Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Характеристика гуморальных факторов противовирусного иммунитета у собак в процессе поствакцинального иммуногенеза

На правах рукописи

БОРЗЕНКО ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА ГУМОРАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ ПРОТИВОВИРУСНОГО ИММУНИТЕТА У СОБАК В ПРОЦЕССЕ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНОГЕНЕЗА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005 г.

Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко)

Научный руководитель:

доктор биологических наук ВЕРХОВСКИЙ ОЛЕГ АНАТОЛЬЕВИЧ

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор УЛАСОВ ВАЛЕНТИН ИЛЬИЧ

кандидат биологических наук МНИКОВА ЛИДИЯ АЛЕКСЕЕВНА

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский и

технологический институт биологической промышленности (ВНИТИБП)

Защита диссертации состоится 14 сентября 2005 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.006.033.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко по адресу:

109428, г. Москва, Рязанский проспект, 24/1, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко Автореферат разослан « « ^ _2005 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор ветеринарных наук,

профессор ------77 Н.П.Овдиенко

Л 05 %

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В разработке методов диагностики и средств специфической профилактики болезней животных основополагающая роль принадлежит иммунологии - науке, изучающей механизмы формирования иммунного ответа, иммунологической памяти и межклеточной кооперации лимфоцитов и базирующейся на современных представлениях об эффектор-ных механизмах иммунитета, среди которых главное место занимает взаимодействие антиген-антитело (J.E Barlough and N.C.Pedersen, 1995; L.J.Gershwin et al, 1995; N.T. Gorman, 1995; Ю.Н.Федоров, О.А.Верховский, 1998, 2000 и др.). При этом важную роль в оценке иммунологического состояния организма на различных этапах онто- и иммуногенеза, обусловленного процессами, возникающими в организме животных в ответ на иммуно-гены различной этиологии, играет анализ гуморальных факторов иммунного ответа.

Несмотря на то, что к настоящему времени опубликован ряд работ oie-чественных и зарубежных авторов, посвященных изучению иммунного статуса собак в норме и при патологи (О.А.Верховский с соавт. 1996, 1998 А.А.Лисицина, 1997; М.В.Даниловский, 2000; А.Д,Середа с соавт., 2000 М.В.Мезенцева с соавт., 2001; И.В.Чуваев, 2001; T.R.Phillips et al., 1989 T.Miyamoto et al., 1995; G.Mazza et al., 1994; P.B.Hill et al., 1995; A.Tipold et al., 2001; C.Leandro ct al., 2001; A.Strasser et al., 1998, 2000, 2003; D.E.Mou?in et al., 2004 и др.) остаются неосвещенными многие вопросы, связанные с изучением структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов собак, изменением уровня иммуноглобулинов и изотип-специфических антител в процессе постинфекционного и поствакцинального иммуногенеза. Кроме того, отсутствие отечественных тест-систем, предназначенных для оценки характера иммунного ответа и иммунологического статуса собак, сдерживает научные исследования, направленные на разработку и эффективное применение средств иммунокоррекции и иммунопрофилактики.

В настоящее время это особенно актуально, поскольку насчитывается большое количество иммунобиологических препаратов, находящихся в производстве и используемых практической ветеринарной службой России. К ним относятся, прежде всего, отечественные и зарубежные вакцины против основных вирусных болезней собак, включающих чуму, парвовирусный энтерит, инфекционный гепатит и аденовироз. Эти болезни занимают ведущее место в структуре инфекционной патологии собак, представляют наибольшую опасность и часто заканчиваются гибелью животных или оставляют в их организме длительные, а иногда и необратимые повреждения органов и тканей (В.И.Уласов, Л.В.Кириллов, 1999). В большинстве стран мира вакци-нопрофилактика является важнейшим звеном в системе мер борьбы и самым эффективным методом эпизоотического контроля за этими болезнями. Повсеместное применение вакцин накладывает жесткие Шгбования к их производству и методам биологического контроля. СжжнЦ'этиологии

структура инфекционных болезней собак, широкое их распространение и необходимость вакцинации животных одновременно против нескольких наиболее распространенных болезней, обуславливают разработку и применение эффективных поливалентных вакцин, обеспечивающих формирование напряженного иммунитета (D.H.Davies, S.Pidford, 1991; J.A.Roth, 1991; R.D. Schultz, 1998; L.E.Carmichael, 1999 и др.). При этом необходимо решить сложные задачи по конструированию таких препаратов из антигенов различной природы, учитывая возможность их интерференции в организме животных в процессе иммуногенеза. Кроме того, создание поливалентных вакцин требует наличия методов контроля антигенных и иммуногенных свойств каждого компонента вакцины с использованием чувствительных и специфичных тест-систем.

В этой связи анализ гуморального иммунного ответа на основе оценки изотип-специфического распределения антител и количественного определения уровня иммуноглобулинов позволяет изучить динамику появления, нарастания и длительности сохранения поствакцинальных антител, что является основным показателем антигенной активности вакцины (А.В.Васильев, 2000; G.L.McMillen et al„ 1995; A.Pratelli et al„ 2000 и др.).

Поэтому вопросы, связанные с разработкой и совершенствованием аналитических методов иммуноанализа на основе поли- и моноклональных антител, также как и с их использованием для изучения поствакцинального гуморального иммунного ответа у собак, являются весьма актуальными и представляют значительный интерес, как в научном, так и в практическом аспектах. Результаты подобных исследований будут иметь не только прикладное значение, но и представлять значительный интерес для ветеринарной науки в целом, способствуя дальнейшему изучению инфекционных болезней и иммунной регуляции у собак.

Цель работы. Характеристика гуморальных факторов противовирусного иммунитета у собак в процессе поствакцинального иммуногенеза.

Основные задачи исследований:

1. Отработать методику постановки, условий проведения и учета результатов реакции иммуноферментных тест-систем (ИФА), предназначенных для выявления изотип-специфических антител к парвовирусу (CPV-2) и аденовирусам собак (CAV-1 и CAV-2) в сыворотке крови животных.

2. Провести сравнительное изучение диагностической ценности традиционных серологических методов и отработанных тест-систем на основе непрямого твердофазного ИФА при оценке антигенной активности вирусных антигенов, входящих в состав отечественных поливалентных вакцин используемых для профилактики инфекционных болезней собак.

3. Изучить динамику формирования В- клеточного иммунного ответа у щенков, вакцинированных отечественными биопрепаратами. Для этого провести исследования, направленные на оценку изотип-специфического распределения антител и количественное определение уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови собак в процессе поствакцинального иммуногенеза.

4. Изучить взаимосвязь между концентрацией иммуноглобулинов и титром противовирусных специфических антител соответствующего изотипа в сыворотке крови иммунных щенков.

Научная новизна работы.

Отработаны чувствительные и специфичные методы непрямого твердофазного ИФА, предназначенные для выявления IgG- и IgM- специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак в сыворотке крови животных. С использованием разноплановых методов (РИД, ИФА, РН, РНГА, РТГА, гематологические методы) впервые проведены комплексные исследования по изучению динамики формирования иммунного ответа на вирусные антигены различной природы. Получены новые данные о количественных изменениях IgG, IgM, IgA и динамике титров вирусспецифических IgG-и IgM- антител в сыворотке крови подопытных щенков на отдельных этапах поствакцинального иммуногенеза.

Впервые проведены сравнительные исследования и установлена высокая корреляционная связь между концентрацией IgG, IgM и титром противовирусных IgG-, IgM- специфических антител в сыворотке крови иммунных щенков.

На основании сравнительных исследований подтверждены некоторые закономерности изменений гуморальных факторов противовирусного иммунитета у собак и показана ведущая роль IgG и вирусспецифических IgG-ан-тител в процессе формирования поствакцинального иммунного ответа.

Практическая значимость исследований.

Методы непрямого твердофазного ИФА целесообразно использовать для оценки напряженности иммунитета, определения содержания материнских антител у щенков с целью корректировки сроков первой вакцинации, а также в качестве методов контроля антигенной активности соответствующих компонентов моно- и поливалентных вакцин. Кроме того, данные тест-системы могут служить дополнительным методом исследований в системе комплексной диагностики парвовирусного энтерита, инфекционного гепатита и аденовироза собак.

Полученные результаты являются основой для дальнейших исследований по изучению механизмов и закономерностей формирования постинфекционного и поствакциналыюго противовирусного иммунитета у собак.

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защшу следующие основные положения:

• результаты экспериментов по отработке ИФА для выявления изотип-специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак;

• результаты комплексных исследований по изучению динамики формирования гуморального иммунного ответа у щенков в процессе поствакцинального иммуногенеза.

Апробация работы. Основные положения диссертационной рабош доложены на:

• Научно- практической конференции «Новые фармакологические средства для животноводства и ветеринарии», Краснодар, 2001;

• IV региональной конференции посвященной проблемам профилактики и лечения домашних животных и птицы, Владимир, 2001;

• Межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, Москва, 2005

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре научные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 125 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка цитированной литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 8 таблицами и 10 рисунками. Список литературы включает 140 источников (30 отечественных и 110 зарубежных авторов).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в 1998-2002 гг. в лабораюрии иммунологии и биотехнологии ВИЭВ. Опыты на щенках проводили в клинике ВИЭВ и в виварии ФГУ Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория (ФГУ ЦНМВЛ, г.Москва).

1.1. Экспериментальные животные

В качестве опытной модели для оценки гуморальных факторов иммунитета использовано 20 двухмесячных беспородных щенков и помесей. В разные сроки было проведено три опыта с количеством животных 6, 7 и 7 соответственно.

Для изучения динамики формирования первичного и вторичного иммунного ответа щенков вакцинировали отечественными поливалентными вакцинами, содержащими в своем составе аттенуированный вирус чумы и инактивированные возбудители парвовирусного энтерита, аденовироза и денгоспироза собак согласно «Наставлению но применению...» каждого препарата. В опыте №1 пять из шести щенков были подвергнуты ревакцинации в возрасте 6 месяцев. В опытах №1 и №2 использовали вакцину производства ЗАО «Ветзвероцентр», в опыте №3 - ЗАО «НПО НАРВАК».

Для проведения исследований использовали цельную кровь и сыворотки крови щенков, полученные на 0, 4, 7, 10, 14, 21-е сутки после первичной вакцинации и на 5, 9, 14 и 21-е сутки после вторичной. У пяти ревакци-нированных через 4 месяца щенков, кровь была взята непосредственно перед инъекцией вакцины, далее на 3-е, 7-е и 14-е сутки п.и. соответственно. Перед постановкой РТГА и РН сыворотки крови щенков предварительно инак-тивировали в водяной бане при 56°С в течение 30 мин.

