Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Функциональное состояние рецепторного аппарата нейрофилов в зависимости от изменений их метаболизма приразличных антигенных, фармакологических и других воздействиях и при ишемической болезни сердца

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Российский научно-исследовательский противочумный _институт „Микроб"_

На правах рукописи УДК 616.165.34—615.015:616-006.4 ЧАЛЫК Наталия Евгеньевна

Функциональное состояние рецепторного аппарата нейтрофилов в зависимости от изменений их метаболизма при различных антигенных, фармакологических и других воздействиях и при ишешческон болезни сердца

14.00.36.— аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов -1992

Работа выполнена в Саратовском филиале Ленинградского научно-исследовательского института кардиологии.

Научные руководители: доктор медицинских неук М.Ю.Ледванов,

Заслуженный деятель науки РСФСР, — доктор медицинских наук, профессор Э.Ш.Халфен

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Г.Г.Ордова, доктор медицинских наук Л.Н.Шанина

Ведущая организация:

Саратовский медицинский институт

Защита диссертации состоится 1993 г. в

"/у" часов минут на заседании специализированного Совета

К 074.32.01 по присуждению ученой степени кандидата наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071, г. Саратов, Университетская ул., 46).

С диссертацией ыожно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Автореферат разослан ""

ОШХ^НлЛ 1992 г.

- Ученый секретарь специализированного Совета~ кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник З.М.Девдариани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Существенной особенностью соЕременкого rana развития клинической медицины является анализ фиэкологиче-ких и патологических процессов в аспекте иммунологических эаконо-зрностей. Иммунологические подходы служат кратчайшим путем реали-ации достижений экспериментальной медицины в решении сложных . эактических проблем (Хаитов P.M., Атауллаханов Р.И., 1986; Верея-ш U.M., 1988; Лященко В.А. с соавт., 1988; Земсков В.М. с соавт., Ю9; Кульберг А.Я, с соавт., 199Г; Bornsen, т. et al., 1983; Leh-эаеп L. et al., 1989 и.др,). Одной из важных практических задач шлется изыскание способов коррекции иммунных нарушений, как пра-wo, возникающих в процессе развития многих патологических со-•ояний.

В интегральном эффекте всех клеточных компонентов иммунной стемы существенная роль отводится нейтрофилам, которые составлп-1 наиболее многочисленную популяцию лейкоцитов, влияют на все arm воспалительной реакции и осуществляют фагоцитарную функцию ебедев К.А., Понякина И.Д., 1990). Оценка иммунного статуса ор-низма предусматривает как веяный этап определение функциокельно-состо.яния нейтрофилов, их рецепторного аппарата (ИаянскиЙ А.Н., 86), в механизмах регуляции которого особое значение придается рмированию первичного сигнала при взаимодействии иммуноглобули-в с Fc-рецепторами (Пол У., Сильверстайн А., Купер М. и др., 37-1988; Флоренс А.Т., 1980).

Известно, что различные вещества экзогенного и эндогенного про-сождения могут активно воздействовать in vivo и in vitro на ябрпняне структуры нейтрофилов и изменять экспрессию их поверх-;тных рецепторов (Земсков В.М. с соавт., 1981; Лящгстго В.А. с 1ВТ,, I960; LBiitonnn х. ot si., 1989).

Исследование'влияния эндогенных регуляторных молекул, поверхностных антигенов, синтетических полимерных имыуномодуляторов, фармакопрепаратов, растительных лектинов на экспрессию поверхностных PcR нейтрофилов может иметь значение в плане изыскания путей направленного действия на юлунокомпетентные клетки и прогнозирования аф$ективности иммунотерапии. В связи с возрастающим коли- . чеством агентов, способных изменять активность иммуцокомпетентных клеток, возникает необходимость выяснения общих закономерностей их эффектов. -

Важная роль в развитии ряда хронических и воспалительных заболеваний принадлежит процессам свободно-радикального окисления биомеыбран (Дубинина Е.Е., 1989). Стимулированные нейтрофилы выделяют высокореактивные и цитогоксичные производные кислорода, которые являясь высоко реакционными молекулами могут оказаться токсичными для собственных тканей, индуцируя окислительную деструкцию клеток и способствуя развитию воспалительных реакций (Eomson j. et al., 1984). Поэтому представляется важный определить возможность' регуляции функциональной активности нейтрофилов путем модификации их окислительного метаболизма.

