Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка эритроцитарного антительного диагностикума для индикации вируса ИРТ-ИПВ в сперме быков-производителей

УКРАИНСКАЯ АКАДЕМИЯ АГРАРНЫХ НАУК Г Г б ИнсОи^т »кспериментальной и клинической ветеринарной медицины

' а ПАЙ ¡НМЛ

На правах рукописи

ГОНЧАРОВА ЛАРИСА ВАСИЛЬЕВНА

УДК 619:610.9. 078:576.£09—630.:612.11.082.4:591.А63/

РАЗРАБОТКА ЗРИТРОЦИТАРНОГО АОТИТЕЛЬНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ИНДИКАЦИИ ВИРУСА ИРТ-ИПВ В СПЕРМЕ БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ

10.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Харьков — ¡993

УКРАИНСКАЯ АКАЛЕНИЯ АГРАРНЫХ НАУК Институт экспериментальной • клинической ветеринарной медицины

Ва Ьравах рукописи

ГОНЧАРОВА.. ДАРЗЗСА ВАСИЛЬЕВНА Ш 618: 616.9. -078:576. 809-636.: 512.11.082. 4:691. АбЗ/

РАЗРАБОТКА ЭРИГРОДИГАРЮГО АНГИШ'ЮГО ДИАГЮСТИКШ ДЛЯ'

шшвди р'туса йрт-шв в спеш шко&-ш>ойзюдашз5

16.00.03- ветеринарная микробиология,вирусология,

ЭПИЗООТОЛОГИЯ, МИКОЛОГИЯ И г-ГМг^УНОЛОГ^

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени j-ангидата ветевинарнш наук

коньков-í993

.Л8'-'

. Работа выпольеяа^влвборатории вирусологии, лаборатории изучения Солезкей молодняка я лаборатории биохимия Института 8ксперимпнтальной й клинической ветеринарной медицины УААН. Цяучнке руководители: доктор ветеринарных наук.член-_ " корреспондент УААН 0. П. Фукс

доктор ветеринарных наук

■ ■ ■ 1

профессор В. И. Алатенко Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, старший ' научный сотрудник Н. П. Чечеткина доктор ястсркпврнгас наук, профессор А.Я.Пустовар

Ведущее предприятие:

Институт ёвтеркнвркоя цедкчкны У4АЙ >

Защита диссертации состоится " ^'¿¿¿'/¿-¿Аоззгода , 7

в ' часов на заседании специализированного Совета

Д 020.68.81 .при Институте экспериментальной и клинк*«.-ской вете-1 ' • рйнарной медицины-со адресу: 310023, Харьков-23, уд. Душганская

(ГвЗ, кэикш.

С диссертацией можно ознакомиться в Си^иотеке ИЭиКВМ. • Автореферат разослан ?

; Жадный секретарь "специализированного совета, "доктор ветеринарных наук ,

К. Е. КонарлавсккЯ

i. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1. Актуажяоеть теии. Совремзняые методы ведения животноводства способствовали распространению ваболеваний,которые превде в мелких хозяйствах не наносили серьозного ущерба. К ним прежде всего следует отнести вирусные респираторные заболевания ПГ-3, ИРТ-ИПВ.ЕД-БС, PC- и аденовирусная инфекции /Андреев Е. R и др. ,1075; Апатенко Е Ы., 1978; Атамась В. А.,iSäö; Сирии ЕЕ и' др. ,1978/.

Особую опасность представляют персистирукдае вирусные инфекции, при которых животные после длительного,часто бессимптомного перебо,вевания и продолжительного вирусовцвеления, остаются вирусо-носителями. Наиболее характерным представителем этой группы болезней является инфекционный ринотрахеит-пустулезный вульвовагииит крупного рогатого скота .вызываемый герпесом 1-го типа /Крюков H.H. ,1070; Сирия В. Н. ,1979; !&рауб О. X. .1381/. ЙРТ-ИПВ /б/ играет оначительнуп роль в респираторной и генитальной патологии крупного рогатого скота различных возрастных групп. Важное значение ИРТ-ИПВ приобретает в племенных хозяйствах.где -осле переболе вания плененные животные /особенно быки/ «огут остаться носителями вир'та и в дальнейшем стать источником возбудителя инфекции при эксплуатации на ГПС. Согласно данным литературы в патогенезе при респираторно-генитальной патологии КРС четко прослеживается связь между спермой больного быка, нарушением воспроизводительной Функции у коров и пневмоэктеритами у телят / Андреев Е. Е и др. 1975; Атамаеь В. А. и др. 1,986; Схрин Е & .Фокина ЕЕ .1979; Чэчет-кина Е R ,löÖl; -Straub О.. 1й08; и другие/.-.

Широкое распространение ЯРТ-ЙПВ ICPC снязано.в первую очередь, с отсутствием простых и доступных методов индйкагвга зсзбудя-тедл. Способствует быстрому распространенна заболевания кснггшни-

рованная возбудителем сперма Вольных или латеятно инфицированных ^ыков на ГПС. Массовый контроль спермы на вирусную контаминацию с

ч

помощью вирусовыделения на культуре клеток невозможен, поскольку это очень трудоемкий и дорогостоящий процесс. Для экспресс-индикации вируса ИРТ-ИПВ в сперме и других органах используют РИФ /4укс Е Е и др. ,1989/. ,но это качественная .реакция,которая требует обеспечения специальным с-оорудоваяием /дюмикисцентнкй микроскоп/ .которое имеется не во всех лабораториях.

В связи с этим разработка экспресс-методов диагностики ИРТ-ШВ, использование при этом высокочувствительных, специфичных, а таювэ простых в постановке методов,пригодных для массовых исследований животных, является чрезвычайно актуальной проблемой в настоя аре время. Предлагаемый метод экспресс-выявления антигенов вируса ИРТ-ИПВ в сперме быков-производителей с помощью эритроци-тарвого .антительного диагностикума может решить эту сложную проблему. С помощью разработанного метода можно наладить вирусологический контроль практически всех партий получаемой от быка спермы, в результате чего будет ликвидирован один, из основных, путей распространения ИРТ-ИПВ КРС. &го обеспечит возможность успешной профилактики и ликвидации данного Заболевания1 у коров и молодняка.

