Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ПОЛЕВЫХИЗОЛЯТОВ В. ANTHRACIS

Я-зз^г> з

На правах рукописи

УДК 619:616,98:579.852.11

ЕГОРОВА ИРИНА ЮРЬЕВНА

ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ПОЛЕВЫХ ИЗОЛЯТОВ А лктнилск

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией н иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Покров -2003 г.

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемни).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Научный консультант:

доктор ветеринарных наук, доцент

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Ведущая организация:

ФГУ Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов

Защита диссертации состоится « 4 » марта 2004 г. в 1 Iй часов заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при ГНУ Всероссийск ; -научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии микробиологии по адресу: 601120, Владимирская обл., г. Покров* ВНИИВВиМ.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии.

Автореферат разослан «¿7-» 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Савукова В Я.

-

Селянинов Юрий Олегович Муруева Галина Борисовна

Русалеев Владимир Сергеевич (ФГУ ВНИЗЖ, г. Владимир)

Власова Наталья Никифоровна (ГНУ ВНИИВВиМ, г. Покров)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Сибирская язва (Anthrax) - болезнь домашних, диких животных и человека, встречающаяся в настоящее время в виде спорадических случаев и редко в виде вспышек. Несмотря на значительное снижение в последние десятилетия экономического ущерба от этого инфекционного заболевания в результате проведения широкомасштабных профилактических мероприятий, интерес исследователей к данному патогену не ослабевает. Это связано со способностью спор возбудителя длительно сохраняться в почве, обуславливая устойчивое поддержание исходного почвенного очага, стационарность заболевания и его распространение (Черкасский БЛ., 2002). Кроме того, действие биотических и абиотических факторов, сказывающееся на свойствах и эволюции микроба (появление атипичных штаммов), определяет необходимость дальнейшего изучения биологических и генетических особенностей возбудителя сибирской язвы.

Для установления источника инфекции и дифференциации природных вспышек особо опасных инфекций (ООИ) от вспышек искусственного происхождения важное значение имеет возможность внутривидового типирования возбудителя. Вопрос внутривидовой дифференциации штаммов В. anthracis до настоящего времени остается одним из актуальнейших в связи с «консервативностью» их таксономических признаков, т.е. отсутствием четко классифицируемых межштаммовых различий по общепринятым дифференциально-диагностическим тестам, что подтверждают результаты многочисленных исследований полевых изолятов, не выявивших существенных различий в их фенотипе. В связи с этим возникает необходимость поиска новых критериев, пригодных для выявления индивидуальных особенностей штаммов.

В разные периоды изучения В. anthracis в качестве маркеров, позволяющих проводить межштаммовую дифференциацию, предлагалось использовать культур ал »но-мор^олошч^мие, Ьиох ¡мические, биологические

свойства, определение питательных потребностей возбудителя, устойчивость к умеренным бактериофагам, анти б иотикорезистентность и другие проявления фенотипических характеристик (Славчев P.C. и др., 1967; Маринин Л.И. и др., 1999; Тамарин А.Л. и др., 1947; Thorne C.B., 1960; Лесняк О.Т., 1968; Шелохович А .И. и др., 1989; Еременко Е.И., 1997; Найманов П.И., 1987). Однако до настоящего времени отсутствуют четкие рекомендации по использованию отдельных биохимических признаков для внутривидового типирования сибиреязвенных штаммов и при их дифференциации применяется лишь классификация, основанная на определении степени вирулентности для животных.

Полученные в последнее десятилетие данные об участии в проявлении патогенных свойств возбудителя сибирской язвы таких факторов хромосомной локализации, как протеолитическая и гемолитическая активности, пигментсорбция, пигментсинтез, свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения, что позволит определить их роль в патогенетическом процессе и дополнить характеристику изолятов, которые могут учитываться при дифференциации штаммов, определении их эпидемиологической значимости и отборе штаммов, пригодных для разработки средств специфической профилактики.

Современные методы молекулярной генетики, основанные на анализе генома бактериальной ДНК, имеют ряд преимуществ перед традиционными подходами дифференциации штаммов. Изучение структурно-функциональной организации генома позволяет выявлять тонкие генетические различия, проводить внутривидовое типирование штаммов и устанавливать их филогенетическое родство, дополняя круг уже существующих приемов микробиологической диагностики. Так, на основании молекулярно-генетического субтиппрования спор пггаммов сибиреязвенного микроба, использованных в Японии (1993) и США (2001) в террористических целях, было установлено их соответствие штаммам Sterne и Ames, соответственно.

Таким образом, исследования, направленные на поиск штамм оспецифичных маркеров, являются необходимым условием для проведения внутривидового тинировання юолятов, установления их эпидемиологической и экологической значимости, а также выявления эволюционных взаимосвязей между штаммами из различных географических регионов. В этом аспекте большое значение имеет углубленное изучение отдельных биохимических и других свойств патогена, а также создание высоко информативной системы внутривидового типнрования, учитывающей как фенотипические свойства, так и свойства генома, отражающие результат генетической эволюции В. апЖгаЫз, Цель и задачи исследования

