Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммунодефицитные состояния и особенности иммунокоррекции организма телят

Представленная в виде научного доклада диссертационная работа является результатом 24-летних экспериментальных исследований общих и местных механизмов естественной резистентности и иммунологической реактивности крупного рогатого скота. Работа выполнена в соответствии с государственной, хоздоговорной и инициативной программами.

Актуальность темы. Генетически детерминированный статус организма поддерживают, в основном, системы естественной резистентности и иммунитета. Дефицит естественной резистентности и иммунологической реактивности, обусловленный недостаточным морфологическим развитием и ослаблением функциональной активности органов и тканей, формирующих защитные системы, является одной из главных причин распространения и неблагоприятного течения болезней разной этиологии. По данным Е.С. Воронина (1994), 90% новорожденных телят находятся в состоянии иммунодефицита. Заболеваемость приплода, полученного от коров с признаками иммунодефицита, достигает 100%, а отход — 33% (Ю.Ф. Петров, В.И. Иванов, 1994).

Отечественными и зарубежными исследователями в последние годы выполнен ряд работ по изучению естественной резистентности и иммунологической реактивности крупного рогатого скота (И.Ф. Храбу-стовский, 1968; П,А, Емельяненко, 1980; К,А, Петраков, 1983; Г.Н. Печникова, 1987; Е.С. Воронин, 1991; Ю.Н. Федоров, 1996; Leirer, Steinback, Meyer, 1969; Mack, Pahrol, 1971; Logan, Perihale, 1971; Buck, Stalei, 1980 и др.).

Однако к началу нашей работы комплексных системных исследований по изучению этиологии и патогенеза дефицита естественной резистентности и иммунологической реактивности у телят в условиях производства не проводилось,- не были разработаны и научно обоснованы методы борьбы с ним.

Цель работы — изучить взаимодействие специфических и неспецифических факторов в защитных механизмах у крупного рогатого скота, установить основные причины, вызывающие их супрессию в условиях существующих методов разВеДекйя, разработать тесты дЛЯ ди= агностики и методы коррекции дефицита естественной резистентности и иммунологической реактивности у телят.

Основные задачи исследований

1.Изучить динамику общих и местных факторов резистентности у здоровых телят в разные периоды постнатального развития.

2.Определить влияние молочной продуктивности, условий кормления и содержания коров на формирование защитных механизмов у приплода.

3.Изучить влияние острых респираторных вирусных инфекций и хирургической травмы на естественную резистентность и иммунологическую реактивность телят.

4.Определить влияние иммуноглобулинов разных классов на гуморальные и клеточные показатели естественной резистентности, установить их защитные и лечебные свойства.

5.Изучить влияние иммуномодуляторов на защитные системы организма: клинически здоровых телят; глубокостельных коров и их приплода; больных острыми респираторными вирусными инфекциями телят и при хирургической травме.

6.Разработать методы тестирования иммунодефицитного состояния организма крупного рогатого скота.

7.Сравнить динамику накопления антител к ИРТ и аденовирусам в сыворотке крови и носоглоточной слизи телят.

8.Провести сравнительное определение ИРТ и аденовирусов в патологическом материале традиционными вирусологическими методами и при помощи ДНК-зондов.

Научная новизна

Впервые комплексно изучены возрастная динамика и уровни клеточных и гуморальных показателей естественной резистентности и иммунологической реактивности у здоровых телят, определено содержание общего белка, лизоцима и иммуноглобулинов в слезе, секретах слизистой оболочки•носоглотки и тонкого отдела кишечника. Выделен в чистом виде лизоцим из слизистой оболочки тонкого отдела кишечника и изучены его свойства. Установлено, что несбалансированное кормление и нарушение зоогигиенических норм содержания высокопродуктивных коров служат причиной врожденного дефицита защитных факторов у их приплода. Доказано, что вторичный дефицит естественной резистентности и иммунологической реактивности развивается у телят, больных вирусными респираторными болезнями, и при хирургической травме. Впервые изучены влияние отдельных классов иммуноглобулинов на активность фагоцитоза, бактерицидную и лизоцимную активность сыворотки крови, а также их защитные и лечебные свойства. Установлено трансплацентарное модулирующее влияние Т- и В-активинов на иммунную систему плодов крупного рогатого скота. Изучены динамика антител в сыворотке крови и носоглоточной слизи при ИРТ и аденовирусной инфекции, доказана ведущая роль секреторного 1д в в защите слизистых оболочек носоглотки. Показана высокая эффективность метода молекулярной гибридизации при индикации вирусов ИРТ и адено- в материалах, полученных от больных и переболевших животных.

Научная новизна работы подтверждена следующими документами: авторское свидетельство № 1099613 - "Способ получения лизоци-ма из животного сырья" от 22.02.84 г; авторское свидетельство № 1592988 - "Способ диагностики аденовирусной инфекции и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота" от 15.05.90 г; авторское свидетельство №1655117 - "Способ диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота" от 8.02.91 г; авторское свидетельство № 1827810 - "Способ профилактики иммунодефицита у приплода высокопродуктивных коров" от 13.10.92г.

Практическая значимость Данные, отражающие физиологические уровни защитных факторов у телят разного возраста и коров могут быть использованы в селекционной работе, при оценке влияния на организм животных новых технологий содержания, кормовых, минеральных, витаминных добавок, лекарственных препаратов. Предложен оригинальный метод получения лизоцима из боенских отходов. Разработаны тесты, позволяющие диагностировать дефицит защитных факторов у коров и телят, предложены методы борьбы с ним, основанные на применении препаратов иммуноглобулинов и иммуномодуляторов. Внедрены в практику- новые методы ранней диагностики инфекционного ринотрахеита и аденовирусной инфекции.

