Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Закономерности формирования резистентности организма к Bacillus anthracis под влиянием искусственного антигенного комплекса сибиреязвенного микроба (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

КОЛЕСНИКОВА Ольга Борисовна

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА К BACILLUSANTIIRACIS ПОД ВЛИЯНИЕМ ИСКУССТВЕННОГО АНТИГЕННОГ О КОМПЛЕКСА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА (экспериментальное исследование)

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

\ 1 & гт

Иркутск - 2008

Работа выполнена в ФГУЗ «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора

Научный руководитель:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Дубровина Валентина Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Бодиенкова Галина Михайловна

доктор биологических наук, профессор

Васильева Людмила Сергеевна

Ведущая организация:

ГУ НЦ клинической и экспериментальной медицины СО РАМИ, г. Новосибирск

ционного совета Д.001.038.02 при ГУ «Научный центр медицинской экологии Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук» по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Научный центр медицинской экологии Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук»

Защита состоится « »

2008 г. в

часов на заседании диссерта-

Автореферат разослан «__»

2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Сибирская язва, являющаяся особо опасным инфекционным заболеванием людей и животных, остается важной проблемой для здравоохранения и ветеринарии (Маринин Л.И. с соавт., 1999; Онищенко Г.Г., 1999). Потенциальная возможность заражения человека Bacillus anthracis под держивается не только периодически возникающими эпизоотиями болезни, но и существованием множественных почвенных очагов, распространенных на всех континентах и не регистрирующихся лишь на немногих островных территориях (Черкасский Б.Л., 2002).

Необходимость изучения этой особо опасной инфекции связана еще и с тем, что В. anthracis остается в списке объектов бактериологического оружия и средств биологического терроризма, что особенно наглядно проявилось событиями 2001 г. в США. В связи с этим, продолжение детального изучения иммунологии сибирской язвы и протекгивных свойств ее возбудителя в настоящее время весьма актуально (Езепчук Ю.В., 1968; Aulinger В. А. et al., 2005; Brey R.N., 2005; Hahn U.K. et al., 2006; Chitlaru T. et al., 2007).

Анализ результатов экспериментальных и практических наблюдений свидетельствует о необходимости разработки новых безопасных и эффективных вакцин против сибирской язвы на основе протективиых бактериальных антигенов или их рекомбинантных аналогов (Ezzell J.W., Abshire T.G., 1988; Turnbull P.C.B., 1999; Li Z.N. et al., 2005; Zeng M. et al., 2006).

Исследование пригодности различных субклеточных фракций В. anthracis с привлечением иммуномодуляторов и адъювантов, обеспечивающих целенаправленное действие на иммунную систему организма человека и животных, может определить принципы отбора и конструирования высоко-иммуногенных препаратов, пригодных для специфической иммунопрофилактики сибирской язвы.

Недостаточная эффективность и ограниченные возможности применения современных сибиреязвенных вакцин на основе живых клеток или их фрагментов определяет актуальность для практического здравоохранения разработки высокоэффективных, но слабо реактогенных химических вакцин (Борисов И.В., Лопаткин О.Н., 1985; Абалакин В.А. с соавт., 1989; Безносой М.В., 1997).

Цель исследования

Выявить закономерности формирования резистентности организма к Л. anthracis под действием искусственного антигенного комплекса, созданного на основе протективного антигена, клеточных стенок и белка С сибиреязвенного микроба в сочетании с иммуномодуляторами.

Для реализации поставленной цели последовательно решались следующие задачи:

1. Изучить фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов экспериментальных животных в отношении сибиреязвенного микроба и его антигенов.

2. Исследовать активность фагоцитов, определяющую бактерицидный потенциал перитонеальных макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов при поглощении искусственного антигенного комплекса сибиреязвенного микроба.

3. Сопоставить бактерицидную активность в отношении В. ап^гаш перитонеальных макрофагов морских свинок, иммунизированных живой сибиреязвенной вакциной и экспериментальным иммунным комплексом в сочетании с иммуномодуляторами.

4. Испытать в экспериментальных условиях иммуногенные препараты на протективную эффективность по отношению к высоковирулентному штамму возбудителя сибирской язвы.

Научная новизна

Впервые на основе исследований искусственного антигенного препарата (ДАК-конъюгат), состоящего из изолированных клеточных стенок, протектив-ного антигена и белка С сибиреязвенного микроба показано, что примирован-ные ДАК-конъюгатом и иммуномодуляторами фагоциты экспериментальных животных продуцируют медиаторы воспаления (ФНО-а), обеспечивающие запуск каскада иммунных реакций; активируются системы, способствующие захвату (хемотаксис, адгезия, поглощение) и внутриклеточной деградации микроба путем одновременной активации кислородзависимых, нитроксидза-висимых и кислороднезависимых бактерицидных факторов.

Приоритетными являются данные о том, что в процессе иммуногенеза, вызванном искусственным антигенным комплексом, имеет место активация фагоцитарного процесса за счет повышения функциональной способности, в частности бактерицидного потенциала макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов.

Экспериментально доказано, что искусственный антигенный комплекс обладает иммуногенной и протективной активностью.

Показана принципиальная возможность повышения протекгивных свойств искусственного антигенного комплекса за счет использования иммуномодуля-торов естественного происхождения (арабиногалактан, сквален).

Теоретическое и практическое значение работы

С учетом современных представлений о факторах вирулентности сибиреязвенного микроба изучены особенности формирования резистентности макроорганизма экспериментальных животных, что уточняет и дополняет 4

знания о патогенезе, иммуногенезе этой особо опасной инфекции и позволяет целенаправленно воздействовать на отдельные этапы фагоцитарного процесса.

Разработаны методологические подходы и принципы конструирования искусственного антигенного препарата (ДЛК-конъюгат) на основе изолированных клеточных стенок, протективного антигена и белка С В. ап1Ьгасп СТИ-1, обладающего иммуногенной и протективной активностью.

Показано, что арабиногалактан и сквален при одновременном введении морским свинкам с конъюгатом белковых препаратов и клеточных стенок, химически связанных дигидратом адипиновой кислоты, повышают лротек-тивную активность этого иммуногенного комплекса, что проявляется увеличением числа выживших экспериментальных животных, инфицированных сибиреязвенным микробом.

Патогенетически обоснована возможность тестирования степени активности фагоцитирующих клеток в ответ на введение стимулирующего агента и функций, связанных с бактерицидной способностью для характеристики неспецифической резистентности организма.

Результаты работы послужили основой для разработки и модификации методов изучения бактерицидных механизмов фагоцитоза и иммунной перестройки организма, которые отражены в методических рекомендациях «Определение функционального состояния фагоцитов в качестве показателя неспецифической защиты организма» (2008 г.). Научные и практически значимые материалы исследований включены в лекционные курсы дополнительного послевузовского образования при Иркутском научно-исследовательском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока.

Разработанные методы внедрены в практику научно-исследовательской работы Иркутского, Ставропольского противочумных институтов, Улан-Удэнского института общей и экспериментальной биологии СО РАН.

Положения, выносимые на защиту

1. Искусственный антигенный комплекс, созданный на основе протективного антигена, клеточных стенок и белка С сибиреязвенного микроба, обладает иммуногенной и протективной активностью. Иммуномодуляторы естественного происхождения (сквален, арабиногалактан) повышают про-тективные свойства ДАК-конъюгата, что проявляется увеличением числа выживших экспериментальных животных (в 1,5-2,0 раза), инфицированных В. аЫкгаж.

2. Фагоциты, стимулированные искусственным антигенным комплексом (ДАК-конъюгат) в сочетании с иммуномодуляторами продуцируют медиаторы воспаления (ФНО-а), индуцирующие запуск каскада иммунных реакций и активацию систем, способствующих захвату и внутриклеточной

деградации микроба путем стимуляции кислородзависимых, нитроксид-зависимых и кислороднезависимых бактерицидных факторов. В процессе иммуногенеза, вызванного ДАК-коныогатом, активируются клеточные факторы иммунитета за счет повышения функциональной способности, в частности бактерицидного потенциала макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов.

Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, представлены на:

• Международной научной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирск, 2004);

• Межрегиональной конференции, посвященной 100-летию академика РАМН СССР СЛ. Карпова (Москва, 2004);

• Научно-практической конференции «Противочумная служба в России и ее роль в обеспечении эпидемического благополучия в России» (Москва, 2004);

• Всероссийской научной конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004);

• VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: проблемы безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005);

• Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007);

• Региональной научной конференции «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения Республики Бурятия» (Улан-Удэ, 2007);

• Конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2008» (Санкт-Петербург, 2008);

• Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Человек: здоровье и экология» (Иркутск, 2008);

• научных конференциях Иркутского противочумного института (20022008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 4 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки

РФ, одна монография «Структура и иммуномодулирующее действие арабино-галактана лиственницы сибирской и его металлопроизводных».

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, иллюстрирована 11 таблицами и 19 рисунками. Список литературных источников содержит 238 наименований, в том числе 172 - на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальными моделями в основных опытах (заражение, иммунизация, отбор проб крови, получение фагоцитов и т.д.) служили беспородные морские свинки (массой 300-350 г) и белые мыши (18-20 г). Всего в опытах использовано 1992 животных: 1597 морских свинок, 395 белых мышей.

Количество животных для опыта подбирали с учетом получения статистически достоверных результатов. Животных выводили из эксперимента воздушной эмболией сосудов сердца или под наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (2003 г.).

При выполнении этапов работы с возбудителем сибирской язвы (заражение и вакцинация экспериментальных животных, постановка реакций фагоцитоза и т.д.) использовали штаммы В. anthracis СТИ-1 и И-9. Штаммы до включения в опыты хранились в лиофилизированном состоянии в музее живых культур НИПЧИ, обладали характерными для представителей соответствующего вида культуралыю-морфологическими и биологическими свойствами.

Вакцинный, бескансульный штамм В. anthracis СТИ-1 получен в ГИСК им. JI.A. Тарасевича. Штамм В. anthracis И-9 изолирован в 1956 г. от человека в Республике Тыва. Штамм В. anthracis СТИ-1 с низкой остаточной вирулентностью при парентеральном введении для белых мышей (DL50- 5 х 108 спор), В. anthracis И-9 - высоковирулентен (DL50- 5 спор).

Объектом исследования служили искусственные антигенные препараты на основе изолированных клеточных стенок, протективного антигена и белка С сибиреязвенного микроба, конъюгированные дигидратом адипиновой кислоты (ДАК-конъюгат) и глутаральдегидом (ГА-конъюгат).