Цель исследований - определение информативности фенотипичеекцх и генетических маркеров и оценка их пригодности для выявления внутривидовых различий и дифференциации изолятов В. атНгаеЬ на основе комплексного изучения вирулентных и авирулентных изолятов возбудителя сибирской язвы, выделенных в различных регионах России.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить культурально-морфологические, биохимические, антигенные и патогенные свойства кал сулообразующнх и бескапсульных полевых изолятов возбудителя сибирской язвы, выделенных в различных регионах России, а также наиболее широко применяемых вакцинных штаммов;

- провести подбор качественных и полуколичественных тест-систем, позволяющих оценить экспрессию феиотипических признаков, связанных с проявлением патогенных свойств возбудителя, и с их помощью охарактеризовать исследуемые штаммы;

- разработать питательную среду для определения гемолитической активности В. аткгас'ч\

определить эффективность выявления генов капсул о* и токсинообразования методом ПЦР у полевых изолятов В. апЛгасЬ-,

выявить генетические различия между штаммами, выделенными в различных регионах РФ, и охарактеризовать их геномы методом RAPD-фингерпринта;

- оценить информативность генетических и фенотипических маркеров для проведения внутривидового типирования изолятов В. anthracis. Научная новизна работы

Впервые установлено, что В. anthracis экспрессирует два типа гемолизинов, вызывающих деградацию эритроцитов барана по а- или р-тнпу.

Разработана питательная среда — двухслойный кровяной агар, позволяющая проводить внутривидовую типизацию и дифференциацию изолятов возбудителя сибирской язвы, изучать гетерогенность популяций по морфологическим и гемолитическим свойствам, а также проводить клональный анализ.

Установлено, что со степенью вирулентности коррелирует выражение таких признаков хромосомной и плазмидной локализации, как тип гемолиза, протеолитическая, пигментсорбирующая активности и капсулообразование.

Произведен подбор праймеров и оптимизированы условия проведения RAPD-fingerprint, позволяющие выявлять геномный полиморфизм изолятов В. anthracis и определять их индивидуальные особенности.

Подана заявка .4? 263 от 18.03.03, иа изобретение «Способ определения гемолитической актив ности и ее тина у популяций н отдельных колониеобразующих единиц В. anthracis». Практическая значимость работы

Разработаны «Методические рекомендации по определению гемолитической активности и её типа отдельных колониеобразующих единиц В. anthracis». Методические рекомендации одобрены Ученым советом (протокол Ха 10 от 11 июня 2003 г.) и утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ.

Разработанные методы позволили провести паспортизацию полевых изолятов В. anthracis, выделенных в различных регионах РФ; они используются

в ГНУ ВНИИВВиМ при идентификации и дифференциации, паспортизации штаммов возбудителя сибирской язвы, в том числе и производственных вакцинных штаммов. Этот комплекс методов может применяться при предварительном отборе перспективных штаммов и клонов, изучении гетерогенности популяций и стабильности штаммов, а также при отборе клонов, обладающих меньшей реактогенностью при совершенствовании существующих вакцинных препаратов. Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ (2001-2003 гг.).

Материалы диссертации доложены на Международной научно-практической конференции «Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей» (г. Покров, 2002 г.), Международной конференции молодых ученых «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов» (Щелково, 2002 г.), IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (г, Москва, 2002 г.), Международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию института 24-26 сентября 2003 г. «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов» (г, Покров, 2003 г.) и представлены на 4-Й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003). Публикации

По материалам исследований опубликовано 11 научных работ, в т.ч. 2 статьи в центральных научных журналах. Личный вклад

Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В выполнении работы по разделам 3.3.2.6.,

s

3.3.3., 3,3.3.1., 3,3.3.2. оказывали практическую и консультативную помощь сотрудники ГНУ ВНИИВВиМ: Цыбанов С.Ж., Стрижаков АА,, Стрижакова О.М., Новиков Б.В., Дмитренко Н.В„ Пантюшенко М.С, Основные положения диссертационной работы, выносимые па защиту:

1. Штаммы и шоляты сибиреязвенного микроба обладают гемолитической активностью и экспрессируют экзотоксины различной природы, вызывающие лизис эритроцитов барана по а- или Р-тину.

2. Питательная среда для определения гемолитической активности и ее типа у В. anthracis.

3. Комплекс таких фенотапических маркеров, коррелирующих со степенью вирулентности, как капсуло- и токсинообразование in vitro, гемолитическая, протеолитическая, п нгментсорб ирующая активности, тип гемолиза и способность синтезировать протокатекуевую кислоту, позволяет выявлять различия между штаммами.

4. С использованием трех праймеров методом RAPD-fingerprinting выявляется геномный полиморфизм хромосомной ДНК штаммов возбудителя сибирской язвы, выделенных в различных регионах РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и приложения. Диссертация иллюстрирована 13 рисунками и 16 таблицами. Список литературы содержит 222 источников, в т.ч. 99 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ Q МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе были использованы 16 полевых изолятов Б. anthracis, выделенных в пространственно отдаленных друг от друга регионах -Белгородская, Оренбургская, Тамбовская, Липецкая области, Алтайский край, Республика Удмуртия, Северная Осетия (Республика Алания), и имеющих

общее территориальное происхождение, но различающихся по времени выделения — с 1949 по 2002 г.г., 8 широко известных вакцинных штаммов В. anthracis и спорообразуюшие сапрофита рода Bacillus: В. cereits .Ys№ 96,8035.