Разработаны и одобрены ВАСХНИЛ:

Методические указания по тестированию естественной резистентности телят — от 2.09.80 г;

Методические рекомендации — "Определение факторов естественной р"езястентности в лимфе здорового и больного лимфолейкозои крупного рогатого скота" — от 21.11.86 г;

Методические рекомендации — "Клинико-иммунологический статус и иммунокоррекция при хирургической травме у крупного рогатого скота" — от 31.01.91 г.

Разработаны и утверждены Главным Управлением ветеринарии СССР:

Указания по ранней диагностике инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота — от 21.07.89 г. (в качестве дополнения к Временному наставлению по лабораторной диагностике инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота — от 5.03.89 г);

Указания по ранней диагностике аденовирусной инфекции крупного рогатого скота — от 17.05.90 г (в качестве дополнения к Методическим указаниям по серодиагностике аденовирусной инфекции крупного рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации — от

10.04.89 г);

Методические указания по экспресс-диагностике инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота ДНК-зондом — от

17.01.90 г;

Методические указания по экспресс-диагностике аденовирусной инфекции и групповому типированию аденовирусов крупного рогатого скота ДНК-зондами — от 23.04.90г.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на отчетных конференциях Московской ветеринарной академии им К.И. Скрябина (1975-1999 гг.); Всесоюзной конференции "Проблемы повышения ветеринарно-санитарного качества и биологической ценности продуктов питания животного происхождения и животноводческого сырья"' (9-12 июня 1976 г., г. Горький); Всесоюзной научно-технической конференции "Профилактика и лечение болезней молодняка сельскохозяйственных животных" (9-10 октября 1991 г., г. Воронеж); Всесоюзной научной конференции "Проблемы хирургической патологии сельскохозяйственных животных" (1991 г., г. Белая Церковь)

Разработки по материалам диссертационной работы демонстрировались на ВДНХ СССР и удостоены серебряной медали (Постановление III-U. от 21.11.90 г.)

Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 35 работ, в том числе 3 методических указания, одобренные ВАСХНШ1, 4 указания по диагностике, утвержденные Главным управлением ветеринарии СССР. Получено 4 авторских свидетельства

Основные положения диссертации, выносимые на защиту. Данные, отражающие возрастную динамику показателей естественной резистентности и иммунологической реактивности у телят, комплекс тестов, позволяющих диагностировать дефицит защитных механизмов у крупного рогатого скота, научное обоснование применения иммуноглобулинов для повышения резистентности новорожденных телят, методы ранней диагностики респираторных вирусных инфекций, способ пренатальной коррекции иммунологического статуса у телят. Объем и структура научного доклада

Научный доклад изложен на 49 страницах, иллюстрирован 14 таблицами и 1 рисунком. Он включает следующие разделы: общая характеристика работы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, выводы, практические предложения, список опубликованных по теме диссертационного доклада работ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 1976-1998 гг. на кафедрах микробиологии, внутренних незаразных болезней, в лабораториях генной инженерии вирусов и болезней молодняка Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина. Экспериментальное заражение телят проводили на базах СевероКавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института . и Белорусского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии, хозяйственный опыт — в трех хозяйствах Московской области. Всего в опытах было использовано 180 белых мышей, 175 коров и 475 телят черно-пестрой, холмогорской и красной степной пород.

Кроличьи моноспецифические антисыворотки против Ig Gi, Ig G2, Ig M и Ig А получены нами совместно с О.Н. Грызловой и М.Н. Тулуповой.

При~определении—антител""к вирусам ИРТ аденов " сыв"оратке" крови и носоглоточной слизи использовали наборы эритроцитарных диагностикумов, предложенные А.В. Васильевым с сотр. (1986) и Р.В. Белоусовой с сотр. (1989),. . Диагностические ДНК-зонды получены нами совместно с А.З. Аваковым. ИРТ- ДНК-зонд представляет собой рекомбинантную плазмиду Н/Е-рИС19, имеющую вставку размером 1,2 тыс. нуклеотидных пар из левой части генома вируса ИРТ, штамма 4016. Адено-ДНК-зонды состоят из плазмиды — вектора рИС19 и встроенных EcoRI-C- и EcoRI-D-фрагментов генома вируса АдКРС-3. Все зонды мечены радиоактивным изотопом i2P.

Нормальные иммуноглобулины получали вместе с О.Н. Грызловой осаждением сульфатом аммония и ионообменной хроматографией на DEAE-целлюлозе; Ig Gi — из обезжиренного молозива 1-2-го удоев, Ig G2 — из сыворотки крови, Ig А — из носоглоточных и бронхиальных смывов здорового неиммунизированного крупного рогатого скота. Ig М выделяли из сыворотки крови путем осаждения при диализе против дистиллированной воды и ионообменной хроматографией на DEAE-целлюлозе. Специфические анти-Е. coli 078 К80 Ig G2 и Ig К были получены из сыворотки крови гипериммунизированных, Ig А — из носоглоточных смывов интраназально иммунизированных гомологичным микробом бычков.

Содержание общего белка в препаратах определяли на спектрофотометре СФ-16 при длине волны 280 мкм, концентрацию иммуноглобулинов — методом радиальной иммунодиффузии со специфическими антисыворотками по Манчини, чистоту контролировали при помощи им-муноэлектрофореза с антиглобулиновой сывороткой.

