Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.04) на тему:Липосомы как средство повышения эффективности ветеринарных препаратов в птицеводстве

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ ПТИЦЕВОДСТВА

На правах рукописи

/ й <;

ПРИХОДЬКО Елена Игнатьвна

ЛИПОСОМЫ КАК СРЕДСТВО ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ В

ПТИЦЕВОДСТВЕ

16. 00. 04 - ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук

Санкт- Петербург, 1998 г.

Работа выполнена в лаборатории фармакологии и токсикологии Всероссийского научно - исследовательского ветеринарного института птицеводства.

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук,

старший научный сотрудник Н.Д. Придыбайло

Официальные оппоненты: - доктор ветеринарных наук,

профессор Г.Г. Щербаков кандидат ветеринарных наук, В.Г. Урбан

Ведущая организация - Всероссийский государственный

научно-контрольный институт ветпрепаратов.

Защита состоится "1" июля 1998 г. в 11 часов на заседании диссертационного Совета Д 120. 20. 02 при Саякт - Петербургской государственной академии ветеринарной медицины по адресу: 196084, г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины

Автореферат разослан

июня 1998 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета доктор Ветеринарных наук, доцент

Шустрова М.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Искусственные фосфолипид-ные везикулы, открытые более 30 лет назад А. Бэнгхемом и получившие название липосом, из объекта чисто лабораторных исследований, где они применялись как модель биологических мембран, превратились в объект широких биологических и медицинских исследований, представляющий на сегодня непосредственный практический интерес. Это подтверждается изданием за рубежом научного журнала по проблемам липосом, образованием ряда промышленных компаний, ориентированных на выпуск липосомальных лекарственных и диагностических препаратов, и, наконец, успешными клиническими испытаниями и появлением на фармацевтическом рынке первых липосомальных препаратов клинического назначения.

Уникальные свойства липосом, как носителей лекарственных веществ, позволяют включать в их внутреннее водное пространство водорастворимые, а в липидный бислой водонерастворимые препараты, целенаправленно доставлять в нужные области организма, снижать токсичность и продлевать действие, предохраняя лекарства от воздействия "агрессивной" физиологической среды организма. В последние годы учёным и технологам в значительной мере удалось решить проблемы, связанные с получением липосом, их стандартизацией по размерам, стерилизацией, хранением в виде суспензий или лио-филизированной форме, а также стабильностью в организме (Норейка P.M. ссоавт., 1987, Чучалин А.Г., 1990).

Значимость таких исследований подтверждается значительным количеством патентных работ в этой области и принятой решением координационного совещания АМН в июне 1988 г. программой по биотехнологии на 1989-1995 гг., в которой была предусмотрена организация как фундаментальных, так и прикладных исследований, предусматривающих изучение физико-химических свойств липосом, особенностей строения и функционирования липосомальной мембраны, изучение взаимодействия липосом с клетками, стабильности и распределения их в организме. Тем не менее, вопросы подбора оптимального состава липосом, способов получения, включения в них иммуномо-дуляторов и вакцин для применения в птицеводстве остаются открытыми.

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований явилось изучение биологических свойств липосом из суммарных липидов и фосфатидилхолина яичного желтка для повышения эффективности некоторых ветеринарных препаратов в птицеводстве.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- подобрать оптимальный состав и метод формирования лило сом и сравнить иммуномодулирующие свойства тималина и тималиш в липосомальной форме в опытах in vitro;

- определить диапазон иммуностимулирующих доз липосо мальных суспензий при различных способах введения цыплятам;

- сравнить иммуномодулирующее действие тималина и тима лина в липосомальной форме при введении в эмбрион и на модел* экспериментальной иммуносупрессии у цыплят;

- исследовать влияние фосфатидилхолиновых липосомальньп суспензий на культуру клеток куриных и перепелиных эмбриональны: фибробластов, культивирование ВГИ и его выживаемость в режима; плюсовых температур;

г изготовить опытную серию вакцины против болезни Марек из штамма "ВНИВИЙ" с добавлением в среду культивирования фос фатидилхолиновых липосомальных суспензий и испытать её иммуно генные свойства в экспериментальных и производственных условиях;

- изготовить экспериментальные серии вакцины против болез ни ССЯ-76 с использованием в качестве адьюванта липосомально] формы тималина или ганглиина и изучить их протективные свойства; птиц в экспериментальных условиях.