В качестве экспериментальной модели служили перитонеальные макрофаги (ПМ) и полиморфноядерные лейкоциты (ПЯЛ) морских свинок и белых мышей, которые получали по общепринятой методике (Фрейдлин И.С., 1986). Для стимуляции фагоцитарного процесса in vitro к взвеси фагоцитов (20 х 106 в

1 мл) добавляли ДАК-конъюгатper se (25 мкг/мл) либо в сочетании с арабино-галакганом (АГ) (50 мкг), скваленом (СКВ) (10 мкг) или обоими препаратами одновременно и смеси инкубировали в течение 60 мин при 37 "С. В качестве контроля использовали интактные фагоциты.

Иммунизацию проводили путем подкожной инъекции животным В. anthra-cis СТИ-1 (103 спор) или ДАК-конъюгата (25 мкг), а также ДАК-конъюгата в сочетании с АГ (25 мкг + 50 мкг), скваленом (25 мкг +10 мкг), АГ и скваленом одновременно (25 мкг + 50 мкг + 10 мкг).

Адгезивные свойства фагоцитов морских свинок исследовали по методу И.С. Фрейдлин (1986). Индекс адгезии рассчитывали по отношению количества клеток, прилипших в опытных и контрольных (фагоциты интакгных животных) пробах, и выражали в процентах.

Интенсивность образования в фагоцитирующих клетках метаболитов кислорода определяли в НСТ-тесте, с помощью которого оценивали два показателя - процент формазанположительных клеток и цитохимический показатель активности (Сафронова В.М. и др., 1994; Park В.Н. et al., 1968).

Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49) определяли цитохимическим (Нарциссов Р.П.,1969) и спектрофотоме-трическим (Прохорова М.И., 1982) методами. Спектрофотометрическое определение активности НАДФ-Н-оксидазы (КФ 1.6.2.-) проводили по методу R.L. Baehner, D.G. Nathan в модификации (Голубинский Е.П. и др., 1995), супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1.) - в соответствии с рекомендациями Б.Н. Матюшина с соавт. (1991). Активность миелопероксидазы (МПО, КФ 1.11.1.7) определяли цитофотометрически по методу В.Е. Пи-гаревского, Ю.А. Мазинга (1981) и спектрофотометрически - Т.Д. Бурой с соавт. (1991). Интенсивность синтеза NO и, следовательно, активность NO-синтазы оценивали по методу L.C. Green с соавт. (1982), содержание неферментных катионных белков (НКБ) - по методу В.Е. Пигаревского, Ю.А. Мазинга (1981). ФНО-а идентифицировали в иммуноферментном анализе с помощью моноклональных антител производства Caltag (Канада). Содержание белка в препаратах определяли по О.Н. Lowry с соавт. (1951) и М.М. Bredford (1976). Электрофоретический анализ антигенов проводили в блоках полиакриламидного геля (10 % акриламида) в присутствии ДСН (ДСН-ПААГ) по методу U.K. Laemmli, М. Favre (1973).

Все полученные материалы обработаны статистически стандартными параметрическими методами с использованием ¿-критерия Стьюдента и непараметрическим методом Манна-Уитни с применением стандартного пакета программ «Статистика», версия 6 (Новосибирск) и пакета программ Microsoft Excel (2003) корпорации Microsoft. Для каждой выборки вычисляли средневыборочные характеристики: М - среднее арифметическое, 5 - среднее квадратичное отклонение, т - ошибка среднего. Результаты считали достовер-

ными, если вероятность ошибки была меньше 0,05 (р < 0,05) по отношению к контролю.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Протсктивная активность искусственных антигенных комплексов сибиреязвенного микроба perse и при одновременном применении с иммуностимулирующими препаратами

Установлено, что при парентеральном введении в дозах до 25 мкг (но белку) ДАК- и ГА-конъюгаты не токсичны для морских свинок и белых мышей и обладают слабо выраженной реактогеаностыо. При дозировке более 25 мкг препараты проявляют реактогенность - в месте введения может развиться нагноение, обычны более или менее выраженные изменения в составе клеточных элементов крови (сдвиг формулы влево, увеличение числа моноцитов, появление атипичных лимфоцитов).

Оба комплексных препарата проявляют протективные свойства: при однократной вакцинации морских свинок и последующем, через 14 дней, внутрибрюшшшом заражении спорами вирулентного штамма В. anthracis И-9 в дозе 20 DL50 (100 спор) ДАК-конъюгат защищал 62 %, а ГА-конъюгат-только 45 % взятых в опыт животных. Все интактные животные погибали на 2-3 сут. после заражения. Заметное (в 1,4 раза) превосходство ДАК-конъюгата перед ГА-конъюгатом в специфической активности послужило основанием для включения в основные опыты ДАК-конъюгата.

После одновременной параллельной вакцинации морских свинок и белых мышей спорами В. anthracis СТИ-1 в дозе 104 м.к. выживаемость животных составляла 80 %. Следовательно, по протективной активности оба конъюгата несколько уступали живой сибиреязвенной вакцине.

Для подбора оптимальной иммунизирующей дозы определяли ImD50 препаратов для морских свинок стандартной массы путем подкожного введения конъюгатов в дозированных количествах с последующим (через 14 сут.) парентеральным заражением животных спорами вирулентного штамма В. anthracis И-9. Иммунизирующая доза ДАК-конъюгата составила 131,4, ГА-конъюгата - 186,6 мкг, т.е. в первом случае на 42 % меньше, чем во втором. Таким образом, если судить по ImD50, то ДАК-конъюгат по протективной способности превосходит ГА-конъюгат.

При экспериментальном испытании ДАК-конъюгата 7 серий в дозах от 25 до 500 мкг в качестве оптимальной признана иммунизирующая доза 25 мкг на морскую свинку.

С целью повышения протективной активности конъюгатов в качестве иммуномодуляторов апробированы АГ, сквален СКВ и полиоксидоний (ПО).

Все опыты проведены с использованием в качестве экспериментальной модели морских свинок.

Суть экспериментов состояла в том, что одновременно с антигенным препаратом - главным образом, ДАК-конъюгатом - животные получали (подкожно) индивидуально либо в сочетаниях АГ, СКВ или ПО в заранее оттитрованных дозах - 60,10 и 75 мкг, соответственно. Контролем служили вакцинированные В. апЛгаш СТИ-1 и интактные морские свинки.

Об эффективности препаратов судили по проценту выживших вакцинированных морских свинок после введения им в летальной дозе спор вирулентного штамма В. аткгаш И-9, величине 1шО50 и средней продолжительности жизни.

Полученные данные позволяют констатировать, что АГ и СКВ обеспечивают повышение процента выживаемости животных, а СКВ, кроме того, снижение иммунизирующей дозы конъюгата. При использовании вместе с ДАК-конъюгатом ПО показатели выживаемости и 1тП5() были ниже, чем в случае АГ и СКВ и даже в случае одного конъюгата, в связи с чем ПО был исключен из последующих опытов.

Материалы опыта, суммированные в таблице 1, свидетельствуют о том, что АГ, СКВ и АГ + СКВ параллельно с увеличением процента выживаемости животных способствуют оптимизации другого важного показателя протектив-ности вакцинных препаратов - средней продолжительности жизни вакцинированных животных (СПЖ), возрастающей в 1,2-1,7 раза по сравнению с показателями, которые обеспечивает один ДАК-конъюгат.

Таблица 1

Результаты исследования протективной активности ДЛК-коиъюгата в сочетании с иммуномодуляторами

Препарат Доза Количество животных СПЖ р

(мкг) в опыте выжило животных, сут

ДЛК-конъюгат 25 10 3 11,78±0,75 <0,05

ДЛК-конъюгат + ЛГ 25 + 60 9 2 14,50±0,16 <0,05

ДЛК-коньюгат + СКВ 25 + 10 10 3 11,67±0,16 <0,05

ДЛК-конъюгат + АГ + СКВ 25 + 60 + 10 10 6 19,75±0,42 <0,01

0. апО)гас& СТИ-1 1О3спор 10 4 14,40±0,26 -

Вакцина СТИ-1 в аналогичных условиях продлевала жизнь вакцинированных ею животных не более чем на 8 %.

Для решения вопросов, какие системы иммунокомпетентных клеток подвержены воздействию специфических антигенов сибиреязвенного микроба, и

какова роль в этом процессе иммуномодуляторов растительного происхождения, мы провели серию экспериментов на модели ИМ и ПЯЛ морских свинок in vitro и in vivo.

2. Исследование in vitro фагоцитирующей способности моно-и полинуклеарных фагоцитов морской свинки при взаимодействии с В. anthracis и его искусственным антигенным комплексом в сочетании с иммуномодуляторами

В опытах in vitro исследовали фагоцитарную активность и бактерицидные системы имуннокомпетентных клеток интактных морских свинок и параллельно - те же клетки, предварительно (до соединения с объектом фагоцитоза спорами В. anthracis СТИ-1) стимулированные ДАК-коныогатом (25 мкг/мл), ДАК-конъюгатом в сочетании с АГ (25 мкг + 50 мкг/мл) или АГ + СКВ (25 мкг + 50 мкг + 10 мкг/мл), а также стимулированные только АГ (25 мкг) или СКВ (10 мкг).

Показано, что фагоциты, активированные ДАК-конъгатом, по поглотительной способности (по величинам ПАФ и ФИ), превосходят не только интактные ПМ, но и макрофаги, стимулированные спорами вакцинного штамма СТИ-1. АГ, особенно в сочетании с СКВ, повышает способность ДАК-конъюгата стимулировать поглотительную активность фагоцитов и обеспечивает завершенность фагоцитоза сибиреязвенного микроба (табл. 2).

Таблица 2

Фагоцитарная активность перитонеалышх макрофагов морских свинок, стимулированных ДАК-конъюгатом и ДАК-коныогатом в сочетании с иммуномодуляторами при фагоцитозе В. anthracis СТИ-1 (М±т)

Антиген ПАФ, % ФИ, усл. ед. ИЗФ, усл. ед.