В связи с вышеизложенным возникает необходимость проведения сравнительных исследований по определению особенностей функционирования рецепторного аппарата нейтрофилов у здоровых людей и при конкретной патологии. С этих позиций особый интерес вызывает такое» серьезное и широкораспространенное заболевание как ишемическая болезнь сердца (ИБС). Это обусловлено тем, что в инициации и развитии процессов альтерации и репарации преинфархтной зоны шемизи-рованного миокарда ключевая роль принадлежит нейтрофилам ( Lautsch Е., 1979; Del Maestro в., et al. 1980; Romsoa J. 1983). Установлено, что миграция полиморфно-ядерных нейтрофилов в миокард со свеяим инфарктом, их активация,представляют собой начальную фазу

сложного процесса, включающего разрушение и последующую организацию пораженной ткани и повергающегося заменой некротического, миокарда фиброзной рубцовбй тканью. Однако в настоящее время в литературе практически отсутствуют сведения о функциональном состоянии рецепторного аппарата нейтрофилов, механизмах его регуляции и связи с метаболизмом этих клеток при ишемической болезни сердца. В то ие время понимание механизмов этих процессов способствовало бы разработке новых фармакологических подходов к ограниченно зоны некроза при остром инфаркте миокарда. Не исключена также воэмояность использования количественных критериев, отражающих структурную и функциональную организацию рецепторного аппарата нейтрофилов, для дифференциальной диагностики инфаркта миокарда.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Изучение структурной и функциональной организации рецепторного аппарата нейтрофилов, установление роли метаболизма кислородных радикалов в механизмах его регуляции и определение возможности использования данных показателей в плане усовершенствования дифференциальной диагностики острого инфаркта миокарда и стенокардии.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. В соответствии с поставленной целью в задачи исследования входило:

1. Проследить связь между состоянием рецепторного аппарата нейтрофилов, активностью их антиоксидантной системы защиты и готовностью к заверленному фагоцитозу.

2. Изучить влияние метаболических факторов (ферментных, анти-зксндантных, прооксидавтных) на функциональное состояние рецептор-того аппарата нейтрофилов, активность антиоксидантной системы заняты нейтрофилов и их способность к заверленному фагоцитозу.

3. Определить состояние рецепторного аппарата нейтрофилов с тамощью ипгибиторног'о внализа и при использовании фармакологических препаратов.

4. Разработать клинически адаптированный метод определения функционального состояния рецепторного аппарата'нейтрофилов периферической крови и провести сравнительные исследования у здоровых людей, больных стенокардией и острим инфарктом миокарда.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые изучен процесс формирования лиганд-рецепторного комплекса на мембране нейтрофилов периферической крови человека под влиянием широкого спектра различных веществ экзогенного и эндогенного происхождения (метаболически активных соединений, антигенов, иммуномодуляторов, фармакологических препаратов) Получены новые данные о зависимости интенсивности флюоресценции трах морфологических форм свечения (кэпы, пэтчи, ринги) и количества образующих их клеток от характера воздействия веществ на метаболизм нейтрофшюв. Впервые посредством ингибиторного анализа процессов кэпообразования с использованием соединений антиоксидантного действия, установлена взаимосвязь экспрессии рецепторов с изменениями кислородаависимого метаболизма нейтрофилов и показана возможность регулирования этих процессов. Представлены новые закономерности, отражающие прямую корреляцию между изменениями активности рецепторного аппарата мембранных структур нейтрофила и функцйей всей клетки под воздействием эндогенных регуляторных молекул, бактериальных и вирусных антигенов, иммуномодуляторов различной природы.

Получены новые данные о функциональном состоянии рецепторного аппарата нейтрофилов у больных стенокардией напряжения. Показано снижение процессов кэпообразования за счет уменьшения общей сорбции лигацда у больных, по сравнению со здоровыми людьми. Впервые установлено, что физическая нагрузка на организм больных стенокардией способствует дальнейшему .подавлению экспрессии рецепторов и приводит к резкому сокращению количества ДОГ-положигельных клеток и уменьшению ПАН.