Основные положения выносимые на защиту. Определен! оптимальные состав и способ получения липосом, получены липосо мальные формы ветеринарных препаратов (иммуномодулятор тима лин, вакцины против болезни Марека и ССЯ-76) и показана их эффек тивность для ветеринарной практики в птицеводстве.

Научная новизна. Впервые на основании исследо ваний, проведённых в лабораторных и производственных условию установлены преимущества использования липосомальной форм! иммуномодуляторов и вакцин:

-определена оптимальная доза липосомальной суспензии дл введения цыплятам;

- установлена эффективность применения липосомальной формы тималина при циклофосфановой иммуносупрессии и введении в эмбрион для увеличения вывода цыплят;

- доказана возможность улучшения свойств ВГИ и ВБМ при их культивировании с добавлением липосом и повышения иммуногенности липосомальной формы вакцины из штамма "ВНИВИП" против болезни Марека.

Практические результаты и предложения по использованию материалов. Результаты проведённых исследований в условиях птицехозяйств позволили получить положительный результат от применения липосомальной формы иммуномодулятора тималина в эмбрион и липосомальной формы вакцины против болезни Марека из штамма "ВНИВИП". Подобранный состав липосом и метод получения могут быть рекомендованы для изготовления на их основе ветеринарных препаратов, применяемых в птицеводстве.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 5-й Межгосударственной межвузовской и 10-й Международной научно-практических конференциях "Новые фармакологические средства в ветеринарии" (Санкт-Петербург, 1993, 1998 гг.), на XI Международном конгрессе Мировой ветеринарной птицеводческой ассоциации (Будапешт, 19-23 августа, 1998 г.), на методическом и учёном советах Всероссийского НИВИ птицеводства (1991-1996 г.г.).

Публикация. Основные положения диссертации опубликованы в 5 научных статьях.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, рекомендации производству, список использованной литературы и приложение. Работа иллюстрирована 5 рисунками и 14 таблицами. Список литературы включает 200 источников, в том числе 85 иностранных авторов.

2. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материалы и методы исследований

Экспериментальная часть работы по теме диссертации выполнена в течение 1990 - 1996 гг. в лаборатории фармакологии и токсикологии Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного ин

ститута птщеводсгва (ВНИВИП), лаборатории сравнительной биохимии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова (ИЭФиБ), лаборатории жировых эмульсий Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии (РНИИГиТ).

В экспериментальных исследованиях были использованы 8-9 -сут перепелиные, 9-10 - и 17-18- сут куриные эмбрионы в количестве 670 штук, суточные цыплята кроссов "Ломанн белый" и "Бройлер-6" в количестве 784 головы, содержавшихся в условиях вивария ВНИВИП. Производственные испытания проведены на птице "Бройлер-6", "П-46" и "Ломанн коричневый" птицефабрик Ленинградской и Тверской областей. Подопытные и контрольные группы формировали по принципу аналогов. В условиях вивария института птиц содержали в клеточных батареях типа БКМ-ЗБ. Кормление осуществляли согласно рекомендациям по нормированному кормлению сельскохозяйственной птицы (МСХ СССР, 1983).

Липосомы получали используя суммарные липиды из желточных мешков 9-10-сут куриных эмбрионов; яичный (ЯФХ) или соевый (СФХ ) фосфатидилхолин (10 %-ный хлороформенный раствор с содержанием 0,5 % ТФ), полученный из РНИИГиТ, (качество фосфа-тидилхолина регламентировано ТУ 6-09-10-1554-83); перекристаллизованный холестерол, производства завода медицинских препаратов АООТ "Самсон" (г.Санкт-Петербург); 50 %-ный масляный раствор альфа-токоферола ацетата (ТФ), отечественного производства; дисперсионные среды - 0,1 М фосфатный и сорбит-фосфатный буферные растворы рН 7,2-7,4, раствор Хэнкса. В качестве органических растворителей использовали свежеперегнанные хлороформ и смесь хлороформ-метанол в соотношении 2:1.