ДАК-конъюгат 42,6 ±1,2* 3,0 ± 0,4* - 80,9 ± 12,6

ДАК-конъюгат + АГ 54,5 ± 0,9* 4,3 + 0,2* - 15,6 ± 1,3*

ДАК-конъюгат + АГ + СКВ 48,4 ± 1,1* 4,6 ±0,4* + 48,4 ± 1.2*

В. anthracis СТИ-1 34,2 ±0,1* 2,1 ±0,2* -41,9 ±0,2*

АГ 41,4 ±0,2* 2,2 ±0,1* - 40,4 ± 1,6*

СКВ 29,6 ±0,1* 1,8 ±0,2* -38,2 ±2,1*

Контроль 21,6 ±0,1 1,2 ±0,2 - 82,2 ± 2,6

Примечание: (+) - завершенный фагоцитоз; (-) - незавершенный фагоцитоз; * - р < 0,05 (значимость различий по отношению к контролю).

В НСТ-тесте установлена способность ДАК-конъюгата, АГ и СКВ стимулировать КЗМ интактных ПМ и ПЯЛ морской свинки. В ПМ наиболее высокие показатели НСТ-теста зафиксированы в присутствии ДАК-конъюгата

+ АГ и ДЛК-кошлогата + АГ + СКВ, причем в отсутствие конъюгата ни у АГ, ни у СКВ не выявлено стимулирующих свойств. При контакте с ПЯЛ наиболее высокие показатели КЗМ обеспечивает ДАК-конъюгат в присутствии АГ + СКВ.

Дополнительные экспериментальные материалы позволили показать, что воздействие ДАК-конъюгата, АГ и СКВ на КЗМ носит поливекторный характер. Общая картина его модификации обусловлена изменением под влиянием внешних факторов таких индивидуальных систем фагоцитов как Г6ФДГ, НАДФ-Н-оксидаза, супероксиддисмутаза, миелопероксидаза и, надо полагать, - многих других.

Результаты проведенных исследований указывают на то, что ДАК-конъюгат в сочетании с АГ и СКВ оказывает на активность Г6ФДГ пери-тонеальных макрофагов более выраженное стимулирующее воздействие (в 1,2-1,6 раза), чем ДАК-конъюгат per se или конъюгат в сочетании только с АГ или СКВ. В контрольных (нестимулированных) фагоцитах активность Г6ФДГ была в 2,1 раза ниже, чем в активированных ДАК-коныогатом (р < 0,05).

Отмечено стимулирующее действие всех исследованных препаратов на активность НАДФН-оксидазы ПМ морских свинок (0,107 ± 0,010 усл. ед.), однако максимальные значения ферментативной активности регистрируются при взаимодействии фагоцитов с комплексным препаратом-ДАК-конъюгатом + АГ + СКВ (0,235 ± 0,010 усл. ед.,р< 0,05).

Известно, что в дополнение к активным формам кислорода в качестве антимикробного агента рассматривается молекула монооксида азота (Green L.C. et al.., 1982). Нами исследовано действие препаратов на синтез монооксида азота. Сочетанное применение ДАК-конъюгата с иммуномодуляторами способствовало коррекции функционального состояния системы фагоцитирующих клеток, связанной с активностью NO-синтазы (рис. 1).

Следует заметить, что действие ДАК-конъюгата в сочетании с АГ, АГ + СКВ или СКВ на ПЯЛ и макрофаги не было равнозначным. Наибольшее стимулирующее действие на синтез монооксида азота в ПЯЛ оказывал ДАК-конъюгат + АГ + СКВ (4,20 ± 0,04 мкМ/106 фагоцитов) и ДАК-конъюгат + АГ (3,98 ± 0,01 мкМ/106 фагоцитов), в ПМ - ДАК-конъюгат + АГ + СКВ (2,46 ± 0,06 мкМ/106 фагоцитов) и СКВ (2,24 ± 0,01 мкМ/106 фагоцитов). Контрольные значения активности NO-синтазы в ПЯЛ и макрофагах не превышали 0,80 ± 0,01 и 0,54 ± 0,01 мкМ/106 фагоцитов, соответственно.

Под воздействием всех испытанных препаратов в ПЯЛ, в меньшей степени - в Г1М (значения в 7 раз ниже) отмечено повышение активности одного из основных эндогенных антиоксидантов - супероксиддисмутазы (превышение по отношению к контролю на 81,5 и 11,7 %, соответственно), особенно выраженное при стимуляции процесса комплексом ДАК-конъюгат в сочетании

с А Г + СКВ. Таким образом, последний стимулирует в фагоцитах процесс превращения супероксида в перекись водорода, увеличивая тем самым бактерицидный эффект в отношении патогена.

4,5

ш о

H S

=Г О

R3

со О

5

н

о п

R3

5 1,5 s

о

2 Г®

5

о

ДАК ДАК+АГ ДАК+СКВ ДАК+АГ+СКВ АГ

СКВ Контроль

□ ПМ

И ПЯЛ

Рис. 1. Влияние комплекса антигена сибиреязвенного микроба, арабиногалак-тана и сквалена на активность NOS иммунокомпетентных клеток морской свинки (мкМ оксида азота/106 фагоцитов; M ± т). Обозначения: * -р < 0,05; ** -р < 0,01 значимость различий по отношению к контролю.

Все исследованные препараты повышают активность миелопероксидазы ПЯЛ морских свинок. Наиболее высокие показатели активности фермента, которые превосходили контрольные, обеспечивали ДАК-конъюгат + АГ + СКВ (более чем в 1,5 раза,р < 0,01) и ДАК-конъюгат + СКВ (в 1,4 раза,р< 0,01). ДАК-конъюгат, ДАК-конъюгат + АГ, АГ и СКВ поддерживали активность МЛЮ на уровнях, превосходивших контрольный (на 15,7-23,2 %,р< 0,05), но между собой существенно не различались.

Полученные нами данные свидетельствуют о стимулирующем воздействии исследованных препаратов на НКБ. Повышение содержания НКБ (в 1,4—1,5 раза, р < 0,05) наблюдали при воздействии на ПЯЛ ДАК-конъюгата в сочетании с АГ + СКВ. ДАК-конъюгат, АГ и СКВ, взятые в отдельности, в меньшей мере (в 1,2-1,3 раза), но также повышают в фагоцитах уровень содержания НКБ, усиливая таким образом их бактерицидную способность.

Установлено, что как в отдельности, гак и в сочетании с АГ или СКВ ДАК-конъюгат активирует синтез ФНО-а перитонеальными макрофагами белых мышей (рис. 2).

Наиболее высокие показатели активизации синтеза цитокина зафиксированы при комплексном воздействии на ПМ ДАК-конъюгата в сочетании с АГ и СКВ (144,9 ±0,7 пг/мл).

160 т

ДАК ДАК+АГ ДАК+СКВ ДАК+АГ+СКВ АГ СКВ В. anthracis Контроль

Рис. 2. Влияние антиг ена сибиреязвенного микроба, арабиногалактана и сквалена на продукцию ФНО-а поритонеальными макрофагами белых мышей. Обозначения: * р < 0,05; ** • р < 0,01 значимость различий по отношению к контролю.

3. Разработка способов повышения специфической активности антигенных комплексов сибиреязвенного микроба

Репрезентативность представленных выше данных подтверждает и дополняет материалы изучения фагоцитарной активности иммунокомпетентных клеток экспериментальных животных (морских свинок, белых мышей), предварительно получивших парентерально искусственный антигенный комплекс (ДАК-конъюгат) как таковой, а также в сочетании с АГ и (или) СКВ. Главная задача исследования in vivo состояла в том, чтобы проследить реакцию клеток им- j мунной системы макроорганизма на комплексное воздействие ДАК-конъюгата -и иммуномодуляторов как на системном, так и на элементарном уровне. Это дало бы возможность не только констатировать факт пролоногирования иммунного ответа, но и судить о некоторых механизмах иммунокоррегирующего действия вводимых препаратов.

Установлено, что у морских свинок, получивших парентерально ДАК-конъюгат, во все сроки иммуногенеза (от 3 до 30 сут.) возрастает адгезивная активность перитонеалышх макрофагов - с 48,5 ±3,1 до 60,0 ± 2,3 усл. ед. в контрольных пробах и от 74,0 ± 1,3 до 96,0 i 2,2 усл. ед.- в опытных. В наибольшей мере повышению адгезивной способности фагоцитов морских свинок способствовал ДАК-конъюгат в сочетании с АГ + СКВ (от 87,5 ± 1,7 до 121,7 ± 2,2 усл. ед. при р < 0,05).

ДАК-конъюгат при одновременном применении с АГ и скваленом оказывает стимулирующее действие и на поглотительную способность фагоцитов.

Таблица 3

Индекс завершенности фагоцитоза В. аМНгаЫя СТИ-1 перитонеальными макрофагами морских свинок, иммунизированных ДАК-конъюгатом и ДАК-конъюгатом в сочетании с иммупомодуляторами (М ± т)

Антиген Сроки наблюдения (сут.)

3 7 14

ДАК-конъюгат -110,9 ±42,6* - 11,6 ±0,9* -0,6 ±0,1*

ДАК-конъюгат + АГ + 48,4 ±1,2* +18,1 ±1,1* + 6,5 ± 0,6*

ДАК-конъюгат + АГ + СКВ - 15,6 ±2,3* -17,5 ±3,2* -2,6 + 0,3*

В. апШгааЪ СТИ-1 -21,9 ±0,2 - 86,9 ± 13,2 + 1,8 ±0,3

Контроль (неаакцинированные животные) -142,2 ±2,6* -132,3 ±3,6* -136,3 ±3,3*

Примечание: (+) - завершенный фагоцитоз; (-) - незавершенный фагоцитоз; * -р< 0,05 (по отношению к В. апМгаа'э СТЙ-1).

Установлено, что завершенность фагоцитоза (показатель, определяющий судьбу возбудителя сибирской язвы в макрооргаиизме) обеспечивает только вакцинация животных ДАК-конъюгатом в сочетании с АГ и В. аыкгаш СТИ-1, в меньшей мере - с АГ и СКВ (табл. 3).

Для выяснения вопроса, на какие звенья фагоцитарной системы влияют комплексный препарат и сибиреязвенная вакцина СТИ-1 в процессе иммунизации морских свинок, исследована активность участников кислородзави-симого бактерицидного механизма фагоцитов - Г6ФДГ, НАДФ-Н-оксидазы и миелопероксидазы.