1.2. Цель исследозавий. ' Целью исследований явилась разработка эрдарсцитарного антительного диаг.ностккума на основе моноспецифических антител для индикации вируса ИРТ-. ИГО в сперме биков-производителей.

, 1. а Сежшные задачи исследований:

- разработать технология получения чистых, мояоспецифических антител к вирусу ИРТ- ИПВ из високогистивяых реконвэлесцентных и >ги1ёриммунных. сывороток кпей и молозива крупного рогатого скота;

- 5 - -

- разработать технологию получения антитедьного диагностику---------

ма ' 'для "индикации вируса ИРТ- ИПВ и испытать при этом различные носители:

- провести сравнительные испытания разработанного антетедь-ного диагностирую с классическими методами выявления вируса ИРТ -ИПВ;

испытать разработанный метод индикации вируса №Т-ИПВ SPC в лаборатор<о-производственных условиях.

1. 4. Научная новизна. Епервые разработан высокочувствительный и специфичны!» эритроиитарный ант отельный диагностику« на основе чистых антител для экспресс-индикации вируса ИРТ-ИГЮ в сперме баков-производителей. Полученный диагностикум по чувствительности не уступает вирусоьыделеки» на культуре клеток к позволяет выявлять на 10-15Х больше полбмггельньк проб, чем при исследовании в Р'ЛФ, поскольку дает возможность исследовать не только клетки спермы, не и семеннуа жидкость.

-Разработан .технологичней и эффективный метод получения чистых антител к вирусу ИРТ-ИПВ с использованием иыыункых комп-'лексоз.

Предложены рациональные схемы гипериммунизации гЛубокостельных коров и быков- доноров для солучения высокоактивных сыворо эк крови -и молозива крупного рогатого скота.' -Впервые в качестве высокоактивного биосырья использован молозивный / - глобудив- коров первого удоя.

1.5. Практическая п»газють. Выполненная работа дает возможность:

- рекомендовать использование молозивне-го ¡' - глобулина .коров первого удоя в качестве высокоактивного антктельного сырья для получения чисти:: антител;

- в -

использовать эффективные схемы гипериммунизацшг глубокостельных коров и Ськов-доноров для получения сывороток крови и молозива с высокой серологической активностью;

- получать чистые,моноспецифпеские антитела к вирусу ИРТ-ИНВ;

- наладить кас^оеый контроль спермы от быков- производителей на Г НС с помощью эритроцитарного антительного диагностику ма на основе чистых антител,что послужит предпосылкой для успешной ликвидации этого заболевания на Укрзине.

1. Б. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуадены на отчетных собраниях Ученого Совета ИЭиКБМ /Харьков 1931-1993/;Всесоюзной конференции "Повышение продуктивности с/х животных и совершенствование мер борьбы с болезнями в условиях интенсивного ведения животноводства и создания Фермерских хозяйств" /Харьков 1991/;Всесоюзной конференции молодых ученых и специалистов Украины "Проблеми ветеринарно! медицин и по обслуго-вуванню тваринництва- • колективних та фермерских ■ господарств" /Харьков 1962/.

1, 7. Дуб,таилгдп|. Со теме . диссертации опубликовано 7 работ. 1 , статья сдана в печать.

1.а0сшаяые положения диссертации, вдгссгдыо ш. анкету. . . - результаты гш1ериммунизации животных-доноров для получения высокоактивного антительного сырья;

• - характеристика .методов получения чистых, моноспецифических • антител к вирусу ИРТ-И1Ш из высокоактивных реконвалесцеят"ых и гипериммунных сывороток крови и молозива крупного рогатого скота;

- разработка антительного дкагностикума на осноее чистых антител и, апробация реакции непрямой гемагглотинзшш для гкспресс-индикации вируса ИРТ-ИПВ в сперме быков- производителей.

- 7. - ■

1.9. Сбъеи н структура диссертации. Диссертация из ложна на страницах - ...ашинописного текста и состоит из введения /ч? стр./, обзора литературы / Ус' ст; / ,собств' 'ных исследований //"¿-' стр./.заключения / У стр./.выводов и практических предложений ' £ стр./.

Список литературы вклхгаает 434 источника, в том числе 223 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 21 таблицей и о графиками. В" приложении представлены документы, подтверждающие результаты собственных исследований.

г. соястташ иссшжтшя.

2.1. Каеркалы я катода ижгодознагсЯ.

Работа проводилась по государственным и ведомственным планам в лаборатории вирусологии и лаборатории изучения болезней молодняка КЭиКВМ УААН , а также в специализированных и молочнотоварных хозяйствах Харьковской, Днепропетровской, Киколаевскс,.. и Оапоро.Екой областей Украины.

Материалом для исследования слулзшс вирусы, сыворотки крови -1-юлозиБа гипериммунизированных.-а также здоровых, Сольных и переболевших ИРТ-ИПВ животных. Использованы вакцины, музейные ытаммы бактерий,эритроциты крупного рога-*го скота и барана, а также на-тивная и глубокозаморокенная сперма от быков- производителей.

3 работе использованы штамм;! вирусов: вакцинный штамм вируса ИРТ-ИПВ "ТК'\ штамм вируса ИРТ-ИПВ "Молдавский",референтные штаммы вируса ВД-БС "Орегон" и вируса ПГ-З "Зг-4"; а также pev¿рентные штаммы рота-вируса "Тимерваль"..- и корона-вируса "ВС-1". ' Вирусы адаптированы'1 и культивировались на перевиваемых культурах клеток ■ ПТ ПО, Трт Культуры клеток вырастали на среде 199,' Игла с 0.5Х ГЛА и Д1 авлением до 102 инакпширозанной сывс,отки крови крупного рогатого скота. Пенициллин и стрептоьатцы! добавили из расчета

по IOC ЕД/мл.