Культивирование микроорганизмов осуществляли в жидких и на плотных питательных средах,

Изучение кулыурально-морфологических, биологических свойств исследуемых культур микроорганизмов проводили в соответствии с "Методическими указаниями по лабораторной диагностике сибирской язвы у животных и людей и обнаружению возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения и объектах внешней среды" (1989),

Споры получали путем выращивания клеток на картофельном агаре при температуре (36±1)°С в течение 7 суток.

Фильтраты культурадьной среды штаммов В. anthracis получали путем выращивания клеток в М11Б или ДПС в течение 18 ч при температуре (Зб±1)"С. После осаждения клеток центрифугированием (3-4 тыс. об/мин, 10 мин), супернатант стерилизовали фильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм («Millípore», США). Стерильность определяли высевом фильтратов в объеме 0,5 см3 в жидкие и твердые питательные среды.

Гемолитическую активность сибиреязвенного микроба определяли согласно «Методическим указаниям ...» (1989), по способу Шевченко О.В. (1998) на 1,5%-ном L-arape, содержащем 5% взвеси эритроцитов, пятикратно отмытых ASE буфером, луночным способом по методу Цыганковой О.И. (1993) и на разработанной в ходе настоящего исследования среде для определения гемолитической активности и ее типа (СОГАТ).

Фосфатную активность у изолятов В, anthracis определяли на агаре СВК с добавлением 0,01% фенол фталеинфосфата в соответствии с инструкцией по применению,

Протеолитическую активность и синтез желтого пигмента определяли из однослойной казеиновой среде, а пигментсорбирующую активность на L-

агаре с добавлением конго красного до конечной концентрации 25 мг/мд (Шевченко О.В., 1999).

Леодтиназную активность штаммов тестировали на твердой питательной среде, содержащей 0,4% лецитина (Pomerantsev А.Р. et al., 1997).

Определение кансуло- и то кс инообразо вання при дифференциации штаммов по вирулентности in vitro проводили по оригинальной методике Еременко Е.И. на среде СОПЭК (1997).

Антигенную специфичность изучали в РП (по Асколи) и РДП (по Оухтерлони) с использованием преципитирующей сибиреязвенной сыворотки и у-глобулнна против сибирской язвы.

Вирулентность штаммов сибиреязвенного микроба определяли на аутбредных белых мышах (15-20 г). Значения LD50 вычисляли по модифицированному методу Кербера (Ашмарнн И.П., Воробьев A.A., 1962).

Выделение ДНК для проведения тишгровакия штаммов с помощью одно- (RAPD-fingerprinting) и двупраймерной ПЦР проводилось фенол ьно-детергентным методом. Для выявления pag- и cap-генов использовали праймеры, рекомендованные МЭБ. Отжиг праймеров осуществляли при 55°С. Для RAPD-анализа применяли универсальные праймеры размером 10-20 нуклеотидов, отжиг которых проводили в мягких температурных условиях. Фрагменты 11ЦР анализировались в 1,5-2%-ных агарозных гелях в присутствии маркерной ДНК фага X, расщепленной по EcoRI-Hindlll сайтам рестрикции.

Анализ и статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами, используемыми в биологии (Лакин Г.Ф., 1990). Коррелятивную зависимость между признаками определяли с использованием пакета прикладных программ Statgraphics (версия 2.1.) и путем подсчета коэффициента корреляции рангов Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Общая характеристика и биологические свойства штаммов В. аШЬгасЬ.

Первый этап настоящего исследования был посвящен изучению полевых изолятов по общепринятым в лабораторной практике методам идентификации и дифференциации вида. Установлено, что все культуры .микроорганизмов таксономически являлись возбудителем сибирской язвы с незначительной вариабельностью по некоторым признакам, б из 16 исследованных изолятов были атипичны по признаку капсулообразования, 1 изолят был не чувствителен к пенициллину в тесте «жемчужного ожерелья», а 3 не обладали лизабельностью бактериофагами К-ВИЭВ, у-МВА, но обладали слабой фагочувствительностью к ^аА-ВНИИВВиМ. Протеолитической активностью обладали 8 из 1б-ти штаммов - очень медленно и слабо разжижали свёрнутую лошадиную сыворотку. Пять изолятов обладали термотолерантностью.

Таким образом, для большинства изолятов уровень сходства по 11-ти тестам находился в пределах от 91 до 73%. У 5 штаммов уровень сходства составил 100%, т.е. общепринятые лабораторные тесты пригодны для определения таксономической принадлежности исследуемых культур к виду В. аШНгасй, но не позволяют выявлять межштаммовые различия.

2. Изучение фенотипических свойств.

На следующем этапе для получения более объективных данных о фенотипических свойствах изолятов, нами были подобран комплекс методов, позволяющих проводить количественную и качественную оценку проявления ряда признаков, связываемых с патогенностью возбудителя.