Полученные результаты показали, что ДАК-конъюгат в сочетании с АГ и СКВ оказывает стимулирующее воздействие на выработку активных форм кислорода в макрофагах при фагоцитозе В. ап1Ъгас1$ СТИ-1, что выражалось в высоких значениях показателей ФП и ЦПА во все сроки (3, 7, 10, 14 и 30 сут.) наблюдения. Пик окислительной активности (174,0 ±2,2 усл. ед.) приходится на 14 сут. после инъекции препаратов, в последующие сроки имеет место постепенное снижение количества формазанположительных клеток, характеризующих выраженность КЗМ в фагоцитах иммунных животных. Процесс иммуногенеза сопровождается активацией в отдельные сроки после инъекции морским свинкам комплексного препарата (ДАК-конъюгат + АГ + СКВ) активности Г6ФДГ и НАДФ-Н-оксидазы иммунокомпетентных клеток, что свидетельствует об усилении окисления в них глюкозы в гексо-зомонофосфатном шунте, наработке НАДФ-Н, активизации бактерицидного метаболизма фагоцитов и, как следствие, - повышении антимикробного потенциала фагоцитирующих клеток. В начальной фазе иммуногенеза имеет место активация НАДФ-Н-оксидазы, причем повышенный фон фермента при

вакцинации животных В. anthracis С'ГИ-1 отмечается на протяжении первых 7 сут., тогда как в случае ДАК-конъюгата - несколько дольше, на протяжении более чем 10 сут.

Полученные данные позволяют заключить, что в условиях опытов ДАК-конъюгат активировал специфические фуЕпсции как Г6ФДГ, так и НАДФ-Н-оксидазы фагоцитов крови морских свинок в большей мере, чем клетки вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1, но достоверными (р < 0,05) по отношению к контролю были результаты не во все сроки наблюдения.

Фагоциты иммунных морских свинок превосходят аналогичные клетки интактных животных и по активности миелопероксидазы. Закономерных различий в активности фермента в зависимости от введенного препарата (ДАК-конъюгат, ДАК-конъюгат + АГ или ДАК-конъюгат + АГ + СКВ) не выявлено.

В ПЯЛ иммунных морских свинок, иммунизированных ДАК-конъюгатом в сочетании с АГ или СКВ, экзоцитоз неферментных катионных белков при поглощении сибиреязвенного микроба происходит более активно, чем в лейкоцитах как интактных животных, так и животных, иммунизированных вакцинным штаммом или только ДАК-коныогатом.

Известно, что эндогенная монооксид азота является одним из важнейших факторов неспецифической антиинфекционной защиты макроорганизма. Дефицит NO способствует размножению возбудителей в тканях и внутри фагоцитирующих клеток, что сопровождается усилением тяжести течения инфекционного процесса и его хронизацией (Green L.C. et al, 1982).

ДАК-конъюгат в сочетании с АГ и СКВ несколько превосходит ДАК-конъюгат с АГ и значительно - СТИ-1 по интенсивности влияния на продукцию N0 (рис. 3).

со о

2 §

го к-

cr S

S ГГ

" g

В ■&

18 16 и 12 10 8 6 4 2

0 -I

•С.;:;.

КА

Ч/Ч"

7 14

Сроки наблюдения (сутки)

I И ДАК-конъюгат | □ ДАК-конъюгат+АГ j □ Д АК-конъ ю гат+АГ+С КВ { В В. anthracis CTVI-1 j □ Интактные (контроль)

Рис. 3. Влияние ДАК-конъюгата, арабиногапактана и сквапена на синтез монооксида азота нефагоцитирующими пери гонеальными макрофагами морских свинок. Обозначения: * - р < 0,05; ** - р < 0,01 значимость различий по отношению к контролю.

Заметный прирост содержания КО-синтазы в ПМ наблюдается уже на третьи сутки после иммунизации морских свинок и сохраняется в последующие сроки (до 30 сут., прир < 0,05). Макрофаги животных, которым ДАК-конъюгат вводили одновременно с АГ и СКВ, на 14-21 сут. после вакцинации по интенсивности синтеза монооксида азота превосходили макрофаги животных, получивших вакцину СТИ-1, что свидетельствует о повышении активности КО-синтазы фагоцитов этих животных и, естественно, - усилении их антиинфекционной защиты.

Кратко резюмируя изложенные выше материалы, можно констатировать, что по совокупности проведенных исследований нами на основе клеточных стенок, протективного компонента токсина сибиреязвенного микроба и соматического белкового антигена (белка С) сконструирован антигенный комплекс, обладающий в эксперименте иммуногенными и протективными свойствами. Полученные результаты подтверждают складывающееся в литературе мнение о том, что защитные функции сибиреязвенной вакцины определяются не только протективным антигеном, но и другими компонентами микробной клетки (в нашем случае - белком С), что расширяет перспективы изыскания альтернативных антигенных фракций сибиреязвенного микроба. Безусловно, важен факт успешного применения арабиногалактана и сквалена в качестве иммуномодуляторов, повышающих специфическую активность ДАК-конъюгата.

Таким образом, в ходе экспериментов нами обоснованы принципы рационального подхода к конструированию вакцинных сибиреязвенных препаратов нового поколения. Показана возможность тестирования степени активности фагоцитирующих клеток в ответ на введение стимулирующего агента и функций, связанных с бактерицидной способностью для характеристики неспецифической резистентности организма.

С учетом литературных данных о механизмах иммуностимулирующего воздействия арабиногалактанов и сквалена растительного происхождения, собственных материалов о роли АГ лиственницы сибирской и ДАК-конъюгата на неспецифическую резистентность организма экспериментальных животных представляется возможным гипотетически сформулировать комплекс факторов, вовлекаемых искусственным антигенным комплексом (ДАК-конъюгат) в сочетании с АГ и СКВ при реализации его иммунокоррегирующей способности.

На основании вышеизложенного можно предложить следующую концептуальную схему механизмов действия ДАК-конъюгата в сочетании с АГ и СКВ на функциональное состояние системы фагоцитирующих клеток (рис. 4).

Рис. 4. Концептуальная схема механизмов действия ДАК-конъюгата в сочетании с арабиногалактаном и скваленом на функциональное состояние системы фагоцитирующих клеток. Примечание: данные литературы выделены курсивом.

ВЫВОДЫ

1. Искусственный антигенный комплекс, созданный на основе высокоочи-щенных препаратов клеточных стенок, протективного антигена и белка С сибиреязвенного микроба - ДАК-конъюгат - не токсичен при парентеральном введении экспериментальным животным (морские свинки, белые мыши), обладает иммуногенной и протективной активностью, сопоставимой или даже превышающей специфическую активность вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1.

2. При стимуляции ДАК-конъюгатом in vitro макрофагов морской свинки фагоцитарные реакции в отношении В. anthracis СТИ-1 носят незавершенный характер. ДАК-конъюгат in vitro стимулирует кислородзависимые, нитрок-сидзависимые и кислороднезависимые бактерицидные системы фагоцитов экспериментальных животных.

3. ДАК-конъюгат in vitro при совместном применении с арабиногалакта-ном и скваленом стимулирует синтез медиаторов воспаления (ФНО-а), обеспечивающих запуск каскада иммунных реакций, способствующих завершенности фагоцитоза сибиреязвенного микроба. Арабиногалактан и сквален оказывают выраженное иммуномодулирующее действие, повышая функциональную способность фагоцитирующих клеток.

4. ДАК-конъюгат при совместном парентеральном применении с араби-ногалактаном и скваленом повышает резистентность организма экспериментальных животных в отношении сибиреязвенного микроба за счет активации бактерицидных систем фагоцитов в большей степени, чем живая сибиреязвенная вакцина.

5. Возросший антимикробный потенциал макроорганизма, обусловленный ДАК-конъюгатом при сочетанном введении с иммупомодуляторами, обеспечивает увеличение числа выживших экспериментальных животных (в 1,5-2,0 раза) при инфекционном процессе, вызванном В. anthracis.

Сиисок работ, опубликованных по теме диссертации

1. Влияние комплекса антигенов Bacillus anthracis и сибиреязвенной вакцины СТИ на показатели неспецифической резистентности морских свинок / О.Б. Колесникова [и др.] // Современные средства иммунодиагностики, иммуно-и экстренной профилактики актуальных инфекций : материалы науч. конф. с международ, участием, 1-2 декабря 2004 г. - СПб., 2004. - С. 149-150.

2. Иммуногенные свойства сибиреязвенных искусственных вакцинных комплексов / М.В. Безносов, О.Б. Колесникова [и др.] // Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний : материалы международ, науч.-практ. конф., 12-15 марта2004 г. - Новосибирск, 2004. - С. 236.

3. Перспективы разработки химической вакцины для экстренной профилактики сибиреязвенной инфекции / О.Б. Колесникова [и др.] // Бюл. Вост.-Сиб. науч. центра Сибирского отделения Российской АМН. - 2004. - Т. 2, № 1.-С. 180-184.

4. Показатели неспецифической резистентности морских свинок иммунизированных Bacillus anthracis СТИ-1 и комплексом антигенов В. anthracis / В.И. Дубровина, E.II. Голубинский, О.Б. Колесникова [и др.] // Бюл. Вост.-Сиб. науч. центра Сибирского отделения Российской АМН. - 2004. - Т. 2, № 1. - С. 73-76.

5. Показатели неспецифической резистентности морских свинок при сочетанном применении комплекса антигенов Bacillus anthracis и иммуномодуля-торов / О.Б. Колесникова [и др.] // Узловые вопросы борьбы с инфекцией: Материалы Рос. науч.-практ. конф., 1-2 декабря 2004 г. - СПб., 2004. - С. 128.

6. Получение и применение белковых сибиреязвенных антигенов Bacillus anthracis для конструирования диагностических и профилактических препаратов / М.В. Безносов [и др.] // Противочум. учреждения России и их роль в обеспечении эпид. благополучия населения страны: материалы конф., посвящ. 70-летию ПЧЦ. - М.: РОО ЛО «Сокольники», 2004. - С. 159-164.

7. Влияние сочетанного применения комплекса антигенов Bacillus anthracis и иммуномодуляторов на повышение резистентности морских свинок к сибирской язве / Т.П. Старовойтова, С. А. Витязева, A.B. Родзиковский, О.Б. Колесникова [и др.] // Санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: проблемы безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях : материалы VI Межгосударственной науч.-практ. конф, 13-14 сентября 2005 г. - Волгоград, 2005. -С. 189-191.