1.2. Гематологические методы

Количество форменных элементов крови подсчитывали, используя стандартные методики (И.П.Кондрахин с соавт., 1985). Подсчет общего количества лейкоцитов осуществляли в камере Горяева. Для дифференциального подсчета лейкоцитов готовили мазки и окрашивали по Романовскому-Гимзе. Лейкограмма выражалась как процентное отношение между отдельными видами лейкоцитов крови.

1.3. Метод радиальной иммунодиффузии по Манчини Количественное определение содержания IgG, IgM и IgA в испьпуе-мых сыворотках крови щенков проводили методом радиальной иммунодиффузии по Манчини. При постановке РИД специфические антисыворотки или моноклональные антитела диспергировали в агаровый гель (1,2% агаро-за на 0,05 М веронал-мединаловом буфере, рН 8,6), смесь наносили на стекло и в застывшем агаре вырезали лунки, в которые вносили испытуемые сыворотки крови щенков. Наряду с исследуемым материалом в другие лунки вносили раствор соответствующего Ig уже известной концентрации. Пластины инкубировали в течение 24- 48 часов во влажной камере при комнатной температуре, затем отмывали в физиологическом растворе, высушивали при 37°С и красили амидо-черным 10В.

Количество Ig определяли по измерению диаметра кольца преципитации испытуемых образцов относительно калибровочной кривой, nocí роенной с использованием стандарта. В качестве стандартов использовались иммунохимически чистые иммуноглобулины каждого изотипа.

1.4. Реакция непрямой гемагглютинации Титр антител к вирусу чумы собак определяли в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) с использованием «Набора эритроцитарных диаг-ностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных» (ТУ №9384001-00008064-96), постановку реакции и учет полученных результатов проводили согласно Наставлению по применению «Набора...».

1.5. Реакция торможения гемагглютинации Титр антител к парвовирусу собак (CPV-2) определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). РТГА проводили с 1 % суспензией эритроцитов свиньи в фосфатном буферном растворе, рН 6,6 и культуральной вируссодержащей суспензией штамма Д-1, постановку реакции и учет полученных результатов осуществляли согласно Наставлению по применению «Набора для диагностики парвовирусных инфекций плотоядных в реакции торможения гемагглютинации» (ТУ №10-07-132-91).

, В РТГА определяли титр антител к аденовирусу собак 1 и 2 серотипов (CAV-1 и CAV-2 соответственно). Для постановки РТГА использовали 0,7% суспензию эритроцитов белой крысы в забуференном физиологическом растворе, рН 6,4 и культуральные вируссодержащие суспензии штаммов ВГНКИ (CAV-1) и Ада (CAV-2). Постановку реакции и учет полученных результатов проводили согласно Наставлению по применению «Набора для обнаружения антител к возбудителям инфекционного гепатита и аде-

новироза плотоядных в реакции торможения гемагглютинации» (ТУ №9388-019-18713812-00).

1.6. Реакция нейтрализации

Реакцию нейтрализации (РН) использовали для определения титра антител к вирусу чумы собак. РН ставили микрометодом в 96-луночных планшетах (Nunc, Дания) по стандартной методике с постоянной дозой вируса.

1.7. Иммуноферментные тест-системы

Иммуноферментные тест-системы были использованы для определения динамики титра IgM- и IgG- специфических антител к парвовирусу и аденовирусу собак первого и второго серотипов в сыворотке крови подопытных животных. Каждая тест-система основана на непрямом варианте твердофазного ИФА, отработана применительно к каждому вирусному антигену и использовалась индивидуально.

В качестве антигенов использовали соответствующие вирусные препараты, полученные физико-химическими методами из вируссодержащих культуральных жидкостей (О.А.Верховский, Л.В.Верховская, Е.Д.Захарова и др., 1994). В каждом полученном антигене определяли концентрацию белка по методу O.H.Lowry (1951), анализировали его структурный состав методом электрофореза в ПААГ-ДСН и подтверждали антигенную активность в иммуноблоттинге.

В качестве конъюгатов использовали моноспецифическую антисыворотку к IgG собак и МкА 1F4 к IgM собак, меченные пероксидазой хрена (Sigma, США). Синтез иммунопероксидазных конъюгатов проводили по отработанной ранее технологической схеме на основе метода R.Tijssen and E.Kurstak (1984). Их активность и специфичность определяли методом прямого твердофазного ИФА с использованием очищенных препаратов IgG, IgM и IgA собак в качестве антигенов.

Во всех вариантах ИФА использовались плоскодонные полистироловые 96- луночные микропанели для ИФА (Nunc, Дания). При постановке всех тест-систем вирусный антиген сорбировали в лунках микропанели в предварительно подобранной концентрации. На следующих этапах реакции в лунки сенсибилизированной микропанели последовательно вносили блокирующий раствор, разведения испытуемых и контрольных сывороток крови и конъюгат в рабочем титре. Разведения антигена, испытуемых проб и конъ-югата готовили на предварительно подобранном буфере.

В качестве субстратной смеси использовался 0,02% о-фенилендиамин (ОФД) в 0,3 М цитратном буфере, рН 4,7, содержащем 0,01% перекиси водорода. Реакцию останавливали через 10-15 минут, добавлением в лунки по 50 мкл 8 М Н; SO4. Результаты ИФА оценивали с помощью фотометра «Multiskan МСС/340» («Labsystems», Финляндия) при длине волны 492 нм по коэффициенту оптического поглощения (ОП 492).

1.8. Электрофорез в ПААГ-ДСН Электрофорез проводили в пластинах полиакриламидного геля размером 100 х 150 х 0,75 мм в буферной системе Laemmli (1970) в "плюс-

минус" варианте (Л.В.Верховская, 1992). Разделение белков проводили при постоянной силе тока 20 мА и циркулирующем охлаждении. После электро-форетического разделения, белки в гелях окрашивали серебром (Porro М. et al., 1982) и фотографировали в проходящем свете.

1.9. Иммуноблоттинг

Для постановки иммуноблоттинга, белки после электрофоретического разделения не окрашивали, а переносили на нитроцеллюлозную мембрану «Immobilon-NC» (Millipore, США) в «полусухой» буферной системе (Kyhse-Andersen J., 1984) при постоянной силе юка 200 мА в течение 1 часа при комнатной температуре. Об эффективности переноса судили после окраски одной мембраны-реплики 0,1% раствором амидо-черного, а соответствующего ей геля- 0,03% раствором Кумасси ярко-голубого. Иммунохимическое окрашивание полученных реплик осуществляли с помощью непрямого варианта ИФА с соблюдением всех его стадий.

1.10. Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием программы Excel для Windows. Значение критерия достоверности оценивали по таблице вероятностей Стьюден га-Фишера в зависимости от объема анализируемого материала Вероятность различий считалась существенной при Р < 0,05.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. ОТРАБОТКА МЕТОДОВ НЕПРЯМОГО ТВЕРДОФАЗНОГО ИФА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ИЗОТИП-СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К ПАРВОВИРУСУ И АДЕНОВИРУСАМ СОБАК

Основной целью первого этапа нашей работы была отработка методики постановки и учета результатов иммуноферментных методов исследований, направленных на выявление в сыворотке крови собак:

1) IgG- и IgM- специфических антител к CPV-2;

2) IgG- и IgM- специфических антител к CAV-1;

3) IgG- и IgM- специфических антител к CAV-2.

Отработка каждого из трех методов состояла из ряда последовательных этапов, при проведении которых решались следующие основные задачи:

• отработка условий сенсибилизации лунок полистироловых микропанелей (твердая фаза) соответствующим очищенным вирусным антигеном и определение рабочего разведения иммуноферментных конъюгатов;

• подбор оптимальных режимов постановки реакции;

• оценка эффективности каждой из трех иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления антител к парвовирусу и аденовирусам собак в сравнении с результатами методов аналогичной направленности.

В качестве источника каждого вирусного антигена была использована вируссодержащая суспензия соответствующего вакцинного штамма парво-вируса и аденовирусов собак первого и второго серотипов полученных из коллекции ФГУ ВГНКИ.

В качестве парвовирусного антигена использовали препарат, полученный после ультрацентрифугирования концентрированного вируса в линейном градиенте плотности 1,32 - 1,45 г/л СвСК Очищенный вирус формировал специфическую полосу в растворе СвС 1 плотностью 1,44 г/л.

В качестве аденовирусных антигенов использовали препараты, полученные после очистки вируссодержащих культуральных жидкостей методами гидрофобной и анионообменной хроматографии.

После электрофоретического анализа полученных препаратов и подтверждения их антигенной активности в иммуноблоттинге, препараты были использованы в качестве антигенов в непрямом твердофазном ИФА.

В качестве иммунопероксидазных конъюгатов были использованы моноспецифическая антисыворотка к и моноклональные антитела к ^М собак, меченные ферментом, полученные и хорошо охарактеризованные ранее (О.А.Верховский, 1998). Результаты проведенных исследований показали, что полученные конъюгаты строго моноспецифичны по отношению к и ^М соответственно и не обладают перекрестной активностью по отношению к другим изотипам иммуноглобулинов собак.

Основным этапом работы по отработке условий постановки иммуно-ферментных тест-систем был выбор рабочего разведения иммунопероксидазных конъюгатов и концентрации каждого вирусного антигена. Рабочее разведение иммунопероксидазных конъюгатов, также как и концентрацию вирусных антигенов, определяли в предварительных экспериментах методом «шахматного» титрования в непрямом твердофазном ИФА. При этом в качестве положительных и отрицательных сывороток использовали сыворотки крови от переболевших или экспериментально зараженных собак с титром антител > 1:128 в РТГА и от неиммунных щенков (с отрицательной реакцией в РТГА) соответственно.

Оптимальной концентрацией вирусного антигена и рабочим разведением конъюгата считали их конечные значения, которые при взаимодейс!-вии с положительной сывороткой обеспечивали показатель ОП 492 > 1,0 При этом соответствующее значение ОП 492 в лунке с отрицательной сывороткой было минимальным (ОП 492 < 0,2).

В результате проведения экспериментов было установлено, что для сенсибилизации микропанелей очищенные вирусные антигены следует использовать в следующих концентрациях: 1) препарат очищенного парвови-руса собак - 2 мкг/мл; 2) препарат, содержащий гексон и отросток пентона аденовируса собак 1 серотипа - 1 мкг/мл; 3) препарат, содержащий гексон и отросток пентона аденовируса собак 2 серотипа - I мкг/мл. При этом рабочие разведения иммунопероксидазных конъюгатов для всех тест-систем составляли:

A) анти- собаки (поликлональный) - 1:2000;

B) анти- 1§М собаки (моноклональный) - 1:500.