Вирус ИРТ, штамм 4 01'6. и аденовирусы крупного рогатого скота (АдКРС-1, штамм В-10; АдКРС-3, штамм WBR, клон 4; АдКРС-7, штамм "Русь-18") были нам любезно предоставлены лабораторией вирусологии; Е. coli 078: К80 — лабораторией болезней молодняка МГАВМиБ. Для экспериментального заражения телят инфекционным ри-нотрахеитом и аденовирусной инфекцией использовали соответствующие вирусы, имеющие титры 105'5-10с'° ТЦД5о/мл. Заражение проводили однократно, комбинированным способом: 1,5-2,0 мл вируса вводили через нос в виде аэрозоля и 5 мл внутритрахеально. Белых мышей заражали колибактериозом методом интрагастрального введения 0,5 мл 1-миллиардной отмытой агаровой культуры Е. coli 078 К80. При заражении безмолозивных телят колибактериозом им выпаивали по 250 мл указанной культуры однократно.

Естественную резистентность исследовали методами, описанными нами с соавторами в "Методических указаниях по тестированию естественной резистентности телят" (1980 г).

Циркулирующие Т-лимфоциты крови определяли методом розеткооб-разования с эритроцитами барана (Jonotal, 1972), В-лимфоциты - с эритроцитами, нагруженными антителами и С3 (Blanko, 1977).

Бактериологические исследования патматериалов, полученных от спонтанно заболевших и экспериментально зараженных колибактериозом телят, проводили общепринятыми методами. Вирус ИРТ выделяли из носоглоточной слизи в трех слепых пассажах в перевиваемой культуре МДВК в пробирках, аденовирусы - в первичной культуре клеток тестикул быка (ТВ). Идентифицировали вирусы в РН со стандартными антисыворотками.

Молекулярную гибридизацию материалов, полученных от экспериментально зараженных животных с HPTttадено-32Р ДНК-зондами выполняли согласно разработанным нами "Методическим указаниям по экспресс-диагностике инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота ДНК-зондом" (1991), и "Методическим указаниям по экспресс-диагностике аденовирусной инфекции и групповому типирова-нию'аденовирусов крупного рогатого скота ДНК- зондами" (1990).

Антитела к ИРТ и аденовирусам в сыворотке крови тестировали при помощи РН и РИГА.

При исследовании носоглоточной слизи на наличие антител руководствовались разработанными нами "Указаниями по ранней диагностике- аденовирусной инфекции крупного рогатого скота" (1990) и "Указаниями по ранней диагностике инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота" (1989).

Полученные результаты обрабатывали с помощью методов вариационной статистики (П.Ф. Рокитский, 1961). При этом находили среднестатистические показатели (М) и их ошибки (м) , коэффициенты корреляции между ними (г), разницу между среднестабиотическими показателями (Д), ее достоверность (Sd). Достоверными считали различия при значении Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Гуморальные и клеточные показатели естественной резистентности и иммунологической реактивности коров и телят

Физиологические уровни защитных факторов определяли у клинически здоровых животных, в зимне-весенний и летне-осенний сезоны при полуконцентратном и сочном типах кормления в условиях Московской и Ростовской областей. В опытах использовали коров черно-пестрой, холмогорской и красной степной пород и их приплод, Гуморальные показатели изучены на 65 парах мать-приплод, клеточные - на 20. Полученные результаты отражены, в табл. 1.

Как видно из таблицы, в организме новорожденных телят до приема молозива содержатся все защитные факторы, обнаруженные у коров, но в меньших количествах. Концентрация лизоцима, комплемента, бактерицидная активность сыворотки крови, процент фагоцитоза, фагоцитарный индекс, содержание В- и Т-лимфоцитов у приплода а 2-3,5 раза ниже, чем у коров. Иммуноглобулины веех классов у новорожденных животных выявлены в незначительных количествах. При исследовании сыворотки крови 21 новорожденного теленка нами были обнаружены'антитела к вирусу парагриппа у 10 животных (4,3 1од2) , вирусу инфекционного ринотрахеита - у 3 (4,3 1од2) , что подтверждает данные Schultz (1973), П.А. Емельяненко (1987) о способности плодов крупного рогатого скота синтезировать иммуноглобулины. Исключение составил пропердин, содержание которого у приплода было больше, чем у коров.

В молозиве коров обнаружены лизоцим, Ig G, Ig М, Ig А в более высоких концентрациях, чем в сыворотке крови коров. Наиболее высокое содержание указанных факторов было ■ в молозиве первого удоя. Комплемент и пропердин в молозиве установлены в следовых количествах.

Изучение подклассов иммуноглобулина класса G показало, что в сыворотке крови коров удельный вес Ig Gi составляет 55, Ig G2 — 45%; в молозиве — соответственно 95 и 5%.

1. Показатели естественной резистентности и иммунологической реактивности коров и телят.

Показатели Коровы Приплод кровь молозиво до приема молозива 3-й сут. 14-е сут. 1 мес. 2 мес. 3 мес. 6 мес.

1-е сут. 2-е сут. 3-й сут.