8. Влияние искусственных антигенных комплексов Bacillus anthracis в сочетании с иммуномодуляторами на фагоцитирующую способность иммуно-компетентных клеток / В.И. Дубровина, Ж.А. Коновалова, О.Б. Колесникова, A.B. Родзиковский // Актуал. вопросы обеспечения сан.-эпид. благополучия населения Республики Бурятия: Юбилейная науч-практ. конф., посвящ. 85-летию образования гос. сан.-эпид. службы РФ. - Улан-Удэ, 2007. - С. 195-199.

9. Влияние комплексного антигенного препарата Bacillus anthracis и иммуномодуляторов на функциональную активность клеток фагоцитарной системы в эксперименте / В.И. Дубровина, A.B. Родзиковский, О.Б. Колесникова [и др.] // Пробл. особо опас. инфекций. - 2007. - № 93. - С. 73-76.

10. Колесникова О.Б. Современные подходы к конструированию вакцин против сибирской язвы / О.Б. Колесникова, В.И. Дубровина, Т.Т. Шкаруба // Деп. в ВИНИТИ 04.07.2007, № 695-В2007. - 28 с.

11. Колесникова, О.Б. Экспериментальное обоснование применения комплекса антигенов Bacillus anthracis и иммуномодуляторов для повышения резистентности организма к сибирской язве / О.Б. Колесникова [и др.] // Международ, медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ. - Саратов, 2007. - С. 222-224.

12. Структура и иммуномодулирующее действие арабиногалактана лиственницы сибирской и его металлопроизводных / В.И. Дубровина, С.А. Медведева, С.А. Витязева, О.Б. Колесникова [и др.]. — Иркутск : Аспринт, 2007. - 145 с.

13. Закономерности и механизмы формирования резистентности организма под влиянием искусственного антигенного комплекса сибиреязвенного микроба / О.Б. Колесникова, В.И. Дубровина, Ж.А. Коновалова [и др.] // Бюл. Вост.-Сиб. науч. центра Сибирского отделения Российской АМН. - 2008. -Т. 60, №2.-С. 64-65.

14. Искусственный антигенный комплекс Bacillus anthracis н сочетании с иммуномодуляторами - препарат, повышающий естественную резистентность организма / В.И. Дубровина, Ж.А. Коновалова, О.Б. Колесникова и др. // Scientific Journal. - Ulaanbaatar, 2008. -N 16. - P. 262-273.

15. Коновалова Ж.А. Нанобиокомпозиты серебра - перспективные препараты для повышения неспецифической резистентности макроорганизма / Ж.А. Коновалова, С.А. Витязева, О.Б. Колесникова // СПб MAIIO «Актуал. вопросы клин, и эксп. медицины - 2008». - СПб., 2008. - С. 47.

Список документов по внедрению научных достижений в практику

Определение функционального состояния фагоцитов в качестве показателя неспецифической защиты организма: метод, рек. / В.И. Дубровина, Ж.А. Коновалова, О.Б. Колесникова и др.; Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. - Иркутск, 2008. - 10 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЛГ - арабиногалактан

БАВ - биологически активные вещества

Белок С - соматический белок сибиреязвенного микроба м.м. 92 кДа

Г6ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

ГА - шутаровый альдегид

ДАК - дигидрат адипиновой кислоты

ДСН - додецилсульфат натрия

ДСН-ПААГ - диск-электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН ИА - индекс адгезии

ИЗФ - индекс завершенности фагоцитоза

ИХ - индекс хемотаксиса

КЗМ - кислородзависимый метаболизм

м.к. - микробные клетки

м.м. - молекулярная масса

МПО - миелопероксидаза

HCT - тест с нитросиним тетразолием

НКБ - неферментные катионные белки

ПААГ - полиакриламидный гель

ПАФ - процент активных фагоцитов

ПМ - перитонеальные макрофаги

ПО - полиоксидоний

ПЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты

СКВ - сквален

СОД - супероксиддисмутаза

СПЖ -- средняя продолжительность жизни

ФИ - фагоцитарный индекс

ФНО-а - фактор некроза опухоли альфа формазанположительные клетки -- цитохимический показатель активности

- доза испытуемого агента, вызывающая гибель 50 % взятых в опыт животных

- доза антигена, вызывающая защитный эффект у 50 % животных

- NO-синтаза

ФП ЦПЛ

DL5O

lmDbo NOS

Подписано в печать 12.11.2008. Бумага офсетная. Формат 60x84'/ Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 зкз. Заказ № 264-08.__

РИО НЦ PBX ВСНЦ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1.Тел 29-03-37. E-mail: arleon@rol.ru)

Актуальность проблемы

Сибирская язва, являющаяся особо опасным инфекционным заболеванием людей и животных, остается важной проблемой для здравоохранения и ветеринарии [42, 48]. Потенциальная возможность заражения человека Bacillus anthracis поддерживается не только периодически возникающими эпизоотиями болезни, но и существованием множественных почвенных очагов, распространенных на всех континентах и не регистрирующихся лишь на немногих островных территориях [64, 65].

Необходимость изучения этой особо опасной инфекции связана еще и с тем, что В. anthracis остается в списке объектов бактериологического оружия и средств биологического терроризма, что особенно наглядно проявилось событиями 2001 года в США. В связи с этим, продолжение детального изучения иммунологии сибирской язвы и протективных свойств ее возбудителя в настоящее время весьма актуально [17, 95, 104, 108, 147].

Анализ результатов экспериментальных и практических наблюдений, свидетельствует о необходимости разработки новых безопасных и эффективных вакцин против сибирской язвы на основе протективных бактериальных антигенов или их рекомбинантных аналогов [103, 105, 129, 185, 232].

Исследование пригодности различных субклеточных фракций В. anthracis с привлечением иммуномодуляторов и адъювантов, обеспечивающих целенаправленное действие на иммунную систему организма человека и животных, может определить принципы отбора и конструирования высокоиммуногенных препаратов, пригодных для специфической иммунопрофилактики сибирской язвы.

Недостаточная эффективность и ограниченные возможности применения современных сибиреязвенных вакцин на основе живых клеток или их фрагментов определяет актуальность для практического здравоохранения разработки высокоэффективных, но слабо реактогенных химических вакцин [1, 7, 8].

Цель исследования - выявить закономерности формирования резистентности организма к В. anthracis под действием искусственного антигенного комплекса, созданного на основе протективного антигена, клеточных стенок и белка С сибиреязвенного микроба в сочетании с иммуномо-дуляторами.

Для реализации поставленной цели последовательно решались следующие задачи:

1. Изучить фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов экспериментальных животных в отношении сибиреязвенного микроба и его антигенов.

2. Исследовать активность фагоцитов, определяющую бактерицидный потенциал перитонеальных макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов при поглощении искусственного антигенного комплекса сибиреязвенного микроба.

3. Сопоставить бактерицидную активность в отношении В. anthracis перитонеальных макрофагов морских свинок, иммунизированных живой сибиреязвенной вакциной и экспериментальным иммунным комплексом в сочетании с иммуномодуляторами.

4. Испытать в экспериментальных условиях иммуногенные препараты на протективную эффективность по отношению к высоковирулентному штамму возбудителя сибирской язвы.

Научная новизна

Впервые на основе исследований искусственного антигенного препарата (ДАК-конъюгат), состоящего из изолированных клеточных стенок, протективного антигена и белка С сибиреязвенного микроба показано, что примированные ДАК-конъюгатом и иммуномодуляторами фагоциты экспериментальных животных продуцируют медиаторы воспаления (ФНО-а), обеспечивающие запуск каскада иммунных реакций; активируются системы, способствующие захвату (хемотаксис, адгезия, поглощение) и внутриклеточной деградации микроба путем одновременной активации кислород-зависимых,. нитроксидзависимых и кислороднезависимых бактерицидных факторов.

Приоритетными являются данные о том, что в процессе иммуногенеза, вызванном искусственным антигенным комплексом, имеет место активация фагоцитарного процесса за счет повышения функциональной способности, в. частности бактерицидного потенциала макрофагов и полиморф-ноядерных лейкоцитов.

Экспериментально доказано, что искусственный антигенный комплекс обладает иммуногенной и протективнойактивностью.

Показана принципиальная возможность повышения* протективных свойств искусственного антигенного комплекса за счет использования им-муномодуляторов естественного происхождения- (арабиногалактан, сква-лен).

Теоретическое и практическое значение работы

G учетом современных представлений о факторах вирулентности сибиреязвенного микроба изучены особенности формирования резистентности макроорганизма экспериментальных животных, что уточняет и дополняет знания о патогенезе, иммуногенезе этой особо опасной инфекции и позволяет целенаправленно воздействовать на отдельные этапы фагоцитарного процесса.

Разработаны методологические подходы и принципы конструирования искусственного антигенного препарата (ДАК-конъюгат) на основе изолированных клеточных стенок, протективного антигена и белка С В. ап-thracis СТИ-1 обладающего иммуногенной и протективной активностью.

Показано, что арабиногалактан и сквален при одновременном введении морским свинкам с конъюгатом белковых препаратов и клеточных стенок, химически связанных дигидратом адипиновой кислоты, повышают протективную активность этого иммуногенного комплекса, что проявляется увеличением числа выживших экспериментальных животных, инфицированных сибиреязвенным микробом.

Патогенетически обоснована возможность тестирования степени активности фагоцитирующих клеток в ответ на введение стимулирующего агента и функций, связанных с бактерицидной способностью для характеристики неспецифической резистентности организма.

Результаты работы послужили основой для разработки и модификации методов изучения бактерицидных механизмов фагоцитоза и иммунной перестройки организма, которые отражены в методических рекомендациях «Определение функциональной способности фагоцитов в качестве показателя неспецифической защиты организма» (2008 г.). Научные и практически значимые материалы исследований включены в лекционные курсы дополнительного послевузовского образования при Иркутском научно-исследовательском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока.

Разработанные методы внедрены в практику научно-исследовательской работы Иркутского, Ставропольского противочумных институтов, Улан-Удэнского института общей и экспериментальной биологии СО РАН.

Положения, выносимые на защиту

1. Искусственный антигенный комплекс, созданный на основе протек-тивного антигена, клеточных стенок и белка С сибиреязвенного микроба, обладает иммуногенной и протективной активностью. Иммуномодуляторы естественного происхождения (сквален, арабиногалактан) повышают про-тективные свойства ДАК-конъюгата, что проявляется увеличением числа выживших экспериментальных животных (в 1,5-2,0 раза), инфицированных В. anthracis.