Для сенсибилизации вирусных антигенов в лунках полистироловых микропанелей был использован 0,05 М карбонатно-бикарбонатный буфер, рН 9,6 (КББ). Для разведения сывороток крови собак был выбран стандартный фосфатно-буферный раствор (ФБР); в качестве промывочного буфера использовался этот же буфер, содержащий 0,05% твина-20 (ФБР !).

Для предотвращения неспецифической реакции проводили подбор блокирующего белка, испытывая бычий сывороточный альбумин (БСА), желатину, казеин, овальбумин и др. В результате в качестве раствора, блокирующего несвязавшие белок участки пластика, был выбран ФБРТ, содержащий 2% БСА.

В результате исследований была отработана универсальная методика постановки реакции общая для трех тест-систем (менялись только сорбированные вирусные антигены). Титр антител в испытуемых сыворотках определяли как последнее разведение, обеспечивающее окраску, превышающую в 2,1 раза интенсивность окраски в лунках с контрольной отрицательной сывороткой.

3 2,5 2

а

? 1.5 Ч 3 1 -

0,5 ■

О

-А - СРУ-2

— - САУ-1

- ■ - САУ-2

ОТР

X

ч^-.ч

1000 2000 4000 8000 16000 32000 64000 обратные разведения сыворотки

Рисунок 1. Определение титров 1§0-специфических антител к парвовирусу (СРУ-2) и аденовирусам собак (САУ-1 и САУ-2) в сыворотке крови щенка на 9-е сучки после повторной вакцинации отечественной поливалентной вакциной В качестве отрица!ельно-го контроля (ОТР.) взята сыворотка крови от неиммунного щенка

Для характеристики отработанных тест-систем были исследованы сыворотки крови собак (п=81) с определенным титром специфических антител в РТГА и известным анамнезом, полученные из ряда ветеринарных клиник г. Москвы. Анализ результатов исследований по выявлению 1§С-

специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак в испытуемых пробах с помощью ИФА и вирус-специфических антител в РТГА свидетельствует о том, что в большинстве случаев наблюдалось совпадение в интерпретации результатов ИФА и РТГА. Так, все РТГА- положительные пробы (п=69) были положительными и в ИФА, а из 12 РТГА- отрицательных проб в ИФА 3 пробы были положительными на СРУ-2 и в двух пробах присутствовали антитела к аденовирусам собак обоих серотипов.

Таким образом, в результате проведения первого этапа нашей работы была отработаны методики постановки ИФА по обнаружению и 1§М-специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак в сыворотке крови животных (рис.1).

2.2. ХАРАКТЕРИСТИКА ГУМОРАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ ПРОТИВОВИРУСНОГО ИММУНИТЕТА У СОБАК В ПРОЦЕССЕ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНОГЕНЕЗА

Основной целью нашей работы являлась характеристика гуморальных факторов противовирусного иммунитета у щенков после применения отечественных вакцинных препаратов. Исследования проводили в двух основных направлениях:

• определение гематологических показателей и количественного содержания сывороточных 1§М и 1цА у щенков в процессе формирования иммунного ответа;

• определение динамики титра ^М- и специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак в сыворотке крови подопытных животных с использованием иммуноферментных тест-систем и титра вирус-специфических антител к соответствующему возбудителю с использованием традиционных методов.

2.2.1. ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

Известно, что общий анализ крови позволяет выявить многие аномалии и патологические состояния животных, обусловленные нарушениями определенного звена иммунной системы и одновременно служить системно-функциональным подходом для иммунологического мониторинга организма животных на различных этапах иммуногенеза. Поэтому мы провели исследования, направленные на выявление и идентификацию возможных нарушений иммунной системы щенков после применения отечественных вакцин. Для этого была изучена динамика количественных изменений основных типов клеток иммунной системы в крови щенков в процессе поствакциналыго-го иммуногенеза.

Исследования проведены совместно с зав. отделом серологии ФГУ ЦНМВЛ Т.И.Сидоркиной.

Материалом для проведения исследований служила цельная кровь щенков, смешанная с антикоагулянтом (1-2 капли 10% ЭДТА-натрия на 5 мл крови) и доставленная в лабораторию в день взятия. Гематологические исследования проводили в динамике после первой, второй и третьей вакцинации соответственно. Результаты, полученные при исследовании крови щенков до вакцинации, сравнивали с нормативными гематологическими показателями, приведенными в отечественной и зарубежной литературе (И.П.Кондрахин с соавт., 1985; Ю.Н.Федоров с соавт., 2000; М.Уиллард с со-авт., 2004 и др.).

В результате проведенных исследований было установлено, что у клинически здоровых двухмесячных щенков общий состав периферической крови характеризуется следующими гематологическими показателями, отражающими иммунологический статус организма:

• абсолютное содержание лейкоцитов в среднем составило 7,0 х 109/л (нормативный показатель: 6- 16 х 109/л);

• относительное содержание палочкоядерных и сегмснтоядерных ней-трофилов в среднем составило 1% и 55% (нормативные показатели: 0 - 6% и 43 - 72% соответственно);

• относительное содержание эозинофилов в среднем составило 2% (нормативный показатель: 2 - 10%);

• относительное содержание лимфоцитов и моноцитов в среднем cocí а-вило 38% и 4% (нормативные показатели: 21 - 40% и 3 - 10% соответственно);

• базофилов обнаружено не было (нормативный показатель: 0 - 1 %).

Таким образом, гематологические показатели щенков до начала экспериментов соответствовали нормативным показателям и в дальнейшем являлись контрольными по отношению к результатам, полученным после проведения вакцинации.

В результате исследований было установлено, что на 4-7-е сутки после первой вакцинации в крови щенков достоверно увеличилось относительное содержание палочкоядерных нейтрофилов и на 7-е сутки - эозинофилов (Р < 0,05), не выходящих однако за рамки нормативных показателей. Увеличение содержания этих типов клеток на ранней стадии формирования иммунного ответа могло свидетельствовать о наличии воспалительной реакции, проходящей в этот период времени в организме животных, впрочем, не отразившейся на поведении и клиническом состоянии щенков, остававшихся под наблюдением в течение всего эксперимента. Эти результаты совпадают с результатами A.Strasser с соавт. (2003) которые показали, что вакцинация взрослых собак (старше 2-х летнего возраста) приводила к увеличению содержания палочкоядерных нейтрофилов и снижению нейтрофильной активности.

В дальнейшем, процентное содержание палочкоядерных нейтрофилов и эозинофилов в периферической крови уменьшилось, и в процессе вторич-

ного и третичного иммунного ответа их содержание достоверно не изменялось. Таким образом, динамика содержания этих типов клеток носила временной характер.

Полученные данные показали, что в процессе поствакцинального иммуногенеза достоверных изменений средних значений содержания лейкоцитов, сегментоядерных нейтрофилов, базофилов, лимфоцитов и моноцитов в периферической крови обнаружено не было.

2.2.2. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТКА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ ВАКЦИНИРОВАННЫХ СОБАК

Количественное определение уровня трех основных изотипов иммуноглобулинов (^в, 1§М и 1§А) в испытуемых сыворотках крови щенков проводили методом РИД по Манчини

В исследованиях использовали моноспецифическую антисыворотку к моноспецифическую антисыворотку к 1§А и МкА 1Б4 к ^М собак, им-мунохимически чистые препараты 1§М и ^А собак полученные и охарактеризованные ранее в лаборатории иммунологии и биотехнологии ВИЭВ.

На первом этапе работы для унификации метода были проведены исследования по подбору оптимальных концентраций моноспецифических реагентов для внесения в гель и необходимого количества вносимых проб для анализа. Для этого в агарозу диспергировали антисыворотки в различных разведениях (от 1:10 до 1:100) и МкА 1Р4 в различных концентрациях (от 1 до 200 мкг / мл). После полимеризации геля в вырезанные лунки вносили испытуемые пробы в различных объемах (от 1 до 3 мкл) и после 24-48 часовой инкубации учитывали реакцию по конечной концентрации антадыворотки или МкА, дающей четкие контуры диска преципитации с испытуемыми антигенами.

По результатам проведенных опытов установлено, что для получения достоверных результатов оптимальным разведением моноспецифической антисыворотки к ^С собак является 1:30, а моноспецифической антисыворотки к 1§А собак - 1:20. Концентрация моноклональных антител 1Р4 в ага-розе должна составлять 4 мкг/мл. Объем вносимой пробы составлял 1 мкл для определения концентрации и 1§М и 2 мкл для определения концентрации 1§А. В качестве стандартов были использованы иммунохимически чистые препараты иммуноглобулинов каждого изотипа.

Далее с использованием отработанного метода решалась основная задача данного раздела работы - количественная оценка сывороточных иммуноглобулинов щенков в процессе формирования иммунного ответа. Для этого были проведены исследования по определению уровня иммуноглобулинов в сыворотках крови вакцинированных собак, в результате которых было установлено, что динамика количественных изменений 1§М и 1§А во всех опытах была практически одинакова и имела ряд аналогичных законо-

мерностей. Статистически обработанные результаты опытов приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Концентрация иммуноглобулинов в сыворотке крови щенков

Вакци- Время Содержание иммуноглобулинов, мг/мл

нация, П.И., (М±ш)

(кол-во животных) сутки

№ 1кМ 1ЛА

До вакцина- 0 5,35 ±0,52 1,68 ±0,24 0,40 ± 0,06

ции (п=20)

4 6,33 ± 0,24 1,8810,43 0,44 ±0,15

Первая 7 6,60 ± 0,64 2,53 ±0,19* 0,51 ±0,13

(п=20) 10 6,72 ± 0,78 3,47 ±0,21* 0,60 ± 0,08*

14 8,90 ± 1,20* 3,23 ± 0,09* 0,46 ±0,13

21 9,10 ± 0,80* 2,33 ± 0,46 0,48 ±0,18

5 9,55 ±0,65* 2,31 ± 0,43 0,59 ±0,10

Вторая 9 9,70 ± 0,50* 1,86 ±0,45 0,66 ±0,12*

(п=20) 14 9,52 ± 0,49* 1,97 ±0,15 0,58 ± 0,09

21 9,55 ±0,33* 1,75 ±0,12 0,56 ±0,10

Перед 0 8,12 ± 1,60 1,70 ±0,20 0,62 ±0,10

ревакци-

нациеи

(п=5)

3 8,15 ±0,40 2,20 ±0,10 0,70 ± 0,24

Третья 7 8,65 ±0,35 1,88 ±0,42 0,79 ±0,15

(п=5) 14 9,12 ±0,31 1,76 ±0,25 0,74 ±0,19

Примечание- *- статистическая достоверное 1Ь различий показателей у щенков после первой и второй вакцинации по отношению к показателям у этих же невак-цинированных щенков, Р < 0,05.

