота. Ней-трофилоциты содержали жировые шарики в 'Циташгазме, что приводило, ло-'вндимому, .к образованию так называемых «перстневидных» клеток, также встречающихся в мазках из молозива. «Перстневидные» ислежи незначительно ¡превышали то «размерам ней трофилоциты. Включения жира гна-блюдалн и в цитоплазме моноцитов, что весьма затрудняло дифференциацию их от клеток «пены» ил« ^печати». Клетки «пены», ¡по сравнению с моноцитами,, имели значительно большие размеры и более пенистую цитоплазму. Зозинофи-лы встретились всего в -одном образце из 25 обследованных коров первого дня лактащш, в мазках второго и третьего дн-ей.лактации эозинофилы не обнаружены. Базофилыв маз- * ках из молозива не были найдены ни в одном случае исследования. . , . .■

Учитывая лишь: лейкоциты здоровых коров 'первых трех дней лактации в осенне-зимний и ¡весенне-летний--сезоны, мы (получили следующие результаты определения относительно-то содержания клеток в молозиве (табл. 2). ...... I

Лейкоциты -молозива жоров представлены нейтрофилами (около 70%), лимфоцитами (около 16%) и моноцитами {■около 14%). Среди иейтрофилов .преобладают сегменто-ядерные формы. Дополнительными, расчетами достоверности разницы между щолученными величинами установлено, что на протяжении первых трех дней лактации динамические изменения в содержании клеток достоверно регистрируются лишь среди лимфоцитов, юных и сегментоядерных ■ иейтрофилов. Относительное содержание -первых и вторых с каждым днем Л'акташш. коров снижается, число третьих, наобо-8

рот, возрастает. Содержание других лейкоцитарных клеток в молозиве впервые три дня после отела торов поддерживается на ¡постоянном уровне.

"Г а блица 2

Количественно« соотношение лейкоцитов молозива коров в первые три дня лактации в осенний и весенний периоды

; Лейкоциты

Деть лактации

Относительное содержание лейкоцитов 1±гахД

осень

весна

Разница между сезонам» года

Лвмфшдты 1 2 3 1Б,0±1,4 17,0±1,6 31^0±2,7 31,0±2,3 33,0±7,9 16,0±3,0 15,0*3,0 16,0±8,0 <0,01 <0,01 >0,05

Палочкоядерные нейгрофилы 1 2 .3 ЗПУШ.Э 280±2,0 25,0^1,7 яб.о±л;а 19,0±1,2 29.0±2,4 16.0±2,0 ' 9.0±2,3 4,0±3,0 <0,01 <0^01 >0,05

Сегменте ядерн ые нейтрофилы - 1 2 3 39,0±1,7 43,0±3,0 49.0 ±3.6 42,0±2,9 44,0±2,5 60,0±7.1 3^±3.4 1,0±4,0 дч;о±8,о >0,05 >0,06 >0,05

Юные нейтро-фнлы "* * ■ 1 '18,0±1]Т 2 17,0±1.7 3 ! 16.0^1,3 ■17-,0±1.5 1 1.0 ±11.9 13,0±1,3 \ 4,0±2,1 Д3,0±3,0 ! 3,0±3,4 >0,05 >0.05 >0,05

Моноциты 1 | №#±0,9 2 | Ч5,0;±1,0 3 ! 13.0 ±1,2 13,0±0.7 1Г2.0±0.2 '№.0±2,0 о,о±:1;5 } >0.05 3,0±.!,0 1 >0,05 3,0±2.3 1 >0.05

у Количественное соотношение лейкоцитов изменяется также и в зависимости от времени года. По сравнению с весной в осенний период в ■молозиве тертзсхго и второго дней лактации количество лимфоцитов уменьшается .вдвое. Содержание лалачжоядерных нейтрофилоцитов в 'молозиве коров (первых двух дней лактации осенью, наоборот, повышается.

Относительное содержание других лейкоцитарных-¡клеток в зависимости от сезона года существенно не меняется.

В каждом из исследованных мазккив наблюдали разнообразные до форме и размерам .клеши «пены».

Интересуясь функциональным значением «лето« молозива коров, мы ^провели серию опытов тю едгределекйю фагоцитарной активности' лейкоцитов молозива "лёршого дня лактации.

Захватывающая опое об! г ость выражена как у нейтрофи-лов, так и моноцитов, но процент фагоцитоза и фагоцитарный индекс несколько выше был« у нейтрофнло® -'молозива. Индекс завершендости фагоцитоза лейкоцитов составил 0,30±0,05, т. в переваривании 'микроорганизмов участвовало примерно треть лейкоцитов.

Наряду с лейкоцитами фагоцитарной активностью обладали та'кже клетки «пены». Однако поскольку исследованное лейкоциты были конта минированы микроорганизмами еще до введения в систему тест-микроба, приведенные данное мы расцениваем ка,к предварительные.

Имея конечной целью работы идентификацию лизошш-содержащих .клеток, нам представлялось «интересным выяснить активность лиэошша па этих же "пробах молозива в зависимости от сезона года и срока лактации (табл. 3).