2. Фагоциты, стимулированные искусственным антигенным комплексом (ДАК-конъюгат) в сочетании с иммуномодуляторами продуцируют медиаторы воспаления (ФНО-а), индуцирующие запуск каскада иммунных реакций и активацию систем, способствующих захвату и внутриклеточной деградации микроба путем стимуляции кислородзависимых, нит-роксидзависимых и кислороднезависимых бактерицидных факторов. В процессе иммуногенеза, вызванного ДАК-конъюгатом, активируются клеточные факторы иммунитета за счет повышения функциональной способности, в частности, бактерицидного потенциала макрофагов и полиморф-ноядерных лейкоцитов.

Апробация работы. Материалы, изложенные в диссертации, представлены на:

• Международной научной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирск, 2004);

• Межрегиональной конференции, посвященной 100-летию академика РАМН СССР С.П. Карпова (Москва, 2004);

• Научно-практической конференции «Противочумная служба в России и ее роль в обеспечении эпидемического благополучия в России» (Москва, 2004);

• Всероссийской научной конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004);

• VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств — участников Содружества Независимых Государств: проблемы безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005);

• Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007);

• Региональной научной конференции «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения Республики Бурятия» (Улан-Удэ, 2007);

• Конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины — 2008» (Санкт-Петербург, 2008);

• Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Человек: здоровье и экология» (Иркутск, 2008);

• научных конференциях Иркутского противочумного института (2002-2008).

Публикации: По теме диссертации опубликованы 15 научных работ, в том числе 4 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, одна монография «Структура и иммуномодули-рующее действие арабиногалактана лиственницы сибирской и его метал-лопроизводных».

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, иллюстрирована 11 таблицами и 19 рисунками. Список литературных источников содержит 238 наименований, в том числе 172 - зарубежных.

107 ВЫВОДЫ

1. Искусственный антигенный комплекс, созданный на основе высоко-очищенных препаратов клеточных стенок, протективного антигена и белка С сибиреязвенного микроба — ДАК-конъюгат — не токсичен при парентеральном введении экспериментальным животным (морские свинки, белые мыши), обладает иммуногенной и протективной активностью, сопоставимой или превышающей специфическую активность вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1.

2. При стимуляции ДАК-конъюгатом in vitro макрофагов морской свинки фагоцитарные реакции в отношении В. anthracis СТИ-1 носят незавершенный характер. ДАК-конъюгат in vitro стимулирует кислородзависимые, нитроксидзависимые и кислороднезависимые бактерицидные системы фагоцитов экспериментальных животных.

3. ДАК-конъюгат in vitro при совместном применении с арабиногалактаном и скваленом стимулирует синтез медиаторов воспаления (ФНО-а), обеспечивающих запуск каскада иммунных реакций, способствующих завершенности фагоцитоза сибиреязвенного микроба. Арабиногалактан и сквален оказывают выраженное иммуномодулирующее действие, повышая функциональную способность фагоцитирующих клеток.

4. ДАК-конъюгат при совместном парентеральном применении с арабиногалактаном и скваленом повышает резистентность организма экспериментальных животных в отношении сибиреязвенного микроба за счет активации бактерицидных систем фагоцитов в большей степени, чем живая сибиреязвенная вакцина.

5. Возросший антимикробный потенциал макроорганизма, обусловленный ДАК-конъюгатом при сочетанном введении с иммуномодуляторами, обеспечивает увеличение числа выживших экспериментальных животных (в 1,5-2,0 раза) при инфекционном процессе, вызванном В. anthracis.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на успехи в изучении протективных антигенов сибиреязвенного микроба, единственным препаратом для специфической профилактики сибирской язвы в России в настоящее время продолжает оставаться сибиреязвенная вакцина СТИ, сконструированная на основе аттенуиро-ванных живых клеток В. anthracis еще в прошлом веке. Как и многие живые вакцины другого микробного профиля, вакцина СТИ обладает нежелательными побочными свойствами, недостаточно эффективна и не пригодна для применения на фоне неспецифической профилактики сибирской язвы антибиотиками [39, 66, 187, 227, 228].

В странах Европы, Северной Америки, других регионов мира на протяжении многих лет используется сибиреязвенная вакцина, сконструированная на основе протективного, в том числе рекомбинантного, антигена сибиреязвенного микроба. Препарат лишен многих балластных компонентов, свойственных живой вакцине, более безопасен, но заметно уступает последней по специфической протективной эффективности [228].

Анализ результатов экспериментальных и практических наблюдений свидетельствует о необходимости разработки новых безопасных и эффективных вакцин против сибирской язвы на основе протективных бактериальных антигенов или их рекомбинантных аналогов [39, 49, 112, 228]. Однако проблема создания субъединичных вакцин не сводится только к получению протективных антигенов или ответственных за формирование иммунитета отдельных антигенных детерминант. Как правило, очищенные или синтезированные антигены и антигенные детерминанты, взятые отдельно, не способны индуцировать выраженный иммунный ответ: необходимый эффект удается достигать только лишь при тщательном подборе адъювантов и матричных носителей, обладающих необходимым иммуно-модулирующим действием [24, 52, 81].

К настоящему времени накопилось достаточное количество материала, свидетельствующего о возможности использования иммуномодуляторов в качестве адъювантов для повышения эффективности вакцинации. Проблема повышения иммуногенности вакцин связана не только с низкой активностью вакцинных препаратов, но и с измененной реактивностью макроорганизма [32, 49, 50].

В литературе имеются данные о возможности повышения неспецифической резистентности макроорганизма такими преимущественно синтетическими препаратами как мурамилдипептид, ликопид, полиоксидоний, бе-митил и другие [27, 50, 55, 56]. В настоящее время большое внимание уделяется полисахаридам растительного происхождения. Несколько таких полисахаридов, в частности, сирингин, К-212, диквертин, арабиногалактан, железо- (феррогал) и кобальтсодержащие нанобиокомпозиты на основе арабиногалактана, нам любезно предоставили для экспериментального изучения их действия на клетки СМФ сотрудники Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского. Среди них по своим физико-химическим свойствам, простоте применения и доступности наше внимание привлек арабиногалактан. Использованный в экспериментах препарат выделен из лиственницы сибирской Larix sibirica, водорастворим, не токсичен, не пироге-нен для экспериментальных животных, характеризуется уникальными биологическими свойствами и большими потенциальными возможностями использования его в научных и медицинских целях [4, 22, 28]. Иммуномоду-лирующие свойства АГ в последние годы выявлены, в частности, при взаимодействии клеток макроорганизма с возбудителями чумы и псевдотуберкулеза [16]. Сведения об его применении для иммуностимуляции при сибирской язве в доступной литературе отсутствуют.

В связи с этим нами была предпринята попытка дать комплексную характеристику влияния ДАК-конъюгата (искусственный антигенный комплекс, созданный на основе протективного антигена, клеточных стенок и белка С сибиреязвенного микроба), с использованием АГ на клетки фагоцитарной системы экспериментальных животных.

В параллельных опытах дополнительно к арабиногалактану мы исследовали иммуностимулирующую способность сквалена - субстрата биологического происхождения, широко распространенного в тканях растений, животных и человека и нашедшего применение в составе сибиреязвенной вакцины на основе протективного антигена [105].

Для решения вопросов, какие системы иммунокомпетентных клеток подвержены воздействию специфических антигенов сибиреязвенного микроба, и какова роль в этом процессе иммуномодуляторов растительного происхождения, мы провели серию экспериментов на модели ПМ и ПЯЛ морских свинок in vitro и in vivo. В первой серии опытов исследовали клетки интактных морских свинок и белых мышей, во второй - клетки этих же животных после однократного парентерального воздействия на них комплексного антигена - ДАК-конъюгата per se, а также в сочетании с арабиногалактаном или скваленом.

Известно, что одним из важнейших этапов в патогенезе сибирской язвы является герминация спор В. anthracis в вегетативные клетки. Процесс превращения спор в бациллы является стимулом для секреции как провос-палительных, так и антивоспалительных цитокинов [189].

Одним из первых этапов реализации иммунного ответа после активации моноцитов/макрофагов внеклеточными индукторами бактериального, вирусного или растительного происхождения, химическими соединениями или другими цитокинами является продукция провоспалительного цито-кина ФНО-а. Уровень ФНО-а в крови повышается уже через 15 мин от момента поступления индуктора, достигает плато через 90—120 мин и снижается до исходного показателя через 240-360 мин [59]. Выделение цитокинов моноцитами/макрофагами служит одной из основных причин развития острой фазы воспаления и появления клинических симптомов при острой инфекции.

На следующем этапе развития иммунного ответа продуцируемый макрофагами ФНО-а способствует мобилизации клеток в очаг инфекции. Попадая в кровяное русло, эти молекулы действую через свои рецепторы на эндотелиальные клетки сосудов. В эндотелиоцитах активируются гены, ответственные за синтез специальных молекул адгезии, которые обеспечивают прилипание к сосудистой стенке циркулирующих в крови грануло-цитов, моноцитов и лимфоцитов. Прилипание к эндотелию для клетки — первый шаг выхода из сосуда и мобилизации в очаг инфекции. Таким образом, ФНО-а является аутокринным и паракринным активатором моноцитов/макрофагов, способствуя увеличению их числа в очаге инфекции. У самих макрофагов имеются рецепторы для ФНО-а, через которые он может их активировать, посылая с поверхности клеток сигналы к их ядру [59].

TNF-a, являясь одним из основных цитокинов, обладающих провос-палительной функцией, запускает «цитокиновый каскад» в очаге воспаления, увеличивая продукцию ИЛ-1, -2, -6, -10 и ИФН-у, которые в свою очередь оказывают влияние на экспрессию ФНО-a и его рецептора. ИЛ-6 и ИЛ-1 усиливают продукцию ФНО-a и его растворимого рецептора, ИЛ-10, напротив, снижает содержание ФНО-а [59, 70].

Важная роль в формировании резистентности организма к бактериальным патогенам провоспалительных цитокинов послужила основанием для исследования влияния комплексного антигена сибиреязвенного микроба и модуляторов иммунного ответа на продукцию ФНО-a. Установлено, что как в отдельности, так и в сочетании с АГ или СКВ ДАК-конъюгат активирует синтез ФНО-a перитонеальными макрофагами белых мышей. Наиболее высокие показатели продукции цитокина зафиксированы при комплексном воздействии на ПМ ДАК-конъюгата совместно с АГ и СКВ (144,9 ± 0,7 пг/мл).