В опытах использовали иммуномодуляторы тималин, производства завода медицинских препаратов АООТ "Самсон", ганглиин - НПО "Биомед" (г. Пермь), а иммунодепрессантом служил циклофос-фан - Саранского завода медбиопрепаратов.

Для исследований применяли вирус маточной (посевной) производственной расплодки из штамма "ФС-126" ВГИ и из штамма "ВНИВИП" ВБМ, жидкую культуральную вакцину против БМ из того же штамма производства ТОО "Кронвет"; суспензии инактивирован-ного вируса ССЯ-76 стандартной активности (1:2048 ГАЕ/0,5 см3) из штамма "В8/78".

Для экспериментального заражения цыплят 7-сут возраста была использована не разведенная цитратная кровь от молодняка кур, заражённых патогенным ВБМ, штамм "RB1B", полученный из фирмы "Рон-Мерье" (Франция).

Выделение суммарных липидов проводили по методике Бергельсон Л.Д. и Дятловицкой Э.В. (1981), анализ состава выделенных фосфолипидов - тонкослойной хроматографией по общепринятой методике совместно с лабораторией сравнительной биохимии ИЭФиБ. Липосомальные суспензии готовили по методу Bangham et al. (1965), модифицированного Лось В.Г.(1987).

В экспериментах, в основном, применяли липосомы с весовым соотношением исходных ингредиентов фосфатидилхолина и хо-лестерола 7:2 с добавлением 1 % ТФ (Шанская А.И. с соавт., 1994), Концентрация липидов составляла 10,20 или 40 мг/ см3.

Размеры и структуру липосом определяли с помощью электронной микроскопии методом негативного контрастирования (Nermut M.V., 1972). Просмотр материала осуществляли под электронным микроскопом "Tesla BS-540" при ускоряющем напряжении 80 кв.

Уровень клеточного иммунитета исследовали по активности Т-лимфоцитов в реакции спонтанного розеткообразования (Е-РОК) с эритроцитами барана (А.С. Алиев с соавт., 1991).

Определение числа Ig M антигелообразующих клеток (АОК) в селезёнке цыплят проводили методом локального гемолиза по Jërne и Nordin на 4-е сутки после иммунизации ЭБ, в модификации Деревянной О.Н. (1997).

Уровень неспецифической резистентности оценивали по проценту фагоцитоза с моноцитами крови по методике, описанной Yi Chu, Dierert R.R. (1989).

Иммунодефицит у цыплят вызывали двухкратным внутримышечным введением цитостатика циклофосфана, аналога циклофос-фамида, в дозе 60 мг/кг (Lerman S.P. et al., 1970).

Показатели относительной массы иммунокомпетентных органов определяли по соотношению массы (мг) органа к массе живого цыплёнка (г), индекса органов - по значению относительной массы органа к таковому в контроле. Его значение выше 1,3 являлось достоверным (Simonsen M., 1962).

Реакцию трансплантант против хозяина (РТПХ) ставили по методике, описанной Sharma J.M, Witter R.L. (1975). Учёт результатов

исследований полностью соответствует определению относительной массы селезенки и селезёночного индекса.

Влияние тималина, инкорпорированного в липосомы, на развивающиеся эмбрионы кур (РЭК) изучали в условиях птицефабрик яичного направления АОЗТ "Синявинское" и мясного направления АОЗТ "Ломоносовская", Ленинградской области. Для этого 15-сут эмбрионы овоскопировали, определяли центр воздушной камеры, соблюдая меры асептики, прокалывали скорлупу иглой 22 калибра, длиной 2,54 см и инокулировали исследуемые препараты в аллантоисную полость эмбриона в объёме ОД см3. Затем отверстие заклеивали расплавленным парафином с фурацилином.

