Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Характеристика гемолизинов Bacillus anthracis

На правах рукописи

Арасланова Вера Алексеевна

Характеристика гемолизинов Bacillus anthracis

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

□□3485288

г. Покров 2009 г.

003485288

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ РОС-СЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ) и в Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи (НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН).

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Ю.О. Селянинов

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук,

профессор В.А. Гаврилов

доктор биологических наук H.H. Власова

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» Министерства сельского хозяйства РФ, г. Казань (ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»)

Защита диссертации состоится « 11 » декабря 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии н микробиологии по адресу: 601120, Владимирская область, Петушинский р-он, г. Покров ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ. Факс: (49243)62125

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ.

Автореферат разослан «_ » ноября 2009г.

и.о. ученого секретаря диссертационного совета, доктор ветеринарных наук, профессор

Е.М. Хрипунов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность работы. Вирулентность возбудителей бактериальных инфекций в значительной степени связана с их способностью подавлять защитные реакции макроорганизма факторами агрессии (капсульные субстанции, экзо- и эндотоксины) и инвазивности. К числу наиболее важных факторов инвазивности, влияющих на тяжесть течения болезни при их взаимодействии с клетками и тканями восприимчивого организма, относят способность патогенов продуцировать протеазы, гемолизины, ферменты пигментосинтеза, пигментосорбции, способность к адгезии на поверхности клеток и другие.

Среди многообразия этих веществ можно выделить токсины, которые в ряде случаев полностью определяют патогенез и клинические проявления болезни, например, столбнячный, дифтерийный, ботулинистический токсины, но чаще принимают ограниченное участие в инфекционном процессе (а-токсин Staphylococcus aureus, гемолизин Escherichia coli, фосфолипаза С Clostridium perfringens, листе-риолизин О Listeria monocytogenes и др.). Цитолигические токсины, нарушая целостность поверхностных структур клетки, повышая проницаемость тканей и подавляя фагоцитоз, способствуют проникновению бактерий в организм и их размножению, повышая вирулентность микробных культур.

Патогенность В. anthracis в основном связывают с наличием двух «классических» факторов — трехкомпонентного токсина и поли-Б-глютаминовой капсулы, структурные и регуляторные гены синтеза которых находятся в составе высокомолекулярных плазмид рХ01 и рХ02 (Mikesell P. et al., 1983; Green B.D. et al., 1985; Uchida I. et al., 1985, 1986,1987). Однако, накопилось много наблюдений, указывающих на то, что в патогенезе сибирской язвы принимают участие и другие, на сегодняшний день, мало изученные факторы патогенное™ (протеазы, гемолизины и др.), кодируемые хромосомной ДНК В. anthracis (Степанов А.С. и др., 1992; Цыганкова О.И., 1993; Еременко Е.И, 1997; Микшис Н.И. и др., 1999, Егорова И.Ю., Селянинов Ю.О., 2003). Об этом также свидетельствуют результаты изучения нуклеотидных последовательностей генов протективного антигена и кап-сульного оперона, в которых не было выявлено существенных отличий у изолятов с различной степенью патогенности.

Большинство из предполагаемых факторов патогенности В.anthracis довольно полно изучено, но работ, посвященных исследованию гемолитических свойств сибиреязвенного микроба, чрезвычайно мало. Так, в 40-х - 60-х годах прошлого столетия вопрос о гемолитических свойствах B.anthracis вызывал интерес микробиологов лишь возможностью использования их в одном из тестов, позволяющем дифференцировать его от близкородственных сапрофитов рода Bacillus. В связи с тем, что гемолитическая активность B.anthracis на стандартном кровяном агаре, как правило, не проявлялась, а в бульоне с кровью гемолиз происходил крайне медленно, отсутствие гемолитической активности долгое время считалось классическим признаком B.anthracis (Михин Н.А., 1940; Гинсбург Н.Н., 1975; Коро-тич А.С. и др., 1976; Бургасов П.Н. и др., 1984; Лобзин Ю.В. и др., 2002).

Наиболее глубокое изучение гемолитической активности данного микроорганизма было проведено О.И. Цыганковой (1993) и О.В. Шевченко (1999), которыми все изученные штаммы B.anthracis были подразделены на две группы - гс-молитически активные и неактивные, причем лизис эритроцитов барана в основном вызывали типичные по всем свойствам высоковирулентные сибиреязвенные штаммы.

Таким образом, учитывая данные литературы об участии гемолизинов в патогенезе болезней бактериальной этиологии, а также недостаточную изученность этого вопроса в отношении возбудителя сибирской язвы, изучение токсинов B.anthracis, обладающих циголитической активностью, является важной задачей для понимания молекулярных основ пагогенности данного микроорганизма.

1.2 Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы являлось определение химической природы, изучение биохимических и биологических свойств гемолизинов сибиреязвенного микроба, а также их генетической структуры.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить влияние условий культивирования на продукцию гемолизинов клетками В. anthracis;

- изучить влияние физико-химических и биологических факторов на цито-литическую активность сибиреязвенных экзотоксинов;

- разработать технологию очистки сибиреязвенных гемолизинов и изучить их физико-химические свойства;

- определитьпервичную структуру гемолитических детерминант B.anthracis и сравнить ее с таковой у других представителей рода Bacillus;

- создать экспрессирующие рекомбинантные плазмиды, содержащие гены сфингомиелиназы и фосфолипазы С B.anthracis, изучить цитолитические и биологические свойства полученных рекомбинантных белков;

- получить иммуноглобулины кроликов к фосфолипазе С и сфингомиелина-зе B.anthracis и изучить их влияние на проявление гемолитической активности сибиреязвенного микроба.

1.3 Научная новизна работы.

- Определены оптимальные условия культивирования Bacillus anthracis для обеспечения высокого уровня секреции сибиреязвенных гемолизинов и получены новые данные об их свойствах и биологической активности.

- Идентифицированы экзотоксины B.anthracis, обладающие гемолитическими свойствами, и проведен их структурно-функциональный анализ.

- Получены данные о первичной структуре гемолитических детерминант исследуемых штаммов B.anthracis и проведен их сравнительный анализ с целью определения степени родства с другими представителями рода Bacillus.

- Сконструирована оригинальная коллекция рекомбинантных клонов на основе прокариотических векторов, экспрессирующих сфингомиелина-зу и фосфолипазу С B.anthracis в функционально активной форме.

- Экспериментально доказано участие сфингомиелиназы В.амЬгааь в проявлении гемолитических свойств сибиреязвенного микроба.

1.4 Практическое значение работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание феномена гемолитической активности и, как следствие, в понимание молекулярных основ вирулентности В.аМИгааБ. Эти данные являются необходимым этапом, закладывающим основу для дальнейших исследований гемолизинов/ цитолизинов сибиреязвенного микроба, выяснения их участия в патогенезе, использования в качестве маркера при внутривидовом 'цитировании, что в перспективе позволит осуществлять контроль над его патогенными свойствами.

Разработаны Методические рекомендации «Получение рекомбинантных белков фосфолипазы С и сфингомиелиназы Л.ди/Лгасй», которые одобрены Советом по внедрению научных достижений в практику (протокол № 6 от 13 ноября 2008 г.) и утверждены директором ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

1.5 Апробация материалов исследований

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ (2003-2005 гг.), Международной научно-практической конференции «Болезни диких животных» (г. Покров, 2004 г.), Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2005 г.), Всероссийской научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (г. Киров, 2008 г.).

1.6 Публикации

Основные результаты исследований изложены в 8 научных работах, в том числе 1 статья в журнале, рекомендуемом ВАК РФ.

1.7 Личный вклад соискателя

Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В выполнении работы по отдельным этапам оказывали практическую и консультативную помощь, заведующий лабораторией «Бактериологии» ГНУ ВНИИВВиМ, к.в.н. И.Ю. Егорова и заведующий отделом «Бактериальных инфекций» НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, д.м.н. Белый Ю.Ф.

1.8 Положения, выносимые на защиту:

1. Исследованные гемолизины сибиреязвенного микроба по механизму ферментативного действия относятся к фосфолипазам.

2. Нормальные сыворотки крови животных обладают блокирующей активностью в отношении проявления ^-гемолитической активности и не оказывают влияния на а-гемолитичеекую активность сибиреязвенного микроба.

3. Сконструированные плазмиды экспрессируют гемолизины В.амЬгасчх в функционально активной форме, которые обладают антигенной активностью и вызывают образование специфических антител при иммунизации лабораторных животных.

1.9 Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: список

сокращений, введение, обзор литературы, собственные исследования, материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, список использованных источников и приложение. Список литературы включает 218 источников (из них 66 отечественных и 152 зарубежных). Работа содержит 28 рисунков и 9 таблиц.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы.

2.1.1 Материалы.

Штаммы микроорганизмов.

В экспериментальной работе использовали вакцинные штаммы B.anthracis -СТИ, Sterne и культуры близкородственных спорообразующих сапрофитов рода Bacillus - B.cereus 96, В. cereiis 8035. Штаммы E.coli XLl-Blue и BL-21(DE3).

Питательные среды.

Для культивирования микроорганизмов использовали питательные среды: мясо-пептонный агар (МПА); мясо-пептонный бульон (МПБ); агар фирмы «Difco»; LB - бульон; минимальную среду «Devis»; панкреатический гидролизат казеина (ПГК); питательный бульон (ПБ) производства НПО «Питательные среды» (Махачкала); бульон на основе триптического гидролизата мяса по Хот-тингеру; дрожже-пептонную среду (ДПС); панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ); питательный бульон фирмы «HiMedia»; гидролизат рыбной муки (ГРМ); сердечно-мозговой бульон (СМБ) фирмы «Difco»; гидролизат кильки (ГК); триптозо-фосфатный бульон.