Как показал детальный анализ полученных результатов, В. anthracis стимулировало продукцию ФНО-а перитонеальными макрофагами в 1,31,9 раз меньше, чем ДАК-конъюгат или его сочетание с иммуномодулято-рами.

Таким образом, ДАК-конъюгат не содержащий ЛФ и ОФ сибиреязвенного микроба, способствует повышению продукции ФНО-а перитонеальными макрофагами, а наличие токсина в В. anthracis вызывает нарушения секреции фагоцитами этого провоспалительного цитокина. Выявленный нами дисбаланс синтеза ФНО-а макрофагами подтверждается исследованиями других авторов [69, 120].

В ходе исследования установлено, что фагоциты, стимулированные ДАК-конъгатом, по поглотительной способности (величинам ПАФ и ФИ), превосходят не только интактные макрофаги, но и макрофаги, стимулированные спорами вакцинного штамма сибиреязвенного микроба. Фагоцитоз В. anthracis СТИ-1 макрофагами морской свинки, стимулированными ДАК-конъюгатом in vitro, является незавершенным (98,4 %). АГ, особенно в сочетании со СКВ, повышает способность ДАК-конъюгата стимулировать поглотительную активность фагоцитов, и обеспечивают вероятность завершенного фагоцитоза сибиреязвенного микроба ПМ в 5,3 раза больше, чем в контроле.

Таким образом, перитонеальные макрофаги примированные В. anthracis и ДАК-конъюгатом, сохраняют способность фагоцитировать споры В. anthracis, однако наличие в живой сибиреязвенной вакцине токсина существенно снижает способность фагоцитов освобождаться от микроба, возможно, за счет нарушения секреции клетками провоспалительного цитокина ФНО-а.

Общеизвестно, что осуществление фагоцитоза клетками системы мо-нонуклеарных фагоцитов и полиморфноядерными лейкоцитами сопровождается увеличением потребления кислорода, повышением активности ферментов гексозомонофосфатного шунта, а также возрастающим образованием перекиси водорода и супероксиданиона в этих клетках [41, 58, 59].

Анализ данных, полученных при изучении влияния ДАК-конъюгата в сочетании с АГ и СКВ на КЗМ интактных ПМ и ПЯЛ морской свинки в НСТ-тесте, позволил выявить стимулирующую способность всех исследованных препаратов. В ПМ наиболее высокие показатели НСТ-теста зафиксированы в присутствии ДАК-конъюгата + АГ и ДАК-конъюгата + АГ + СКВ. Макрофаги, примированные АГ и СКВ по степени активности окислительного метаболизма достоверных различий по сравнению с контролем (интактные клетки) не выявлено. При контакте с ПЯЛ наиболее высокие показатели КЗМ обеспечивает ДАК-конъюгат + АГ + СКВ.

Таким образом, в отличие от спор В. anthracis, не способных в достаточной мере противостоять при внедрении в фагоцит таким антибактериальным факторам как О'г и Н2О2, ДАК-конъюгат + АГ + СКВ стимулирует выработку активных форм кислорода иммунокомпетентными клетками морской свинки, что в свою очередь способствует завершенности фагоцитоза [184] и повышению резистентности организма.

Согласно современным представлениям, активные формы кислорода, обладающие сильным бактерицидным действием, используются фагоцитами для уничтожения вторгшихся микроорганизмов, а НАДФ-Н-оксидазы - группа ассоциированных с мембраной энзимов принимают активное участие в этом процессе [41, 59]. НАДФ-Н-оксидаза катализирует продукцию супероксида (02-), используя в качестве донора электронов НАДФ-Н: 02 + НАДФ-Н = 2 02- + НАДФ+ + Н\ Генерированный супероксид далее служит стартовым материалом для широкого круга реактивных оксидан-тов, таких как свободные радикалы, синглетный кислород, перекись водорода и др. [41, 60].

Учитывая важную роль НАДФ-Н-оксидазы в бактерицидных механизмах фагоцитоза, нами была предпринята попытка, исследовать влияние искусственного антигенного комплекса как per se, так и в сочетании с АГ и

СКВ на активность НАДФ-Н-оксидазы фагоцитов. Отмечено стимулирующее действие всех исследованных препаратов на активность этого фермента перитонеальных макрофагов морских свинок по сравнению с контролем, однако максимально достоверные значения ферментативной активности регистрируются при взаимодействии фагоцитов с комплексным препаратом ДАК-конъюгат + АГ + СКВ.

Известно, что Г6ФДГ - ключевой фермент пентозомонофосфатного шунта — катализирует начальную реакцию окисления глюкозо-6-фосфата, при которой акцептором водорода является НАДФ [41]. Следует отметить, что ДАК-конъюгат в сочетании с АГ и СКВ оказывает на активность Г6ФДГ перитонеальных макрофагов более выраженное стимулирующее воздействие (в 1,2—1,6 раза), чем ДАК-конъюгат per se или конъюгат в сочетании только с АГ или СКВ. В контрольных (нестимулированных) фагоцитах активность Г6ФДГ была в 2,1 раза ниже, чем в активированных ДАК-конъюгатом (р < 0,05).

Таким образом, примирование фагоцитирующих клеток ДАК-конъюгатом и иммуномодуляторами сопровождается активацией в этих клетках Г6ФДГ и НАДФ-Н-оксидазы, что свидетельствует об усилении в них окисления глюкозы в гексозомонофосфатном шунте и о повышении скорости взаимопревращения НАДФНАДФ-Н. Связанная с этим активация КЗМ обеспечивает фагоцитам более высокий уровень бактерицидной способности, которая носит дифференцированный характер в зависимости от применяемого препарата.

Внутриклеточную антиокислительную защиту обеспечивают, в основном, СОД и каталаза. Считается, что этот фермент удаляет избыток токсических супероксидных радикалов и тем самым защищает биологические мембраны от окислительного повреждения. Активность СОД во многих случаях зависит от уровня супероксиданиона в тканях, который выступает по отношению к ферменту в качестве индуцирующего и активирующего фактора [41, 58, 59].

В ходе выполнения настоящего исследования нами были проанализированы данные по изменению активности СОД макрофагов и ПЯЛ. Так, под воздействием всех испытанных препаратов в ПЯЛ, в меньшей степени - в ПМ (значения в 7 раз ниже) отмечено повышение активности СОД, особенно выраженное при стимуляции процесса комплексом ДАК-конъюгат в сочетании с АГ + СКВ, увеличивая тем самым бактерицидный эффект в отношении патогена.

Таким образом, активность СОД зависит как от вида фагоцитов, так и от свойств взаимодействующих агентов. Наиболее выраженный положительный эффект стимуляции в фагоцитах процесса превращения супероксида в перекись водорода с участием СОД выявлен при сочетанном применении ДАК-конъюгата с иммуномодуляторами.

Известно, что МПО является основой кислородзависимой системы ПЯЛ, бактерицидный эффект которой связан с ее способностью продуцировать высокоактивные агенты, участвующие в защите организма хозяина от патогенов [41].

В связи с этим, на следующем этапе нашей работы мы проводили оценку действия ДАК-конъюгата, АГ и СКВ на активность МПО. Показано, что все исследованные препараты повышают активность миелоперок-сидазы ПЯЛ морских свинок. Наиболее высокие показатели активности фермента обеспечивали ДАК-конъюгат + АГ + СКВ (более чем в 1,5 раза по сравнению с контрольными значениями) и ДАК-конъюгат + СКВ (в 1,4 раза). ДАК-конъюгат, ДАК-конъюгат + АГ, АГ и СКВ поддерживали активность МПО на уровнях, превосходивших контрольный на 15,7—23,2 %.

Таким образом, в результате проведенного исследования нами показано, что ДАК-конъюгат как per se, так и в сочетании с АГ и СКВ оказывают положительное влияние на МПО систему фагоцитов, повышая тем самым неспецифическую защиту организма.

В литературе имеются сведения о том, что в дополнение к активным формам кислорода в качестве антимикробного агента рассматривается молекула монооксида азота [41]. Нами исследовано действие препаратов на синтез монооксида азота. Следует заметить, что действие ДАК-конъюгата в сочетании с АГ, АГ + СКВ или СКВ на ПЯЛ и макрофаги не было равнозначным. Наибольшее стимулирующее действие на синтез монооксида азота в ПЯЛ оказывал ДАК-конъюгат + АГ + СКВ (4,20 ± 0,04 мкМ/106 фагоцитов) и ДАК-конъюгат + АГ (3,98 ± 0,01), в макрофагах - ДАК-конъюгат + АГ + СКВ (2,46 ± 0,06) и СКВ (2,24 ± 0,01). Контрольные значения активности NO-синтазы в ПЯЛ и макрофагах не превышали 0,80 ± 0,01 и 0,54 ± 0,01 мкМ/106 фагоцитов, соответственно.

Анализ данных, полученных при изучении влияния in vitro ДАК-конъюгата с иммуномодуляторами на макрофаги и ПЯЛ экспериментальных животных, позволил выявить, что все исследованные препараты повышают функциональную активность системы фагоцитирующих клеток, связанную с NO-синтазой. Основываясь на имеющиеся в литературе данные об участии монооксида азота в бактерицидных механизмах фагоцитоза, логично предположить, что ДАК-конъюгат как per se, так и в сочетании с АГ и СКВ могут способствовать усилению киллинга инфекционного агента в тканях и внутри фагоцитирующих клеток.

При исследовании кислороднезависимых бактерицидных механизмов фагоцитов мы уделили особое внимание неферментным катионным белкам, поскольку по своеобразному электростатическому механизму воздействия на клеточные структуры микробов НКБ резко отличаются от описанных выше ферментных систем.

Полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют о стимулирующем воздействии исследованных препаратов на НКБ. Наиболее выраженную активацию НКБ (в 1,4-1,5 раза, р < 0,05) наблюдали при воздействии на ПЯЛ ДАК-конъюгата в сочетании с АГ + СКВ. ДАКконъюгат, АГ и СКВ, взятые в отдельности, в меньшей мере (в 1,2-1,3 раза), но также повышают в фагоцитах уровень содержания НКБ, усиливая таким образом их бактерицидную способность.

Таким образом, ДАК-конъюгат in vitro стимулирует неспецифическую резистентность организма при участии кислородзависимых, нитро-ксидзависимых и кислороднезависимых бактерицидных систем фагоцитов экспериментальных животных. Арабиногалактан и сквален оказывают выраженное иммуномодулирующее действие, усиливая бактерицидный потенциал фагоцитов.