Считается, что такие экзофермеиты, как ДНК-аза, фосфатаза, гемолизин и др., не дают возможности секреторным IgA элиминировать возбудитель па начальном этапе воспаления. Кроме того, фосфатазы принимают активное участие в метаболизме бактерий как катализаторы при гидролизе эфиров фосфорной кислоты. По данным Груз Е.В. (1965) и 1уапоУ1С5 в, (1958) тест на

щелочную фосфатазу позволял различать высоко- и слабовирулентные штаммы, хотя и отмечалось непостоянство данного признака. При проверке штаммов на среде для выделения и культивирования сибиреязвенного .микроба разного производства, предназначенной для дифференциации В. anthracis по признаку фосфатазной активности (Еременко Е.И., 1997), получены неоднозначные результаты. Установлено, что на среде Ставропольского Ш1ГТЧИ 71 % изученных штаммов (17 из 24 штаммов) давали отрицательный тест на щелочную фосфатазу, б изолятов (среди которых 4 капсульных) продуцировали энзим на одном или чуть ниже уровне с близкородственными представителями рода Bacillus. На среде производства ГНЦПМ (Оболенск) вакцинные штаммы а бескалсульные полевые изоляты по этому признаку были трудноотличимы от близкородственных сапрофитов. Из 10 высоковирулентных изолятов (LDioo для белых мышей ЮЧО1 спор) б не вырабатывали щелочную фосфатазу или же синтезировали ее на очень низком уровне (Pho"), а 4 изолята не отличались по продукции фермента от бескапсульных (Pho*). Таким образом, признак фосфатазной активности не является надежным не только для внутривидового тонирования В. anthracis, но и для дифференциации их от близкородственных сапрофитов.

О ферментах пигментсорбци», ассоциируемых с вирулентностью микроорганизмов (Sh. flexneri, V. cholerac, Е. coli, N. meningitides, Y. pestis и др.) и подробно охарактеризованных для многих видов бактерий, в отношении возбудителя сибирской язвы в печати приводятся лишь отрывочные сведения (Микшис Н.И. с соавт., ] 999). Нами при изучении способности штаммами возбудителя сибирской язвы сорбировать красители из среды было установлено, что культуры вирулентных штаммов обладают высокой активностью пигментсорбирующнх ферментов (CR*)» а бескапсульные изоляты и вакцинные штаммы - либо низкой активностью, либо ее отсутствием (CR').

Признак отсутствия гемолитической активности у сибиреязвенного микроба до настоящего времени считается классическим и используется как дополнительный тест при идентификации и дифференциации В. anthracis от

близкородственных сапрофитов. Однако результаты ряда исследователей свидетельствуют о возможности некоторых сибиреязвенных культур экспрессировать экзотоксины, вызывающие деструктивные изменения эритроцитов (Езепчук Ю.В. и др., 1969; Leppla S.H., 1988; Цыганкова О,И., 1993; Шевченко О.В., 1999). Для получения более объективных данных об этом признаке была проведена сравнительная оценка сред (классический кровяной агар, модифицированный кровяной агар по Шевченко О.В. и луночный метод Цыганковой О. И.), ранее предложенных для выявления гемолизинов. Результаты исследований показали, что испытанные методы либо не обладают достаточной чувствительностью, либо трудоемки и не пригодны для работы с патогенными изолятами. Поэтому для тестирования гемолитической активности нами был разработан кровяной агар, прототипом которого послужил двухслойный кровяной агар Цыганковой О.И. (1993). При разработке среды был произведен подбор соотношения компонентов в двухслойном кровяном агаре, питательной основы покрывного слоя агара, процентного содержания эритроцитов, способа их обработки и условий постановки реакции. Вновь разработанная среда СОГАТ обладала более высокой чувствительностью и эффективностью выявления гемолитической активности сибиреязвенного микроба и позволяла определять не только уровень гемолитической активности у эпизоотических изолзггов В. anthracis, но и её тип через 24-48 часов инкубирования, В результате изучения исследуемых изолятов и штаммов установлено, что все калсульные изоляты, за исключением штаммов второй вакцины Ценковского, облазали способностью вызывать и-гемолиз {«-Шу), тогда как бескапсульные изоляты и вакцинные штаммы л из про вал и эритроциты по р-типу (р-HIy). Уровень экспрессии гемолизинов в обеих группах изолятов варьировал (табл.1): у 4 изолятов отмечали высокий уровень (Н1у+"), у 8 — средний (Hly**) и 4 изолята характеризовались низкой гемолитической активностью (Н1у*). Среди вакцинных штаммов наивысшая гемолитическая активность наблюдалась у культур СТО, штаммов второй вакцины Ценковского и 34F^, наименьшая у штаммов Ихтиман и Sterne, причем

последние три штамма вызывали лизис эритроцитов по а-типу. То есть, использование признака гемолитической активности как маркера позволяет разделить изоляты на группы по способности лидировать эритроциты по а- или р-типу и но уровню экспрессии гемолизинов,

Таблица 1

Определение уровня гемолитической, протеолити ческой и лецитииазной активности В. атИга^

п=3

Ж п/п Наименование штамма Гемол кигческая активность Протеолшкческ&я активность Лецитиназаая активность