Данные таблицы 1 показали, что первичный, вторичный и третичный поствакцинальный иммунный ответ у щенков приводил к изменению имму-ноглобулинового профиля в крови животных.

Так, на 7-е сутки после первой вакцинации концентрация ^М увеличилась на 50,6% (Р < 0,05) и на 10-е сутки достигла своего максимума (3,47 ± 0,21 мг/мл). В этот промежуток времени содержание иммуноглобулинов данного изотипа увеличилось более чем в 2 раза, и было самым высоким по сравнению с аналогичными показателями как у неиммунных щенков, так и у щенков после последующих введений вакцины. Далее концентрация иммуноглобулинов данного изотипа начала постепенно снижаться, и в процессе формирования иммунного ответа, обусловленного Т- и В- клетками

формирования иммунного ответа, обусловленного Т- и В- клетками памяти (после второй инъекции вакцины), его количественные показатели не имели выраженной тенденции к изменению и находились в пределах своих возрастных норм, определенных для данного вида животных.

Анализ полученных результатов по количественной характеристике иммуноглобулинов показал, что наблюдается выраженная зависимость содержания ^С от срока с начала формирования поствакцинального иммунного ответа. Так в сравнении с контрольными показателями, концентрация достоверно увеличилась на 14-21-е сутки после первой вакцинации (на 66% и 70% соответственно, Р < 0,05) и оставалась таковой в течение всего периода после второй. При этом максимальное значение содержания 1§0 (9,70 ± 0,50 мг/мл) в сыворотке крови вакцинированных щенков было установлено на 9-е сутки после повторной инъекции вакцины Через 4 месяца уровень 1 цСЭ незначительно снизился, а к 14-м суткам после проведения ревакцинации вновь увеличился до 9,12 ± 0,31 мг/мл (срок наблюдения).

Клиническое значение 1§А в поствакцинальном противовирусном иммунном ответе у щенков практически не изучено. В наших опытах у щенков в процессе первичного и вторичного иммунного ответа наблюдалась тенденция к увеличению, а затем к постепенному снижению содержания иммуноглобулинов данного изотипа в сыворотке крови исследуемых животных. В сравнении с контрольными показателями статистически достоверное повышение уровня 1§А было зарегистрировано на 10-е сутки после первой и на 9-е сутки после повторной инъекции вакцины (на 50% и 65% соответственно, Р < 0,05). Максимальный уровень 1§А, также как и ^О, был установлен на 9-е сутки после повторной инъекции вакцины и составил 0,66 ±0,12 мг/мл.

Ревакцинация шестимесячных щенков не приводила к достоверным изменениям концентрации сывороточных иммуноглобулинов всех трех изо-типов.

2.2.3. ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУС-СПЕЦИФИЧЕСКОГО ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У СОБАК В ПРОЦЕССЕ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНОГЕНЕЗА

Для изучения динамики формирования гуморального поствакцинального иммунного ответа у щенков и оценки диагностической ценности отработанных методов ИФА, предназначенных для выявления ^М- и специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак, в каждой испытуемой пробе сыворотки крови щенков определяли:

1) тцтр антител к СБУ, СРУ-2, САУ-1 и САУ-2 с помощью традиционных серологических тестов;

2) титр 1§М- и специфических антител к СР\'-2, САУ-1 и САУ-2 с помощью иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления антител к каждому вирусу отдельно.

Исследования проводили совместно с |к.в.н. Е.Д.Захаровой

2.2.3.1. ДИНАМИКА СОДЕРЖАНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ЧУМЫ СОБАК

Титр антител к СОУ в сыворотке крови испытуемых щенков определяли в традиционных серологических тестах: РИГА и в РН. Результаты исследований во всех проведенных экспериментах статистически обработаны и приведены на рисунке 2.

время п.и., сутки

Рисунок 2. Динамика содержания поствакцинальных антител к СОУ в сыворотках крови щенков. Приведены средние геометрические значения титров антител, выраженных в 1о§2- Стрелками показано время первой (1), второй (2) и третьей вакцинации (3)

Пунктирными линиями показаны значения протективно! о титра антител а) в РИГА (1:64 или 6,0 1ой; А.В.Васильев, 2000) б) в РН (1.100 или 6,64 В Н Сюрин с соавт., 1998)

Полученные результаты свидетельствуют о том, что у большинства подопытных невакцинированных двухмесячных щенков в сыворотке крови обнаружены антитела к вирусу чумы собак (в 16 случаев из 20) в титрах 1:21:16 как в РИГА, так и в РН. Однако, согласно литературным данным, этот уровень антител не обеспечивает устойчивости животного к заражению вирулентным вирусом (Б.Ь.МсСаш ег а1, 1998; А.В.Васильев, 2000 и др.).

Как видно из данных рисунка 2, формирование выраженного пос гвак-цинального гуморального иммунного ответа к вирусу чумы собак происходило после первой вакцинации и в первые 9 суток после второй В эти сроки уровень антител к СБУ, определяемых в РН и РНГА, повышался и достигал своего максимума на 21-е сутки первичного (11,4 ± 1,7 1о§2 в РН) и на 9-е сутки вторичного (8,5 ±1,1 1о§2 в РНГА) иммунного ответа.

Третичный гуморальный иммунный ответ к вирусу чумы собак после ревакцинации шестимесячных щенков, обусловленный Т- и В- клетками па-

мяти, не сопровождался достоверным увеличением титров антител, определяемых двумя методами.

При сравнительном анализе результатов РИГА и РН установлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью этих двух методов (г=0,9, Р < 0,05).

2.2.3.2. ДИНАМИКА ТИТРА И ОЦЕНКА РАСПРЕДЕЛЕНИЯ 1ёМ- и ДО-СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В ИММУННОМ ОТВЕТЕ К ПАРВОВИРУСУ СОБАК

Титр антител к парвовирусу собак определяли в РТГА, титр ^М- и ^С- специфических антител к СРУ-2 - в ИФА. Статистически обработанные результаты исследований по определению титра антител в сыворотке крови испытуемых щенков двумя методами во всех проведенных экспериментах приведены на рисунках 3-4.

2

время п.и , сутки

Рисунок 3. Сравнительные результаты содержания поствакцинальных антител к CPV-2 в сыворотках крови щенков. Приведены средние геометрические значения титров антитез, выявляемых в ИФА и РТГА и выраженных в log? Стрелками показано время первой (1), второй (2) и третьей вакцинации (3) Пунктирной линией показано значение протек-тивного титра антител в РТГА ( > 1:64 или 6,0 log2 согласно данным S А Fiscus et al. 1985, M.J.G Appell et al., 1987; М.М.Рахманиной, 1993 и др.)

время п.и., сутки

время п.и., сутки

Рисунок 4. Динамика содержания поствакцинальных ангигел к парвовирусу собак в сыворотках крови щенков Приведены средние геометрические значения обратных титров антител Стрелками показано время первой (1), второй (2) и третьей вакцинации (3)

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что у большинства подопытных двухмесячных щенков в сыворотке крови обнаружены антитела к парвовирусу собак (в 18 случаев из 20) как в РТГА, так и в ИФЛ. Причем у четырех из них титр в РТГА был > 1:128, т.е. превышал значение протективного уровня. В ИФА титры 1§М- и 1§0- специфических антител достигали значений 1:160 (7,3 ^2) и 1:400 (8,6 1о§2) соответственно.

Результаты ИФА и РТГА свидетельствуют о формировании выраженного поствакцинального гуморального иммунного ответа к парвовирусу собак у всех щенков. Так после первой вакцинации 1 итр вирус-специфических антител, обнаруживаемых в РТГА, увеличился на 4-5 \о%г соответственно по сравнению с контрольными показателями и достиг своего максимума на 14-е сутки п.и. (11,3 ± 0,5 1оц2). Вторая вакцинация не приводила к значительным изменениям в содержании антител выявляемых в РТГА, их титр даже был несколько ниже по отношению к достигнутому ранее максимуму. Однако в любом случае он был значительно выше протективного показателя и сохранялся на этом уровне вплоть до проведения ревакцинации (у пяти щенков бывших в опыте).

Поскольку практически у всех щенков до вакцинации (0 сутки) в сыворотке крови были обнаружены как ТсМ- так и ^О- антитела к СРУ-2 в различных титрах, то первая инъекция поливалентной вакцины стимулировала формирование как ^М- так и 1§0-иммунного ответа у всех исследованных животных. При этом содержание ^М-специфических антител в сыворотке крови щенков начинало достоверно увеличиваться на 4-с сутки п.и. и достигало своего максимального значения на 10 сутки (средний титр 1:800), далее титр антител данного изотипа резко снижался. Однако даже в период своего максимального подъема, уровень ^М- антител превышал уровень антител аналогичной специфичности только у 6 щенков, в большинстве же случаев антитела доминировали не только во вторичном, но и в первичном иммунном ответе.

Вторая вакцинация приводила к незначительному повышению Ш1ра 1£М-специфических антител на 5-е сутки п.и, далее антитела данного изотипа не играли значимой роли в иммунном ответе.

После первой вакцинации содержание сывороточных вирус- специфических антител, относящихся к ^С- изотипу, происходило постепенно, достигая своего максимального значения к моменту вторичной вакцинации (21 -е сутки п.и.). Вторичный иммунный ответ у щенков характеризовался дальнейшим повышением содержания антител в сыворотке крови, которые достигали своего максимального значения на 14-21-е сутки после повторной вакцинации животных и циркулировали в организме длительное время.

У пяти ревакцинированных щенков титры ^О- антител к СРУ-2 перед введением препарата достигали 10-12 1о§2, а на 14-е сутки п.и. возрастали до 13-15 1о£2 соответственно.

Таким образом, ревакцинация шестимесячных щенков приводила к достоверному повышению уровня антител к СРУ-2, определяемых как в

РТГА, так и в ИФА, и в большинстве случаев относящихся к изотипу. Во всех проведенных экспериментах установлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью РТГА и ИФА (г=0,77, Р < 0,05).