Культуры клеток готовили из фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) и фибробластов эмбрионов перепелов (ФЭП) по общепринятой методике.

Жизнеспособность клеток в экспериментах in vitro составляла не менее 80-85 %.

Индекс пролиферации определяли отношением числа выросших клеток к количеству засеянных.

Титрацию липосомальной и выпускаемой промышленным способом вирусвакцин против БМ проводили по методике Calnek B.W. et al., (1972), модифицированной во ВНИиТИБП на стадии учёта фокусов ЦПД (Слепенко Т.Б. с соавт., 1980). Титр вируса выражали в фокусообразующих единицах (ФОЕ) в 1 см3 (lg ФОЕ/ см3).

В эксперименте вакцины против БМ вводили внутримышечно, вручную, в область бедра, в объёме 0,2 см3, а против ССЯ-76 - аналогичным способом по 0,5 см3 и при исследовании на безвредность по 5,0 см3.

При оценке иммуногенных свойств вакцины против БМ учитывали птиц, павших от БМ. В сомнительных случаях диагноз подтверждали гистологическими исследованиями. Птиц, оставшихся в живых до конца опыта, продолжительность которого составляла 111 дней, убивали, тушки подвергали ветеринарно-санитарной экспертизе с целью обнаружения в органах и тканях изменений, характерных для БМ. Эффективность вакцинации определяли коэффициентом по формуле:

КЭ= 100%-(А-В):А где:

КЭ - коэффициент эффективности вакцинации, %;

А - число случаев БМ в контрольной группе, %;

В - число случаев БМ в вакцинированной группе, %.

Производственные испытания вакцины против БМ провели на птицефабрике "Калининская" Тверской области на поголовье 68 тыс. цыплят кросса "Ломанн коричневый".

Уровень специфических антигемагглютининов к вирусу ССЯ-76 определяли в РЗГА, которую ставили по общепринятой методике. Для постановки РЗГА использовали 4 ГАЕ стандартного инактивиро-ванного антигена вируса ССЯ-76, производства ВНИВИП.

Каждый из проведённых в диссертационной работе опытов повторяли не менее двух - трёх раз.

Все полученные результаты экспериментальных исследований подвергали статистической обработке. При этом использовали критерий Стьюдента и правила вариационной статистики (Еремин В.П., 1975).

2.2. Приготовление липосомальной формы тималина и оценка иммуномодулирующих свойств in vitro

В своих исследованиях мы использовали один из самых простых и доступных способов получения липосом, достоинством которого является:

- отсутствие влияния остаточных детергентов и органических растворителей на препараты, включённые в липосомы;

- возможность лиофилизации липосомальной формы препаратов, применяемых в птицеводстве, что важно с учетом их транспортировки на большие расстояния.

С этой целью был определён количественный и качественный состав суммарных липидных компонентов, выделенных из нескольких партий желточных мешков 9-10-сут куриных эмбрионов. Показано, что наличие в их составе фосфолипидов, в том числе фосфатидилхо-лина (68,1 %), холестерола (2,4 %) и ТФ (0,3 %) позволяет формировать многослойные липосомы, но не обеспечивает стандартность. В связи с вышеизложенным, для дальнейших исследований липосомы получали из ЯФХ или СФХ. Фосфатидилхолин, полученный из сои имеет лучшие мицеллообразующие свойства, не обладает повышенной аутоокисляемостью, что может иметь значение при технологии получения и хранения липосомальных препаратов (Придыбайло Н.Д. и со-авт., 1994).

-8В результате проведённых in vitro исследований установили, что применение липосомальной формы тималина достоверно увеличивало количество Е-РОК лимфоцитов цыплят до 63,3 - 68,3 % (Р<0,05), по сравнению с таковыми при контакте с "пустыми " липосомами -34,7 - 49,0 % или тималином - 42,0 - 48,7 %.