Дифференциально-диагностические среды: среду для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба (СВК) производства НПО «Питательные среды» (Махачкала); кровяной агар, двухслойный кровяной агар. Споруляционно-росговые среды: картофельный агар.

Животные.

Белые мыши, живой массой 15-20 г; кролики, массой 2,0-2,5 кг

2.1.2 Методы.

Получение спорового материала.

Споровой материал исследуемых штаммов получали путём выращивания микробных культур на картофельном агаре в течение 6-7 суток и смывали с его поверхности по достижении не менее 80% спорообразования. После прогревания суспензии на водяной бане при температуре 80°С в течение 20 минут, споры трижды отмывали от остатков питательной среды стерильной дистиллированной водой и контролировали на отсутствие бактериальной контаминации высевами в МПБ и на МПА.

Определение концентрации жизнеспособных спор.

Концентрацию жизнеспособных спор определяли на агаризованной среде для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба (агар СВК) или МПА в соответствии с требованиями ОСТ 10-19-002-00 «Вакцина живая из штамма 55-ВНИИВВиМ против сибирской язвы животных».

Получение фильтратов бульонных культур.

Споры вакцинных штаммов (106 спор/см3) засевали в жидкую питательную среду и инкубировали в течение 24 ч. при температуре (36±1)°С при постоянном покачивании (100 об/мин). По окончании культивирования клетки осаждали центрифугированием (5 тыс. об/мин в течение 15 мин), а супернатант стерилизовали фильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм («Millipore», США). Стерильность определяли высевом 0,5 см3 культуральных фильтратов (КФ) в жидкие и на твердые питательные среды.

Определение гемолитической активности.

Гемолитическую активность сибиреязвенного микроба и фильтратов куль-туральной среды определяли согласно методическим указаниям «Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды» (1989), на модифицированном однослойном кровяном агаре по Шевченко О.В. (1999), луночным способом по методу Цыганковой О.И. (1993) и на среде для определения гемолитической активности и ее типа (СОГАТ), согласно «Методическим рекомендациям по определению гемолитической активности и её типа отдельных колониеобразующих единиц B.anthracis» (2003г.).

Определение лецитшшзной активности.

Лецитиназную активность штаммов определяли на твердой питательной среде, содержащей 0,4% лецитина (Pomerantsev А.P. et al., 1997).

Лецитиназную активность рекомбинантных белков и культуральных фильтратов определяли в лунках планшета с лецитовителлином, приготовленным из

1 желтка куриного яйца и 250 см3 физраствора. Разведения рекомбинантных белков вносили в лунки планшета, затем добавляли лецетовителлин, инкубировали

2 ч при температуре 37°С и 12ч при 4°С. Лецитиназную активность учитывали на спектрофотометре при длине волны 630 нм.

Концентрирование экзопродуктов фильтратов бульонных культур.

Для концентрирования гемолитически активных компонентов супернатан-тов бульонных культур использовали методы осаждения сульфатом аммония, этанолом, трихлоруксусной кислотой и хлороформом.

Очистка гемолитически активных экзопродуктов методом хроматографии.

Для выделения гемолитически активных компонентов концентрированную культуральную жидкость наносили на ионообменные колонки Mono Q и Mono S, уравновешенные фосфатным буфером. Материал фракций (полученных на ионообменных носителях), обладающих гемолитической активностью концентрировали и дополнительно фракционировали на колонке с «Суперозой 12», уравновешенной 20мМ трис-HCl буфером, рН 7,4, содержащим ЮОмМ NaCl.

Постановка ПЦР.

Амплификацию фрагментов ДНК B.anthracis, содержащих последовательности sph и pic генов, осуществляли в следующем режиме: денатурция 94°С - 40 сек., отжиг 55°С-40 сек., элонгация цепи 72°С -90 сек. (30 циклов). Наличие синтезированного фрагмента выявляли методом электрофореза в 1,0% агарозном геле.

Молекулярное клонирование фрагментов ДНК.

В качестве матрицы использовали ампликоны ДНК штаммов СТИ и Sterne B.anthracis. содержащие последовательности генов pic и sph. Манипулирование с ДНК осуществляли в соответствии с общепринятыми методиками (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., 1989). Клонирование контролировали секвенированием конечных рекомбинантных плазмид.

Экспрессия рекомбинантных белков.

Бактериальные культуры рекомбинантных клонов E.coli подращивали при 37°С на LB-бульопе с антибиотиком до достижения оптической плотности ОДш = 0,5-0,6, добавляли 0,5мМ ИПТГ и продолжали выращивание в течение 2-3 часов. Бактериальные клетки осаждали центрифугированием и разрушали ультразвуком. Хроматографическое выделение рекомбинантных белков осуществляли с использованием сорбента Glutathione-Sepharose 4В или Chelating Sepharose Fast Flow согласно рекомендациям производителя к использованию сефарозы соответствующего типа.

Определение концентрации белка.

Концентрацию белка определяли с использованием красителя Coomass-ie Brilliant Blue G250 и бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта (Bradford М.М.,1976).

Электрофорез в полиакриламидном геле.

Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия проводили по методике U.Laemmli (Leammli U.K.,1970). Гели окрашивали с применением нитрата серебра (Nesterenko M.V. et al.,1994).

Получение специфических сывороток.

Препарат очищенного рекомбинантного белка вводили кроликам 3-х кратно с интервалом 14 дней подкожно в области паховой складки в дозе 200 мкг/гол, а мышам с интервалом 5 дней внутрибрюшинно в дозе 15 мкг/гол. Животных обескровливали через 7-10 дней после последней иммунизации.

Определение полипептидной специфичности методом иммуиоблот-тинга.

Иммуноблоттинг проводили согласно Towbin и соавт. (Towbin H. et al.,1979) и использовали антитела против фосфолипазы С и сфингомиелиназы B.anthracis. В качестве проявляющего красителя применяли диаминбензидин или 4-хлор-1-нафтол.

3. Результаты исследований.

3.1. Изучение условий, влияющих па экспрессию гемолизинов B.anthracis.

Ранее было показано, что штаммы возбудителя сибирской язвы экспресси-руют мембранотоксины, лизирующие эритроциты по а- или р-типу (Егорова И.Ю., Селянииов Ю.О., 2003), а их продукция и возможность выявления зависят от целого ряда условий (Померанцев А.П. с соавт, 2003; Кличко В.И. с соавт., 2003). Однако, в связи с малочисленностью и противоречивостью данных литературы по этому вопросу, для нас представлял интерес изучение зависимости экспрессии а- и /i-гемолизинов от состава питательной среды, наличия свободного кислорода воздуха, углекислого газа и времени культивирования сибиреязвенных бацилл.

Для определения влияния состава питательной среды на продукцию гемолизинов, нами испытано 10 сред различного состава. В экспериментах использовали штаммы B.anthracis Sterne и СТИ, которые по предварительным данным на высоком уровне экспрессируют in vitro а- и р-гемолизины, соответственно.

В зависимости от исследуемого штамма и питательной основы среды культивирования в посевах наблюдали различия в интенсивности роста: скудный (оптическая плотность 0,2 и менее при Хт), умеренный (0,2-0,4) или обильный (более 0,4) (табл. 1). Однако проявление гемолитической активности КФ не всегда совпадало с интенсивностью роста культуры микроорганизмов.

Таблица 1. Проявление гемолитической активности культур Bacillus anthracis в зависимости от состава питательной среды.

№ п/п Питательная среда СТИ Sterne

рост уровень экспрессии рост уровень экспрессии

I ПГК + Devis +++ 44- +++ ++

2 ПГРМ + Devis +++ + +++ +

3 ПГК +++ +++ ++ +++

4 ПГРМ ++ +++ ++ +

5 ÜBHiMedia ++ + ++ +

6 МПБ +++ ++ +++

7 ГРМ +++ +++ ++ ++

8 СМБ ++ +++ ++ +++

9 ДПС ++ + ++ +

10 ГК +++ +++ -Н-+ +++

Примечание: рост: + — слабый, ++ — умеренный, +++ — обильный уровень экспрессии: + — низкий, ++ — средний, +++ — высокий.

Результаты проведенных исследований показали, что экспрессия р-гемолизинов в большей мере проявляется на средах, содержащих ПГРМ, ГРМ, ГК, ПГК, СМБ, а а-гемолизинов - ПГК, ГК, МПБ, СМБ. Универсальными для получения релевантных количеств гемолитически активных веществ можно считать среды на основе ПГК, СМБ, ГК, в которых в равной мере экспрессируются как а- так и р-гемолизины B.anthracis. Поскольку на СМБ и ПГК в равной мере наблюдался высокий уровень экспрессии гемолизинов обоих типов, эти срсды использовались нами для дальнейшего изучения гемолитически активных веществ B.anthracis.

На следующем этапе была исследована динамика накопления гемолитически активных продуктов при выращивании сибиреязвенных бацилл в жидкой питательной среде. Установлено, что гемолизины начинают выделяться в культураль-ную среду в интервале между 6-18 часами после внесения взвеси спор в бульон, достигая максимума к 24-30 часам. Кривые изменения гемолитической активности КФ у изученных штаммов носили однотипный характер.