Имеющиеся в настоящее время данные литературы из-за их разрозненности и недостаточности сравнительных данных не позволяют пока определить факторы, играющие ключевую или, по крайней мере, ведущую роль в процессе иммуногенеза при сибирской язве. Для решения проблемы, носят ли они универсальный или строго индивидуальный характер, необходимо комплексное сравнительное исследование.

Главная задача исследования in vivo состояла в том, чтобы проследить реакцию клеток иммунной системы макроорганизма на комплексное воздействие ДАК-конъюгата и иммуномодуляторов как на системном, так и на элементарном уровне. Это дало бы возможность не только констатировать факт пролонгирования иммунного ответа, но и судить о некоторых механизмах иммунокоррегирующего действия вводимых препаратов.

Установлено, что у морских свинок, получивших парентерально ДАК-конъюгат, во все сроки иммуногенеза (от 3 до 30 сут.) возрастает адгезивная активность перитонеальных макрофагов — с 48,5 ± 3,1 до 60,0 ± 2,3 усл. ед. в контрольных пробах и от 74,0 ± 1,3 до 96,0 ± 2,2 усл. ед. - в опытных. В наибольшей мере повышению адгезивной способности фагоцитов морских свинок способствовал ДАК-конъюгат в сочетании с АГ + СКВ (от 87,5 ± 1,7 до 121,7 ± 2,2 усл. ед. при р < 0,05).

ДАК-конъюгат при одновременном применении с АГ и скваленом оказывает стимулирующее действие и на поглотительную способность фагоцитов. Этот вывод подтверждает положительная тенденция изменения использованных оценочных параметров ПАФ и ФИ. Однако наиболее впечатляющим в этом плане является почти двукратный рост показателя завершенности фагоцитоза - процесса, определяющего судьбу возбудителя сибирской язвы в макроорганизме. Так, при изучении влияния ДАК-конъюгата, АГ и СКВ на протективную активность получены данные, позволяющие констатировать, что АГ и СКВ обеспечивают повышение процента выживаемости животных, а СКВ, кроме того, — снижение иммунизирующей дозы конъюгата. Материалы следующего опыта показали, что АГ, СКВ и АГ + СКВ параллельно с увеличением процента выживаемости животных способствуют оптимизации другого важного показателя про-тективности вакцинных препаратов — средней продолжительности жизни вакцинированных животных, возрастающей в 1,2-1,7 раза по сравнению с показателями, которые обеспечивает один ДАК-конъюгат. Вакцина СТИ-1 в аналогичных условиях продлевала жизнь вакцинированных ею животных не более чем на 8 %.

Таким образом, ДАК-конъюгат при одновременном применении с АГ и СКВ оказывает стимулирующее действие на фагоцитарную активность фагоцитов, вследствии чего повышаются протективные свойства этого антигенного комплекса.

Для выяснения вопроса, на какие звенья фагоцитарной системы влияют, ДАК-конъюгат + АГ + СКВ, ДАК-конъюгат + СКВ и сибиреязвенная вакцина СТИ-1 в процессе иммунизации морских свинок, исследована активность ферментов кислородзависимого бактерицидного механизма фагоцитов - Г6ФДГ, НАДФ-Н-оксидазы и миелопероксидазы.

Полученные результаты показали, что ДАК-конъюгат в сочетании с АГ и скваленом оказывает стимулирующее воздействие на выработку активных форм кислорода, в макрофагах при фагоцитозе В. anthracis СТИ-1, что выражалось в высоких значениях показателей ФП и ЦПА во все сроки (3, 7, 10, 14 и 30 сут.) наблюдения. Пик окислительной активности (174,0 ± 2,2 усл. ед.) приходится на 14 сут. после инъекции препаратов, в последующие сроки имеет место постепенное снижение количества формазан-положительных клеток, характеризующих выраженность КЗМ в фагоцитах иммунных животных. Процесс иммуногенеза сопровождается активацией в отдельные сроки после инъекции морским свинкам комплексного препарата (ДАК-конъюгат + АГ + СКВ) Г6ФДГ и НАДФ-Н-оксидазы иммуно-компетентных клеток, что свидетельствует об усилении окисления в них глюкозы в гексозомонофосфатном шунте, наработке НАДФ-Н, стимуляция бактерицидного метаболизма фагоцитов и, как следствие, — повышение антимикробного потенциала фагоцитирующих клеток. Активация обоих ферментов в клетках крови на 10 сут. после иммунизации животных происходит интенсивнее у особей, вакцинированных ДАК-конъюгат + АГ + СКВ, чем сибиреязвенной вакциной СТИ-1.

Фагоциты вакцинированных морских свинок превосходят аналогичные клетки интактных животных и по активности миелопероксидазы. Закономерных различий в активности фермента в зависимости от введенного препарата (ДАК-конъюгат, ДАК-конъюгат + АГ или ДАК-конъюгат + АГ + СКВ) не выявлено.

В ПЯЛ иммунных морских свинок, иммунизированных ДАК-конъюгатом в сочетании с АГ или СКВ, экзоцитоз неферментных катионных белков при поглощении сибиреязвенного микроба происходит более активно, чем в лейкоцитах как интактных животных, так и животных, иммунизированных вакцинным штаммом или только ДАК-коньюгатом, но результаты небыли достоверными относительно контроля.

Известно, что эндогенная окись азота является одним из важнейших факторов неспецифической антиинфекционной защиты макроорганизма. Дефицит NO способствует размножению возбудителей в тканях и внутри фагоцитирующих клеток, что сопровождается усилением тяжести течения инфекционного процесса и его хронизацией.

Сравнительный анализ полученных данных между группами обследованных экспериментальных животных в зависимости от использованного для исследования in vivo препарата показал, что ДАК-конъюгат в сочетании с АГ и скваленом несколько превосходит ДАК-конъюгат с АГ и значительно - СТИ по интенсивности влияния на продукцию NO (р < 0,05).

Так, заметный прирост содержания NO-синтазы в перитонеальных макрофагах наблюдается уже на третьи сутки после иммунизации морских свинок и сохраняется в последующие сроки (р < 0,05). Макрофаги животных, которым ДАК-конъюгат вводили одновременно с АГ и скваленом, на 14-21 сут. после вакцинации по интенсивности синтеза монооксида азота превосходили макрофаги животных, получивших вакцину СТИ-1, что свидетельствует о повышении активности NO-синтазы фагоцитов этих животных и, естественно, — усилении их антиинфекционной защиты.

Таким образом, ДАК-конъюгат в сочетании с арабиногалактаном и скваленом активирует бактерицидные системы фагоцитов в большей степени, чем живая сибиреязвенная вакцина. Возросший антимикробный потенциал макроорганизма, обусловленный ДАК-конъюгатом при сочетанием введении с иммуномодуляторами, обеспечивает увеличение числа выживших экспериментальных животных (в 1,5—2,0 раза) при инфекционном процессе, вызванном В. anthracis.

Кратко резюмируя изложенные выше материалы, можно констатировать, что по совокупности проведенных исследований нами на основе клеточных стенок, соматического белкового антигена (белка С) и протективного компонента токсина сибиреязвенного микроба сконструирован антигенный комплекс, обладающий в эксперименте иммуногенными и протек-тивными свойствами. Полученные результаты подтверждают имеющееся в литературе мнение о том, что защитные функции сибиреязвенной вакцины определяются не только протектнвным антигеном, а и другими компонентами микробной клетки (в нашем случае — белком С), что расширяет перспективы изыскания альтернативных антигенных фракций сибиреязвенного микроба.

Согласно имеющимся в литературе предположениям о том, что факторами, лимитирующими эффективность фагоцитоза В. anthracis СТИ-1, являются ингибирующее влияние микроба на адгезивную способность фагоцитирующих клеток, дисбаланс окислительного метаболизма фагоцитов, устойчивость бактерий к лизосомальным ферментам фагоцитов и их способность после эндоцитоза попадать в фагосому, избегая губительного действия микробицидных факторов фагоцита. Отсюда становится ясным, что для повышения эффективности фагоцитоза следует направленно воздействовать именно на фагоцитарный процесс. Безусловно, важен факт успешного применения арабиногалактана и сквалена в качестве иммуномодуля-торов, повышающих специфическую активность ДАК-конъюгата и неспецифическую резистентность организма экспериментальных животных в отношении сибиреязвенного микроба.

Таким образом, в ходе экспериментов нами обоснованы принципы рационального подхода к конструированию вакцинных сибиреязвенных препаратов нового поколения. Показана возможность тестирования степени активности фагоцитирующих клеток в ответ на введение стимулирующего агента и функций, связанных с бактерицидной способностью для характеристики неспецифической резистентности организма.

С учетом литературных данных о механизмах иммуностимулирующего воздействия арабиногалактанов и сквалена растительного происхождения, собственных материалов о роли АГ лиственницы сибирской и ДАК-конъюгата на неспецифическую резистентность организма экспериментальных животных представляется возможным гипотетически сформулировать комплекс факторов, вовлекаемых искусственным антигенным комплексом (ДАК-конъюгат) в сочетании с АГ и СКВ при реализации его иммунокоррегирующей способности.

На основании вышеизложенного можно предложить следующую концептуальную схему механизмов действия ДАК-конъюгата в сочетании с АГ и СКВ на функциональное состояние системы фагоцитирующих клеток (рис. 17).

Синтез цитокинов и других БАВ

Фагоцитарная активно1

Кислорода висим ые бактерицидные системы (НСТ-тест, Г6ФДГ, НАДФН-оксидаза. СОД, МПО)

Нитроксидэависимые бактерицидные системы (NO-си нтаза)

Кислородзависимые бактерицидные системы (НСТ-тест, Г6ФДГ, НАДФНоксидаза, СОД МПО) |

К ислоро днез авис имые бактерицидные системы (HKf

Нитроксидзависимые бактерицидные системы (NO-си нтаза)

NK-штки ШШШMlI

Цитотоксическая ИНФ-а активность в ИФН-у отношении ил-з возбудителей ИЛ-8

ИЗ

ТЭ о <-s со ж и S 03 X ед so

S 3 г я о

ГО я ас w м я>

-J га оэ Ж о о >н

Q4

Формирование резистентности организма к В, anthracis

Примечание: данные литературы выделены курсивом.

Рис. 17. Концептуальная схема механизмов действия ДАК-конъюгата в сочетании с арабиногалактаном и скваленом на функциональное состояние системы фагоцитирующих клеток