Прослеживается количественная зависимость Е-РОК от взятой концентрации липидов и тималина в липосомальной суспензии. Изменение концентрации липидов от 0,01 до 0,5 мг/см3, при одинаковом количестве тималина в липосомальных суспензиях, влияет на увеличение Е-РОК от 51,3 % до 68,3 %. "Пустые" липосомы при изменении в них концентрации липидов от 0,01 до 0,5 мг/ см3 дают увеличение Е-РОК с 34,7% до 49,0%.

Таким образом, липосомальная форма тималина повышает функциональную активность лимфоцитов цыплят по отношению к ЭБ (Е-РОК) в 1,5-2 раза.

Липосомальная форма тималина способствовала не только количественному увеличению Е-РОК, но и качественному изменению образовавшихся розеток. Если обычно в поле зрения попадают розетки с присоединившимися 3-4 эритроцитами барана, то липосомальная форма тималина способствовала образованию розеток с большим количеством присоединившихся эритроцитов, вплоть до образования морулы (6-8 клеток) - очень редкого явления для куриных лимфоцитов.

2.3. Исследование иммуностимулирующих доз липосомальных суспензий у цыплят

Дозы липосомальных липидов, вводимых лабораторным животным и человеку, могут колебаться от 50 мкмоль/кг до 1250 мг/кг. Поэтому нами впервые проведено определение влияния внутримышечной инъекции различных концентраций липосомальных липидов на иммунный ответ цыплят при введении ЭБ.

Результаты исследований показывают, что однократное внутримышечное введение нативных липосомальных липидов в исследуемых дозах (0,045-120 мг/кг) вызывает достоверное (Р<0,05) увеличение титра гемагглютининов. Однако оптимальный результат этого показателя получен при назначении дозы 4,5 и 45 мг/кг (1:620±30,4 и 1:693±40,2). Последующее увеличение дозы липосомальных липидов до 100 мг/кг уже снижает титр гемагглютининов с 1:693±40,2 до

1:233±27,3. При этом он сохраняется ещё достаточно высоким, по сравнению с контролем (1:60±10,7). По-видимому, введение липосо-мальных липидов в дозе 10Q мг/кг уже вызывает повышенную нагрузку в организме цыплят. Для дальнейших исследований выбрана доза 4,5 мг/кг.

Было показано, что при внутримышечном введении нативных и лиофильно высушенных липосомальных липидов в этой же дозе у цыплят наряду с увеличением титров гемагглютининов на ЭБ в 2-2,5 раза, нарастает и количество Ig М-АОК в 3 раза. Ещё больший эффект увеличения гуморального иммунитета получен при интраназальном и интраокулярном методах введения (титр в 3 и более раза, количество Ig М-АОК в 5-6 раз).

Такой факт можно объяснить наличием в составе глаза и легочной ткани высокого уровня фосфолипидов, имеющих сродство с фосфолипидами в составе липосом, а также ролью иммунитета слизистых оболочек (Vadalas et al„ 1989, Fahey K.Y., York Y.Y., 1990).

2.4. Влияние липосомальной формы тималина на развивающиеся эмбрионы кур и при циклофосфановой иммуно-

супрессин цыплят

При экспериментальной циклофосфановой иммуносупрессии, как правило, поражается Т-клеточное звено иммунитета. С этой целью для коррекции иммунодефицита используется тималин. В этом плане предстояло дать оценку липосомальной форме тималина. Было показано, что основой корригирующего действия этой формы препарата является увеличение показателей Т-клеточного звена иммунитета. Так, самый низкий показатель Е-РОК был у цыплят, подвергшихся одной иммуносупрессии (45,4±1,2 %), а самый высокий - при введении липосомальной формы тималина (60,5±2,2) и тималина (55,6+1,0 %). При назначении липосомальной формы тималина, с последующим двухкратным введением циклофосфана, количество Е-РОК в этой группе цыплят достигало 49,1±1,3 % и было на уровне контрольной группы-50,0±1,1 %.

Тималин (40 мг/кг) в липосомальной форме практически предотвращал снижение относительной массы тимуса, а РТПХ увеличивал, по сравнению с супрессированной и контрольными группами цыплят.