Лизоцим, ед/мл. 311,6 ± 50,5 487,0 ± 62,7 227,6 ± 27,6 229,0 ± 103 158,3 ± 15,1 322,612 6, 8 330, 0 ± 33,4 321,7 ± 30,9 350,4 ± 43,3 380,6 ± 47,8 329,6 ± 47,

Комплемент, ед/мл. 326,0 ± 15,0 следы следы следы 156,0. ± 9,0 204,0 ± 10,0 209,0 ± 13, 0 256, 0 ±12,0 252,0 ± 10,0 256,0 ± 12,0 334,0 ± 15,

Пропердин, ед/мл. 3,16 ± 0,24 следы следы следы 3,24 ± 0,20 5,78 ± 0,22 5,35 ± 0,17 5,06 ± 0,16 3,88 ± 0,20 3,15 ± 0,21 3,19 ± 0,

Бак. акт. сыв. крови, ед/мл. 66,41 ± ■ 1,98 26,38 ± 3,77 39,76 ± 3,55 40,12 ± 2,99 45,17 ± 2,44 55,92 ± 2,56 56,26 ± 1,97 55,11 ± 2,

1д 0, мг/мл. .19,09 ± 0,63 ' , ■ ± 5,82 26,09 ± 236 10,61 ± 0,91 0,76 з 0,14 16,50 ± 1,70 13,25 ± 1,68 14,85 ± 2,26 14,58 ± 1,17 18,45 ± 1,21 19,90 ± 1,

1д М, мг/мл. 2,19 ± 0Л1 2,68 + 0,23 1,44 ± 0, 09 0,91 ± 0, 11 0,35 ± 0, 06 1,74 ± 0,15 1,44 ± 0, 19 1,52 ± 0,14 2,50 ± 0,23 2,43 ± 0,23 2,50 ± 0,

1д А, мг/мл. 0,54 ± 0, 07 1,58 ± 0,11 1,24 ± 0, 09 1,13 ± 0,11 0,04 ± 0,03 0,73 ± 0,10 0,35 ± 0, 05 0,38 ± 0, 03 0,50 ± 0,06 0,63 ± 0,12 0,60 ± 0,

Фагоцитоз: % фагоцитоза 65,73 ± 1, 99 — — — 36,50 ± 2,69 64,0 ± 2,64 49,60 ± 7,80 47,6 ± 3, 0 54,80 ± 2,50 60,20 ± 3,45 66,14 + ' 1, индекс фагоцитоза 1,22 ± 0,12 — — 0,58 ± 0, 08 1,11 ± 0,12 0,88 ± 0,13 0,85 ± 0,20 1,08 ± 0,12 1,42 ± 0, 03 1,40 ± 0, переваривания 69,50 ± 4, 00 — 52,40 ± 4, 60 72,20 ± 3,0 70, 0 ± 0,3 68,10± 23, 0 67,20 ± 3,0 68,50 ± 4,50 69,21 ± 3,

Лимфоциты, 10" /л 5,8 ± 0,1 3, 8 ± 0, 3 3,6 ± 0,2 4,3 ± 0,1 4,8 ± 0,1 . 5,1 ± 0,4 5,3 ± 0,2 5,5 ± 0,

В-лимфоциты, Ю9/ л /о 1,4 ± 0,07 24, 1 ± 0,2 0,38 ± 0,03 10,0 ± 0,08 0,85 ± 0, 04 23, 6 ± 0, 1 0, 95 ± 0,06 22,1 ± 0,2 1,1 ± 0,04 22,9 ± 0,1 1,3 ± 0,05 25, 4 ± 0,1 1,25 ± 0,03 23, 6 ± 1,0 1,5 ± 0,07 27,2 ± 0,

Т-лимфоциты, 10®/. л ы /о 2,0 ± 0,14 34,1 ± 0, 9 0,98 ± 0,06 25,8 ± 0, 8 1,1 ± 0, 07 30,5 ± 0, 4 1,15 ± 0, 08 26,7 ± 0,5 1,38 ± 0,04 28,8 ± 0,3 1,6 ± 0, 09 31,3 ± 0,5 1,8 ± 0,1 34,0 ± 1,0 1,95 ± 0,1 35,5 ± 0,

К 3-дневному возрасту после приема и абсорбции молозива уровни всех показателей у телят, за исключением общего количества лимфоцитов, повысились, причем содержание лизоцима, заглатывающая и переваривающая активность фагоцитов достигли значений взрослых животных, а концентрация пропердина превысила их. В" дальнейшем отмечены снижение содержания пропердина, а с 3-месячного возраста - стабилизация его на уровне, установленном у коров.

Общее количество лимфоцитов в крови телят после приема молозива незначительно снизилось, и только с 14-дневного возраста отмечено увеличение их содержания. Ингибирующее влияние молозива на пролиферацию лимфоидной ткани нами было подтверждено в опытах in vitro. Было установлено, что сыворотки молозива и крови 3-дневных телят на 35-50% снижают интенсивность спонтанной пролиферации лимфоцитов селезенки мышей линии СВА в культуре клеток. Сыворотка крови новорожденных, не получавших молозива телят, не проявляла ингибирующих свойств.

Подавление первичного иммунного ответа молозивными антителами отмечали Ю.Н. Федоров, Я.Р. Коваленко (1971); Renshan (1975) . Lospalutto (1970), Б.И. Кондауров (1973) указывают, что ведущую роль при этом играют Ig Gi. Полученные нами результаты раскрывают механизм иммуносупрессорного влияния факторов молозива.

Дифференциация лимфоцитов под влиянием факторов молозива усиливается, о чем свидетельствует увеличение к 3-дневному возрасту содержания В-лимфоцитов на 13,6%, Т-лимфоцитов - на 4,7%. У 14-дневных телят отмечено существенное снижение содержания иммуноглобулинов, процента и индекса фагоцитоза; переваривающая активность нейтрофилов не менялась до конца наблюдения. С месячного возраста содержание изучаемых факторов в организме телят повышалось и к концу наблюдения достигало уровней у коров,