Сыворотки: сыворотки крови от.г<ипери1М7ниэированных гдубэ-костельных коров и быков-доноров ¡новорожденных телят в телят 1-2 мес. возраста; сыворотка молоэиза, подученная по методике, описанной Чекишевым ЕМ./1675/;а также диагностические сыворотки из наборов дда диаггтстики ИРТ-ИПВ,ЛГ-3,РС- . н а'чновирусной инфекиии.^ч-пускаемыэ биопромшиенностью.

бактерии: музейный штамм бактерии Staph, s^rophyticus albus из муэейас" коллекции бактериальных кул_гур лаборатории микробиологу и иммунологии ИЭаКВМ. Бактерии культивировались на ШБ и МПА. '

Вакцины: для иммунизации КРС использована инактивированпая ассоциированная вакцина против ИРТ и ПГ-3 /производство ШКИ-ТЙШ/. . .<

Эритроциты: формалин из ированные по Wambach R. /1653/ эритроциты кругг.'.'уго-»югатого скота и барана и агрегированные по мето-'W Гориной А Г. ;-ж Олейникова A. IL /1875 /эритроциты крупного ро-гатогб скота.

Сперма: подвергнуто исследованию 621 проба .нативной и глубо-козаморояенной спермы от быков-производителей -ГЙС Харьковской, Николаевской и .Запорожской областей Украины. Пробы нативной спермы доставлялись ь лабораторию в термосе со льдом, глубокозамороженной - в сосудах Дысара. Пробы до исследован», хранили при Т -20* С .

Обнаружение «ирусных антигенов в сперме бшов-произюдителей проводили с помофс прямого метода РИФ.. Иссдедрсание проводили на микросколе "Ломам-1" с ислольасеанием диметилфталата.

{änaejc wte вирусных агентов из спермы быков проводили на куАтуре «леток. ПТ 1ри Ш согласно ГОСТу ВГЯКИ-27755-вЗ. В. исследованиях по вяруговаделекмг использовано 32 пробы натиьнол и глу-

_____________ - 9 - -----

Сокозашрокенной спермы. На каздую пробу использовано 4-3 пробирок с культурой клеток. За зараженной культурой наблюдали в течение 10 суток, контролируя их состояние под микроскопом. Пробирки с явлениями дегенерации клеточного монослоя на 3-4 креста подвергали замораживанию. Проводили не менее З-ч пассажей, выделенные цитопаткческие агенты идентифицировали в Рш и РЕ

РН ставили по общепринятой игчотт /Сгрт В. II и др. ,1986/ в пробирочном монсслое клеток ПТ с постоянной дозой вируса /1000 ТЦД 50 / мл/ и двукратными разведениями сывороток, инакгивирован-щгх в течение 30 минут при температуре 56е С.

■ Определение антител в сыворотках крови проводили в серологических реакциях:

РН35А применяла для обнаружения антител к вирусам ИГ?-КПЗ, 85-ВС я антител к треп ееротипаа микоидазм с использованием антигенных ДИаГКОСГИКуМОВ.ПрЗДЛОгЕйтЯ Е П И др. /1888/.

РЗГА яспользоЕа.т-5 зля обпаружния антител к ькрусам ПГ-з /в модификации Стзиэккэ а II Д573/,а тшиэ для серологической диагностика рота- н корола-глруснсл инфвгасет / "Ьйтадичесгае ро-Аг'мгнггцив по дгЗорагсркоЗ иядвкашт я дйчебио-врофаакгичбсягм •л/опраатжш при рота- и караяа-ээрусяьз .энтеритах войоротеея»?^

РНЗЮ ксяо^гогатаз! .7.7.1 ^¿заа&йка «втигел к-вирусу ИРТ-ИПР с римэнением культура к.-гтс:: ПТ агп ГО. вкрашшы* ца предметах гклах. в чгазд Егтра' з гарзгаод&г вявгевд ШТ-ЧП5.

истсздач к за Чаьта газаавцяя»1« чхт -е.-л

п.-птяс.! о т»ч»зю» ГО ииуг прч кмаагак* те^ааратуре.из эмыэсот в /р.Ч 7.2 / э т?чз;:г.э 15 з

дистиллированной воде и. на высушенный монослой клеток наносили антибычий меченый ИГГЦ коныпгат в рабочем разведении. После инкубации во влажной камере в течение 30 минут, при комнатной температуре, препараты промывали . в 2-х порциях ЗФР /во вторую добавляли 0.1 X -ный раствор краски синий Эванса/, высушивали на воздухе и просматривал1« в лшинисцентком микроскопе. За титр акти; -л в.РШЙ принимали наивысшее разведение сыворотки,которое давало специфическое зеленое свечение не менее,чем на 3 креста. Результат учитывали только при отрицательных контроля! /антиген + ЗС? и антиген + коньюгат/.

РШ'А для индикации вируса ИРТ-ИПВ в сперме быков осуществляли никоеметодом с помощью набора Такачи. В лунки микропанели закапывали по 0.025 мл глмцеркниаированного /0.5 У. / физиологического раствора /рН 7.0 /. Б первые лунки специальной петлей вносили исследуемые пробы семенной жидкости и клеток спермы.обработанных ультразвуком в количестве 0.025 мл и последовательными переносами получали двукратные разведения исследуемого материала от 1:2 до 1:256." ЗаТеы во все лунки вносили по 0.025 мл зритроци-тарного _ антительного диагностику»», который представляет собой стабилизированные бормальдэгкдом.танизщювзнные эритроциты крупного рогатого скота,сенсибилизированные .в кислом буферном растворе чистыми,коиоспецифичныыи антителами к-вирусу ИРТ-ИШ,которые были получены методами сорбции-злхдаи на имшбилизовгякых антитезах. Учет реакции осуществляли через 2-2, & часа, по виду осадка. За титр вирусного антигена в исследуемых пробах принимали магюи-шлькое его разведение, которое вызывало агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов не «нее, чеи нч 2 креста.