На процесс эмбриогенеза куриных эмбрионов негативное действие могут оказать повышение температуры, снижение относительной влажности, накопление микрофлоры в инкубатории и др. факторы. С учётом выявленных иммунокорригирующих свойств липосомальной формы тималина, нами была применена однократная инъекция в 18-сут эмбрион. При этом установлено иммунотропное действие препарата: увеличение относительной массы селезёнки и бурсы эмбриона.

В производственных условиях инкубатория птицефабрик яичного и мясного направлений инъекция в эмбрион липосомальной формы тималина способствовала увеличению вывода цыплят на 4-6 %, а один тималин, но в повышенной дозе (100 мг/кг) - на 6-8 %.

Дальнейшее внедрение этой разработки в практику будет зависеть от того, как быстро в стране появятся высокопроизводительные инъекторы для введения в эмбрион, как, например, фирмы "Embrex", с помощью которых можно обработать 20 и более тыс. эмбрионов в час (Smith R., 1996).

2.S. Повышение эффективности специфической профи. лактики болезни Марека с использованием липосом

Использованйе липосом для повышения эффективности применяемых вакцин, в том числе и в птицеводстве, - сравнительно новое направление. Поэтому мы поставили задачу изучить влияние липосо-мальных суспензий, как компонентов питательной среды, на культивирование ВГИ и ВБМ, и определить влияние культивирования на выживаемость ВГИ в режимах плюсовых температур. Первым этапом в решении этой задачи было изучение влияния различных концентраций липосомальных суспензий на пролиферативные свойства клеток и формирование монослоя перепелиных и куриных ЭФ.

Для этого в ростовую среду культивирования добавляли липо-сомальные липиды в количестве 0,1; 0,5; 1 и 1,5 мг/см3. Показано, что по сравнению с контролем индекс пролиферации ПЭФ и КЭФ увеличивается соответственно на 0,19; 0,67; 0,56 и 0,12 единиц.

Внесение в ростовую и поддерживающую среду в процессе культивирования ПЭФ и КЭФ оптимальной концентрации липосомальных липидов (0,5 мг/см3) повышало титр ВГИ (штамм "ФС-126") и ВБМ (штамм "ВНИВИП"), по сравнению с контролем на 0,18 и 0,23 lg ФОЕ/см3 соответственно.

В следующем опыте на КЭФ культивировали ВГИ, штамм "ФС-126", при этом в ростовую и поддерживающую среду добавляли липосомальные липиды (0,5 мг/см3) из ЯФХ и СФХ. После 72 часов культивирования снятый монослой инфицированных клеток оставляли на 4 часа при комнатной температуре (22°С). Исходный титр микросерии вакцины для обоих вариантов липосомальных липидов составил 5,37 и 5,35 lg ФОЕ/см3, а после испытания на термоустойчивость -снизился на 0,25 и 0,23 lg ФОЕ/см3 соответственно. В контрольном образце вакцины исходный титр был равен 5,04 lg ФОЕ/см3, а в конце опыта он снизился на 0,76 lg ФОЕ/см . Механизм большей стабильности липосомальной вакцины заключается, по видимому, в улучшении качества вирионной липидной оболочки. Эти результаты находят подтверждение в исследованиях с другими вирусами (Поздеев B.JL, Чер-номашенцев В.М., 1990, Порываев В.Д. с соавт., 1995)

В экспериментальных условиях вивария были проверены им-муногенные свойства липосомальной формы вакцины, из штамма "ВНИВИП", одной вакцины из штамма "ВНИВИП", наработанной по утверждённой технологии, и её сочетанного введения с липосомами.

Коэффициент эффективности вакцинации в группах составил 63, 47 и 64 % соответственно. Хотя невысокий защитный эффект вакцин был предопределён выбором очень вирулентного штамма "RB1B" вируса БМ, всё же предпочтение следует отдать экспериментальной липосомальной и производственной вакцине при сочетанном введении с липосомами.