Изучение влияния свободного кислорода воздуха и углекислого газа на экспрессию гемолизинов B.anthracis проводили посевом культур непосредственно на плотные среды, содержащие эритроциты барана (LB-arap и среда СОГАТ), а также в жидкие питательные среды с последующим инкубированием посевов при различных условиях.

А...... Б.

Рисунок 1. Изучение влияния 02(Б) и С02 (А) на экспрессию гемолизинов B.anthracis. Среда СОГАТ: 1 - штамм Sterne, 2 - штамм СТИ.

Результаты экспериментов показали, что регуляция генов B.anthracis, ответственных за синтез гемолизинов, лизирующих эритроциты по а- и Р-типу, различна (рис.1). Так, углекислый газ (10%) оказывал стимулирующее действие на продукцию гемолизинов штаммом СТИ. Причем, С02-активируемая экспрессия р-гемолизина наблюдалась независимо от способа культивирования (на твердой или в жидкой питательной среде). Для штамма Sterne отмечена обратная картина: присутствие свободного кислорода воздуха индуцировало выработку гемоли-тически активных веществ, вызывающих деградацию эритроцито в по а-типу. 02-активация в большей степени проявлялась при культивировании штамма на твердых питательных средах.

Какой-либо зависимости продукции гемолизинов B.cereus 96 от условий культивирования не выявлено: на среде СОГАТ и на LB-arape регистрировалась О,-активация, на СМБ - С02-активация.

Сравнительная оценка эффективности и чувствительности плотных сред (LB-arap и СОГАТ) для выявления гемолизинов B.anthracis подтвердила преимущества двухслойного кровяного агара.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов установлено, что уровень продукции гемолизинов B.anthracis зависит от ряда условий: состава питательной среды, времени культивирования сибиреязвенных бацилл, наличия свободного кислорода воздуха и углекислого газа.

3.2 Изучение факторов, влияющих на литическую активность экзотоксинов сибиреязвенного микроба.

Влияние температуры на литическую активность гемолизинов B.anthracis. Так как одной из характеристик токсинов является их термоустойчивость, нами изучено влияние температуры на проявление литической активности а- и /^-гемолизинов B.anthracis. Препараты (фильтраты бульонных культур B.anthracis штамов Sterne, СТИ и B.cereus 96) прогревали в течение 15 минут при 37, 40, 50, 60, 70, 80, 90 и 100°С, затем быстро охлаждали на льду и тестировали в модифицированном двухслойном кровяном агаре по Цыганковой О.И. (1993). Для всех препаратов установлена обратно пропорциональная зависимость: с повышением температуры снижается гемолитическая активность КФ (рис. 2).

37 40 50 60 70 80 90 100

Рисунок 2. Влияние температуры на литическую активность гемолизинов B.anthracis и B.cereus.

Интересным является тот факт, что при прогревании при 60°С препарата экзотоксинов штамма Sterne наблюдалась полная ингибиция гемолитической активности, которая затем восстанавливалась после кратковременного прогревания при высоких температурах. Подобный феномен (эффект Аррениуса) использовался Кульбахом и Вильямсом в качестве одной из характеристик при идентификации гемолизинов и для отличия их от тиолзависимых гемолизинов, которым это свойство не присуще (Coolbaugh and Williams, 1978).

Определение динамики лизиса эритроцитов. Одним из свойств, отличающих цереолизин B.cereus от гемолизина B.anthracis является наличие у второго из них относительно продолжительной отсрочки начала проявления лизиса эритроцитов. В связи с этим проведены эксперименты по сравнительному изучению динамики лизиса эритроцитов экзотоксинами культур B.cereus 96 и B.anthracis штаммов Sterne и СТИ. В лунки кровяного агара вносили аликвоты КФ и инкубировали при 37°С. Зоны гемолиза вокруг лунок с КФ B.cereus начинали формироваться уже через 1,5-2,0 часа инкубирования, тогда как с фильтратами B.anthracis — через 24 часа. При этом максимальный размер зоны гемолиза с КФ B.anthracis штамма СТИ наблюдался через 48 часов инкубирования (15 мм), штамма Sterne через 72 часа (10 мм), а у B.cereus 96 через 24 часа (20 мм).

Данное различие, по-видимому, связано с особенностями механизмов взаимодействия этих цитолизинов с мембранами эритроцитов. Так, задержка лизиса эритроцитов сибиреязвенными экзотоксинами может быть обусловлена наличием промежуточного этапа (этапов) во взаимодействии цитолизина с мембраной, предшествующего стадии лизиса клетки, или же являться результатом того, что исследуемый цитолизин образует в мембране поры меньшего размера, чем формируемые цереолизином B.cereus (Bhakdi et al., 1985).

Влияние СаС12, ЭДТА и дитиотрейтола (ДТТ) на активность сибиреязвенных гемолизинов. Известно, что двухвалентные ионы металлов оказывают влияние на синтез и функциональную активность многих бактериальных гемолизинов (Geoffrey С., Gaillard J.L., 1986). Так, добавление ионов Са2+, Mg2+ повышает гемолитическую активность М.bovis и V.parahaemolyticus, но угнетает ак-

тивность гемолизинов Y.pestis и V.cholerae El-Tor. ЭДТА, связывая двухвалентные ионы металлов, также обладает ингибирующим действием на гемолитическую активность токсинов.

Представители семейства тиолзависимых цитолизинов могут также активироваться цистеином, Р-меркаптоэтанолом и ДТТ. Так, например, гемолизин L.monocytogenes, несколько снижающий свою активность в процессе очистки, резко активируется цистеином, гидросульфитом натрия и другими восстановителями (Jenkins, 1964). В связи с этим нами изучены влияния СаС12, ЭДТА и ДТТ на активность а- и Р-гемолизинов КФ B.anthracis штаммов Sterne и СТИ, соответственно. Для этого к КФ добавляли 0,01 M СаС12, 0,05мМ/мл ЭДТА или 0,01мМ/мл ДТТ и инкубировали при 37°С. В качестве контроля использовали КФ без добавления указанных веществ. После 24-48 часовой инкубации измерялась гемолитическая активность исследуемых образцов КФ.

В результате исследований установлено отсутствие выраженного влияния ДТТ и двухвалентных ионов металлов на гемолитическую активность фильтратов, означающее, что сибиреязвенные гемолизины не относятся к группе SH-токсинов. Снижение активности фильтратов на 40% при добавлении ЭДТА указывает на то, что цитолитическое действие фильтратов частично обусловлено ферментативной активностью, вызывающей разрушение белковых структур оболочек чувствительных клеток с последующим их лизисом.

Влияние холестерина на активность гемолизинов. Одной из важнейших отличительных характеристик представителей группы SH-токсинов является ингибирование их активности холестерином, который служит для них мембранным рецептором (Alouf and Geoffroy, 1984; Vazquez-Boland et al., 1989). Результаты экспериментов показали, что обработка КФ B.anthracis холестерином не приводила к изменению гемолитической активности экзотоксинов, присутствующих в образцах.

Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствует о нетождественности изучаемых гемолизинов антролизину, описанному Shannon J.G. в 2003 году, а также о том, что данные гемолизины не принадлежат к группе тиолактивируемых токсинов.

Влияние сывороток крови различных видов животных на гемолитическую активность сибиреязвенного микроба. Одним из важнейших факторов патогснности возбудителей инфекционных болезней является их способность противостоять бактерицидному действию нормальной сыворотки крови макроорганизма (Павлович Н.В. и др., 1996; Peetboons et al, 1983).

Ранее проведенными исследованиями было показано, что нормальные сыворотки животных и человека обладают значительным ингибирующим действием на проявление гемолитической активности сибиреязвенного микроба. Однако авторы использовали либо ограниченное количество штаммов (Езепчук Ю.В. и др., 1969), либо недостаточно чувствительные тест-системы (Цыганкова О.И.,1993), что не позволило им объективно оценить влияние сывороток животных на гемолизины B.anthracis.

В своих исследованиях для оценки влияния сывороток крови животных на гемолитическую активность сибиреязвенных культур мы использовали среду СОГАТ (Селянинов Ю.О., Егорова И.Ю., 2004) с добавлением в покрывной слой 20,0; 4,0 и 0,8% нормальной сыворотки крови животных различных видов, а фильтратов культуральной жидкости - луночным методом (Цыганкова О.И., 1993), широко используемым для определения энзиматической активности микробов. Учет результатов проводили через 24-48 ч инкубирования при 37°С по наличию или отсутствию зоны гемолиза вокруг лунок или сибиреязвенных колоний.

Исходя из данных о видовой чувствительности животных к возбудителю сибирской язвы в экспериментах использовали нормальные сыворотки крови наиболее восприимчивых (козы, крупный рогатый скот, овцы, олени, лошади), слабо восприимчивых (свиньи, собаки) и лабораторных животных (крысы, кролики, морские свинки, мыши). Дополнительно были испытаны специфические противо-сибиреязвенные сыворотки и сыворотки крови вакцинированных животных.

Установлено, что независимо от способа определения иигибиции гемолитической активности результаты испытаний были сходны. Нормальные сыворотки крови животных обладали высокой блокирующей активностью в отношении Р-гемолизинов и не оказывали влияния, либо в незначительной степени инги-бировали (лошадь, свинья) а-гемолитическую активность. Интересным является тот факт, что мышиная сыворотка полностью ннгибировала действие как а- так и [З-гемолизинов. Присутствие в сыворотках специфических противосибиреязвен-ных антител не изменяло характера взаимодействия эритроцитов и гемолизинов.