Контролями при постановке реакции слугзиш: 1. глицеринизировзнный / 0.5 X / физиологический расгБОр /рЧ

- и -

?. О/ и худътурадыш липкость из пробирок с неинфицировафгой вирусом куьтурой + сенсибилизированные эротроциты /контроль яа са-isarf лиг инавда/;

2. гетерогенная вирусссдериешая кудътуральная жидкость /вирусы ЕД-БС ПГ-3 . рота-,корона-/ + сенсибилизированные эритроциты /контроль на свяшф-тсность/;

3. культуралькый вирус ИРТ-ЙПВ + сенсибилизированные эритроциты /контроль на активность/.

Биохимические исследования: определение количества белка в исследуемых элыатах антител проводили с помощью спектрофотометра я по ттоЕУ Лоури. Для определения IgG и lg Ы использовали метод радиальной кммунодиффузии по Манчини /1Й65/.

Гомогенность исследуемых препаратов проверяли методом электрофреза в ПААГ.

Статистическую обработку полученных результатов проводили на компьютере IBM PC/КГ с использсданкем программ ветеринарной статистики.

г. г. результат а ;>селЕ?рзт!й. г. 2.1. Разработка cscu simapumiymsatm!!}} яирогяых доноров для получешз высокоахстнвного аатитольвого сырь в.

Балннм этапом в разработке эритроцитарного аитительного ди-

агностикума для экспресс-кяднкации вируса ИРТ-ИПВ КРС явилось по*

•лучение высокоактивного антительного сырья,которое использовалось в доследующем ш выдедзния "частых" м&иоспецифических антител к вирусу ИРТ-ЙПЕ

С этой цельи по принципу аналогов были сформировано* опытные и контрсгаьнкэ группы глубокостельных короз к сыкоз-докороз. находящихся на последней стадии откорма. Яяя иммунизация была использована еухая икэктиБированная культуральная вакцина, против ИРГ и

-лъ-

ЕГ-З крупного рогатого стота /ВНИИТИЕПЛ

.• В опыт было взято 35 годов .иорск? в пг"Уюдние 1,5-2 месяца' стельности. Коров опытных групп пйерим<униаировалн 3-х кратно с интервалом 7 дней меаау 1-м и 2-м введением в дозе 5.0 и 14 дней мэхду !>-м и 3-м введением-в дозе 10. 0 мв. Пробы крови на наличие -¿«гтюральных антите^ к вирусу ИРТ •ТШВ отбирали до вакг-иа-ции.ватеы через 14 дней после введения вакцины, а также через б и 15 ярей после отела.. Исследованию подвергались также пробы сыво-роткимо ■»ива. Шследовали сыворотку -юлоаива коров первого удоя и татем пробы, в 1-4 дви после" отела. Серологическую активность сывороток крови и молозива против ИРГгИПВ определяли в реакции непрямой, бактериальной агглютинации с Б-антигеном УНИВЭВ. Тг»чск-ратнея гипериммунизация глубокостельных коров инакгивированкой вакциной обеспечивала стабильное наростание титра антител к вирусу ИРТ-.ИПВ в сыворотках крови до 7.6 Ьо?^ ,а в молозиве коров первого удоа дрЮ.О Ьовь , Следует отметить, что титр специфических антител X вирусу ИРТ-ИПВ в сыворотке молозива первого удоя . был Ьа высоком уровне как у- коров опытной,так и контрольной групп и составлял соответственно 10 и 0, Б Ьог^ • В последующие дни после стела >1- й - 4-й / наблюдали вначительное• снижение титра специфических» антител в сыворотке'1 мбдовива на Б - 5,5 Ьо^. При /ясследования сывброток крови через 5 и .15 дней после отела бшо обнаружено снижение уровня гуморальных о-ггител до 3, 5 - 4 \о«А .

При постановке данного опыта изучалась динамика и степень накопления противовирусных антител не только у втщинированных коров, но и в сьшоронах крови /»лученных от них телят. У те-Ж2,я(>91чеаш1 от животных опытных ч контрольной групп.проба кропи отбирали В; б-тн дневном: возрасте . затем в возрасте 10,15,20.30 и 60 дней. Результаты опыта показали,чтЬ телята, Поду-

-начавшие высокоактивное молозиво ' иммунизированных матерей, име. л высокий уровень заветных колостралькых антител /5,35 £ о, 1/ до 2-х ¿гесячного возраста,з то время,i.ж у телят,полученных от не-аакцинированных коров,титр колоотралышх антител заметно снижался угяг к 20-ти дневному возрасту, а к 60-му дно жизни этот показатель составлял не более 3,16+0,43.

Таким образом, применение ия активированной вакцины глубокостельным коровам позволяет получать высокоактивное антительное сырье /сыворотки крови и молозива/ для выделения чистых антител,а также способствует повышению уровня колостральных антител в сыворотке крови телят и сохранению их на достаточно, высоком уровне до 2-х месячного возраста,что важно в плане профилактики заболеваний новорожденных телят.

При иммунизации быков-доноров ставилась задача разработки простого и эффективного метода, с помощью которого можно было бы значительно-повысить титры специфических антител к вирусу ИРТ-ИПВ в сыворотках крови этих аивотных. При .этом изучалось влияние исходного уровня гуморальных антител к вирусу ИРГ-ШВ на уровень антительного ответа при вакцинации бьков сухой инактивированной культуральной вавдиной против ИРТ $ ПГ-З. О этой целью было сформовано 4 опытных / по 10 гол./ н контрольная / 6 гол. / групп давотных,находящихся на* погледней стадии откорма о различным исходным уровнем гуморальных антител к вирусу ИРТ-ИПВ. В первой опытной группе титр антител перед вакцинацией бия иияэ, чем у животных второй группы на 1,77 log* / РНВА /; у животных третье л и четвертой опытной групп.' - на соответственно 2,84 и 3,84 Loe^ . Быков-дочоров иммунизировали трехкратно с интервалом 3 дня а дозах 5,0 ,. .5,0 и 10,0 ма соответственно. Пробы крови отбирали и исследовали в РНБА до введения вакцины, а таюэ через 7, 14,21 и