Tint темолиза Уровень Синтез пигмента Уровень Пит. агар (ШтюНа) Агар Хоггиигера

1. 55- ВНИИВВиМ Р Средний - Низкий Низкий Низкий

2. ста в Высокий [ Низкий Средний Средний

3. СТИ-1 в Средний | Низкий Низкий Низкий

4. 34Fi а Высокий | + Высокий - Низкий

5. Sterne ' а Низкий | -г Высокий Низкий Низкий

б. Ихтиман а Низкий [ Высокий | Низкий

7. M 71. 0 Высокий | Высокий ) Высокий Высокий

8. 71/12 0 Высокий | Высокий Высокий Высокий

9. 51 а Низкий [ Высокий - Низкий

10. 76 а Средний [ 4- Высокий - Низкий

11. 267 а Средний - Средний - -

12. 268 а Высокий - Средний •

13. 275 _ Р Средний | Низкий Низкий Низкий

14. 283 а Средний ) + Средний Низкий Низкий

15. 294 а Средний - Средний - Низкий

16. 297 В Низкий - Низкий Низкий Низкий

17. 298 В Высокий - Низкий Низкий Низкий

18. 307 в Высокий - Низкий - Низкий

19. 308 а Низкий - Высокий - Низкий

20. 320 | В Высокий - Средний Средний Средний

21. 327 1 В Средний - Средний Средний Средний

22. 347 а Низкий + Высокий - Низкий

23. 348 а Средний - Средний - -

24J349 1 а Средний - Высокий - Низкий

Гак как в характере роста на СОГАГ культур В, anthracis (локальный рост) и близкородственных сапрофитов (ползучий рост) имеются значительные отличия, среда может быть использована в качестве дифференциально-диагностической .

В связи с выявлением у возбудителя сибирской язвы гемолизинов двух типов представляло интерес изучение ингибирующего действия на а- и (Î-гемолизины сывороток крови животных и препаратов на ее основе, содержащих противосибиреязвенные антитела. Установлено, что сывороточные препараты ингибируют активность (3-гемолизнноь и не влияют на способность а-гемолизинов вызывать лизис эритроцитов барана.

Учитывая, что для вирулентных культур возбудителя сибирской язвы характерен высокий уровень протеолиза нами было проведено изучение протеолитической активности сибиреязвенных культур на казеиновой среде, применяемой некоторыми авторами для изучения гетерогенности популяций по данному признаку. Исследования показали, что бескапсульные полевые изоляты и вакцинные штаммы 55-ВНИИВВиМ, СТИ, СТИ-1 обладают низким уровнем экспрессии лротеаз (Prt*)- Лишь у двух штаммов уровень продукции протеолитических ферментов граничил со средним (табл.1). Среди капсульных вирулентных изолятов 5 обладали высоким уровнем экспрессии протеаз (Pit"') и 5 — средним (РгГ). Вакцинные бескапсульные штаммы 34F;, Ихтиман и Sterne, а также капсульиыс штаммы второй вакцины Ценковского обладали высоким уровнем экспрессии лротеаз.

Считается, что сибиреязвенные культуры с выраженной активностью протеолитических ферментов способны синтезировать желтый пигмент -пратокатекуевую кислоту, который некоторыми исследователями отнесен к группе факторов патогснности данного возбудителя (Koehler Т,М. et al., 1992; Микшис Н.И. и др., 1999). Нами при изучении способности штаммами синтезировать желтый пигмент получены неоднозначные результаты (табл.1). Во-первых, признак продукции протокатекуевой кислоты на казеиновой среде обнаруживался не постоянно. Во-вторых, способностью к синтезу желтого

пигмента обладало лишь 3 капсульных изолята и 3 вакцинных штамма с высоким и средним уровнем продукции протеаз (Ydp'). Характерной особенностью этих штаммов являлось то, что они синтезировали а-гемолизины. Штаммы с низким и пограничным уровнем экспрессии протеаз пигмента не синтезировали (Ytlp").

В формировании местных реакций организма в ответ па внедрение возбудителя, помимо гемолизинов, протеаз, принимает участие и лецитиназа, В связи с низкой чувствительностью плотных и жидких лично-желточных сред Дрожжевкиной в наших исследованиях лецитиназную активность изолятов определяли на твердых средах с добавлением в качестве субстрата лецитина (0,494). Для агаризованной основы использовали питательный агар (Himedia) и агар Хотгингера. При сравнительной оценке лецитиназной активности сибиреязвенных культур на средах с разной питательной основой установлено, что при использовании агара Хоттингера лецитиназная активность выявляется в 87,5% случаев, тогда как на питательном агаре производства Himedia - в 50% (табл.1). Большинство штаммов (16 из 24) обладали низким уровнем продукции лешшшазы (Lee*), три - средним (Lee"") и два шгамма - высоким уровнем (Lee**4). У 3-х капсульных изолятов 267, 268, 348), лецитиназная

активность не регистрировалась.

Качественную оценку продукции изолятами основных факторов патогенности сибиреязвенного микроба проводили на среде для определения продукции экзотоксина и капсулообразования (СОПЭК), разработанной в Ставропольском НИПЧИ. Из исследуемых 8 вакцинных штаммов, 16 полевых изолятов В. anthracis все калсульные штаммы, за исключением одного (Ха 51), образовывали колонии SM-формы со слизистым капсульным веществом на поверхности (Сар"). Бескапсульные штаммы образовывали колонии R-формы (Сар'). У вакцинных штаммов 55-ВНИИВВиМ, СТИ, Sterne, Ихтиман и 13 полевых изолятов вокруг колоний формировалось от 1 до 3-х четких линий преципитации, свидетельствующих о выработке токсина (Тох+) (табл. 2). У штаммов СТИ-1, второй вакцины Ценковского линии преципитации были

трудно различимы, вследствие слияния их с краем колонии. У штамма 34F; в трех повторностях опыта роста культуры не наблюдали. Культуры 3-х капсульных штаммов 267,268,348) линий преципитации ие формировали (Тох*), причем данное свойство не было связано с утратой плазмиды рХО! и снижением вирулентности для белых мышей (LDjo для белых мышей 6-15 спор). Наличие генов токсино- и капсулообразования подтверждали методом ПЦР с использованием праймеров, комплементарных последовательностям pag- if cap-генов. Причем на матрице ДНК штаммов ЛЪУ» 267, 268, 348 получены специфические ПЦР-продукты крод-гену, а штамма №51 к си/5-гену.