В производственных условиях птицефабрики "Калининская" Тверской области при применении экспериментальной липосомальной вакцины смертность от БМ составила 1,21 % и выбраковка 1,8 %, в то время как для вакцины, изготовленной по утверждённой технологии, эти показатели были равны 2,22 и 2,5 % соответственно.

Согласно литературным данным, если в результате вакцинации смертность до 240-сут возраста составляет 1 %, то результаты считаются хорошими, 1-3 % - удовлетворительными, и свыше 3 % - неудовлетворительными (Purchase Н. G., 1977).

Как видно из полученных нами результатов исследований, ли-посомы способны почти в 2 раза снизить отход птицы от болезни Марека и значительно поднять уровень защиты (1,21 %).

2.6. Испытание липосомальной формы инактивированной вакцины против ССЯ-76

Для вакцинации против ССЯ-76 в России широко используется инактивированная вакцина из штамма "В8/78". В качестве адъюванта в ней используется инфузолипол, представляющий собой мелкодисперсную эмульсию соевого масла, соевого фосфатидилхолина и сорбита эмульгированного в воде. Учитывая дефицит двух первых компонентов комплексного адъюванта, мы сделали попытку заменить его липосомальной суспензией на основе яичного ФХ.

Включение инактцвированного вируса ССЯ-76 в липосомаль-ную суспензию, содержащую иммуномодулятор тималин и ганглиин, с последующим введением цыплятам кросса "Ломанн коричневый" 110

- сут возраста в дозе 0,5 и 5 см3 внутримышечно вызывало у них формирование антигемагглютинннов на 14- и 21-сут в титрах 5,6-5,8 и 6,4

- 6,8 log2.. Аналогичный результат получен и для промышленной вакцины: 5,8-6,2 и 7,0 log2.

Как видим, для обеих вакцин получен равнозначный иммунный ответ. С учётом того, что входящие в липосомальную суспензию компоненты (яичный фосфатидилхолин и холестерол в весовом соотношении 7:2 с добавлением 1 % омгокоферола) доступны и технология получения липосомальной формы инактивированной вакцины против ССЯ-76 не сложна, имеется основание испытать её в производственных условиях.

ВЫВОДЫ

1. Липосомальная форма иммуномодулятора тималина, полученная на основе суммарных липидов из желтка 9-10-сут куриных эмбрионов, вызывает in vitro увеличение количества Т-лимфоцитов (в 1,5 раза) и качества формируемых ими розеток с эритроцитами барана (образование морулы), по сравнению с аналогичными показателями для одного тималина.

2. Однократное внутримышечное введение цыплятам липосомальной суспензии, полученной на основе фосфатидилхолина из желтка 9-10-сут куриных эмбрионов, в широком диапазоне доз (0.045

- 120 мг/кг) не вызывает реакций местного или общего характера и изменений в клиническом состоянии.

3. Нативная или лиофильно высушенная и регидратированная форма липосомальной суспензии, назначенная цыплятам внутримышечным методом, вызывает увеличение титров гемагглютининов на ЭБ в 2-2,5 раза и количества Ig М-АОК в 3 раза. Ещё больший эффект увеличения гуморального иммунитета получен при интраназальном и интраокулярном методах введения липосомальной суспензии.

4. Тималин в дозе 40 мкг/кг, включённый в липосомальную суспензию, при однократном внутримышечном введении профилак-тирует иммуносупрессию у цыплят, вызванную двухкратным введением цитостатика циклофосфана в дозе 60 мг/кг. Механизм его корригирующего действия заключается в увеличении показателей Т-клеточного звена иммунитета (количество Е-РОК, относительная масса селезёнки, реакция трансплантант против хозяина).

5. Введение 18-сут куриным эмбрионам тималина в дозе 40 мкг/кг, включённого в липосомальную суспензию, вызывает иммуно-тропное действие: увеличение относительной массы селезёнки и бурсы. В производственных условиях применение липосомальной формы тималина in ovo повышает вывод цыплят на 4-6 %, а один тималин, но в дозе 100 мкг/кг - на 6-8 %.