- 14 -

>,

28 дней после последнего введения препарата Результаты опыта показали, что предлагаемая схема пте^мукизяции быков-доноров оказалась аффективной для получение вьюокоактиьиых сывороток крови к вирусу ИРТ-ИПВ. Наиболее высокая серологическая активность' исслг-дуемах ' проб сывороток крови-после проведения гипсриммунизации наблюдалась через К дне» во веехопытдад группах /7,66 8,83 и>гА /в не завиеила от исходного уровня, антител/ хотя кратность прироста антител в группах животных с низким п исходным урсв-нем.ВШа* выше,чем в группах с более здсокиод исходными уровнями специфических антител: 1-я группа - на 4,83 /РНБА/,4-я

группа - 2,16 1.оеЛ /РНБА/. Достоверное снижена уровня специфических антител против вируса ИРТ-ИПВ,отмечено черев 21 день после последнего введения вакцины.

2.2.2. Разработка зффсктивиих ш: годов оолучеиыя Vне тих автитея яла явдмкации вируса еервеса-1 крупного рогатого скота.

В работе было испытано 3 способа получения чистых, моноспе-цифтеских антител к вирусу ИРТ-ИПВ иг /-глобулина молозива короь первого удоя и сывороток крови гипериммунязированных животных методами иммунной сорбции с использованием бифункционального реагента {глигарового альдегида, .неорганического носителя - аминоси-лохрома марки "Диапак Аыино" и с помощью метода, который заюао-чался л получении иммунных комплексов их'последуюирй диссоциа-ШеД.

Мгтодики получения -мстых антител построены по единому принципу, который включает следующей этапы: 1. Антиген к которому полу-чаот чете антитела переводится в нерастворимое состояние, форми; руется иммуносорбент; 2. Инкубация иммуносорбента с иммунной сывороткой, формирован» комплекса иммуносорбент-антитело,т. к. иммоби •

* 1.5;-

лязованны'е на иммуносорбенте антигены «-охраняет: в, той или иной степени свои антигенные летерижитты; '3. Разрушение комллегса им-муирсорбент-антитело и гляциа чистых антител.

' При получении иье<укогеасорбента мы" использовали методические подходы а С. рукосуева( 1973); и Ävraneas . S., Тегпупск ?.(1959).основанные' на полимеризации антигена с образованием нерастворимых агрегатов.испольэун в качестве бифункционального ве-кства, глятаровый альдегид. Бьбор данного препарата опрел?ляле? тем, что по сравнении с другимя би{7Пга&ганальЕыии реагентами, глю-таровый альдегид в большей степени щадит иммунологическую активность яслгеризуемых ^молекул и сохраняет от 90 до ЮТ зпитопой.

В основу метода получения моноспецифических антител против вируса ИРТ-ИПВ с использованием неорганического носителя юрки "Диадах Амино" была положена методика И. Е Березина А. Я Егорова др. (19'76>; к И. Е. Баллад, К. к. ЗебряеС 1535) ,Тде в качестве " сорбента ¡¡•¿пользуст неорганическое производное кремния - аминосидохром, хи-М"ческую модификацию которого проводили глптаровым альдегидом, а ковалентное связывание белка вели в присутствии тритс-а Х-100. При сравнительном изучении элшрувдей способности двух буферных растворов (0,1Н глицин--HCl-оуфер/рН2,5/ и ЗМ NaCMS),более эффективным оказалось использование OvlM глицин-й31-буфера(рН2,5) помопа-ю которого получали элюати чистых антител с более высокой серологической активность*!, чем при использовании ЗМ NaCNS (3,7S)og4 соответственно)/РНБА/. . . .

• Элгаты, полученные при диссоциации антилиганДов раствором 0.1Ы НС 1 -глицинового буфера (рВ2,5), нейтрализовали сухим бикарбонатом до рК7,0, подвергали диализу на холоду против • МР (рК7,2),затем в них определяли белок.количество и класс иммуно-" глобулинов и тестировали антитела в серологических реакциях. Но-

. - 18 -

воспэцифичность выделенных антител к вирусу ИРТ-ИПВ. изучали в реакции непрямойагглхггинации с В-антигеном УНИИЗВ, эритроцитар-ным антигеном, предложенным Е А. Красочко. и в реакции непрямой иммунофлуоресцемии. а также с рота- в корона-вирусными антигенами ЛШЗВ (РЗГА),парагриппоэным антигеном (РЗГА) ,Б-антигенами для диагностики ВД-БО и микоплаям( РНБА). При серологическом тестировании антител в элюатах, грлученных с обоих иммуносорбен-тов.были обнаружены антитела только, к вирусу ИРТ-ИПВ (РНВА.РНГА, РНИФ). При исследовании элюатоз на наличие антител к вирусам ПГ-3 (РЗГА),ВД -ВС (РЯБА).ротз- и корона-(РЗГА).а также к трем серо-типам микоплаэм( РНБА), были получены отрицательные результаты. Наибольшая концентрация чистых антител содержалась в элюатах,полученных с кммуногеяьсорбекта и сорбента типа "Диапак Амине", где в качестве антисыворотки использовали молозивный у-глобулин (4,4 и 4,7Б1оасоответственно).Это объясняется тем,что указанная антисыворотка содержит антитела низкой авидности, которые легче злюи-ровались из комплекса антиген-антитело в отличие от сыворотки крови пшеримуунизйрованяья животных. Серологическая активность выделенных юноантител с обоих'иммуносорбентов при использовании указанной антисыворотки. была не более 2,25 и 3,751о%,соответрт-венно.