3.3 Изучение цитотоксической активности сибиреязвеиых кулътураль-пых фильтратов in vitro.

В наших экспериментах в качестве тест-системы использовалась перевиваемая культура клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК). Испытуемый материал в объеме 20 мкл вносили в плоскодонные лунки планшетов для микротитрования, в которые вносили по 200 мкл суспензии клеток. Смесь инкубировали в течение 48 часов. Цитотоксический эффект оценивали методом световой микроскопии (рис. 3).

А. Б.. .........В...............Г.

Рисунок 3. Цитотоксическая активность КФ B.anthracis в отношении клеток ПСГК через 48 часов культивирования (хЮО): А, Б - штамм Sterne; В - штамм СТИ; Г - контроль.

Установлено, что КФ B.anthracis проявляют цитотокснческую активность в отношении клеток ПСГК. Цитотоксическое действие выражалось в округлении клеток, стирании межклеточных границ, очаговом отслоении клеток от стекла и дегенеративных изменениях.

3.4 Концентрирование внеклеточных гемолизинов B.anthraeis.

В связи с отсутствием в литературе достоверных сведений о природе сибиреязвенных цитолизинов, а также с целью подбора наиболее эффективного способа их концентрирования и очистки, мы использовали методы солевого и спиртового осаждения, а также обработку КФ хлороформом и трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Для получения препаративных количеств гемолизинов использовали КФ B.anthraeis штаммов СТИ и Sterne.

В результате спиртового осаждения нами получен препарат экзопродуктов, обладающий гемолитической активностью, превышающей исходную в 4 раза. Обработка экзопродуктов хлороформом в течение 2-х часов не изменяла их гемолитической активности. Применение ТХУ приводило к выпадению обильного осадка, который не проявлял гемолитической активности, что вероятно связано с денатурацией исследуемых цитолизинов.

Осаждение экзопродуктов КФ методом ступенчатого насыщения сульфатом аммония (10-80%) позволило определить, что гемолитически активные экзо-продукты высаливаются при 40-80% насыщения (NII4)2S04. Наибольшей активностью обладали препараты, полученные при 60% насыщении (NI14)2S04 (рис. 4). Их активность превышала исходную в 16 раз.

С " 2/ О N f 1 : : , Ч

«и

2

I )

ч 3

U

4V

1

)

J 3

■-J

и

О 1 i и u J*

V/ ; ... ; - 4:' ï ■ ^ J

U4 I \ « ° / л® У U5

Zl_A. i Î^Ss_i_^ .В. _!--Г.

Рисунок 4. Гемолитическая активность КФ B.anthraeis, обработанных сульфатом аммония при 60% насыщения: А - исходный фильтрат штамма СТИ; Б - фильтрат штамма СТИ, после внесения (NH4)2S04; В - исходный фильтрат штамма Sterne; Г - фильтрат штамма Sterne, после внесения (NH4)2S04.

Таким образом, концентрирование экзопродуктов КФ с использованием сульфата аммония и этанола с сохранением гемолитической активности может указывать на их белковую природу.

3.5 Разделение гемолитически активных фракций экзопродуктов B.anthraeis с использованием метода хроматографии.

На следующем этапе очистки гемолизинов мы использовали ионообменную хроматографию, позволяющую разделять молекулы многокомпонентных систем по величине их суммарного заряда.

В результате последовательного разделения экзопродуктов, сконцентрированных сульфатом аммония, на анионообменной колонке Mono Q и катионообмен-ной колонке Mono S было установлено, что гемолитической активностью обладали фракции экзомолекул, не сорбированных на носитель или элюировавшихся при 0,1 M NaCl. При этом фракции штамма СТИ наряду с гемолитической, обладали и ле-цитиназной активностью.

1/128

1/Б4

Ï 1/32

1 1/16

1/8

S

§ 1/4

J5 1/2

0

PS

/П.

- - */. ч

•г» -чЛ". 1.

,у® m' * AJ. дГ '» ж\Ч • --

.l^f^ir-l*" , , ,'"', Viïlt ** I • 1 I », • (•■[ »1 »

125 + 100 g

75 J

50 I

25 I 0

11 13 15

номера сйзакций

— ■ л,— • ФАсти — е- - — ГАсти

— ■ Ж • — TAslerne -СТО -»-Sterne

Рисунок 5. Гель-фильтрация гемолитически активных фракций на колонке с Superóse 12: СТИ - материал очищенного КФ штамма СТИ; Sterne - материал очищенного КФ штамма Sterne; ГА - гемолитическая активность; ФА - фосфолипазная (лецитиназная) активность.

Материал гемолитически активных фракций концентрировали (в 50 раз) и подвергали гель-фильтрации на колонке с Superóse 12. В результате разделения макромолекулы элюировались в виде двух пиков: 2-4 с м.м. >300 кДа и 5-14 с м.м. 20-40 кДа (рис. 5).

При тестировании материала фракций на наличие гемолитической и леци-тиназной активностей было установлено, что этими видами активностей обладали макромолекулы фракции с м.м. 20-40 кДа. Пик лецитнназной активности экзопро-дуктов штамма СТИ был незначительно смещён относительно пика гемолитической активности данного штамма в сторону низкомолекулярных продуктов.

Результаты разделения материала этих фракций методом SDS-электрофореза показали, что они содержат три полипептида с относительной молекулярной массой 31, 37 и 41 кД.

Поскольку исходные КФ содержали низкое количество экзопродуктов с ци-толитической активностью, что не позволило получить их в препаративных количествах, дальнейшие исследования проведены с применением молекулярно-биологических методов.

3.6 Конструирование и изучение экспрессии рекомбинаитных фосфоли-пазы С и сфингомиелипазы В. anthracis.

По данным литературы в геноме В.anthracis присутствуют нуклеотидные последовательности генов pic и sph, ответственных за продукцию фосфолипазы С (PLC) и сфингомиелипазы (SPH), аналогичных соответствующим генам B.cereus, которые у сибиреязвенного микроба находятся в аттенуированном состоянии (Pomerantsev А.P. et al., 2003). Так как молекулярные массы данных ферментов соответствовали таковым, выделенным нами из КФ гемолитически активных экзопродуктов, были проведены работы по выявлению различий в структуре гена регулятора транскрипции гемолизинов (plcR'), клонированию генов pic и sph В.anthracis, получению рекомбинаитных белков и изучению их биологических свойств.

На первом этапе исследований у штаммов СТИ и Sterne были определены нуклеотидные последовательности плейотропного регулятора pIcR, специфичного для всех бацилл группы видов Bacillus (B.cereus, B.thuringiensis, B.mycoides и В. anthracis). На матрицах ДНК обоих штаммов с использованием праймеров, фланкирующих ген plcR, были амплифицированы соответствующие ПЦР-продукты. Нуклеотидное секвенирование полученных ампликонов показало, что последовательность гена plcR штамма СТИ не отличается от последовательности гена plcR штамма Sterne.

На следующем этапе был проведён комплекс экспериментов по клонированию и получению рекомбинантных SPH и PLC штамма Sterne. Для амплификации интересующих нас генов синтезировано восемь олигонуклеотидов, фланкирующих различные фрагменты генома, содержащие кодирующие последовательности генов PLC (pic) и SPH (sph) В.anthracis и их сигнальные пептиды. Полученные ПЦР-продукты лигировали с вектором рЕТ-28Ь или pGEX-4T-3, а затем трансформировали в штамм E.coli XL-Blue. После выращивания трансформантов на ага-ризованной среде с соответствующим антибиотиком (Кп или Amp) и выделения плазмидной ДНК осуществляли рестрикционный анализ и определение нуклео-тидной последовательности рекомбинантных плазмид, содержащих необходимые вставки. Охарактеризованные плазмиды, были использованы для трансформации в экспрессируюший ш тамм E.coli BL21 (DE3). Характеристика сконструированных плазмид представлена в таблице 2.

Изучение экспрессии рекомбинантной SPH (р279) показало, что большая часть синтезированного продукта находилась во фракции несвязанных белков. В связи с этим выделение данных полипептидов проводили с применением никель-аффинной хроматографии из цитоплазматической фракции микробных клеток. Дополнительно нами получена рекомбинантная SPH на основе плазмиды р293 (pET-6His::Sph), не содержащей в своем составе сигнального пептида.

Таблица 2. Характеристка сконструированных рекомбинантных плазмид.