2.2.3.3. ДИНАМИКА ТИТРА И ОЦЕНКА РАСПРЕДЕЛЕНИЯ 18М- и ДО-СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В ИММУННОМ ОТВЕТЕ К АДЕНОВИРУСАМ СОБАК

Титр антител к САУ-1 и САУ-2 в сыворотке крови экспериментальных животных определяли в РТГА (табл.2). Для определения динамики титров и ^О- антител к антигенам САУ-1 и САУ-2 были использованы сооь ветствующие методы ИФА (рис.5).

Таблица 2.

Динамика титров антител в РТГА к аденовирусам собак в сыворотке крови щенков

Вакцинация, (кол-во животных) Время п.и., сутки Титр антител , 1ой2 (М ± т)

к САУ-1 к САУ-2

До вакцинации (п=20) 0 3,2 ±1,4 5,4 ± 0,6

Первая (п=20) 4 3,6 ± 0,5 5,9 ±0,15

7 4,8 ± 0,8* 6,7 ±0,13*

10 4,75 ± 1,1* 6,75 ± 1,1*

14 5,05 ± 1,7* 6,56 ± 1,13*

21 5,6 ± 0,8* 6,08 ± 1,2*

Вторая(п=20) 5 5,6 ± 1,25* 7,7 ±0,9*

9 6,3 ± 0,24* 7,86 ±0,8*

14 6,3 ± 0,8* 7,58 ±0,6*

21 6,1 ± 1,4* 7,56 ±0,5*

Перед ревакцинацией(п=5) 0 5,4 ±0,2 7,65 ± 0,5

Третья (п~5) 3 5,9 ±0,5 8,15 ± 1,2

7 6,8 ± 0,5 8,75 ± 1,1

14 6,6 ± 0,4 8,75 ± 0,8

Примечание: * - статистическая достоверность различий показателей у щенков после первой и второй вакцинации по отношению к показателям у этих же невак-цинированных животных, Р < 0,05.

Из данных таблицы 2, видно, что титр антител выявляемых в РТГА, достоверно увеличивался на 7-е сутки после первой вакцинации и достигал максимальных значений на 9 - 14-е сутки вторичного иммунного ответа. При этом прирост специфических антител составлял 1,3 - 1,6 и 2,4 -3,1 1о£г соответственно.

время п.и., сутки

время п и., сутки

Рисунок 5. Динамика содержания поствакцинальных антител к аденовирусам собак (САУ-1 и САУ-2) в сыворотках крови щенков Приведены средние геометрические значения обратных титров антител Стрелками показано время первой (1), второй (2) и третьей вакцинации (3). Пунктирной линией показано значение отрицательной реакции в ИФА (< 1:100).

У шестимесячных щенков перед ревакцинацией титр антител к С АУ-1 составлял 5,4 ± 0,2 1о§2, к САУ-2 - 7,65 ± 0,5 , а в период максимального подъема (7-е сутки п.и.) - 6,8 ± 0,5 и 8,75 ± 1,1 log2 соответственно. Таким образом, после первой вакцинации титр антител к аденовирусам возрастал более чем в 2,5 раза, после второй - более чем в 4 раза и после ревакцинации немногим более чем в 2 раза.

Следовательно, применение отечественных вакцин стимулировало формирование выраженного иммунного ответа к аденовирусам обоих серо-типов, уровень которых обеспечивает протективный эффект (по данным Е.Д.Захаровой и В.И.Уласова, 1995, наличие антител к САУ-1 и САУ-2 в сыворотке крови в титре > 4 log2 обеспечивает защиту животных от аденовирусных инфекций).

Анализ полученных результатов, приведенных на рисунке 5, свидетельствует о том, что у всех щенков до вакцинации (0 сутки) в сыворотке крови были обнаружены как ^М- так и антитела к аденовирусам обоих серотипов. На 7-е и на 10-е сутки после первой вакцинации отмечалось максимальное увеличение содержания 1§М- специфических антител к САV-1 и САУ-2 соответственно.

Как первая, так и вторая инъекции поливалентных вакцин стимулировала формирование выраженного ^в-иммунного ответа к аденовирусам собак первого и второго серотипов у всех исследованных животных, что выражалось в логарифмическом нарастании титров антител данного изотипа. При этом их максимальное значение, установленное на 9-14-е сутки после повторной вакцинации животных, достигло 1:6400 (12,6 к САУ-1 и 1:17500 (14,1 1о§2) к САУ-2 соответственно. Перед ревакцинацией пяти щенков титры ^О-антител снизились до 1:2000 (10,97 кщ2), а на 7 - 14-е сутки после введения препарата возрастали до 1:16000 (13,97 log2) к САУ-1 и 1:32000 (14,97 1о§2) к САУ-2 соответственно.

Таким образом, поствакцинальный гуморальный иммунный ответ к САУ-1 и САУ-2 характеризовался достоверным увеличением содержания специфических антител на 4 - 7-е сутки после первой вакцинации (^М-изотипа и 1§С-изотипа к САУ-1), на 9 - 14-е сутки после второй (1§0-изотипа) и на 7 - 14-е сутки после третьей (^О-изотипа).

При этом также как и в случае с антителами к СРУ-2, ^Ст- антитела к САУ-1 и САУ-2 являлись доминирующим изотипом антител на всех этапах иммуногенеза. Увеличение содержания вирусспецифических антител, принадлежащих к ^М-изотипу, происходило только на ранней стадии первичного иммунного ответа.

Установлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью ИФА и РТГА. При определении титров специфических антител к адновирусу собак первого серотипа коэффициент корреляции результатов, полученных двумя методами, составил 0,9, при определении титров специфических антител к САУ-2 - 0,79 соответственно.

2.23.4. КОРРЕЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ РИД И ИФА

Для проведения корреляционного анализа были использованы результаты исследований по:

1) количественному определению уровня IgG и IgM методом РИД (табл.1);

2) определению титров IgM- и IgG- специфических антител к CPV-2, CAV-1 и CAV-2 методом ИФА (рис. 4-5).

Коэффициент корреляции результатов (коэффициент корреляции Пирсона) вычисляли с использованием программы Excel для Windows.

Полученные результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Корреляционный анализ результатов содержания вирусспецифических

IgG- и IgM- антител (ИФА) и общего количества IgG и IgM (РИД)

Антиген Коэффициент корреляции (г) результатов ИФА/РИД

IgG- / IgG IgM- ЛgM

CPV-2 0,9 0,87

CAV-1 0,6 0,69

CAV-2 0,76 0,75

Анализ полученных данных свидетельствует о том, что во всех случаях установлена высокая корреляционная связь между концентрацией иммуноглобулинов Б- или М- изотипа, определенной в РИД, и титром противовирусных специфических антител соответствующего изотипа, установленным в ИФА.

При сравнении результатов содержания гетерологичных иммуноглобулинов и вирус-специфических антител (например. ^О/^М- антител) была установлена обратная (отрицательная) корреляция результатов во всех случаях.

3. ВЫВОДЫ

1. Отработаны методы непрямого твердофазного ИФА, предназначенные для выявления и специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак в сыворотке крови животных. Получены убедительные данные, свидетельствующие о том, что ИФА является высокочувствительным, специфичным, информативным и воспроизводимым методом определения вирус-специфических антител определенного изотипа.

2. Впервые проведены комплексные исследования с использованием РИД, ИФА, традиционных гематологических и серологических методов и установлены закономерности в развитии поствакцинального гуморального иммунного ответа у щенков, вакцинированных отечественными поливалент-

ными вакцинами, предназначенными для профилактики чумы, парвовирус-ного энтерита, инфекционного гепатита и аденовироза собак. Показано, что используемые вакцины не обладают иммуносупрессивным действием и могут применяться для массовой вакцинопрофилактики. Во всех случаях установлены статистически достоверные различия между уровнем антител у щенков до и после применения препаратов (Р < 0,001).

3. В опытах по определению специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак первого и второго серотипов установлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью ИФА и РТГА (г= 0,77; 0,9 и 0,79 соответственно).

4. Дана количественная характеристика ^М, 1§А в сыворотке крови подопытных животных и установлено, что концентрация 1§М была максимальной на 10-е сутки после первой вакцинации (3,47 ± 0,21 мг/мл), а

и 1§А - на 9-е сутки после повторной инъекции вакцины (9,70 ± 0,50 и 0,66 ± 0,12 мг/мл соответственно). Показано, что одно- и двукратная вакцинация двухмесячных щенков отечественными поливалентными препаратами приводила к значительному повышению уровня сывороточного ^С.

5. В экспериментальных исследованиях изучена динамика и определены сроки повышения и максимального содержания и ^М- специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак в сыворотке крови щенков в процессе поствакцинального иммуногенеза. Установлено, что в ранние сроки первичного иммунного ответа (4 - 10-е сутки) достоверно возрастает содержание вирус-специфических антител 1дМ- изотипа. После второй вакцинации и ревакцинации щенков в 6-ти месячном возрасте их роль в гуморальном иммунном ответе является незначительной. Установлено закономерное нарастание титров вирусспецифических ^в-антител после каждой инъекции вакцин и их ведущее значение в поствакцинальном иммуногенезе.

6. Установлена высокая корреляционная связь между концентрацией иммуноглобулинов в сыворотке крови иммунных щенков и титром ирошво-вирусных специфических антител соответствующего изотипа. Так, у подопытных животных установлена положительная корреляция результатов между количественным содержанием и титром специфических антител к парвовирусу собак (г = 0,9, Р < 0,05), аденовирусу первого (г = 0,6, Р < 0,05) и второго (г = 0,76, Р < 0,05) серотипов. Аналогичная высокая корреляционная связь установлена между количественным уровнем ^М и титром ^-специфических антител к СРУ-2 (г = 0,87, Р < 0,05), САУ-1 (г = 0,69, Р < 0,05) и САУ-2 (г = 0,75, Р < 0,05) соответственно.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Тест-системы на основе непрямого твердофазного ИФА могут быть рекомендованы в качестве методов оценки иммунного статуса, контроля антигенной активности соответствующих компонентов моно- и поливалентных вакцин, а также в качестве дополнительных методов диагностики парвови-русного энтерита, инфекционного гепатита и аденовироза собак.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. О.А.Верховский, Ю.Н.Федоров, А.Ю.Ханис, Т.В.Борзенко. Влияние препарата Риботан на антигенную активность вакцины против парвовирус-ного энтерита собак // Материалы научно- практической конференции «Новые фармакологические средства для животноводства и ветеринарии», посвященной 55-летию Краснодарской НИВС, Краснодар, 2001, с.67.