Приведенные данные 'показывают, что в сохранении постоянства внутренней среды организма коров участвуют иммунные и неспецифические факторы защиты. В крови новорожденных телят до выпойки молозива обнаружены дифференцированные лимфоциты и незначительное количество иммуноглобулинов. Это дает основание заключить, что новорожденные телята иммунокомпетентны, однако основную роль в противоинфекционной защите их организма играют неспецифические факторы — лиэоцим, системы комплемента и пропердина, фагоцитарная активность нейтрофилов. Особое внимание обращает на себя обладающий свойствами неспецифических антител пропердин (РЩетег, 1954), содержание которого у новорожденных телят выше, чем у коров. С молозивом, кроме иммуноглобулинов, телята получают лизо-цим и, вероятно, лимитирующий фактор системы пропердина. После приема и абсорбции молозива активность пропердина у них повышается на 78%, С возрастом, по мере повышения содержания иммуноглобулинов и других защитных факторов, она снижается до уровня взрослых животных. Наши исследования показывают, что факторы молозива активизируют фагоцитоз, в основном поглотительную активность нейтрофилов. Влияние их на собственную иммунную систему теленка характеризуется уменьшением общего содержания лимфоцитов в крови и увеличением абсолютного и относительного содержания Т- и В-лимфоцитов, Гипоиммуноглобулинемия и снижение фагоцитарной активности в 14-дневном возрасте телят являются следствием элиминации молозивных и недостаточного синтеза собственных иммуноглобулинов и причиной повышенной заболеваемости молодняка в послемолозивный период. Формирование защитных систем у телят завершается к 6-месячному возрасту.

Данные, характеризующие местные защитные механизмы телят, приведены в табл, 2. Из табл. 2 видно, что в секретах слезной железы и слизистых оболочек носоглотки и тонкого отдела кишечника, наряду с лизоцимом и 1д А выявлен 1д устойчивость которого к протеолитическим кишечным ферментам, вероятно, обусловлена наличием секреторного компонента. Иммуноглобулин класса М содержится в следовых количествах. Более высокая, чем в сыворотке крови, концентрация 1д А и лизоцима в секретах слизистых оболочек свидетельствует о том, что они выполняют в организме барьерную функцию.

Нами разработан оригинальный способ получения лизоцима из кишечного шляма (авторское свидетельство № 1099613 от 22.11.84) и изучены его свойства. Установлено, что содержащийся в секрете слизистой оболочки тонкого отдела кишечника лизоцим относится к типу С, имеет молекулярную массу 14 ООО ± 380 дальтон, устойчив к нагреванию в кислой и не устойчив в щелочной среде, устойчив к протеолитическим и сычужному ферментам.

Он обладает в три раза большей литической активностью, чем стандартный препарат, ее максимум проявляется при рН = 3,5-4,5.

Установлена- сезонная зависимость изучаемых показателей: в летне-осенний период содержание лизоцима, комплемента, иммуноглобулинов, бактерицидная активность сыворотки крови, поглотительная активность фагоцитов были на 15-20% выше, чем в зимне-весенний, Не выявлено достоверной зависимости данных показателей в связи с породой и полом животных.

Методом корреляционного анализа установлено, что у приплода высокопродуктивных коров показатели резистентности ниже, чем у телят, полученных от животных с низкой и средней продуктивностью. В связи с этим нами был проведен опыт по изучению влияния продуктивности матерей, условий их кормления и содержания на резистентность приплода.

2. Содержание общего белка, лизоцима и иммуноглобулинов в слезе и секретах слизистых оболочек верхних .дыхательных путей и тонкого отдела кишечника крупного рогатого скота

Исследуемый материал п Общий белок, мг/мл Лизоцим, ед/мл Иммуноглобулины, мг/мл в М А

Слеза 25 7,14 ± 0,13 7650±1125 -М2175+775 1,6 ± 0,15 0,06 ± 0,01 1,52 ± 0,

Носоглоточная слизь 42 26,0 ± 1,31 422±125 ч-1075±100 3,96 ± 0,63 следы 2,12 ± 0,

Секрет тонкого отдела кишечника 50 18,0 ± 2,0 26700 ± 9729 2,334:0,14 0,6 ± 0,1 1,82 ± 0,

Влияние продуктивности, кормления и условий содержания коров не естественную резистентность и колостральный иммунитет телят

Опыты проводили в июне-сентябре на двух группах коров черно-пестрой породы, 3-5-й лактации, принадлежащих двум разным хозяйствам, и полученных от них телятах.

В первом хозяйстве животные находились на круглогодичном стойловом содержании, не пользовались активным моционом, их продуктивность составляла 6000-6200 кг молока за лактацию на 1 фуражную корову. Рацион коров включал 5 кг сена, 40-50 кг зеленой массы и комбикорм из расчета 400 г на 1 л удоя. В рационе установлен избыток фосфора и азота, дефицит кальция и сахара. При клинических исследованиях у всех подопытных коров отмечали: ожирение, малоподвижность, тахикардию, одышку, рассасывание последних хвостовых позвонков, болезненность и увеличение области печеночного притупления. В сыворотке крови, моче, молоке и молозиве коров было повышено содержание кетоновых тел. Заболеваемость новорожденных телят острыми желудочно-кишечными болезнями по хозяйству составляла 100%, отход — 26%.

Во втором хозяйстве продуктивность подопытных коров составляла 3000-3500 кг. Они содержались в летнем лагере, пользовались пастбищем и получали зеленую подкормку; концентраты вводили в рацион из расчета 200 г на 1 л удоя. Клинически выраженных признаков нарушения обмена веществ у коров не отмечено. Заболеваемость приплода острыми желудочно-кишечными расстройствами составляла 30%, отход был на уровне 2%.

В обоих хозяйствах новорожденным телятам выпаивали молозиво матерей из сосковых поилок 3 раза в сутки по 1,5-2 л. Коров за 60 и 45 суток до отела иммунизировали против сальмонеллеза концентрированной формол-квасцовой вакциной.