Обозначение плазмиды Плазмиды Характеристики

- рЕТ-28Ь Вектор для E.coli; Кпг

р280 рЕТ-6His::PlcS.pZ 1.95 T.fi.ii ПЦР фрагмент (#238-237), кодирующий PC-PLC

р279 рЕТ-6His::SphS.p 1.02 т.п.л ПЦР фрагмент (#236-237), кодирующий SPH

р292 рЕТ-6His::Plc 740 п.и ПЦР фрагмент (#257-258), кодирующий mature PC-PLC

р293 pET-6His::Sph 929 п.и ПЦР фрагмент (#259-260), кодирующий mature SPH

р295 pET-6Nis::Ph::6His 728 п.н ПЦР фрагмент (#257-263), кодирующий PC-PLC

р296 pIT-SY/iV./'/r.S'./) 853 п.н ПЦР фрагмент (#238-258), кодирующий PC-PLC и последовательность сигнального пептида

рЗОО pET-6His::PlcS.p::fiHis 841 п.н ПЦР фрагмент (#238-263), кодирующий PC-PLC и последовательность сигнального пептида

- pGEX-4T-3 Вектор для E.coli; Amp'

рЗОВ pGE X-PfcS.p 1.95 т.п.и EcoRI-Sall ДНК фрагмент из рЕТ-28Ь-6H::PlcS.pZ

Получить PLC в чистом виде на основе плазмиды р280 нам не удалось, в связи с чем были предприняты попытки её получения с использованием рекомбинантных плазмид, с различными вариантами встройки гена pic - плазмиды р292, р295, р296, рЗОО, а также рекомбииантной плазмиды pGEX-4T-3, в которой очистка гибридных белков осуществляется в один этап с применением иммобилизирован-ного на сефарозе глутатиона за счет аффинного взаимодействия с ним глутатион-S-трансферазы (табл. 2). В результате испытаний рекомбинантная PLC в чистом виде была получена лишь на основе плазмиды р292.

Изучение свойств рекомбинантных фосфолипазы С и сфингомие-линазы. Выделенные с помощью никель-аффинной хроматографии рекомбинант-ные белки были исследованы методом электрофореза в полиакриламидном геле. Установлено, что очищенный белок фосфолипазы С мигрировал полосой с м.м. 30-31кД, а сфингомиелиназы - 41 и 37кД (плазмидные конструкции р279 и р293, соответственно).

В таблице 3 представлены данные определения гемолитической и лецити-назной активностей полученных рекомбинантных белков и лизатов клеток рекомбинантных клонов E.coli.

Таблица 3. Гемолитическая и лецитиназная активности рекомбинантных белков.

Рекомбинантная плазмида Гемолитическая активность Лецитиназная активность

Лизат клеток Очищенный белок Лнзат клеток Очищенный белок

р279 (sph) 1:64000 1:64000 1:1 1:1

р293 (sph) 1:64000 1:64000 1:1 1:1

d280 (pic) 1:64000 не получен 1:1280 не получен

р292 (pic) 1:6400 1:6400 1:1 не определяется

р296 (pic) 1:1 не определяется 1:640 не определяется

рЗОО (pic) 1:1 не определяется 1:160 не определяется

p308 (pic) 1:1 не определяется 1:160 не определяется

Установлено, что рекомбинантная SPH обладает высоким уровнем гемолитической и низким уровнем лецитиназной активностей, причём данные виды активности проявляются независимо от того, в каком виде использовались белки - в виде лизата клеток или хроматографнчески очищенных. Наличие или отсутствие сигнальной последовательности не влияло на ферментативные свойства рекомбииантной SPH.

Рекомбинантная PLC в виде лизата клеток имеет как гемолитическую, так и лецитиназную активности. У лизата клеток Е. coli, содержащих плазмиду р292 (pic), более низкая гемолитическая активность по сравнению с лизатом клеток Е. coli, несущих плазмиду р280 (pic), но при этом именно из этого лизата удалось выделить очищенный белок фосфолипазы С, обладающий гемолитической активностью (рис. 6).

Рисунок 6. Гемолитическая активность очищенных рекомбинантных белков: сфин-гомиелиназы р279 (А) и фосфолипазы р292 (Б). А - 1. Разведение препарата (sph) 1:1000: 2. 1:2000; 3.1:4000; 4.1:8000; 5.1:16000; 6. 1:32000; 7.1:64000. Б- 1. Разведение препарата (pic) 1:100; 2. 1:200; 3. 1:400; 4. 1:800; 5. 1:1600; 6. 1:3200; 7. 1:6400.

Таким образом, полученные нами рекомбинантные SPH и PLC экспрессиру-ются клетками E.coli в активной форме и способны вызывать лизис эритроцитов и расщепление лецитина.

Антигенные свойства рекомбинантных фосфолипазы С и сфин-гомиелиназы. С целью получения антисывороток, специфически выявляющих сфингомиелиназу и фосфолипазу С, мыши были иммунизированы очищенными рекомбинантными SPH (р293) и PLC (р292). После трехкратного введения полипептидов с интервалом в 5 дней полученные иммунные сыворотки использовались в иммуноблоттинге с препаратами очищенных белков и ультразвуковых лизатов рекомбинантных клеток. Оптимальным являлось разведение сыворотки 1:20000.

Исследования показали, что все испытанные препараты рекомбинантных SPH и PLC специфически взаимодействовали с антителами соответствующих антисывороток мышей.

Влияние нормальных сывороток крови на гемолитическую активность рекомбинантных фосфолипазы С и сфингомиелиназы. Дополнительно нами изучено влияние нормальных сывороток крови человека и различных видов животных на проявление гемолитической активности рекомбинантных белков.

Установлено, что независимо от испытуемого белка получены сходные результаты. Сыворотки всех видов животных (кроме мышиной) в разведении 1:10 незначительно, а сыворотка козы полностью ингибировали гемолитическую активность рекомбинантных PLC и SPII (рис. 7).

Сыворотка крови мыши полностью блокировала действие как сфингомиелиназы, так и фосфолипазы в разведении 1:320, что согласуется с ранее полученными нами результатами об ингибирующей активности мышиных сывороток (п. 3.2).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об экспрессии в E.coli рекомбинантных белков B.anthracis, обладающих гемолитической и лецитиназ-ной активностями.

Рисунок 7. Влияние нормальных сывороток крови на гемолитическую активность ре-комбинантной фосфолипазы: А. - сыворотка мыши; Б. - кролика; В. - барана; Г. - человека. 1. - контроль (белок без добавления сыворотки); 2. - разведение сыворотки 1:10; 3. - 1:100; 4. - 1:1000; 5. - 1:10000; 6. - 1:100000; 7. - 1:1000000.

Получение иммуноглобулинов. Рекомбинантные PLC и SPH также использовали для иммунизации кроликов. Из полученных гипериммунных сывороток методом аффинной хроматографии с применением Protein Sepharose А были выделены антифосфолипазные (a-PLC Ig) и антисфингомиелиназные (a-SPH ig) иммуноглобулины.

Специфичность взаимодействия иммуноглобулинов с рекомбинантными белками подтверждалась в иммуноблоттииге (рис. 8).

1 2 3 А. 1 2 3 Б.

Рисунок 8. Взаимодействие рекомбинантных SPH (А) и PLC (Б) в иммуноблоттииге с: 1 - нормальная сыворотка кролика; 2 - a-SPH Ig (А) и a-PLC Ig (Б); 3 - анти-SPH (А) и анти-PLC (Б) сыворотки кроликов.

При оценке способности полученных иммуноглобулинов ингибировать гемолитическую активность B.anthracis использовали КФ штаммов Sterne и СТИ (табл. 4).

Таблица 4. Влияние иммуноглобулинов на гемолитическую активность супернатан-тов бульонных культур B.anthracis штаммов Sterne и СТИ.

Разведение препарата КФ штамма СТИ КФ штамма Sterne

N крол.сыв. Nig a-PLC Ig a-SPH Ig N крол.сыв. Nig a-PLC la a-SPH Ig

1:10 + + + - + + -

1:100 + + + + + + + -

1:1000 + + + + -h + + +

1:10000 + + + + + + + +

1:100000 + + + + + + + +

Примечание: «+» — наличие зоны гемолиза; «-» — отсутствие зоны гемолиза

Как видно из данных таблицы, гемолитическая активность КФ испытуемых штаммов не снижалась при добавлении к ним нормальных кроличьих (N Ig) и a-PLC Ig. Внесение в КФ a-SPH Ig в разведении 1:10 (16 мкг/мл) ингибировало лизис эритроцитов гемолизинами штамма СТИ, а в разведении 1:100 - штамма Sterne, что является свидетельством преимущественной, по отношению к фосфолипазе, роли сфингомиелиназы в процессе разрушения эритроцитов.

3 выводы

1. Питательные среды на основе панкреатического гидролизата казеи на, сердечно-мозгового бульона и гидролизата кильки в достаточной мере обеспечивают ростовые потребности исследуемых штаммов B.anthracis и высокий уровень секреции сибиреязвенных гемолизинов. Активная секреция гемолизинов B.anthracis в культуральную среду начинается после первых 6 часов культивирования и достигает максимума к 24-30 часам выращивания.

2. Установлено различие в регуляции генов, кодирующих гемолизины B.anthracis: при культивировании штаммов B.anthracis в атмосфере углекислого газа происходит активация генов, ответственных за продукцию цитотоксина, вызывающего лизис эритроцитов по ß-типу, а в аэробных условиях - по а-типу.

3. Гемолизины штамма Sterne отличаются от гемолизинов штамма СТИ наличием у первых способности восстанавливать после кратковременного прогревания при высоких температурах свою гемолитическую активность, утрачиваемую в результате воздействия "умеренных" (40-60°С) температур - эффект Ар-рениуса.

4. Характер динамики лизиса эритроцитов под действием гемолизинов B.cereus и B.anthracis отличается наличием у последних продолжительных фаз связывания и формирования «повреждений».

5. Гемолитическая активность B.anthracis не ингибируется холестерином, не активируется дитиотрей голом и ионами Са2+, при добавлении ЭДТА активность снижается на 40 %. Нормальные сыворотки крови животных блокируют действие ß-гемолизинов и не предохраняют эритроциты от лизиса а-гемолизинами.