Учитывая важную роль протекпшного антигена (ПА) в патогенезе сибирской язвы и в формировании противосибнреязвеиного иммунитета, а также низкую чувствительность РИД в отношении оценки уровня токсинообразования, нами были проведены эксперименты по сравнительной оценке продукции протектшэного антигена in vitro с использованием моноклональных антител (МАТ) к ПА. Так как признак токсинообразования, по мнению большинства исследователей, находится под контролем индуцпбельного промотора, культивирование вакцинных штаммов проводили на средах без добавления и с добавлением индукторов роста и синтеза ПЛ.

В результате исследований установлено, что разные вакцинные штаммы в значительной степени отличаются по способности экспрессировать ПА in vitro (табл.2). Так, у штаммов 55-ВНИИВВиМ и Ихтимап ПА экспрессировался только на среде ДПС. При добавлении карбоната натрия к МПБ количество ПА, продуцируемого штаммом СТИ, увеличивалось, в то время как его добавление к ДПС 1шгибировало синтез. Для штаммов второй вакцины Ценковского наблюдалась обратная картина: добавление карбоната натрия к МПБ ингибирокало синтез ПА, а добавление к ДПС — стимулировало. Штамм СТИ-1 не синтезировал токсин ни в МПБ, ни на среде ДПС. При исследовании фильтратов культур вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ, выращиваемых глубинным способом с интенсивной аэрацией, установлено, что уровень

протективного антигена в них через 18 часов культивирования составлял 1/256 и выше.

Таблица 2

Сравнительная оценка экспрессии ПА вакцинными штаммами В. аМкгаш

№ к/я Наименование штамма РИД1 СОПЭ1С ТФИФА {титр ПА)

МЛБ ДПС

без индукторов с индукторами без индукторов с индукторами

1. 55- ВНИИВВиМ - 3 - - 1/2 (1/320)* 1/4

2. СТО 1 + 3 1/256 1/256 и > 1/8 -

3. СТИ-1 1 - 1 • н.и. - н.и.

4. Sterne I 3 1/256 н.и. t/B нл.

5. 34Fj | - - - н.и. 1/4 1 1/32

6. Ихтиман 1 1 • н.и. 1/8 н.и.

7. М 71 1 - 1 1/256 и > - - 1/12S

8. 71/12 1 - 1 1/256 и > - - 1/128

Примечание: 1- наличие линий преципитации, соответствующих ПА;

2 - количество линий преципитации; н.и. - не исследовали; - - ПА не обнаружен.

* - титр ПА при глубинном культивировании.

Тагам образом, продукция ПА штаммом 55-ВНИИВВиМ лишь в незначительной степени стимулировалась добавлением в питательную среду индукторов его синтеза (титр в ТФИФА 1/4) и в тоже время не ингибировалась, а значительно стимулировалась свободным кислородом воздуха (титр 1/256 и выше). Это является свидетельством того, что в геноме В. anthratis имеются локусы, регулирующие на уровне транскрипции как СОз-зависимую, так и С02-незавнсимую продукцию компонентов токсина.

С учетом предполагаемой взаимосвязи комплекса изученных признаков В. anthracis с патогенностью нами был определен уровень вирулентности изолятов (LDjoo и LDjo) для белых мышей (табл. 3). При сопоставлении результатов дифференциации изолятов по вирулентности in vivo (Шляхов Э.Н., Груз Е.В., 1978) и in vitro (Еременко Е.И., 1997) для большинства капсульных и бескапсульных изолятов, а также вакцинных штаммов распределение по

группам в обеих классификациях было либо одинаковым, либо с незначительным отклонением. Несоответствие в определении уровня вирулентности отмечено для 4 штаммов Л?№ 51, 267, 268 и 348, у которых па СОПЭК не тестировались либо капсуло-, либо токсинообразование (табл.3).

Таким образом, при исследовании фенотипических признаков с использованием более чувствительных тест-систем установлено, что изученные изоляты возбудителя сибирской язвы, выделенные в различных географических зонах, имеют существенные различия в их проявлении. Вследствие не постоянства таких признаков, как фосфзтазная активность и способность синтезировать протокатекуевую кислоту, они не пригодны для определения межштаммовых различий. Такие маркеры, как способность к капсуло- и токсинообразованию in vitro, лецитиназная, гемолитическая и иротеолитическая активности, могут быть использованы при внутривидовом типировании изолятов, паспортизации штаммов, изучении популяционной гетерогенности, отборе штаммов и клонов, перспективных для создания диагностических препаратов и средств специфической профилактики.

Корреляционным анализом с использованием как параметрических, так и непараметрических показателей установлено, что с изменением степени вирулентности штаммов В, anihracis коррелирует выражение таких признаков, как капсулообразование, тип гемолиза» протеолитическая и пигментсорбирующая активности. Полученные значения коэффициентов корреляции находятся в интервале между 0,69 и 0,95 (с вероятностно корреляции 99%), что соответствует значительной степени взаимосвязи между этими характеристиками сибиреязвенного микроба. Взаимосвязь протеолитической активности и вирулентности носит экспоненциальный характер и обнаружение высокой протеолитической активности у исследуемых сибиреязвенных изолятов с 96 %-ноЙ вероятностью позволяет отнести их к вирулентным.