..Чийтоту подученных антител подтверждали, методом электрофореза в ПААГ. Исследования 'показали,что неистощенная гипериммунная сыворотка к' вирусу ИРТ-ИПВ имела множество полос.относящихся-к' различным.белкам сыворотки крови крупного рогатого скота. Антитела к вирусу ИРТ-ИПВ.ввделеинье на иммунсгедьсорбенте.бшш представлены иммуноглобулинами классов б и Ы, характеризовались единичной полосой,расположенной в зоне подвижности гаммаглобулиновой фракции. Индекс очистки по бедку составил 143.

- 1,7- -

, Исследование препаратов злшровакных антител с неорганического носйтелй марки "Диапак Амино" показало наличке в препаратам не только иммуноглобулинов,но ещэ 2-3 фракций в зове подвид-ности альфа и бета-глобулинов, что явилось следствием • высокой неспецифической сорбции данного, сорбента..' •,■. ,• .-.-,.

Кратность использования указанных имыуйосорбентов составляла 3-4 раза, т. к. при дальнейшем использовании серологическая активность полученных злюатов снижалась более, чем яа 31024, (РЯБА) по сравнению с исходной величиной. Причины такого явления связаны, очевидно, с необратимыми конформационными явлениями в структуре антигенные, детерминазт вируса ИРТ-ИПВ, возникающие вследствие ыно-гг,--ратных обработок иммуносорбентов элвирувдими растворами с низким значением рН, а. также - с. неполной десорбцией антител и эоэ-. растением неспецифической сорбции белков.

Как показали наш*. исследования,копытанкиа способы получения чистых антител методами сорбции-злюции на иммобилизованных антигенах оказались мало эффективными. Серологическая активность полу' ченных элштов чистых ант иге была недостаточной для приготовления высокоактивного антительного диагностикума для индикации вируса КРТ-ИЛЕ

Эффективным способом 1 получения чистых антител к вирусу ИРТ-ИПВ КРС оказался метод с использованием юа<унных комплексов по методике К1 А. Кузьмин; Б. А. Каралькик и др. (1985}; и Д Г. Горина к (1983) в нашей-юдифякацик котор! '1 заключался в-соединено,' вирусного антигена с соответствующей антисыао^ткой.освддёяием полученных иммунных комплексов ПЭГ-6000 я их-посяеяувдей' ■ дисчзава-цией. Серологическая активность выделенных' антител к вирусу ИРГ -ИПВ составила 6,7В-?,751оег. Наибож:высокий показатель титра моноантител наблюдался при использовании, в качестве антисыворотки

' л» -

ыолозивкого '¿глобулина из молозива короа первого уЛо.ч. Биохимические исследования полученных препаратов антител свидетельствовали оС Чх гомогенности',наличие одной белковой полосы),полученные антитела били представлены иммуноглобулинами класса б. При исследовании элгаровзнных препаратов антител в серологических реакциях с гетерогенными антигенами бита получены отрицательные результаты. '

2. Н.Э. Разработка антителоиого диагаосгняуыя для индикации вируса ИРТ-ИПВ круцвого рогатого скота.

Индикация антигенов в реакциях.основанных на явлении пассивной гемагглютинацйи.является в настоящее время одним из общепринятых диагностических приемов и находит широкое применение в ла-бораторно-диагностических исследованиях. В основу технологии при изготовлении аятительного диагностику*« для индикации вируса ИРТ-ИПВ была положена методика Т.Рыпай,которой в 1356г. модифицировал методику Бойдена применительно к обнаружению различных аи тигенов.

фи разработке • дйагкостикума на основе чистьа антител для иидиизции виг"са ИРТ-ШЬ КРС.быля запланированы следующие этапы исследований: 1. Испытание различных носителей чистых антител г(ри конструировании аятительного диагностикума; 2. Изыскание эффективных к технологичных методов фиксация и танязации носителя: 3. Определение рациональных режимов, взаимодействия носителя с элюатами вдетых, антител, их титра и объема; 4. Изучение различных стабилизаторов аятительного диагиостикума, обеспечиваших его активность и специфкчьостъ.

Результаты испытания различных носителей чистых антител при изготовлении аятительного диагностику^ показали, что наиболее эффективным оказалось использование эритроцитов здорового крупного

рогатого скота. При применении эритроцитов барала обнаруживали _ " «¿специфическую агглютинацию с гетерогенными вируссодерявлими кулъ$уральныхи лидкостямн. Испытанный инертный бактериальный носитель в FHBA с вируссодержвоей кудмуралькой жидкостью ЙРТ-ШВ вызывал спонтанную агглягкиацкв.

Эффективным методом стабилизации зрктроцитоЕ оказалось пря-кенение 2.5,"-кого раствора формальдегида. Стабилизированные с по-мо??>ю этого щч^арага ••рагроадкы JSC не проявляли яеепеги&ркской агглэтине"чи и хранились з течение 1 года "рн температуре 4*С( срок наблюдения). Эритроциты КРС, обработанный с поиощью ГЛА,также не проявляли кеспецифической агглютинации в РИГА,хранились более б месяцев при 4*С, однако активность диагност'/кума с использованием агрегированных эритроцитов.была нимэ по сравнению с форкалинизированними на- 5 1с.

Проведенные сравнительные исследования эффективности различна препаратов-"посредяпкоэ" при сенсибилизация эритроцитов КРС згтт&уи чистых аятктад поксзаяя всгскуя зффэкхизность таакна s развсдожя 1:20000 при Т-й'Г'С в течение 20-40кинуг. Использовали хлорида, хрока в кзчестгэ' "посредника" приаодкдо к появленив неспецкфич2скзй агглзткпацйи.а глотарозый альдегид как- "посред-ниг"не. позволял получить достаточно активный диагностику ц.

Оптичалгнь?'!? yc.~cn:™.ai алии форкалйшгакровааяых а

тйккзйрозанньа гритроцигоз крупного рогатого скота яхзвяаах чистых антител в каких опытах оказались следукзй: экспозиция 40 . минут при температуре 37®С, рН буферного раствора 5,4 и соотношение зрятрояятов и секскткиа 1:1.