6. Культуральные фильтраты B.anthracis обладают не только гемолитической, но и цитотоксической активностью в отношении перевиваемой культуры клеток почки сибирского горного козерога.

7. Сконструированы плазмиды для экспрессии рекомбинантных белков сфинго-миелиназы и фосфолипазы С B.anthracis в функционально активной форме.

8. Нуклеотидным секвенированием определены последовательности гемолитических детерминант штаммов СТИ и Sterne и проведен их сравнительный анализ. Установлено, что нуклеотидные последовательности гена регулятора pIc.R исследуемых штаммов идентичны.

9. Получены иммуноглобулины против рекомбинантной сфингомиелиназы и фосфолипазы С B.anthracis, с помощью которых показано, что в процессе разрушения эритроцитов экзопродуктами сибиреязвенного микроба преимущественная роль принадлежит сфингомиелиназе.

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведённых исследований разработаны, утверждены и рекомендуются в практику научно-исследовательских учреждений Методические рекомендации «Полу чение рекомбинантных белков фосфолипазы С и сфингомиелиназы B.anthracis».

Сконструированные рекомбинантные штаммы E.coli, содержащие нуклео-тидные последовательности гемолитических детерминант B.anthracis и экспрес-сирующие фосфолипазу С и сфингомиелиназу в функционально активной форме, целесообразно использовать при изучении роли гемолизинов в патогенезе сибиреязвенной инфекции.

5 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Арасланова, В.А. Влияние состава питательных сред на продукцию гемолизинов Bacillus anthracis / В.А. Арасланова, И.Ю. Егорова, Ю.О. Селянинов, Н.С. Косяченко // Болезни диких животных: Труды Междунар. науч.-практ. конф. -Покров. - 2004. - С. 59-62.

2. Егорова, И.Ю. Изучение индуцирующего действия 02 и С02 на экспрессию гемолизинов B.anthracis / И.Ю. Егорова, В.А. Арасланова, Ю.О. Селянинов // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Материалы Междунар. науч.-практ. конф., посвященной 35-летию института. - Щелково.-2005. - С. 313-317.

3. Арасланова, В.А. Изучение условий, влияющих на экспрессию гемолизинов B.anthracis / В.А. Арасланова, И.Ю. Егорова, Ю.О. Селянинов // Сибирская язва и др. опасные инфекционные болезни животных: Материалы по теме работы круглого стола приуроченного к 80-летию академика РАСХН Бакулова И.А. -Покров. - 2005. - С. 19-24.

4. Арасланова, В.А. Влияние сывороток крови различных видов животных на гемолитическую активность сибиреязвенного микроба / В.А. Арасланова, И.Ю. Егорова, Ю.О. Селянинов // Сибирская язва и др. опасные инфекционные болезни животных: Материалы по теме работы круглого стола приуроченного к 80-летию академика РАСХН Бакулова И.А. - Покров. - 2005. - С. 24-27.

5. Арасланова, В.А. Гемолитическая активность Bacillus anthracis / В.А. Арасланова, Ю.О. Селянинов, Ю.Ф. Белый // Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов - Москва. - 2007. - С. 206.

6. Арасланова, В.А. Гемолитическая активность Bacillus anthracis / В.А. Арасланова, Ю.О. Селянинов // Российский ветеринарный журнал. - №2 -2008. - С. 17-19.

7. Арасланова, В.А. Гемолитическая активность Bacillus anthracis / В.А. Арасланова, Ю.О. Селянинов // Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России»,- Киров: ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» - 2008. - Вып.1,- С.37-42.

8. Арасланова, В.А. Цитолитическая активность B.anthracis / В.А. Арасланова, Ю.О. Селянинов // «Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней»: Сб. научных трудов №9.- Москва.: ЗАО МП «Гигиена», - 2009. - С.350-353.

Список сокращений,

АХ Агар Хоттипгера

БХ бульон Хоттингера

ГА гемолитическая активность

ГК гидролизат кильки

ГРМ гидролизат рыбной муки

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ДПС дрожже-пептонная среда

ДТТ дитиотриэтол

ИПТГ изопропил - P-D-тиогалактопиранозид

кДа килодальтон

КФ культуральный фильтрат

мкг микрограмм

мкл микролитр

мл миллилитр

м.м. молекулярная масса

мМ миллимоль

МПА мясо-пептопный агар

МПБ мясо-пептониый бульон

ПБ питательный бульон

ПГК панкреатический гидролизат казеина

ПГРМ панкреатический гидролизат рыбной муки

ПСГК перевиваемая культура клеток почки сибирского горного козерога

ПЦР полимеразная цепная реакция

СВК среда для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба

СМБ сердечно-мозговой бульон

СОГАТ среда для определения гемолитической активности и ее типа

т.п.н. тысяч пар нуклеотидов

ТФБ триптозо-фосфатный бульон

ТХУ трихлоруксусная кислота

ФА фосфолипазная (лецитиназная) активность

ЭДТА этиленднамин тетраацетат

Amp ампициллин

а В HI способность штаммами синтезировать различные типы

'' " гемолизинов

СО углекисный газ

GST глутатион-8-трансфераза

Ig иммуноглобулин

Кп канамицин

LB среда Лурия-Бертана

О кислород

PC-PLC фосфотпдилхолинспецифичсская фосфолипаза

рН водородно-ионный показатель среды

PLC фосфолипаза

SDS додецилсульфат натрия

SPH сфингомиелиназа

Заказ № 165-а/10/09 Подписано в печать 30.10.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Актуальность работы. Одним из основных фундаментальных направлений современной микробиологии является изучение патогенности микроорганизмов. В настоящее время известно, что патогенные бактерии вырабатывают широкий спектр веществ, как непосредственно повреждающих или убивающих клетки макро- и микроорганизма, так и способствующих преодолению защитных систем организма хозяина для обеспечения своего проникновения. Эти соединения играют основную роль в патогенезе болезней бактериальной этиологии. (McDonel et al.,1986).

К числу наиболее важных факторов инвазивности, влияющих на тяжесть течения болезни при их взаимодействии с клетками и тканями восприимчивого организма, относят способность патогенов продуцировать протеазы, гемолизины, ферменты пигментосинтеза, пигментосорбции, способность к адгезии на поверхности клеток и другие. Среди многообразия этих веществ можно выделить токсины, которые в ряде случаев полностью определяют патогенез и клинические проявления болезни, например, столбнячный, дифтерийный, ботулинистический токсины, другие принимают более ограниченное участие в инфекционном процессе (а-токсин Staphylococcus aureus, гемолизин Escherichia coli, фосфолипаза С Clostridium perfringens и др.). Вместе с тем последние, нарушая целостность поверхностных структур клетки, повышая проницаемость тканей и подавляя фагоцитоз, способствуют проникновению бактерий в организм и их размножению, повышая вирулентность микробных культур.

Сибиреязвенный микроб в этом отношении также не является исключением. Установлено, что в основном вирулентность сибиреязвенного микроба связана с продукцией двух «классических» факторов — трехкомпонентного токсина и поли-Б-глютаминовой капсулы, структурные и регуляторные гены синтеза которых находятся в составе высокомолекулярных плазмид рХ01 и рХ02 (Mikesell P. et al., 1983; Green B.D. et al., 1985; Uchida I. et al., 1985, 1986, 1987). Однако анализ культурально-морфологических и биологических свойств полевых изолятов и их изогенных производных показывает, что в развитии инфекционного процесса при сибирской язве принимают участие и другие, на сегодняшний день, плохо изученные факторы патогенности, кодируемые хромосомой В. anthracis (Степанов А.С. и др., 1991; Цыганкова О.И., 1993; Еременко Е.И., 1997; Микшис Н.И. и др., 1999, Егорова И.Ю., Селянинов Ю.О., 2003). Об этом также свидетельствуют результаты изучения нуклеотидных последовательностей генов протективного антигена и капсульного оперона, в которых существенных отличий не было выявлено у изолятов с различной степенью патогенности.

Большинство из предполагаемых факторов патогенности B.anthracis довольно полно изучено, но работ посвященных исследованию гемолитических свойств сибиреязвенного микроба чрезвычайно мало. Так, в 40-х - 60-х годах прошлого столетия вопрос о гемолитических свойствах В. anthracis вызывал интерес микробиологов лишь возможностью использования их в одном из тестов, позволяющем дифференцировать его от близкородственных сапрофитов рода Bacillus. Но в связи с тем, что гемолиз на стандартном кровяном агаре, как правило, отсутствовал, а в бульоне с кровью происходил крайне медленно отсутствие гемолитической активности долгое время считалось классическим признаком B.anthracis (Михин Н.А., 1942; Гинсбург Н.Н., 1975; Коротич А.С. и др., 1976; Бургасов П.Н. и др., 1984; Лобзин Ю.В. и др., 2002).

Наиболее глубокое изучение гемолитической активности данного микроорганизма было проведено О.И. Цыганковой (1993) и О.В. Шевченко (1999). С помощью разработанных ими способов выявления гемолитической активности (луночный метод на двухслойном агаре и однослойная среда) все изученные штаммы B.anthracis были подразделены на две группы -гемолитически активные и неактивные, причем гемолиз эритроцитов барана в основном вызывали типичные по всем свойствам высоковирулентные сибиреязвенные штаммы.