Таблица 3

Дифференциация эпизоотических штаммов В, anthracis ио степени вирулентности in vivo и in vitro.

№п/п Наименование Дифференциация in vitro по феишииу калсуло- и Дифференциация in vivo по дотам, втываюидш

штамма юксипообратоБзшщ гибель белых беспородных мышей

Продукция на СОПЭК Оценка наюгенносга Величина Оценка иэтогегаюсги

в атмосфере CO¡ ш»

капсулы токсина (кол-во КОЕ)

1. №51 - -И А вирулентный 53 Ум ерешювирулентиы й

2. №76 + ч* В ысоковнрулентный 5 ВысоковирулеитныЙ

3. №267 + - Умерен! ювирул ei m ш К 15 Вирулатгий

4. №268 + - Ум ереш ювирул ентный 10 Вирулентный

5. №275 - АвИруЛМПНЫЙ 2,54x10е" Лв:фуле1Пный

6. №283 + + I) ысоковкрула ггны й 12 Вирулентный

7, №294 + + Высоковируленгш j и 20 Вирулентный

8. №297 - Авирулеипшй 2,59x10* АвирулентныЙ

9, №298 - + Авирулеипшй 1,57x10" Лвнрулентный

10. №307 - -t-f Авирулеипшй а>10' Авнрулетиий

П. №308 + + Выеоковврул ei m Й 24 У мера щопнрулекп шн

12. №320 - + Авнруленпшй *107 Авирулентный

13. №327 - ft Авируленншй 1,19x10" А вирулентный

14. №347 -t А Высоковиру. iei m i ы й 13 Вирулентный

15. №348 + - Умерен новирула шш й 6 Buco ков ируленп i и й

16. №349 + + В ысоковирул ешный 6 В и соковкрулеитиы й

Примечание: 4* - линия преципитации выходит та край колошш менее 0,1 см; + - лилия преципитации выходит за край колони» евшее, чем на 0,1 см.

3. Молекул я рно-генетнческне исследования штаммов В. ап^гат.

На следующем этапе для выявления межштаммовых различий методом КАРО-йгщегрпп т^ нами был произведен подбор универсальных праймеров и с их помощью исследован геномный полиморфизм 10 полевых изолятов, выделенных в различных регионах РФ.

Предварительные исследования показали, что три (1А, £45, С13) из 14-ти испытанных универсальных праймеров позволяли получать КАРО-профили с 4-13 мажорными и минорными фрагментами ДНК. ИАРП-профили исследованных изолятов имели как обшие, так и индивидуальные фрагменты, число которых у разных штаммов варьироваю (рис.1).

п я. 1904 на. 1384 па . 1375 П.В

947 пи '

8)1 пк

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Т тТт 1з^г,™

V - ^ - ^ «т

■ • ^ - ж^Ь'я'г «а

Рис. 1, Результаты ИАРО—Пп£етргт1ш£ полевых изолятов возбудителя сибирской язвы с универсальным праймером Е45:

1 -№ 51; 2 - № 275; 3 - №283; 4 - №294; 5 - №297; б - №298; 7 - №307; 8 - № 308; 9 -В. сегеи$№8035; 10-№304; 11-№327,

Анализ ИАРВ-профилеЙ с тремя универсальными проймерами позволил установить идентичность распределения ПЦР-продуктов бескапсул ьных штаммов 275 и 298, выделенных в Оренбургской области и Алтайском крае, и отличие остальных штаммов друг от друга наличием или отсутствием 24 фрагментов. Два из изученных нами штаммов (№№ 294 и 308) с одним из

праймеров (1 А) и три 304,308 и 327) с двумя проймерами, выделенные в Белгородской области, Алтайском крае и республике Удмуртия, формировали уникальные генотипы, характеризующиеся отличным от остальных штаммов набором фрагментов.

Таким образом, подобранные праймеры позволили выявить сходство и отличительные черты геномов изученных изолятов возбудителя сибирской язвы. Обнаруженные в данном исследовании различия являются индивидуальными генетическими характеристиками изолятов и могут быть использованы при определении их филогенетического родства.

ВЫВОДЫ

1. Определена информативность фенотипических и генетических маркеров В. ггжАгяс&.

2. Разработаны питательная среда, основанная на радиальной диффузии гемолизинов в двухслойный кровяной агар, и способ определения гемолитической активности и ее типа у В. аМкгасЬ, Среда пригодна для проведения массового скрининга популяций штаммов возбудителя сибирской язвы по данному признаку, клонального анализа при постановке экспериментов, направленных на идентификацию детерминант, кодирующих синтез гемолитически активных белков, а также для отбора вариантов, обладающих необходимыми свойствами, при поиске новых перспективных штаммов для производства вакцинных и диагностических препаратов.

3. Штаммы возбудителя сибирской язвы обладают гемолитической активностью по отношению к эритроцитам барана. Изученные вирулентные штаммы вызывают лизис эритроцитов барана по а-типу, а бескалсульные полевые изоляты и вакцинные штаммы, за исключением 34Р;, £1ете, Ихтимаи - по Р-типу.