2. Т.В.Борзенко, Е.Д.Захарова, О.А.Верховский, А.А.Курносов. Оценка антигенной активности ассоциированной вакцины для собак // Материалы IV региональной конференции «Золотое кольцо России» посвященной проблемам профилактики и лечения домашних животных и птицы, Владимир, 2001, с. 34-35.

3. Т.В.Борзенко, О.А.Верховский. Динамика содержания изотип-специ-фических антител в сыворотке крови вакцинированных щенков // Труды ВИЭВ, 2003, том № 73, с. 221-224.

4. Т.В.Борзенко. Количественная характеристика иммуноглобулинов сыворотки крови щенков после вакцинации // Труды ВИЭВ, 2003, том № 73, с. 224-227.

Принято к исполнению 18/07/2005 Исполнено 19/07/2005

Заказ № 960 Тираж: 90 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru

РНБ Русский фонд

2007-4 8057

-.¡.и ■ ;

В разработке методов диагностики и средств специфической профилактики болезней животных основополагающая роль принадлежит иммунологии - науке, изучающей механизмы формирования иммунного ответа, иммунологической памяти и межклеточной кооперации лимфоцитов и базирующейся на современных представлениях об эффекторных механизмах иммунитета, среди которых главное место занимает взаимодействие антиген-антитело (J.E.Barlough and N.C.Pedersen, 1995; L J.Gershwin et al, 1995; N.T. Gorman, 1995; Ю.Н.Федоров, О.А.Верховский, 1998, 2000 и др.). При этом важную роль в оценке иммунологического состояния организма на различных этапах онто- и иммуногенеза, обусловленного процессами, возникающими в организме животных в ответ на иммуногены различной этиологии, играет анализ гуморальных факторов иммунного ответа.

Несмотря на то, что к настоящему времени опубликован ряд работ отечественных и зарубежных авторов, посвященных изучению иммунного статуса собак в норме и при патологи (О.А.Верховский с соавт. 1996, 1998; А.А.Лисицина, 1997; М.В.Даниловский, 2000; А.Д,Середа с соавт., 2000; М.В.Мезенцева с соавт., 2001; И.В.Чуваев, 2001; T.R.Phillips et al., 1989; T.Miyamoto et al., 1995; G.Mazza et al., 1994; P.B.Hill et al., 1995; A.Tipold et al., 2001; C.Leandro et al., 2001; A.Strasser et al., 1998, 2000, 2003; D.E.Mouzin et al., 2004 и др.) остаются неосвещенными многие вопросы, связанные с изучением структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов собак, изменением уровня иммуноглобулинов и изотип-специфических антител в процессе постинфекционного и поствакцинального иммуногенеза. Кроме того, отсутствие отечественных тест-систем, предназначенных для оценки характера иммунного ответа и иммунологического статуса собак, сдерживает научные исследования, направленные на разработку и эффективное применение средств иммунокоррекции и иммунопрофилактики.

В настоящее время это особенно актуально, поскольку насчитывается большое количество иммунобиологических препаратов, находящихся в производстве и используемых практической ветеринарной службой России. К ним относятся, прежде всего, отечественные и зарубежные вакцины против основных вирусных болезней собак, включающих чуму, парвовирусный энтерит, инфекционный гепатит и аденовироз. Эти болезни занимают ведущее место в структуре инфекционной патологии собак, представляют наибольшую опасность и часто заканчиваются гибелью животных или оставляют в их организме длительные, а иногда и необратимые повреждения органов и тканей (В.И.Уласов, Л.В.Кириллов, 1999). В большинстве стран мира вакци-нопрофилактика является важнейшим звеном в системе мер борьбы и самым эффективным методом эпизоотического контроля за этими болезнями. Повсеместное применение вакцин накладывает жесткие требования к их производству и методам биологического контроля. Сложная этиологическая структура инфекционных болезней собак, широкое их распространение и необходимость вакцинации животных одновременно против нескольких наиболее распространенных болезней, обуславливают разработку и применение эффективных поливалентных вакцин, обеспечивающих формирование напряженного иммунитета (D.H.Davies, S.Pidford, 1991; J.A.Roth, 1991; R.D. Schultz, 1998; L.E.Carmichael, 1999 и др.). При этом необходимо решить сложные задачи по конструированию таких препаратов из антигенов различной природы, учитывая возможность их интерференции в организме животных в процессе иммуногенеза. Кроме того, создание поливалентных вакцин требует наличия методов контроля антигенных и иммуногенных свойств каждого компонента вакцины с использованием чувствительных и специфичных тест-систем. В этой связи анализ гуморального иммунного ответа на основе оценки изотип-специфического распределения антител и количественного определения уровня иммуноглобулинов позволяет изучить динамику появления, нарастания и длительности сохранения поствакцинальных антител, что является основным показателем антигенной активности вакцины (А.В.Васильев, 2000; О.Ь.МсМШеп е1 а1., 1995; А.Рга1еШ (Л а\., 2000 и

ДР-)

Поэтому вопросы, связанные с разработкой и совершенствованием аналитических методов иммуноанализа на основе поли- и моноклональных антител, также как и с их использованием для изучения поствакцинального гуморального иммунного ответа у собак, являются весьма актуальными и представляют значительный интерес, как в научном, так и в практическом аспектах. Результаты подобных исследований будут иметь не только прикладное значение, но и представлять значительный интерес для ветеринарной науки в целом, способствуя дальнейшему изучению инфекционных болезней и иммунной регуляции у собак.

Цель работы. Характеристика гуморальных факторов противовирусного иммунитета у собак в процессе поствакцинального иммуногенеза.

Основные задачи исследований:

1. Отработать методику постановки, условий проведения и учета результатов реакции иммуноферментных тест-систем (ИФА), предназначенных для выявления изотип-специфических антител к парвовирусу (СРУ-2) и аденовирусам собак (САУ-1 и САУ-2) в сыворотке крови животных.

2. Провести сравнительное изучение диагностической ценности традиционных серологических методов и отработанных тест-систем на основе непрямого твердофазного ИФА при оценке антигенной активности вирусных антигенов, входящих в состав отечественных поливалентных вакцин, используемых для профилактики инфекционных болезней собак.

3. Изучить динамику формирования В- клеточного иммунного ответа у щенков, вакцинированных отечественными биопрепаратами. Для этого провести исследования, направленные на оценку изотип-специфического распределения антител и количественное определение уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови собак в процессе поствакцинального иммуногенеза.

4. Изучить взаимосвязь между концентрацией иммуноглобулинов и титром противовирусных специфических антител соответствующего изотипа в сыворотке крови иммунных щенков.

Научная новизна работы.

Отработаны чувствительные и специфичные методы непрямого твердофазного ИФА, предназначенные для выявления IgG- и IgM- специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак в сыворотке крови животных. С использованием разноплановых методов (РИД, ИФА, РН, РНГА, РТГА, гематологические методы) впервые проведены комплексные исследования по изучению динамики формирования иммунного ответа на вирусные антигены различной природы. Получены новые данные о количественных изменениях IgG, IgM, IgA и динамике титров вирусспецифических IgG-и IgM- антител в сыворотке крови подопытных щенков на отдельных этапах поствакцинального иммуногенеза.

Впервые проведены сравнительные исследования и установлена высокая корреляционная связь между концентрацией IgG, IgM и титром противовирусных IgG-, IgM- специфических антител в сыворотке крови иммунных щенков.

На основании сравнительных исследований подтверждены некоторые закономерности изменений гуморальных факторов противовирусного иммунитета у собак и показана ведущая роль IgG и вирусспецифических IgG-ан-тител в процессе формирования поствакцинального иммунного ответа.

Практическая значимость исследований.

Методы непрямого твердофазного ИФА целесообразно использовать для оценки напряженности иммунитета, определения содержания материнских антител у щенков с целью корректировки сроков первой вакцинации, а также в качестве методов контроля антигенной активности соответствующих компонентов моно- и поливалентных вакцин. Кроме того, данные тест-системы могут служить дополнительным методом исследований в системе комплексной диагностики парвовирусного энтерита, инфекционного гепатита и аденовироза собак.

Полученные результаты являются основой для дальнейших исследований по изучению механизмов и закономерностей формирования постинфекционного и поствакцинального противовирусного иммунитета у собак. Основные положения, выносимые на защиту.

Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

• результаты экспериментов по отработке ИФА для выявления изотип-специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак;

• результаты комплексных исследований по изучению динамики формирования гуморального иммунного ответа у щенков в процессе поствакцинального иммуногенеза.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на:

• Научно- практической конференции «Новые фармакологические средства для животноводства и ветеринарии», Краснодар, 2001;

• IV региональной конференции посвященной проблемам профилактики и лечения домашних животных и птицы, Владимир, 2001;

• Межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, Москва, 2005. Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре научные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 125 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, заключения, выводов, практических предложений,-списка цитированной литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 8 таблицами и 10 рисунками. Список литературы включает 140 источников (30 отечественных и 110 зарубежных авторов).

6. выводы

1. Отработаны методы непрямого твердофазного ИФА, предназначенные для выявления и 1§М- специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак в сыворотке крови животных. Получены убедительные данные, свидетельствующие о том, что ИФА является высокочувствительным, специфичным, информативным и воспроизводимым методом определения вирус-специфических антител определенного изотипа.

2. Впервые проведены комплексные исследования с использованием РИД, ИФА, традиционных гематологических и серологических методов и установлены закономерности в развитии поствакцинального гуморального иммунного ответа у щенков, вакцинированных отечественными поливалентными вакцинами, предназначенными для профилактики чумы, парвовирус-ного энтерита, инфекционного гепатита и аденовироза собак. Показано, что используемые вакцины не обладают иммуносупрессивным действием и могут применяться для массовой вакцинопрофилактики. Во всех случаях установлены статистически достоверные различия между уровнем антител у щенков до и после применения препаратов (Р < 0,001).

3. В опытах по определению специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак первого и второго серотипов установлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью ИФА и РТГА г= 0,77; 0,9 и 0,79 соответственно).

4. Дана количественная характеристика 1§0,1§М, ^А в сыворотке крови подопытных животных и установлено, что концентрация была максимальной на 10-е сутки после первой вакцинации (3,47 ± 0,21 мг/мл), а и 1§А - на 9-е сутки после повторной инъекции вакцины (9,70 ± 0,50 и 0,66 ± 0,12 мг/мл соответственно). Показано, что одно- и двукратная вакцинация двухмесячных щенков отечественными поливалентными препаратами приводила к значительному повышению уровня сывороточного

5. В экспериментальных исследованиях изучена динамика и определены сроки повышения и максимального содержания 1§0- и ^М- специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак в сыворотке крови щенков в процессе поствакцинального иммуногенеза. Установлено, что в ранние сроки первичного иммунного ответа (4 - 10-е сутки) достоверно возрастает содержание вирус-специфических антител 1§М- изотипа. После второй вакцинации и ревакцинации щенков в 6-ти месячном возрасте их роль в гуморальном иммунном ответе является незначительной. Установлено закономерное нарастание титров вирусспецифических ^в-антител после каждой инъекции вакцин и их ведущее значение в поствакцинальном иммуногенезе.