Таким образом, учитывая данные литературы об участии гемолизинов в патогенезе болезней бактериальной этиологии, а также недостаточную изученность этого вопроса в отношении возбудителя сибирской язвы, изучение токсинов B.anthracis, обладающих цитолитической активностью, является важной задачей для понимания молекулярных основ патогенности данного микроорганизма.

Цели и задачи исследования. Основной целью данной работы являлось определение химической природы, изучение биохимических и биологических свойств гемолизинов сибиреязвенного микроба, а также их генетической структуры.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

-изучить влияние условий культивирования на продукцию гемолизинов клетками B.anthracis;

-изучить влияние физико-химических и биологических факторов на цитолитическую активность сибиреязвенных экзотоксинов;

-разработать технологию очистки сибиреязвенных гемолизинов и изучить их физико-химические свойства;

-определить первичную структуру гемолитических детерминант В. anthracis и сравнить ее с таковой у других представителей рода Bacillus;

-создать экспрессирующие рекомбинантные плазмиды, содержащие гены сфингомиелиназы и фосфолипазы С B.anthracis, изучить цитолитические и биологические свойства полученных рекомбинантных белков;

-получить иммуноглобулины кроликов к фосфолипазе С и сфингомиелиназе B.anthracis и изучить их влияние на проявление гемолитической активности сибиреязвенного микроба

Научная новизна работы.

- Определены оптимальные условия культивирования Bacillus anthracis для обеспечения высокого уровня секреции сибиреязвенных гемолизинов и получены новые данные об их свойствах и биологической активности.

Идентифицированы экзотоксины B.anthracis, обладающие гемолитическими свойствами, и проведен их структурно-функциональный анализ.

- Получены данные о первичной структуре гемолитических детерминант исследуемых штаммов B.anthracis и проведен их сравнительный анализ с целью определения степени родства с другими представителями рода Bacillus.

- Сконструирована оригинальная коллекция рекомбинантных клонов на основе прокариотических векторов, экспрессирующих сфингомиелиназу и фосфолипазу С В. anthracis в функционально активной форме.

- Экспериментально доказано участие сфингомиелиназы B.anthracis в проявлении гемолитических свойств сибиреязвенного микроба.

Практическое значение работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание феномена гемолитической активности и, как следствие, в понимание молекулярных основ вирулентности B.anthracis. Эти данные являются необходимым этапом, закладывающим основу для дальнейших исследований гемолизинов/цитолизинов сибиреязвенного микроба, выяснения их участия в патогенезе, использования в качестве маркера при внутривидовом типировании, что в перспективе позволит осуществлять контроль над его патогенными свойствами.

Разработаны Методические рекомендации «Получение рекомбинантных белков фосфолипазы С и сфингомиелиназы B.anthracis», которые одобрены Советом по внедрению научных достижений в практику (протокол № 6 от 13 ноября 2008 г.) и утверждены директором ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Апробация материалов исследований. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ (2003-2005 гг.), Международной научно-практической конференции «Болезни диких животных» (г. Покров, 2004г.),

Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2005г.), Всероссийской научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (г. Киров, 2008г.).

Публикации. Основные результаты исследований изложены в 8 научных работах, в том числе 1 статья в журнале, рекомендуемом ВАК РФ.

Личный вклад соискателя. Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В выполнении работы по отдельным этапам оказывали практическую и консультативную помощь, заведующий лабораторией «Бактериологии» ГНУ ВНИИВВиМ, к.в.н. И.Ю. Егорова и заведующий отделом «Бактериальных инфекций» НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, д.м.н. Белый Ю.Ф.

Положения, выносимые на защиту.

1. Исследованные гемолизины сибиреязвенного микроба по механизму ферментативного действия относятся к фосфолипазам.

2. Нормальные сыворотки крови животных обладают блокирующей активностью в отношении проявления Р-гемолитической активности и не оказывают влияния на а-гемолитическую активность сибиреязвенного микроба.

3. Сконструированные плазмиды экспрессируют гемолизины B.anthracis в функционально активной форме, которые обладают антигенной активностью и вызывают образование специфических антител при иммунизации лабораторных животных.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: список сокращений, введение, обзор литературы, собственные исследования, материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, список использованных источников и приложение. Список литературы включает 218 источников (из них 66 отечественных и 152 зарубежных). Работа содержит 28 рисунков и 9 таблиц.

6. ВЫВОДЫ.

1. Питательные среды на основе панкреатического гидролизата казеина, сердечно-мозгового бульона и гидролизата кильки в достаточной мере обеспечивают ростовые потребности" исследуемых штаммов B.anthracis и высокий уровень секреции сибиреязвенных гемолизинов. Активная секреция гемолизинов B.anthracis в культуральную среду начинается после первых 6 часов культивирования и достигает максимума к 24-30 часам выращивания.

2. Установлено различие в регуляции генов, кодирующих гемолизины B.anthracis: при культивировании штаммов B.anthracis в атмосфере углекислого газа происходит активация генов, ответственных за продукцию цитотоксина, вызывающего лизис эритроцитов по Р-типу, а в аэробных условиях - по а-типу.

3. Гемолизины штамма Sterne отличаются от гемолизинов штамма СТИ наличием у первых способности восстанавливать после кратковременного прогревания при высоких температурах свою гемолитическую активность, утрачиваемую в результате воздействия "умеренных" (40-60°С) температур -эффект Аррениуса.

4. Характер динамики лизиса эритроцитов под действием гемолизинов B.cereus и B.anthracis отличается наличием у последних продолжительных фаз связывания и формирования «повреждений».

5. Гемолитическая активность B.anthracis не ингибируется холестерином, не активируется дитиотрейтолом и ионами Са2+, при добавлении ЭДТА активность снижается на 40 %. Нормальные сыворотки крови животных блокируют действие (3-гемолизинов и не предохраняют эритроциты от лизиса а-гемолизинами.

6. Культуральные фильтраты B.anthracis обладают не только гемолитической, но и цитотоксической активностью в отношении перевиваемой культуры клеток почки сибирского горного козерога.

7. Сконструированы плазмиды для экспрессии рекомбинантных белков сфингомиелиназы и фосфолипазы С B.anthracis в функционально активной форме.

8. Нуклеотидным секвенированием определены последовательности гемолитических детерминант штаммов СТИ и Sterne и проведен их сравнительный анализ. Установлено, что нуклеотидные последовательности гена регулятора plcR исследуемых штаммов идентичны.

9. Получены иммуноглобулины против рекомбинантной сфингомиелиназы и фосфолипазы С B.anthracis, с помощью которых показано, что в процессе разрушения эритроцитов экзопродуктами сибиреязвенного микроба преимущественная роль принадлежит сфингомиелиназе.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

На основании проведённых исследований разработаны, утверждены и рекомендуются в практику научно-исследовательских учреждений Методические рекомендации «Получение рекомбинантных белков фосфолипазы С и сфингомиелиназы B.anthracis».

Сконструированные рекомбинантные штаммы E.coli, содержащие нуклеотидные последовательности гемолитических детерминант В. anthracis и экспрессирующие фосфолипазу С и сфингомиелиназу в функционально активной форме, целесообразно использовать при изучении роли гемолизинов в патогенезе сибиреязвенной инфекции.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Патогенность В. anthracis в основном связана с образованием двух факторов — трехкомпонентного экзотоксина и капсулы, структурные и регуляторные гены которых находятся в высокомолекулярных плазмидах рХ01 и рХ02. Однако накопилось много наблюдений, указывающих на то, что в патогенезе сибирской язвы принимают участие и другие, на сегодняшний день, плохо изученные факторы патогенности (протеазы, гемолизины и др.), кодируемые хромосомой В. anthracis (Цыганкова О.И., 1993 и др., Егорова И.Ю., Селянинов Ю.О., 2003). О роли в проявлении патогенных свойств генов хромосомной детерминации может также свидетельствовать и факт циркуляции в природе «типичных» изолятов, имеющих в своем составе обе плазмиды, но значительно различающихся по степени вирулентности.

Недостаточная изученность и противоречивость данных литературы о гемолитических свойствах сибиреязвенного микроба свидетельствуют о необходимости ее дальнейшего изучения, а возросший в последние годы интерес к изучению гемолитически активных продуктов возбудителя сибирской язвы свидетельствует о возможном пересмотре их роли в патогенезе заболевания.

В данной работе нами представлены результаты исследований по определению химической природы, изучению биохимических и биологических свойств гемолизинов B.anthracis, а также их генетической структуры.

На первом этапе исследований для нас представляло интерес изучение зависимости экспрессии а- и /?-гемолизинов от состава питательной среды, наличия свободного кислорода воздуха, углекислого газа и времени культивирования сибиреязвенных бацилл.

В зависимости от исследуемого штамма и питательной основы среды культивирования в посевах наблюдали различия в интенсивности роста. Однако проявление гемолитической активности КФ не всегда совпадало с интенсивностью роста культуры микроорганизмов.

Экспрессия (З-гемолизинов в большей мере проявлялась на средах ПГРМ, ГРМ, ГК, ПГК, СМБ, а а-гемолизинов - на средах ГК, ПГК, СМБ и МПБ. Универсальными для получения релевантных количеств гемолитически активных веществ обоих типов можно считать среды на основе гидролизатов казеина (ПГК), сердца (СМБ) и кильки (ГК), которые и использовались нами для дальнейшего изучения гемолитически активных веществ B.anthracis.