Прг; спргделенк! ояк^ддьпой ьзисьСйййЭйруки^А дозы ге-»»сенретизтоз установили,*^ она находится в пределах и

ярсггерата* .'Eicc&x ац?»гее,й,где в качестве исходного сырья для их

» 20 - •

получения использовали кшозкзнъй /^глобулин и в пределах 5-б1оф, в препаратах чистых антител, где в качестве исходного биосырья применял сыворот*и крови крупного рогатого скота,подвергнутого птериммунизации с вомэиз>в квакгивироьанной вакцины. Это связана с тем,что при гиперяммункзашш животных, в сыворотках крови появляется антитела высокой наивности, которые хотя и хуке диссоциирует ,кз комплекса антиген-антитело при изготовлении иммуносорбен-тов,обладают более высокой силой сцепления с антигеном при сенсибилизации носителя. При сенсибилизации зритроцитов катквнкми гипе-риммуниыми сыворотками крови и иолозивным /-глобулином отмечали спонтанную агглютинацию.

В качестве стабилизатора при конструировании антительного диагностикума был использован глицерин в концентрация 0,5г. который позволил выявлять вирус ЙРГ-ШВ в культуральней жидкости в более высоких титрах, чем при использовании №0, применение которой связано с рядом неудобств, главкш из которых является применение только с неких препаратов кроличьей сьшооотки.а такде возможность появления, неспецнфичесАк реакций.

Споцйфичгзсть полученного таким способом эритроцкт&рного ая-, тительного диагкостккуш' проверяли путем постановки РЗНГА с вй-руссодергаезй культуральной аядкостьп, с использованием для нейтрализации культурагьного вируса КРГ-йПВ, очинённых противовирусных аэтите-,а так» путем постановки РИГА г гетерогенные Бнруссодер--жзоши культуральниил вддшеткии (ВЛ-ЕС. ПГ-3, рота-.корона-).

. Свою йяканостъ а спеифгчпость эрктроцитарный антителышя диагностику, прг.гс-озлзкньа согласно разработанной технологии, сохранял в течзшге 612СЯЦ2В при условии хранения его при температуре 4°С.

- fil

2.2.4. Пртхпевна рэакцш» неярзшй гечзгг^шяввщт л*а

____сОааруяевия к мдевтаЦ«ягщза вируса ИРТ-ИПВ

в caspszs бн^оз-прокзгюднтеяай.

При разработке способа яндикзции вируса ИРТ-ИПВ в сперме быков-производителей с помощью антительвого дингностккума,основное внимание было уделено предварительной обработке нативной и глубо-козамороиенной сперш, т.к. использование цельной спермы в РЫТА с испытуемым диагностикуюм приводило* получению жшояолсгзтель-ньа результатов, "оторкй не согласоваяксь с результатами, получен-нъш при исследования спермы общепринятыми методами ( РИФ и ви-русовыделглие). Эффективным способом обработки спермы оказался метод ультразвуковой дезинтеграции kjbwok спермы s редиме 22кГц в течение 40-60секунд с использованием ультраавуковойустановки УЗДВ-2Т. Обработанные, ультразвуком клетки спермы це:гтрифугирова-ли(3000оС/мия. ) в течение 1СЬ15минут а наяосадочную жидкость параллельно с семенной жидкость» неследовали в реакции непрямой гем-в- глотинации. Контролями при постановке РНРА служили культураль-яый вирус ИРТ-ИПВ, гетерологичные антигены ( культурегькые вирусы ВД-К.ПГ-З, рота-,корона-).Отсутствие спонтанной агглютинации ди~ агнсстикума проверяли путем вакэны испытуемого материала глицери-низированным (С,52) физиологическим раствором (рИ 7,G).Специфичность обнарудения антигена вируса ИРТ-ИПВ в исследуемом материале подтверждали также вирусовыделеннем и методом РЖ Б опытах по гравнительному исследованию спермы вирусовыделеиием, методам- РИФ и РИГА было использовано 32 образца сперш. Исследования подтвердили высокую »специфичность и совпадаемость. результатов при исследовании спермы в РИГА. РИФ а юродом вярусосааелеккя. Коэффициент корреляции при исследовании в РИГА г РМсостаыи 0,73, прп ксслс-зовании в РКГА и методом вирус&Евделепкл - 0.52. Ч)П»етвительность

■ предлагаемого диагностику»» оказалась выше,поскольку позволял? выявлять вирус не только в клетках спермы, но и в семенной жидкости.

С помощью разработанного аихительнсго диагностикума в реак-■цяи непрямой гемагглптингции исследована 821проба нативной и глу-бояозашрояекной спермы от быков ГШ Николаевской. Запорожской и ■Харьковской областей Украины. Реакция непршзй гемагглгаинации обеспечивала быструю индикацию вируса ИРТ-ИПВ в сперме быков-производителей и позволяла'выявлять ва 10-152 больше положительных проб,чем при исследовании в РИ& Изложенные данные свидетельствуют о- возможности экспресс-диагностики ИРТ-ИГ} в РИГА и позволяет ре-комэндоват этот метод для широкого практического использования с да лью контроля; дмучаемой от быхов-производаяелэй спермы на вис руснув контаминациа

Разработанный вкспрэсс-мгтод диагностики заболевания г комплексе с ухе имеищшся способом индикации возбудителя (РИЗ),даст возможность короткие сроки выявлять животных с различной формой •- течения,, инфекции, что позволит прт ^хранить хозяйства от ; шоса и раепросхранегезя вируса ДО-ИЯВ при осеменении животных.'

3. ВЫВОДЫ.

Разработана-технология' приготовления высокоспецифичного - эритроцитарнога - антителънйго диагностикума для индикации вируса КРГ-.КПЕ в сперме быть - производителей ' на основе .использования мэноспецифичных антител. .'

■ 2. Разработана схема .гипериммушвацик гдубокостелышх коров и бнк^довород^вгааиЕирсЕаннгЛ вакциной против ЛРТ и пг-з(ВНй-ЗЦЙВЦ)',£лз. получения югмунных сывороток крови и „молозива,исполь-? уеьасс в псследупфи для аиделарня противовирусных антител, которая ■ зкгоает:

а/трехкратноэ введение вакцины глубокостельным коровам в • последние 2 месяца стельности с интервалом 7 и 14 дней в дозах 5,0/5,0 и. 10,0мл подгадаю; ' .. . ..