Таблица 3

Изменение лнтвчесхой активности лнэоцлма молозива коров первых трех дней лактации я зависимости от кременм года

День Сезон Л ктическа я активность лиз сплина 1±Ш1, ед/ил Разница между «езоизда

лактации года Р

1 Ооекь Весна 4014,7 ±24,7 (746,3±6,6 2268,4 ±35,0 <о,ш

2 Осень Весна 3388,8±25,7 1305,4±3,7 2053,|±26,()

3 | Оосиь | Веска ■ГО44,2±6,0 ' 760,8±5,0 538,4±8,0 1 \ <0,01 [

Как видно из та>бл, 3, логическая активность лиэоцдема в .молозиве в осенний «тержад примерно в два раза выше, чем весной,'и уменьшается к третьему дню лактации.

- Для выявления связи между уровнем логической активности л-изони-ма и содержанием, лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов в молозиве коров 'первых трех дней лактации результаты (проведенного эксперимента был*и ает-роксимиро-ваны девятью зави-с им остами. Линейная зависимость уровня л-итичеокой активности лизюцима от .содержания лимфоцитов и нейтрофшюв молозива ■наблюдалась в первый день лактации, что шок азан о в табл. 4.

Таблица 4

.Коэффициент корреляции (г ± я) между уровнем дитической активности лизоцмма и процентом лейкоцитов в молозиве коров первого дня лактации

Лейкоциты п | г±о I I ■ Р

- - I ! I '

Лимфоциты 14 —0,69±0,14 4,67 <0,01

Не.^трофнлы 14 0.63±0,|16 3,97 <,0,0-1

Моноциты 14 —оле±о,2б 0,59 >0#5

Как видно из та'бл. 4, в первых двух случаях зарегистрирована тесная стат1гстичеакая связь: 'коэффициент корреля-ни'и между' уровнем' лит гоч-еако й акти вности "л изоцим а и содержания- л1шфодитов равен минус "0,68, а между " уровнем активности''фермента и содержанием .нейтрофилов пглюс 0,ф3. В шервом' случае овязь отрицательная. Значит, уменьшение уровня л итнческой" актнвности' ли-зоци-ма -сопряжено с увеличением числа лимфоцитов. Во 'втором случае связь положительна?, ""т. е. 'оба иака-эателя ¿говыща^отся одновременно.

Можно считать, что выявленная связь носит линейный характер. Данной связи не ¡прослеживается 'При изменении .количества моноцитов в первый день лактации коров. Однако (в третий день лактации в параболической зависимости второго порядка и ангроксимирова-нни по формуле 2,30,46х— 0,02х2 »прослеживается (положительная связь между уровнем литичеокой активности лиэоцима и количеством моноцитов, что указывает на зависимость литической активности лизощма и от содержания моноцитов в молозиве.

Индикация лизоцимсодержаших клеток

Главная трудность три индокацни клеток молозива с помощью метода флуоресцирующих антител заключалась -в том, что до 80% случаев исследования мазков в поле зрения микроскопа ¡встречали .круглые и бесформенные образования, светящиеся всей поверхностью. Подобное, ио менее интенсивное «свечение наблюдали и в контрольных препаратах, где >в качестве сыворотки .перовой ступени' попользовали -нормальные глобулины кролика. Провести дифференциацию ядерных клеток было чрезвычайно трудно из-за маскирующего свечения. Увеличивая время и количест&о отмываний .меток молозива, мы не смогли избавиться от неапецифнче-ского свечения в мазково-осадочных треп аратах и добиться четкой дифференциации клеток. Допуская, ■ что [помехой могла быть сорбция меченых ФИТЦ глобулинов кролика на жировых шариках, мы изменили способ фиксации мазков: вместо обезвоженного метилового спирта использовали фиксацию охлажденным ацетоном. Однако замена, метилового спирта ацетонам существенно не улучшила результаты им-мунофлуоресиентной индикации.

Наиболее приемлемым для индикации и идентификации лизоцимсодержаших клеток в молозиве оказался непрямой (вариант жчмунопероксидазного метода. Дополнительная окраска мазков раствором азур II и эозина после иммуно-ферментного выявления лизоцима позволила четко дифференцировать -клетки молозива по характерной окраске ядра и его морфологии. В контрольных препаратах иммунонгерок- г -свдаз-наго комплекса не обнаружено. Клетки принимали слегка заметную дополнительную окраску азура II и эозина.