Изучение динамики накопления гемолитически активных продуктов при выращивании сибиреязвенных бацилл в жидкой питательной среде показало, что гемолизины начинают выделяться в культуральную среду в интервале между 6-18 часами после внесения взвеси спор в бульон, достигая максимума к 24-30 часам. Кривые изменения гемолитической активности КФ у изученных штаммов носили однотипный характер.

Результаты экспериментов по изучению влияния свободного кислорода воздуха и углекислого газа на экспрессию гемолизинов сибиреязвенного микроба показали, что регуляция генов B.anthracis, ответственных за синтез гемолизинов, лизирующих эритроциты по а- и Р-типу, различна. Так, углекислый газ (10%) оказывал стимулирующее действие на продукцию гемолизинов штаммом СТИ. Для штамма Sterne отмечена обратная картина: присутствие свободного кислорода воздуха индуцировало выработку гемолитически активных веществ, вызывающих деградацию эритроцитов по а-типу.

Таким образом, уровень продукции гемолизинов B.anthracis зависит от состава питательной среды, времени культивирования сибиреязвенных бацилл, наличия свободного кислорода воздуха и углекислого газа.

На следующем этапе нами было проведено изучение влияния физико-химических и биологических факторов на литическую активность экзотоксинов сибиреязвенного микроба.

При определении влияния температуры на проявление литической активности а- и /^-гемолизинов B.anthracis для всех препаратов установлена обратно пропорциональная зависимость: с повышением температуры снижается гемолитическая активность КФ. Интересным является тот факт, что при прогревании при 60°С препарата экзотоксинов штамма Sterne наблюдалась полная ингибиция гемолитической активности, которая затем восстанавливалась после кратковременного прогревания при высоких температурах. Подобный феномен (эффект Аррениуса) использовался Кульбахом и Вильямсом в качестве одной из характеристик при идентификации гемолизинов и для отличия их от тиолзависимых гемолизинов, которым это свойство не присуще.

Результаты экспериментов по сравнительному изучению динамики лизиса эритроцитов экзотоксинами культур B.cereus 96 и B.anthracis штаммов Sterne и СТИ показали, что зоны гемолиза вокруг лунок с КФ B.cereus начинали формироваться уже через 1,5-2,0 часа инкубирования, тогда как с фильтратами B.anthracis - через 24 часа. При этом максимальный размер зоны гемолиза с КФ B.anthracis штамма СТИ наблюдался через 48 часов инкубирования, штамма Sterne через 72 часа, а у B.cereus 96 через 24 часа. Данное различие, по-видимому, связано с особенностями механизмов взаимодействия этих цитолизинов с мембранами эритроцитов.

В результате исследований по изучению влияния СаСЬ, ЭДТА и ДТТ на активность гемолизинов КФ B.anthracis установлено отсутствие выраженного влияния ДТТ и двухвалентных ионов металлов на гемолитическую активность фильтратов, означающее, что сибиреязвенные гемолизины не относятся к группе SH-токспнов. Снижение активности фильтратов на 40% при добавлении ЭДТА указывает на то, что цитолитическое действие фильтратов частично обусловлено ферментативной активностью, вызывающей разрушение белковых структур оболочек чувствительных клеток с последующим их лизисом.

Ещё одной из важнейших отличительных характеристик представителей группы SH-токсинов является ингибирование их активности холестерином. Результаты экспериментов показали, что обработка КФ B.anthracis холестерином не приводила к изменению гемолитической активности экзотоксинов, присутствующих в образцах.

Таким образом, сибиреязвенные гемолизины имеют рецепторные сайты, отличающиеся от таковых для SH-токсинов. Кроме этого, отсутствие ингибирующего влияния холестерина на гемолитическую активность исследуемых экзопродуктов свидетельствует об их нетождественности антролизину, описанному Shannon J.G. в 2003 году, а также о том, что данные гемолизины не принадлежат к группе тиолактивируемых токсинов.

Одним из важных факторов патогенности возбудителей инфекционных болезней является их способность противостоять бактерицидному действию нормальной сыворотки крови макроорганизма. Установлено, что нормальные сыворотки крови животных обладали высокой блокирующей активностью в отношении р-гемолизинов и не оказывали влияния, либо в незначительной степени ингибировали (лошадь, свинья) а-гемолитическую активность. Интересным является тот факт, что мышиная сыворотка полностью ингибировала действие как а- так и р-гемолизинов. Присутствие в сыворотках специфических противосибиреязвенных антител не изменяло характера взаимодействия эритроцитов и гемолизинов.

На следующем этапе было проведено изучение цитотоксической активности сибиреязвеных культуральных фильтратов in vitro. Установлено, что КФ B.anthracis проявляют цитотоксическую активность в отношении клеток ПСГК. Цитотоксическое действие выражалось в округлении клеток, стирании межклеточных границ, очаговом отслоении клеток от стекла и дегенеративных изменениях.

При подборе наиболее эффективного способа концентрирования и очистки сибиреязвенных цитолизинов использовали методы солевого и спиртового осаждения, а также обработку КФ хлороформом и трихлоруксусной кислотой.

В результате спиртового осаждения нами был получен препарат экзопродуктов, обладающий гемолитической активностью, превышающей исходную в 4 раза. Обработка экзопродуктов хлороформом не изменяла их гемолитической активности. Применение ТХУ приводило к денатурации интересующих нас цитолизинов и потере их активности.

При выделении экзопродуктов КФ методом ступенчатого насыщения сульфатом аммония (10-80%) гемолитически активные экзопродукты осаждались при 40-80% насыщения (NH^SO^ Наибольшей активностью обладали препараты, полученные при 60% насыщении (NH^SO^ Их активность превышала исходную в 16 раз.

Дальнейшую очистку гемолизинов мы проводили с использованием ионообменной хроматографии на анионо- и катионообменных колонках (Mono Q и Mono S) и гель-фильтрации на колонке с Superose 12.

Тестирование материала фракций на наличие гемолитической и лецитиназной активностей показало, что этими видами активностей обладали макромолекулы фракции м.м. 20-40 кДа. Пик лецитиназной активности экзопродуктов штамма СТИ был незначительно смещён относительно пика гемолитической активности данного штамма в сторону низкомолекулярных продуктов.

Результаты разделения материала этих фракций методом SDS-электрофореза показали, что они содержат три полипептида с относительной молекулярной массой 31, 37 и 41 к Д.

Поскольку даже концентрирование не позволило нам получить гемолитически активные экзотоксины в препаративных количествах, дальнейшие исследования мы проводили с применением молекулярно-биологических методов.

Нуклеотидное секвенирование гена регулятора транскрипции гемолизинов plcR показало, что последовательность гена plcR штамма СТИ не отличается от последовательности гена plcR штамма Sterne.

Далее был проведён комплекс экспериментов по клонированию и получению рекомбинантных SPH и PLC штамма Sterne. Выделенные с помощью никель-аффинной хроматографии рекомбинантные белки сфингомиелиназы и фосфолипазы С B.anthracis были исследованы методом электрофореза в полиакриламидном геле. Установлено, что очищенный белок фосфолипазы С мигрировал полосой с м.м. 30-31кД, а сфингомиелиназы - 41 и 37кД (плазмидные конструкции р279 и р293, соответственно).

Показано, что рекомбинантная SPH обладает высоким уровнем гемолитической и низким уровнем лецитиназной активностей, причём данные виды активности проявляются независимо от того, в каком виде использовались белки - в виде лизата клеток или хроматографически очищенных. Наличие или отсутствие сигнальной последовательности не влияло на ферментативные свойства рекомбинантной SPH.

Рекомбинантная PLC в виде лизата клеток обладала как гемолитической, так и лецитиназной активностями. Лизат клеток Е. coli, содержащий плазмиду р292 (pic), имел более низкую гемолитическую активность по сравнению с лизатом клеток Е. coli, несущих плазмиду р280 (pic), но при этом именно из этого лизата удалось выделить очищенный белок фосфолипазы С, обладающий гемолитической активностью.

Таким образом, полученные нами рекомбинантные SPH и PLC экспрессируются клетками E.coli в активной форме и способны вызывать лизис эритроцитов и расщепление лецитина.

Дополнительно на мышах и кроликах нами были получены сыворотки к рекомбинантным сфингомиелиназе и фосфолипазе С. В иммуноблоттинге сыворотки в разведении 1:20000 специфически взаимодействовали с препаратами очищенных белков и ультразвуковых лизатов рекомбинантных клеток.

При определении влияния нормальных сывороток крови человека и различных видов животных на проявление гемолитической активности рекомбинантных белков установлено, что сыворотки всех видов животных за исключением мышиной, в разведении 1:10 незначительно, а сыворотка козы полностью ингибировали гемолитическую активность рекомбинантных PLC и SPH. Сыворотка крови мыши полностью блокировала действие как сфингомиелиназы, так и фосфолипазы в разведении 1:320, что согласуется с ранее полученными нами результатами об ингибирующей активности мышиных сывороток.

Антисфингомиелиназные иммуноглобулины, выделенные из гипериммунных сывороток кроликов, в разведении 1:10 (16 мкг/мл) ингибировали лизис эритроцитов гемолизинами штамма СТИ, а в разведении 1:100 - штамма Sterne. Нормальные кроличьи и антифосфолипазные иммуноглобулины на проявление гемолитической активности не влияли.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об экспрессии в E.coli рекомбинантных белков B.anthracis, обладающих гемолитической и лецитиназной активностями и преимущественной роли сфингомиелиназы в процессе разрушения эритроцитов.