б/трехкратное введение вакцины бькам-донорам с интервалом 3 дня в дозах 5,0, 5,0 и 10.0мл подпаяно. ....

3. Чистые антитела получали из глобулина шлозива коров Первого удоя И сыворотки крови ГИЛбрИМЦУНИЗИрОВаННЫХ животных us-ТОД2МИ КММуНЯОй СОрбЦКМ С ИСТТОЯЗОНЭНИ^М б'!фуНКЦКСНЗЛЬНСГС реЗ~

riHia. неорганического носителя и ¡валунных комплексов. Максимальные т^гра чистых противовирусных антител (6-71üst) получали с помощью метода шлунных комплексов.

4. Изучение аатитзл методом электрофореза з ПААГ показало их гомогенность (наличие, одной белковой полосы). Антитела были

представлены иммуноглобулинами класса а, расположенными з зона

• подвк:*ности /-глоСулшгсвой фракции.

5. Разработаны основные технологические процессы получения антктельного доагзосгакума, вк^зочаюшиегформалиниэацшо эритроци-

•' тов крупного- рогзгего скота 2,57;-нал раствором формальдегида з течение 24 чаеоа;такизацию фермалинизированных эритроцитов КРС раствором тажша а разведении 1:20000 в течение гОминут'пря 37"С я с5нс1й1ш:гац:аз пх эдватами чистых энт51тел(р?13очее разгеденю 5, -5 10%)- в течение 40минуг при pH буферного раствора 6.4 и соотнесении эритроцитов п сеясатика 1:.!.. .

5. Проведенные испытания антителаного диагнсстикуыа для ин-

• дгаации антигена. BJtpi^a Ш-ИПВ -в сперш бисов-производптв- * дгй, цепользузыой для искусственного осе^нения, показали высокув

• - 24 -

его чувствительность и специфичность.

7. Сравнительные исследования спермы на контаминацию вирусом ИРТ-ИПБ методами РИФ, РИГА и вирусовыделением на культуре клеток выявили высокую тепе'нь совпадаемости результатов. Коэффициент корреляции при исследовании в РИГА и РИ-i составил 0,73, при исследовании в РИГА и мес дом вирусовыделения 0,52.

8. Предлагаемый серологический метод индикации вируса ИРГ-ИПВ в РКГА пригоден для экспресс-диагностнки,прост в техническом исполнении,позволяет проводить массовые исследования спермы быков-производителей и тем самым предотвратить распространение этого возбудителя в стадах КРС.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Разработаны и предлагается "Методические рекомендации по приготовлению и применению зритроцитарного антительного диаг-ностикума для индикации вируса ИРТ-ИЛВ крупного рогатого скота."

2.Информационный листок,изданный Харьковским ЦНГИ( 1992).под N 268-91.-

• Список работ, опубликованных по теш диссертации. . .1. роль и локализация респираторных вирусов у плодов и . новорожденных телят-Тез. докл.Всесоюзной научн. конф. "Повышение npb-дукгивности с/х животных и совершенствование мер борьбы с болезнями в .условиях интенсивного ведения животноводства и создания фермерских хозяйств /Харьков 1991/';- С. 150 /П. Д. Зукс.В. С. Голуб, Л. Е Гончарова/.

.г 2. йсп6и>гование высокоактивной сыворотки крови и молозива для профилактики ОРБ в хозяйствах,неблагополучных по инфекционному ринотрахеиту(ИРТ) и парагриппу-3(ПГ-3) крупного рогатого скота Информационный листок о передовом производственно-техническом ' опыте, ЯШТИ, Харьков.-N'268-91. - 1991С Голуб И.О. ,Фуке П. П. ,Гонча-

- 2Б -

роза JL & ')

------------а Извинение лечебно-профилактической-эффективности-сыворотки-

реконв&песцентов в хозяйствах,неблагополучию по ШТ и ПГ-3 крупного рогатого скота. -Тез. докл. Всесоюзн. конф. -Вэронел, 1991. -С 15-16. (Голуб XX С., Гончарова Л. В. ).

4. Розробка технологи виготовлекня чистих антипл для 1нди-кацп Bipyca герпеса-i ВРХ -Тез. дол. конф. мол. вчених j спещалюив Украши "Проблеми ветеринарно! медицини по ,обслуго-вування ТЕаринницгва колективних та Серыерських господарств" -Харк1В,1992.-С. 14-1Б(Гончарова JLB., Фукс IL IL ).

5. Удосконалення методу одержання чистих антипл для 1нди-кацП Bipyca герпеса-1 ВРХ -Tes. доп. конф. мол. вчених i cneuiaaicTiB Укра1ни "Проблеми ветеринарно! медицини по обслуто-вуванню тваринницгва колективних та фермерських господарств"-XapKiB,1932.-С-15-1б(Фукс IIEL, Гончарова Л. В.).

6. Розробка та випробування антит!льного еритроцитарного д1агностикума для 1ндикац1f герпес-взруса 1-го серотилу ве.отког рогатог худоби. -Тез. доп. наук, виробн. конф. "Бютехнолопя ветери-нарнях пре парат 1 в ".. - Харк i в, 1993. - С. (Гончарова ЛВ.Зукс П. II,Голуб Ю. С. .ВЭЛОСЯНКО О. В. ).

7. Еикористання реакцп непрямо! гемаглотинацп для -1ндикац1 f Bipyca 1РТ-1ПВ велико! рогатоi худоби у .cnepMi бу-га1в-пл1дниюв. -Тез. доп. наук, -вироба. конф. "Бютехнолопя ветери-нарних препарзпв"-'XàpKtB.1993.-С. (Зукс П. L , Гончарова JIB.,

• Апатенко Е VL , Голуб й С. ).