Сразу после отела у коров исследовали кровь из яремной вены и молозиво; у телят кровь получали до приема молозива, на 3-, 14-, и 30-е сутки жизни. Результаты исследования приведены в табл. 3, из которой видно, что у высокопродуктивных коров повышено содержание Jg М и лизоцима в сыворотке крови и снижена переваривающая активность нейтрофилов. В молозиве этой группы коров отмечено повышение содержания лизоцима и антител к 3. с!иЬл.п. Однако у приплода высокопродуктивных коров показатели, характеризующие резистентность организма, были снижены. У новорожденных телят до приема молозива уменьшено количество лизоцима в сыворотке крови и снижена переваривающая активность нейтрофилов. Наиболее значительные различия негативного характера отмечены у телят после приема молозива. Так, в трехдневном возрасте, по сравнению с приплодом коров со средней продуктивностью, наблюдали снижение концентрации общего белка на 40%, 1д Б - на 64, 1д М — на 37, лизоцима — на 36, антител к Б. сШЬПп — на 63%, процента фагоцитоза -в 1,6 раза, индекса фагоцитоза - в 2,2 раза, процента переваривания - в 2,4 раза. У 14-суточных животных были снижены содержание Ig G, Ig М, антител к S, dublin и процент переваривания при фагоцитозе. У месячных животных оставалась сниженной переваривающая активность фагоцитов.

Суммируя полученные результаты, можно заключить, " что адинамия и несбалансированное кормление послужили причиной глубокого нарушения обмена веществ у высокопродуктивных коров. По данным И.П. Кондрахина (1983) , при нарушении обмена веществ в крови и секрете молочной железы коров накапливаются кетоновые тела в высоких концентрациях и другие токсичные продукты метаболизма. Вероятно, из крови коров они проникают через плаценту и оказывают отрицательное влияние на формирование защитных систем у плода, о чем свидетельствует снижение переваривающей активности нейтрофи-лов у безмолозивных телят, полученных от высокопродуктивных коров . Так как в молозиве высокопродуктивных коров не установлено достоверного снижения содержания иммуноглобулинов, дефицит коло-стрального иммунитета у их приплода можно объяснить пониженной способностью усваивать молозиво. Снижение способности сорбировать молозиво, вероятно, связано с наличием патологических изменений в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта новорожденных телят, вызванных внутриутробной интоксикацией и воздействием токсических продуктов обмена, содержащихся в молозиве.

Естественная резистентность и иммунитет у телят при инфекционном ринотрахеите

Вирусом инфекционного ринотрахеита заразили 21 бычка 1,5-2 месячного возраста, б контрольных животных получали культураль-ную жидкость. У подопытных животных измеряли температуру тела, определяли пульс и количество дыхательных движений. Кровь и носоглоточную слизь для исследования получали до заражения и на 3-, 5-, 7-, 10-, 15-, 20-, 25-е сутки наблюдения. Вирус ИРТ в носоглоточной слизи тестировали вирусологическим методом и при помощи ИРТ-32Р ДНК-зонда, Предварительные исследования показали, что метод молекулярной гибридизации с ИРТ-32Р ДНК-зондом является специфичным и позволяет определять вирус ИРТ в свежеполученных, замороженных, высушенных тканях организма, носоглоточных смывах, сперме в титрах 1,0-1,5 log ТЦД5о/мл. Содержание антител опреде

3. Естественная резистентность и колостральный иммунитет у телят, полученных от коров, имеющих разную молочную продуктивность и разные условия кормления и содержания.

Показатели Удой 3,0-3,5 тыс. л, М ± т, (п = 10) Удой 6,0-6,2 тыс. л, М ± ш, (п - 10) коровы приплод коровы приплод молози во сыворотка крови при рожд. 3-й сут. 14-е сут. 30-е сут. молози во сыворотка крови при рожд. 3-й сут. 14-е сут. 30-е сут.

Общий белок, мг/мл 232 ± 12 81,0 ± 5, 0 41 ± 5, 0 71 + 7,0 58 ± 9, 0 62 + 5,0 204 ± 27 88 ± 3 34+2 42 + 3* 52 ± 5 51 ±

1д6, мг/мл 52,0 ± 7,0 ' 16,6 ± 0,1 1,0 ± 0,6 17,0 ± 2,0 14,0 ± 2,0 16,0 ± 3, 0 51 ± 4 15,2 ± 0, 4 1,7 ± 0,15 6,0 ± 2,5* 8,0 ± . 2,0* 11,0 + 3,

1дМ, мг/мл 3,0 ± 0,3 2,1 ± 0,2 0,2 ± 0, 06 1,6 ± 0,1 1,5 ± 0,2 1,7 ± 0,1 3,7 + 0,4 3,0 ± 0,2* 0,6 ± 0, 1 1, 0 ± 0, 04* 1,0 + 0,1 1,5 ± 0,

Лизоцим, ед/мл 31В + 67 286 ± 27 206 ± 12 330 ± 34 334 ± 33 326 ± 26 508 + 69* 364 ± 27* 123 ± 14* 210 ± 32* 334 ± 32* 254 ±

Антитела к Б. аиЬПп, 1од2 4,3 + 0,2 4,3 + 0,3 0 з,е ± 0,5 2,4 ± 0,2 1,3 + 0,5 5,2 ± 0,3* 4,6 ± 0,3 0 1,4 ± 0,4* 0,7 + 0,3 0,9 + 0, фагоцитоза 65,2 ± 2,0 36,5 ± 2,7 64, 0 + 2,6 49,6 ± 7,8 47,6 + 3, 0 56,7 ± 6,0 30,3 ± 3,5 40,0 ± 4,1* 46,8 + 7,4 36,8 ± 5,