Новыми являются данные о структурных и функциональных изменениях рецепторного аппарата нейтрофилов при остром трансмуральтом инфаркте миокарда. Сдвиги проявляются в значительном снижении общей сорбции лиганда, увеличении процессов спонтанной агрегации, уменьшении энергозависимых ассоциаций лиганд-рецепторных комплексов и в конечном итоге повышенной ригидностью мембран. При сравнении количественных показателей функциональной активности нейтрофилов у больных инфарктом миокарда и стенокардией впервые были обнаружены значительные различия, проявляющиеся в первую очередь в разной интенсивности флюоресценции мембран типа "нэп", что послужило основанием для рекомендации включить данный критерий в комплекс тестов для дифференциальной диагностики инфаркта миокарда.

: ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Разработан клинически адаптированный способ дифференциальной диагностики острого инфаркта миокарда и стенокардии, основанный на различиях количественных показателей функционального состояния рецепторного аппарата нейтрофилов периферической крови у этой категории больных. Метод предложен в качестве дополнительного к общепринятому комплексному обследованию больных. Определены количественные критерии оценки функционального состояния рецепторного аппарата нейтрофилов, которые могут иметь значение в качестве потенциального индикатора объема повреждения миокарда и характеристики восстановительных процессов.

Выявленная взаимосвязь между функциональной активностью рецепторного аппарата нейтрофилов, их фагоцитарной активностью и характером изменений антиоксидантной системы защиты нейтрофилов может иметь значение в плане изыскания путей коррекции иммунных процессов в организме при разработке рациональной патогенетической терапии заболеваний.

ВДВДРШда В ПРАКТИКУ. По материалам работы изданы и внедрены методические рекомендации "Определение количестветгах критериев

функционально-структурных изменений рецепторного аппарата нейтро-филов периферической крови для дифференциальной диагностики острого инфаркта миокарда и стенокардии". Материалы диссертации используются при чтении лекций по клинической фармакологии студентам Саратовского медицинского института. Получено авторское свидетельство № 1704011 на изобретение "Способ дифференциальной диагностики острого инфаркта миокарда и стенокардии". Предложенный способ применяется. в практической работе Саратовского филиала Ленинградского НИИ кардиологии, терапевтическом отделении 2-й городской больницы, о чем имеются соответствующие акты о внедрении.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Характеристика формирования лиганд-рецепторного' комплекса на мембране нейтрофилов периферической крови человека под влиянием широкого спектра различных веществ экзогенного и эндогенного происхождения.

2. Зависимость интенсивности флюоресценции трех морфологических форм свечения (кэпы, пэтчи, ринги) и количества образующих их нейтрофилов от характера воздействия веществ на кислород-зависимый метаболизм клеток.

3. Закономерности, отражающие прямую корреляцию между изменениями активности рецепторного аппарата и функцией нейтрофила в целой.

4. Новые данные сравнительного анализа показателей функциональной активности рецепторного аппарата нейтрофилов периферической крови здоровых людей, больных стенокардией и острым инфарктов миокарда.

5. Способ дифференциальной диагностики острого инфаркта миокарда и стенокардии, основанный на различиях количественных показателей функционального состояния рецепторного аппарата нейтрофилов периферической крови больных.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, Саратов, 1985 г.

- Ш Областной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Труд и здоровье в условиях научно-технического прогресса на селе", Саратов, 1987 р. .

- научно-практической конференции Саратовского филиала Ленинградского НИИ кардиологии, Саратов, 1988 г.

- научно-практической конференции, посвященной 80-летюэ Саратовского медицинского института, Саратов, 1989 г.

- расширенной конференции лаборатории шемической болезни сердца Саратовского филиала Ленинградского НИИ кардиологии и лаборатории клеточного иммунитета РНИТНИ "Микроб", Саратов, 1992 г.

ПУБЛИКАЦИИ. Основное содержание диссертации отражено в 9>опубликованных работах.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения и выводов. Общий обгем диссертации 183 страницы. Работа иллюстрирована 26 таблицами и 24 рисунками. Библиографический указатель включает 180 источников, из них 70 отечественных и НО зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ. Использовались образцы крови 146 практически здоровых лиц. Объектом исследования являлась капиллярная и венозная кровь, которую забирали путем пуннтирования кубитальной вены сухой иглой с широким просветом.

В работе представлены также данные обследования 117 больных ишемической болезнью сердца, страдающих стенокардией напряжения (96 человек) и инфарктом миокарда (21 человек). Все больные были госпитализированы в клинику Саратовского филиала Ленинградского

НИИ кардиологии vi терапевтическое отделение 2-Й городской больницы за период 1986-1990 гг.