4. Нормальная сыворотка крови животных, преципитирующая сибиреязвенная сыворотка и гамма-глобулин обладают выраженным

ингибирующим действием на ¡3-гемолизины и не влияют на способность ct-гемолизинов вызывать лизис эритроцитов.

5. Оценку способности изолятов к капсуло- и токсинообразованню in vatro, гемолитической, протеолитической и лецнтиназной активности с использованием таких сред, как СОПЭК, СОГАТ, казеинового агара и агара с 0,4% лецитина следует учитывать при паспортизации штаммов, изучении популяшюнной гетерогенности, отборе штаммов и клонов, перспективных для создания диагностических препаратов и средств специфической профилактики,

6. Результаты изучения экспрессии протективного антигена штаммами В. anthracis свидетельствуют о том, что регуляция его синтеза может быть как COi-зависимой, так и СО?- независимой.

7. Выявлена положительная корреляция степени вирулентности штаммов В. anthracis с калсулообразованием, типом гемолиза, протеолитической и пигментсорбнрующей активностями (коэффициент корреляции 0.95,0,86, 0.69 и 0.76 соответственно при уровне достоверности 99 %).

8. Методом RAPD-fingerprinting с использованием трех (1А, Н45, С13) универсальных праймеров выявлен геномный полиморфизм полевых изолятов возбудителя сибирской язвы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по определению гемолитической активности и её типа отдельных колониеобразуютих единиц В. anthraci$>\ утвержденные директором ВНИИВВиМ 11.06.2003 г., которые могут быть использованы для изучения популяционной гетерогенности, дополнительной паспортизации штаммов, отборе штаммов и клонов, перспективных как вакцинные.

Подобранные универсальные праймеры для однопраймерной ППР могут быть использованы для выявления геномного полиморфизма В. anthracis и определения филогенетического родства сибиреязвенных культур.

Составлены паспорта на 16 полевых изолятов В. anthracis, выделенных в различных регионах РФ (в Приложении представлены паспорта на три нзолята, поступивших в музей ГНУ ВНИИВБиМ в 2002 г.).

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО

МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Егорова I1JO,, Селянинов Ю.О. Некоторые бнолого-экологические аспекты значения атипичных штаммов В. anthracis // Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патолога и сельскохозяйственных животных и людей: Материалы Международной научно-практической конференции 16-18 апреля 2002 г. -Покров, 2002. - С, 238-240.

2. Экспериментальная оценка эффективности ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец / Селянинов Ю.О., Балышев В.М., Косяченко Н.С., Егорова И.Ю. // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук - 2002. - -Ys 4. - С. 52-54.

3. Архипова Г.Ф., Селянинов Ю.О., Егорова И.Ю. Слияние протопластов как метод обмена генетической информацией внутри рода Bacillus // Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и нх роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей: Материалы Международной научно-практической конференции 16-18 апреля 2002 г. - Покров, 2002. - С. 240-243.

4. Селянинов Ю.О., Егорова И.Ю., Стрижаков A.A. Оценка экспрессии протективного антигена штаммами Ä anthracis с использованием моноклональных антител И Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов: Сборник докладов Международной конференции молодых ученых, 5-6 декабря 2002 г. - Щелково, 2002. - С. 144-147.

5. Егорова И.Ю., Селянинов Ю.О., Пантюшенко М.С. Изучение фенотипических и генетических свойств изолятов возбудителя сибирской язвы, выделенных на территории Алтайского края // Генодиагностика инфекционных заболеваний: Сборник тезисов 4-й Всероссийской научно-практической конференции, 22-24 октября 2002 г. - Москва, 2002. - С. 334-337.

6. Изучение изолятов возбудителя сибирской язвы, выделенных на территории Алтайского края / Егорова HJO., Селянинов Ю.О,, Барышников П.И., Федорова Г.А. // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонсизов: Труды международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию института, 24-26 сентября 2003 г. -Покров - 2003. - Ч. 1. - С. 122 - 126.

7. Селянинов Ю.О., Егорова И.Ю. Изучение гемолитической и ггрогеолитической активности у вакцинных штаммов В. anthracis // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: Труды

международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию института, 24-26 сентября 2003 г. - Покров - 2003, - Ч. 1. - С. 212216.

8. Егорова И.Ю., Селянинов Ю.О. Сравнительное изучение фенотнпических характеристик эпизоотических штаммов В. anthracis Я Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: Труды Международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию института, 24-26 сентября 2003 г. - Покров -2003.-Ч. 1. - С. 216-221.

9. Селянинов Ю.О., Егорова И.Ю., Стрижаков A.A. Оценка экспрессии протективного антигена вакцинными штаммами Bacillus anthracis И Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: Труды Международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию института, 24-26 сентября 2003 г. - Покров - 2003. - Ч. 1. - С. 227232.

10. Селянинов Ю.О., Егорова И.Ю., Стрижаков A.A. Сравнительное изучение методов опенки экспрессии протективного антигена В. anthracis И Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней: Материалы 4-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ, 30сентября-2 октября 2003 г. — Саратов. - 2003. - С. 164-167.

11. Селянинов Ю.О., Егорова И.Ю. Оценка гемолитической активности вакцинных штаммов возбудителя сибирской язвы // Сельскохозяйственная биология-2003. - Hi 6. -С. 114- 119.

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ, г.Покров, Владимирской обл. Тираж 70 экз.

2B7ü