6. Установлена высокая корреляционная связь между концентрацией иммуноглобулинов в сыворотке крови иммунных щенков и титром противовирусных специфических антител соответствующего изотипа. Так у подопытных животных установлена положительная корреляция результатов между количественным содержанием и титром специфических антител к парвовирусу собак (г = 0,9, Р < 0,05), аденовирусу первого (г = 0,6, Р < 0,05) и второго (г = 0,76, Р < 0,05) серотипов. Аналогичная высокая корреляционная связь установлена между количественным уровнем 1§М и титром ^М-специфических антител к СРУ-2 (г = 0,87, Р < 0,05), САУ-1 (г = 0,69, Р < 0,05) и САУ-2 (г = 0,75, Р < 0,05) соответственно.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Тест-системы на основе непрямого твердофазного ИФА могут быть рекомендованы в качестве методов оценки иммунного статуса, контроля антигенной активности соответствующих компонентов моно- и поливалентных вакцин, а также в качестве дополнительных методов диагностики парвови-русного энтерита, инфекционного гепатита и аденовироза собак.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Всестороннее изучение формирования гуморального иммунного ответа у млекопитающих (в т.ч. и собак) и птиц в процессе постинфекционного и поствакцинального иммуногенеза является важным направлением ветеринарной иммунологии. Поскольку иммуноглобулины являются важнейшей составной частью гуморальной иммунной системы, то их количественный анализ и оценка распределения антител, относящихся к их основным изотипам, дают важную информацию об иммунологическом состоянии организма на различных этапах иммуногенеза. Многие вопросы специфической профилактики, диагностики инфекционных и инвазионных заболеваний невозможно решать без глубокого знания природы и функциональных свойств иммуноглобулинов каждого изотипа, динамики их изменений в норме и в процессе иммуногенеза и той роли, которую они играют в иммунном ответе.

Несмотря на то, что имеются работы отечественных и зарубежных авторов, посвященные изучению иммунного статуса собак, до настоящего времени остаются неосвещенными многие вопросы, связанные с изучением структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов животных данного вида, изменением уровня иммуноглобулинов и изотип-специфических антител в норме и в процессе иммуногенеза.

Решение проблемы, связанной с изучением природы и функций иммуноглобулинов различных изотипов, обнаруженных в иммунной системе собак, представляет глобальный интерес не только для фундаментальной ветеринарной иммунологии, но также способствует дальнейшему изучению инфекционных болезней, разработке и совершенствованию методов иммунодиагностики, поиску и применению средств иммунокоррекции и иммунопрофилактики животных (ЬЛ.ОегзЬлут е1 а1, 1995; Ы.Т.Оогшап, 1995; ГЯ.'Пгагс!, 2003 и др.).

Для проведения подобных исследований необходимы высокоспецифические реагенты на основе поли- и моноклон ал ьных антител к отдельным классам иммуноглобулинов, которые позволяют не только выявлять, но и количественно определять содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови и распределение специфических антител по отдельным изотипам Ig's. Наличие таких реагентов и очищенных антигенов способствует разработке и совершенствованию разноплановых диагностических тест-систем, предназначенных для оценки состояния гуморального звена иммунитета, что имеет не только прикладное значение, но и представляет значительный интерес для ветеринарной науки в целом, способствуя дальнейшему изучению инфекционных болезней и иммунной регуляции у животных.

В настоящее время в клинико-лабораторных исследованиях помимо традиционных серологических тестов (РН, РНГА, РТГА и др.), направленных на выявление вирусспецифических антител, большое практическое значение приобрел метод ИФА (В.Н.Сазонкин, В.И.Уласов, 1995; G.Mazza et al. 1994; T.Gemma et al. 1996; R.D.Jones et al., 2000; C.Leandro et al., 2001; T.Waner et al. 1998, 2003 и др.). За рубежом уже появились коммерческие ИФА-наборы, предназначенные для обнаружения IgG- и IgM- специфических антител к вирусу чумы и парвовирусу собак (фирмы Biogal Galed Labs., Израиль; Ingenaza, Испания и др.).

В результате проведенной ранее работы, в лаборатории иммунологии и биотехнологии ВИЭВ были получены и охарактеризованы моноспецифические реагенты к иммуноглобулинам собак. Опытным путем была показана принципиальная возможность их использования в тест-системах на основе РИД и ИФА для оценки распределения и количественного анализа изотипов иммуноглобулинов и определения уровня изотип- специфических антител к вирусным антигенам в иммунном ответе (А.А.Лисицина, 1997; О.А.Верхов-ский, 1998).

В связи с этим основной целью нашей работы был анализ гуморального иммунного ответа на основе оценки изотип-специфического распределения антител и количественного определения уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови собак в процессе поствакцинального иммуногенеза после применения отечественных биопрепаратов. Кроме того, эти исследования определяли возможность использования методов ИФА для характеристики антигенных свойств вирусных компонентов, входящих в состав вакцинных препаратов использовавшихся в наших опытах и широко распространенных на ветеринарном рынке России.

Исходя из этого, на первом этапе нашей работы решались следующие основные задачи: отработка методов получения и идентификации вирусных антигенов, характеристика поли- и моноклональных антител к иммуноглобулинам собак и отработка на их основе методов РИД и ИФА для количественного и качественного анализа изотипов ^'э. Методологической основой служил опыт отечественных и зарубежных исследователей в этой области (О.А.УегкЬоУБку е1 а1., 1996; В.В.Вахромеева, 2000; Б-А^сив ег а1., 1985; Р.ЬЛЧага а1., 1983; Ь.А.Наггеш^еп е1 а1., 1997; Т.\\Ъпег & а1., 1998, 2003 и ДР-)

При отработке иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления и 1§М- специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак в сыворотке крови животных, были использованы соответствующие вирусные антигены, полученные с помощью ультрацентрифугирования в линейном градиенте плотности 1,32 - 1,45 г/л СбС1 или после очистки методами гидрофобной и анионообменной хроматографии. Идентификацию и определение антигенной активности полученных и используемых в ИФА препаратов проводили методом электрофореза в ПААГ-ДСН с последующим иммуноблоттингом с использованием соответствующих контрольных сывороток и ранее полученных моноклональных антител. В качестве конъюгатов были использованы моноспецифическая антисыворотка к и монокло-нальные антитела к ^М собак, меченные пероксидазой хрена, обладающие высокой степенью аффинности и сохраняющие свои иммунобиологические свойства после перйодатного окисления. Результаты проведенных исследований показали, что полученные конъюгаты строго моноспецифичны по отношению к и 1§М соответственно и не обладают перекрестной активностью по отношению к другим изотипам иммуноглобулинов собак. При отработке условий постановки ИФА были установлены рабочие разведения им-мунопероксидазных конъюгатов (анти- собаки - 1:2000 и анти- 1§М собаки - 1:500) и концентрации каждого вирусного антигена, составляющие 2 мкг/мл для СРУ-2 и 1 мкг/мл для САУ-1 и САУ-2. Далее были подобраны условия сорбции основных иммунологических реагентов при постановке ИФА. Так для сенсибилизации вирусных антигенов в лунках полистироловых микропанелей был использован 0,05 М карбонатно-бикарбонатный буфер, рН 9,6, для разведения испытуемых проб и конъюгатов был выбран стандартный фосфатно-буферный раствор, в качестве промывочного буфера использовался этот же буфер, содержащий 0,05% твина-20. В качестве раствора, блокирующего несвязавшие белок участки пластика, был выбран ФБРТ, содержащий 2% БСА.

Для характеристики отработанных тест-систем были исследованы сыворотки крови собак (п=81) с определенным титром специфических антител в РТГА и известным анамнезом. Анализ результатов исследований по выявлению ^в-специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак в испытуемых пробах с помощью ИФА и вирус-специфических антител в РТГА свидетельствует о том, что в большинстве случаев наблюдалось совпадение в интерпретации результатов ИФА и РТГА. Так, все РТГА- положительные пробы (п=69) были положительными и в ИФА, а из 12 РТГА- отрицательных проб в ИФА 3 пробы были положительными на СРУ-2 и в двух пробах присутствовали антитела к аденовирусам собак обоих серотипов.

Для количественного определения уровня иммуноглобулинов трех основных изотипов в испытуемых сыворотках крови был отработан метод радиальной иммунодиффузии по Манчини (С.Мапсни е1 а1., 1965) с использованием моноспецифических антисывороток к и к ^А и МкА 1Г4 к ^М собак. Опытным путем были установлены оптимальные разведения моноспецифической антисыворотки к собак -1:30, моноспецифической антисыворотки к ^А собак - 1:20 и концентрация моноклональных антител 1Г4 — 4 мкг/мл. Для определения концентрации и ^М объем вносимой пробы в агарозный гель составлял 1 мкл/ лунку и для определения концентрации ^А - 2 мкл/лунку. При постановке РИД в качестве стандартных препаратов были использованы иммунохимически чистые препараты ^М и ^А собак полученные и охарактеризованные ранее в лаборатории иммунологии и биотехнологии ВИЭВ (О.А.Верховский, 1998).

Таким образом, в результате проведения первого этапа нашей работы была отработаны методики постановки ИФА по обнаружению ^О- и ^М-специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак и РИД для определения концентрации 1§М и 1§А в сыворотке крови животных. Эффективность использования аналогичных методов при изучении иммунной системы собак в норме и после экспериментального заражения и/или воздействия биопрепаратов была продемонстрирована в ряде работ зарубежных исследователей (Р.Ь.Ыага е1 а1., 1983; Т.Я.РЫШрз & а1., 1989; Ь.А.НаггепБ^еп е1 а1., 1997; Я-О.-Гопез ег а1., 2000; А.Т1роМ е1 а1., 2001; M.E.Griot-Wenk е1 а1., 2001; Т.8ота а1., 2003; H.HogenEsch & а1., 2002, 2004 и др.).

Поскольку отработанные тест-системы на основе РИД и ИФА предназначены для количественного и качественного анализа изотипов иммуноглобулинов собак, наши основные эксперименты были посвящены характеристике В-системы иммунитета у щенков в процессе иммуногенеза, обусловленного воздействием отечественных поливалентных вакцин применяемых для профилактики инфекционных болезней.