В препаратах мазков молозива, фиксированных охлажденным ацетоном, наблюдали более четкую морфологию клеток, чем при обработке м-азков обезвоженным метиловым спиртом. Клетками, содержащими лизоцим, считали те, .которые имели в своей структуре гранулы коричневого цвета, независимо от интенсивности их окраски. Подсчитывали 100 ядерных «слеток >и находили процент лизоцимсодержа-Щ'нх. При 'микроскопни опытных мазково-осадочных препаратов молозива обнаружено, что мммуноп ер оксида зны й комплекс располагается в виде гранул, наягомииающнх просяное •зерно. Часто гранулы фермента соединены вместе в виде глыбок и расположены в цитоплазме нейгрофилов, моноцитов и на поверхности лимфоцитов, а также во 'внеклеточном (пространстве. Наиболее темную окраску иммуноггероксида-з-ного комплекса наблюдали в нейтрофилах, где он располагался ¡по всей цитоплазме клетки а виде плотной решетки. 12

В 'моноцитах »ммунаперсжоидааный -комплекс расположен в свободном от жировых шариков1 етространстве. Содержание иммунопертесидазного .комплекса-в лим'фоцитах наблюдали (примерно « 60% этих клеток (табл. 5) молозива первых трех дней лактации. Кате -правило, 'Перокеидазный комплекс рааполатался на »поверхности ■клеточной мембраны в виде зерен различного раамер-а. Иногда гранулы локализовались в-киде иояска что всей поверхности клетки. Нейтрофилы, моноциты и клетки «таены» во всех случаях содержали лиэо-цнм. Интенсивность окраски '»ммунолегромсидазного комплекса колебалась от светлого до: интенсивного темно-коричневого цвета.

• Та блик а 5

Результаты иммунопероксидазного анализа мазков о-осадочных препаратов молозива коров первых трех дней лактации

;; Клетки молозива

Нейтрофилы ■ Моноциты Лимфоциты Клетки «пены»

% «леток, содержащих им-

М)Ч5С>перок-

сидазпый комплекс

.100

! ■ ■ )

1 Локализация им- {

) мунопе р оксида а- ;

. кого комплекса ; в клетке

Интенсивность окраски перок-«гдазы

10

60

100

цитоплазма

цитоплазма

поверхность

клеточной

мембраны

цпгоплазма

от светлого до интенсивно темно-коричневого

от светлого до интенсивно темно-коричневого

светло-корнч левого

от светлого до темно - кор ич 1ЮВОГО

Таким образом, непрямым вариантом иммунопероксидазного метода и-ам удалось идентифицировать нелегки молозива, содержащие лнзоцим, К юга относятся преимущественно ней графили, моноциты и клегкц -шены». Гранулы лшоинма рашоложены также на поверхностной мембра.н-е части лимфоцитов.

■ Выводы

1. Для выделения -с помощью аффинной хроматографии гомогенного (препарата лизоцим а из молозива .моров необходима предвЕрительная обработка его раствором сычужного фермента.

2. Антисызоротка к этому препарату специфически взаимодействует с лизоцимом других биологических жвдкостеГг организ-ма крупного рогатого скота и ие реагирует с гетеро-логичным ферментом, что свидетельствует о видовой специфичности лизошша молозива коров,

3. В 'молозиве коров содержатся обладающие фатх>ци-тарнон акт-ианостью нейтрофилы, моноциты, а также лимфоциты, количество которых не существенно варьирует с каждым цнем лактации.

4. Установлена связь между уровнем актив-поста лизоци-■ма и .содержанием нейтрофилов и моноцитов в .молозиве, что согласуется с повышением обоих показателей в осенний период года.

5. В сравнительных опытах по обнаружению Л'изоцимсо-дерэкащих клеток в -молозиве коров выявлены индикационные ¡преимущества иммуноперомсидазно^о м-етада1 перед им-мунофлуоресцентным.

6. Лиэоцим в основном локализуется е цитоплазме полиморф коядер ных н мононуклеарных фагоцитов и частично на внешней мембране лимфоцитов молозива коров.

Практические предложения

1. На основании .полученных результатов составлены «Методические рекомендации по' -выделению лизоцима да ■молозива коров и 'получение к нему апецифической антисы-еоротки», псоторые одобрены методическим советом ветеринарного факультета MB А (протокол № 3 от -21 декабря 1982 г.) и 'Представлены на утверждение в ВАСХНИЛ.

2. Для индикации лизоцимсодержащих клеток в молозиве коров рекомендуем жммунопероксидазный метод.

По материалам диссертации опубликованы работы:

1. Сатюко-ва Л. Г. Получеше антисывороткн к лизошшу коров, — М., 1982, Рукопись представлена Моск. вет, акад. им. К. И, Скрябина. Деп. в ВНИИТЭИСХ, 11982, № 100—82, Опубл. в серии: Ветеринария, 1982, № 7, с. 74.

2. Сатюкова Л. Г. Выделение препарата лизоцима из молоэи.ва коров. — М., 11982, Рукогтнсь представлена Моск. вет, акад. им. К. И. Скрябина, Деп. в ВНИИТЭИСХ, 4982, № 164—82. Опубл. в серии: Ветеринария. 4-982. № 11, с, 89.

3. Сатюкова Л. Г. Цитологический анализ молозива, — Ветеринария, 1983, № 2, с. 34—35.

Л 77775 4.Х-83 г.

Зак. 1258. Тяр. 100

Типография Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии имени К. И. Скрябина 109472, Москва, ул. Академика Скрябина 23