Индекс фагоцитоза 1,3 ± 0,1 0,6 ± 0,1 1,1 ± 0,1 0,9 ± 0,1 0,9 + 0,2 1,4 ± 0,15 0,4 + 0,1 0,5 ± 0,1* 0,7 ± 0,14 0,92 + 0, переваривания 69,5 ± 4,0 52,4 ± 4,6 72,2 ± 3, 0 70,0 ± 0,3 68,1 + 2,3 37,8 ± 4,3* 31,5 ± 4,8* 30,2 ± 3,3* 46,0 + 2,3* 39,8 ± 4,1*

Статистически достоверные изменения показателей-. Е < 0, ляли в носоглоточной слизи и сыворотке крови. Клинические признаки болезни — угнетение, снижение аппетита, серозно-слизистые истечения из носа, повышение температуры тела до 41-42 °с, одышку, учащение пульса до 95-120 ударов в минуту, гнойно-катаральжкГриниты и конъюнктивиты; увеличение и болезненность" подчелюстных лимфоузлов отмечали через 18-25 ч после заражения. На 9-12-е сутки клинические показатели приходили в норму. Отхода среди подопытных и контрольных животных не отмечено.

Вирус ИРТ в культуре клеток выделяли только на стадии клинического проявления болезни (3-10-е сутки). Методом молекулярной гибридизации с ИРТ-32Р ДНК-зондом вирус тестировали на протяжении всего периода наблюдения. Клинически выздоровевших телят, положительно реагирующих на ДНК-зонд, помещали вместе со здоровыми интактными животными. Через 2-3 суток совместного содержания среди последних наблюдали вспышку инфекционного ринотрахеита. Данные, отражающие влияние инфекционного процесса на общие защитные механизмы телят, приведены в табл. 4. Из табл. видно, что у больных инфекционным ринотрахеитом телят в сыворотке крови снижена концентрация лизоцима, комплемента, иммуноглобулинов и бактерицидная активность. Клиническое выздоровление животных сопровождалось нормализацией гуморальных показателей резистентности. Концентрация 1д М возрастала выше исходного уровня.

Заглатывающая активность фагоцитов увеличивалась во время проявления клинических признаков ИРТ, а переваривающая резко, более чем в 2 раза, снижалась. Отмечали выраженный лейкоцитоз, лимфоцитоз и снижение содержания Т-лимфоцитов. Повышение уровня антител к вирусу ИРТ в сыворотке крови отмечали с 10-го, диагностические титры с 15-25-го дня .после заражения. У контрольных животных достоверных изменений изучаемых показателей не установлено

Состояние естественной резистентности и иммунитета носоглотки у подопытных телят приведено в табл. 5. Данные табл. 5 свидетельствуют о том, что в носоглоточном секрете больных ИРТ животных повышена концентрация общего белка, лизоцима и 1д в. После клинического выздоровления содержание названных факторов снижалось, достигая уровней здоровых телят к 25-му дню, а концентрация 1д А повышалась. Содержание антител к вирусу ИРТ в носоглоточной слизи достигает диагностических титров раньше, чем в сыворотке крови — на 5-7-й день после заражения.

4. Динамика показателей естественной резистентности и иммунологической реактивности телят при экспериментальном инфекционном ринотрахеите (п = 21)

Показатели До заражения Дни после заражения

Лиэоцим, ед/мл 34,1+ 5,1 32,5 + 8,8 26,0 ± 5,1 19,2±7,1 17, 0± 4,2 19,7+ 6,3 35, 6± 4,

Комплемент, ед/мл 291,4 ±10,6 177,5 ± 18,7 ISO, 7+21^ 142,1+18,1 155,7+ 28, 9 185, 0 ±11,1 232,1± 14,

Бакт. акт. сэв. крови, ед/мл. 60,9 ± 3,3 49,3 1 9, 0 55,6±3,1 52,7±4,9 56, 3+ 4,2 57,3 ± 4, 0 67,1+ 4,

1дО. иг/мл. 18,2 1 0,5 16,6 ± 0,8 .16, 2±0, 7 17,3 ± 0,4 18, 2± 0,5 18,57± 0,7 19,6± 1,

1дМ, мг/ш1. 2,0 ± 0,07 2,0 ± 0,03 1,9±0,21 2,6 ± 0,3 3,0± 0,2 3, 07± 0, 2 2,56+ 0,

Антитела к вирусу ИРТ, 1од2 2. 3 2,5 2,7 3,1 3, 9 6,2 6, фагоцитоза 60 ± 8 73 + 3 85±5 87±6 83+ 3 69+ 5 64 + индеко фагоцитоза 0,81 ± 0,3 3,4 ± 0,5 3, 3+0, 4 3,9±0,4 4,2± 0,9 2,4+ 0,2 1,5+ 0, переваривания 0,45 + 0,1 0,22 ± 0,1 0,17±0,1 0, 20±0,2 0, 26± 0,1 0, 42± 0, 1 0, 4 8± 0,

Лейкоциты, 10*/ л 4,37 ± 0,4 5,93 ± 0,7 15,97 ± 0,6 14, 25±0, 8 14,97± 0,

Лимфоциты, 10ч/л 2,82 ± 0,2 3,69 + 0,5 10,9 ± 0,7 10,0±0,6 9, 38± 0,

В-лимфоциты, 10у/ л 0,52 ± 0,1 0,65 ± 0,1 2,56" ± 0,6 2, 56±0,4 2,55+ 0,

19,8 ± 2,1 20,8 ± 0, 9 24,0 ± 6,5 25,3 ± 5,1 26, 3± 7,

Т-лимфоциты, 10ч/ л 0,89 ± 0,1 0,63 ± 0,1 1,78 ± 0,3 2,35±0,2 2,65+ 0,

31,3 1 1,2 17,0 ± 0,5 16,7 ± 3,8 19,2±2,9 28,3 1 0,

5. Динамика общего белка, иммуноглобулинов, лиэоцима и антител в носоглоточной слизи зараженных вирусом ИРТ и контрольных телят (опыт - п=21, контроль - п=6).