В качестве опытных моделей было использовано 20 двухмесячных беспородных щенков и помесей, сформированных в группы по принципу аналогов и иммунизированных отечественными поливалентными вакцинами, содержащими в своем составе аттенуированный вирус чумы и инактивирован-ные возбудители парвовирусного энтерита, аденовироза и лептоспироза собак. Для проведения исследований использовали цельную кровь и сыворотки крови щенков, полученные на 0, 4, 7, 10, 14, 21-е сутки после первичной вакцинации и на 5, 9, 14 и 21-е сутки после вторичной. У пяти ревакцинированных через 4 месяца щенков, кровь была взята непосредственно перед инъекцией вакцины, далее на 3-е, 7-е и 14-е сутки п.и. соответственно.

Анализ гематологических показателей подопытных животных позволил установить, что вакцинация отечественными препаратами не вызывала нарушений в иммунной системе щенков и они оставались клинически здоровыми в течение всего эксперимента. После первой вакцинации было отмечено достоверное увеличение содержания палочкоядерных нейтрофилов и эозинофилов, после второй и третьей - их содержание достоверно не изменялось. При этом было показано, что в процессе поствакцинального иммуногенеза средние значения содержания лейкоцитов, сегментоядерных нейтрофилов, базофилов, лимфоцитов и моноцитов в периферической крови оставалось практически без изменений.

По результатам проведенных опытов было установлено, что содержание 1§М и ^А в сыворотке крови щенков до опыта составляло 5,35 ± 0,52, 1,68 ± 0,24 и 0,40 ± 0,06 мг/мл соответственно, что сопоставимо с данными отечественных и зарубежных исследователей, определивших средние величины количественного содержания сывороточных иммуноглобулинов у собак аналогичного возраста (К.М.БсЬшайгшап, 1984; Я.М.Ье^чз и С.А.Рюи!:, 1989; О.А.Верховский, 1998; Ю.Н.Федоров с соавт., 2000 и др.). При этом первичный, вторичный и третичный поствакцинальный иммунный ответ у щенков приводил к изменению иммуноглобулинового профиля в крови животных.

Так, первичный иммунный ответ характеризовался достоверным увеличением общего количества 1§М и 1§А, пик которых зарегистрирован на 10-е сутки п.и. При вторичном иммунном ответе в сыворотке крови иммунных щенков не происходило достоверных изменений концентраций иммуноглобулинов данных изотипов. После ревакцинации щенков было отмечено увеличение содержания иммуноглобулинов данных изотипов, однако эти изменения не являлись статистически достоверными и лишь отражали динамику формирования иммунного ответа.

Анализ полученных результатов показал, что наблюдалась выраженная зависимость содержания 1§0 от сроков формирования поствакцинального иммунного ответа. Так его концентрация в сыворотке крови подопытных щенков достоверно увеличилась на 14-21-е сутки после первой вакцинации и достигла максимальных значений (9,70 ± 0,50 мг/мл) на 9-е сутки после повторной инъекции вакцины. Через 4 месяца уровень незначительно снизился, а к 14-м суткам после проведения ревакцинации вновь увеличился до 9,12 ± 0,31 мг/мл (срок наблюдения).

Результаты наших исследований по определению концентрации 1§М и 1§А в сыворотке крови двухмесячных щенков показали, что в поствакцинальный иммуногенез вовлечены иммуноглобулины всех трех изотипов, при этом ведущую роль в количественном отношении играет

Подобные исследования на щенках ранее не проводились, однако, есть результаты, опубликованные А.Зйгаззег с соавт. (2003), свидетельствующие о том, что вакцинация собак приводила к повышению концентрации 1§С и усилению гемолитической активности комплемента. В опытах, проведенных H.HogenEsch с соавт. (2002, 2004), вакцинация взрослых собак (старше 2-х летнего возраста) приводила к увеличению содержания в сыворотке крови только ^Е.

Повсеместное использование вакцин в качестве основного звена в системе мер борьбы против инфекционных болезней собак предопределяет разработку и совершенствование методов оценки их иммунологической эффективности, напряженности иммунитета и осуществления иммунологического мониторинга. Поэтому, исходя из цели и задач нашей работы, заключительная часть исследований была посвящена определению динамики титров антител к СБУ, СРУ-2, САУ-1 и САУ-2 с помощью традиционных серологических тестов и определению динамики содержания ^М- и специфических антител к СРУ-2, САУ-1 и САУ-2 в ИФА в сыворотке крови щенков в процессе поствакцинального иммуногенеза.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что у большинства подопытных двухмесячных щенков в сыворотке крови были обнаружены антитела ко всем вирусам, выявляемые как в ИФА, так и в РНГА, РН и РТГА. Однако их уровень не достигал необходимого протективного значения, обеспечивающего защиту от вирулентного возбудителя. После проведения первой и второй вакцинации у всех исследованных животных формировался выраженный гуморальный иммунный ответ. Было установлено, что во всех случаях специфические антитела к парвовирусу и аденовирусам собак первого и второго серотипов являлись доминирующим изотипом антител, как при первичном, так и при последующих иммунных ответах (вторичном и третичном). При этом максимальный титр ^О- антител к СРУ-2 был установлен на 21-е сутки после первой вакцинации, на 14-21-е сутки после второй и на 14-е сутки после третьей. Поствакцинальный гуморальный иммунный ответ к САУ-1 и САУ-2 характеризовался достоверным увеличением содержания ^О- антител на 10-е сутки после первой вакцинации, на 9 — 14-е сутки после второй и на 7 - 14-е сутки после третьей.

Во всех экспериментах достоверное увеличение содержания вирусспе-цифических 1§М- антител происходило только на ранней стадии первичного иммунного ответа. При этом максимальный титр антител данного изотипа к СРУ-2 установлен на 10-е сутки, к САУ-1 - на 7-е сутки и к САУ-2 - на 7-10-е сутки после первой вакцинации.

Наши результаты по изучению первичного иммунного ответа в значительной степени совпадают с результатами Т.\\/апег с соавт. (2003), которые изучали динамику содержания 1§С- и 1§М- специфических антител к СБУ и СРУ-2 в сыворотке крови 10 щенков, однократно иммунизированных поливалентной вакциной. По их данным, полученным с помощью дот- ИФА, высокий уровень ^М-антител к СРУ-2 был зафиксирован на 7-е сутки, а антител аналогичной специфичности - на 9-е сутки после вакцинации. При этом ^М-антитела к СБУ были обнаружены в высоком титре на 9-е сутки п.и., и затем достигали своего максимального значения на 12-е сутки п.и. антитела к СБУ были выявлены в сыворотке крови подопытных щенков на 9-е сутки после вакцинации.

Во всех случаях результаты ИФА сопровождались результатами традиционных серологических тестов, также свидетельствовавших о формировании поствакцинального гуморального иммунного ответа у щенков. Во всех случаях установлена статистически достоверные различия между уровнем антител у животных до и после вакцинации (Р < 0,01). Высокая положительная корреляция результатов, полученных с помощью ИФА и РТГА, была установлена при определении титра антител к СРУ-2 (г=0,77, Р < 0,05), САУ-1 (г=0,9, Р < 0,05) и САУ-2 (г=0,79, Р < 0,05).

Результаты наших экспериментов по определению специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак первого и второго серотипов методами ИФА и РТГА, показавшие положительную корреляцию результатов, полученных с помощью этих двух методов, сопоставимы с результатами исследований проведенных ранее зарубежными авторами. Так З.А.Пвсш с со-авт. (1985) предложили конкурентный вариант ИФА с использованием моно-клональных антител для выявления антител к парвовирусу собак. Авторы установили высокую степень корреляции результатов, полученных с помощью ИФА, РН и РТГА. В их опытах в ИФА отрицательными оказались 87,9% сывороток крови, имеющих титры < 1:4 в РН и 1:10 в РТГА, положительными в ИФА были 94,4% сывороток с титрами > 1:64 в РН и 1:80 в РТГА. На основе полученных данных авторы рекомендовали ИФА для мониторинговых исследований щенков, направленных на обнаружение материнских антител к парвовирусу и определения сероконверсии у собак после вакцинации.

В заключение нами впервые был проведен корреляционный анализ динамики содержания общего количества иммуноглобулинов в- и М- изотипов и титров и 1§М- специфических антител к парвовирусу и аденовирусам собак в процессе формирования поствакцинального противовирусного гуморального иммунного ответа у щенков. Установлена высокая корреляционная связь между количественным уровнем 1§0, определенным в РИД, и титром

-специфических антител к СРУ-2 (г = 0,9, Р < 0,05), к САУ-2 (г = 0,76, Р < 0,05) и к САУ-1 (г = 0,6, Р < 0,05) определенными в ИФА. Аналогичные данные были получены при вычислении корреляционной связи между содержанием 1§М и титром вирусспецифических ^М- антител. При этом цифровые значения коэффициента корреляции составили в системе концентрация ^М / титр ^М-специфических антител к СРУ-2 - 0,87, концентрация ^М / титр 1§М-специфических антител к САУ-2 — 0,75 и концентрация ^М / титр ^М-специфических антител к САУ-1 - 0,69.

Таким образом, суммируя весь изложенный в настоящей работе материал, можно сделать общее заключение о том, что в результате проведенных исследований дана оценка эффективности и показана принципиальная возможность использования разработанных тест-систем на основе непрямого твердофазного ИФА для определения уровня изотип-специфических антител к антигенам СРУ-2, САУ-1 и САУ-2 в сыворотке крови щенков. С их помощью можно проводить сравнительный анализ и достоверную оценку иммунологических процессов, возникающих в организме собак в ответ на имму-ногены разной природы.

Методами ИФА и РИД изучена динамика содержания вирус-специфических и 1§М- антител и количественных изменений трех основных изотипов иммуноглобулинов в сыворотке крови щенков в процессе поствакцинального иммуногенеза.

Результаты данных исследований имеют важное значение, как для фундаментальной ветеринарной иммунологии, так и в прикладных аспектах. В частности, данные методы могут быть использованы для изучения действия различных биопрепаратов на иммунную систему собак, при проверке антигенных свойств соответствующих вирусных компонентов, входящих в состав поливалентных вакцин, применяемых в нашей стране для специфической профилактики инфекционных болезней собак. При этом использование разработанных тест-систем, предназначенных для оценки состояния гуморального звена иммунитета, будет способствовать дальнейшему изучению инфекционных болезней плотоядных и иммунной регуляции у собак.