6. Липосомальная суспензия в количестве 0,1-1,5 мг/см3, добавленная в ростовую среду при культивировании куриных эмбриональных фибробластов (КЭФ), повышает индекс пролиферации этих клеток на 0,12-0,67 ед. (максимально при дозе 0,5 мг/см3). Введение этого количества липосом в ростовую и поддерживающую среду для КЭФ при культивировании вируса герпеса индеек (ВГИ) и вируса болезни Марека (ВБМ) увеличивает титр на 0,18 и 0,23 lg ФОЕ/см3 и способствует повышению их термостабильных свойств.

7. В экспериментальных условиях полученная на основе липосомальной суспензии вакцина из штамма "ВНИВИП" ВБМ показала относительно лучшую иммунологическую защиту, по сравнению с вакциной, изготовленной по утверждённой технологии. В производственных условиях при применении экспериментальной вакцины смертность от болезни Марека составила 1,21 % и выбраковка 1,8 %, в то время как для вакцины, изготовленной по утверждённой технологии, эти показатели были равны 2,22 и 2,5 % соответственно.

8. Включение инактивированного вируса ССЯ-76 (штамм "В8/78") в липосомальную суспензию, содержащую иммуномодулятор тималин или ганглиин, с последующим введением цыплятам кросса

"Ломанн коричневый" 110-суг возраста в дозе 0,5 и 5 см3 внутримышечно, вызывало у них формирование антигемагглютининов на 14- и 21-сут в титрах, аналогичных образующимся после применения промышленной серии вакцины на основе адьюванта инфузолипола.

9. Липосомальная суспензия, состоящая из яичного фосфатидил-холина и холестерола (соотношение по массе 7:2) с добавлением 1 °А а-токоферола, повышает иммуностимулирующие и адьювантные свойства препаратов, применяемых в птицеводстве.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Рекомендовать введение в эмбрион тималина (40 мкг/кг) i липосомальной форме на 18-е сутки инкубации, что повышает выво,г цыплят на 4-6 %.

2. Применять в условиях птицефабрики экспериментальнук вакцину из штамма "ВНИВИП" вируса болезни Марека, полученнук на основе липосомальной суспензии, снижающую смертность и вьт браковку от болезни Марека на 1 и 0,7 % соответственно.

3. Липосомальная суспензия, состоящая из яичного фосфата дилхолина и холестерола (соотношение по массе 7:2) с добавление& 1% а-токоферола, может быть использована для повышения эффек тивности других лечебно-профилактических и вакцинных препаратов применяемых в птицеводстве.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Приходько Е.И., Придыбайло Н.Д., Хлопина А.Ф., Яушевг Л.Н. Иммуномодулирующие свойства тималина в липосомальной форме//Новые фармакологические средства в ветеринарии: Тез. докл 5-й Межгосударственной межвузовской науч.- пракг. конф., С Петербург, 1993.- С.47-48.

2. Хлопина А.Ф., Придыбайло Н.Д., Приходько Е.И. Исследо вание стабильности вакцинного вируса герпеса индеек ФС-126, полу ченного в присутствии липидов//Докл. Российской акад. е.- х. наук 1996,-№3,-С. 32-33.

3. Pridybailo N.D., S'hornicov V.V., Belkina I.V., Prichodko E.I Application of immunomodulators in poultry//Proceedings of the XI th In

ternational Congress of the World Veterinary Poultry Association. - Budapest, 1997.-P. 173.

4. Приходько Е.И. Эффективность применения липосомальной формы тималина при циклофосфановой супрессии//Новые фармакологические средства в ветеринарии: Тез. докл. 10-й Международной науч.- практ. конф., С-Петербург, 1998,- В печати.

5. Придыбайло Н.Д., Приходько Е.И. Перспективы применения липосомальных препаратов в птицеводстве//Новые фармакологические средства в ветеринарии: Тез. докл. 10-й Международной науч.-практ. конф., С-Петербург, 1998,- В печати.