Показатели Общий белок, мг/мл Дни после заражения (опыт/контроль)

26,3 ± 1/ 31±2 35±3/ 30+1 50±3/ 32+1 7 9±17/ 32±2 Я81 6/ 31 + 1 60+19/ 31 ± 4 41 ±5/ 32 ± 2 39 ± 7/

Лизоцим, мкг/мл 43±4/ 44 ± 9 112 ± .16/ ' " 48± 4 145 ± 23/ 53± 4 155 ± 16/ 54+ 6 150 + 29/ 52 ± 5 82 ± 26/ 55± 2 601 18/ 41 ± 4 42 ± 11/ 53 i

Ig G, мг/мл 5,0 i 0,2/ 5, 5 ± 0, 9 7,3±0,5/ 5,1 ± 0,1 8,3 ± 0, 4/ 5,2 ± 0,1 10,4±0,8/ 5,5 ± 0,2 12,4 1 0,9/ 5, 3±0,3 7,9 ± 0,6/ 4,8 ± 0,1 6,9±0,5/ 4,8 1 0,1 6,0 i 0, 6/ 5,

Ig А, мг/мл 1,1 ± 0,1/ 2,2 ± 0,1 2,3 ± 0,1/ 2,2 ± 0,1 2,1 ± 0,1/ 2,2+0,1 2,2 ± 0,1/ 2,2 ± 0,2 2,6 ± 0, 1/ 2,31 0,3 2,9 1 0,2/ 2,210,3 2,3 ± 0,2/ 2,3 ± 0,1 2,6 1 0,1/

Антитела к вирусу ИРТ, log. 2,2/2,0 3,0/2,0 8,0/1,8 9, 2/2fi 8,6/2,1 4,9/2,1 2,7/2,0 2,5/2,

После клинического выздоровления уровни местных антител снижались. Следует отметить, что эффективность вирусовыделения в культуре клеток и титры выделенного вируса снижались с увеличением уровня местных антител. Нами было впервые установлено, что местные ранние носоглоточные антитела относятся к классу 1д в. Цельная анти-1д6 сыворотка полностью блокировала антительную активность носоглоточной слизи. Последовательные разведения ее пропорционально снижали уровни антител в носоглоточной слизи. Анти-1дА сыворотка незначительно снижала антительную активность, а анти-1дМ сыворотка вообще не влияла на содержание антител в носоглоточном секрете. На основании полученных данных нами был разработан и внедрен в практику метод ранней диагностики ИРТ, основанный на определении антител в носоглоточной слизи (авторское свидетельство №1592988 от 15.05.1990). У контрольных телят не установлено существенных изменений в содержании местных антител.

Сравнительная эффективность выявления вируса ИРТ крупного рогатого скота из культуры клеток и ИРТ-32Р ДНК-зондом, содержание антител в сыворотке крови и носоглоточной слизи, связь' между процентом вирусовыделения и, содержанием антител к вирусу ИРТ в носоглоточной слизи отражены на рис. 1.

Влияние аденовирусной'инфекции на естественную резистентность и иммунитет телят

Естественную резистентность и иммунитет при аденовирусной инфекции изучали на 9 экспериментально зараженных 1,5-2-месячных телятах черно-пестрой и красной степной пород. Контрольная группа состояла из 3 животных. Угнетение общего состояния, серозно-катаральный ринит, серозно-гнойный конъюнктивит отмечали на 312-е, повышение температуры тела до 40,0-40,5°С, одышку — на 3-4=е, диарею — на 6=10~е. сутки после заражения. Аденовирусы из носоглоточной слизи были выделены в 2-3 пассажах на 3-7 день после заражения телят, Адено-32Р ДНК-зондом аденовирусный антиген тестировали в течение 3-9-го дней наблюдения. Показатели естественной резистентности и иммунитета зараженных аденовирусной инфекцией телят имели такую же динамику, как и при ринотрахеите.

Рисунок 1.

Результаты индикации вируса ИРТ вирусологическими методами и ДНК-зондом, титры антител в сыворотке крови и носоглоточной слизи у экспериментально зараженных инфекционным ринотрахеитом телят

60 40 ■-30 • • 20 •• 10 О

НИМ Определение вируса ИРТ 32Р-ДНК-зондом — Вирусовыделение в культуре клеток ' | Титр вируса * Секреторные антитела 'Антитела сыворотки крови

20 26 Дни после заражения

В период проявления клинических признаков болезни отмечено снижение содержания лизодима, комплемента, иммуноглобулинов в сыворотке крови, повышение заглатывающей и снижение переваривающей активности нейтрофилов, снижение процентного содержания Т-лимфоцитов." ■Титры^ажтител в свворотке"крови-;достигали'"диагностик ческих титров на 15-25-е сутки после заражения.

В носоглоточной слизи наблюдали повышение концентрации лизо-цима, Ig GjtB конце наблюдения — Ig А. Титры местных антител к аденовирусам на 5-7-й день болезни увеличились с 2-2,3 1од2 до 89,5 1од2. На основании полученных результатов нами был разработан, испытан и внедрен в практику метод ранней диагностики аденовирусной инфекции у крупного рогатого скота.