В контрольную группу вошли 23 донора, у которых при клиническом обследовании не было выявлено изменений со стороны сердечнососудистой системы.

В работе был применен комплекс различных методов исследования (иммунологических, биохимически^ и клинических). Исследования проводились Ш vivo И in vitrei

Для изучения функционального состояния рецепторного аппарата нейтрофилов использовался ишунофлюоресцентний метод, включавший вьщеление гранулоцитов в градиенте плотности верографин-фиколл (1,077-1,078 г/см3),

обработку выделенных клеток люминесцентными коньогатами кроличьих иммуноглобулинов против глобулинов человека (коммерческие препараты) и оценку результатов путем подсчета средних величин интенсивности трех морфологических форм свечения мембран (кэпы, лэтчи, ринги) с одновременным подсчетом их процентного соотношения. При изучении морфологических типов свечения мембран рассчитывали также ряд дополнительных показателей (Кульберг А.Я. с соавт., 1988), таких как общая сорбция лигшада, энергозависимая ассоциация лиганд-рецепторного комплекса (ЛРК), спонтанная агрегация ЛРК, выраженность парабиоза, ригидность мембран, шэдинг ЛРК, Для проведения оценки функциональной активности нейтрофилов человека по реакции восстановления нитро-синего тетразолия (HGT-тест) использовали нейтрофилы цельной крови. Данный способ позволял определить индекс активации нейтрофилов (ИАН) и количество фо] казан-положительных клеток (НСТ+) капиллярной крови.

Активность суперонсиддисмутазы (КФ.1.15.1.1) определяли по методу Nishikimi м. et aií 1972) и yried B.(I975).

Больным стенокардией напряжения проводилась велоэргометриче-скал проба (ВШ) в положении сидя на велоэргометре типа 380В фирм:

"Сименс-Згсеиа", снабженном электронным устройством, позволяющим три различном числе оборотов педалей сохранять одну и ту же мощность рабочей нагрузки (60 об/мин).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Первая серия экспериментов была посвящена ингибитор-1 о и у анализу процесса кэпообразования. Изучена роль "ловушек" кислородных радикалов (супероксидцисмутазы, каталазы, ланнитола и др.) в защите клеток от оксидантов с мощным энергетическим потенциалом, которые в числе'разнообразных эффектов вызывает пероксидацто липидов и денатурация структурних балков. Последнее ведет к разрушению биологических мембран и лизису клеток-миие-лей.

Получено достоверное снижение интенсивности свечения кэпов, 1этчей и рингов при внесении в инкубационную среду СОД, каталазы, дагнитола, Наиболызее снижение интенсивности всех трех морфологических форм свечения наблюдалось в присутствии перекиси водорода. 1ри использовании сочетаний различных модификаторов наиболее аффективным суммарным ингибирующим действием обладала СОД в сочетании с ¿ачкитолом - интенсивность свечения кэпов и пэтчвй значительно / Д!вньшалась. Существенное, но менее выраженное уменьшение процес-;ов образования ЛРК на поверхности нейтрофилов наблюдалось при вне-зении в среду инкубации СОД одновременно с- кат-алазой, а также ката-газы в сочетании с маннитолом. Уменьшение интенсивности свечения '.эпоо в опытах с использованием СОДшаннитол и СОД+каталаза шло на [юне уменьшения числа кэппирующих клеток и роста клеток, образующих пэтчи и ринги.

Таким образом, ингибиторний анализ процесса кэпообразования гейтрофилов с использованием "ловуиек" кислородных радикалов вышил существенную роль последних в агрегации ЛРК. Очевидно, присут-

СОД ваталаза маннитол , Н2О2

1-р-ор Хенкса, 2- 10".%, 3-Ю"4 М, 4-ГСГ5М

Рис. I. Влияние "ловушек" кислородных радикалов на уровень люминесценции (сит хДО-З) кэяов(О) и их количество СИ)

ствие в среде антиоксидантов в различных сочетаниях приводит к определенным сдвигам в энергетическом потенциале клетки и изменению функциональной активности рецепторного аппарата.

Следующий раздел ингибиторного анализа касался исследований кэпообразования в системах, генерирующих кислородные радикалы. Известно, что нейтрофил располагает метаболическими субстратами и всем ферментным каскадом необходимым для образования метаболитов с широким спектром биологической активности (Ыаянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989). Исследования', проведенные в присутствии фенозинмоносульфата (ФМС), НАДН, ксактина, ксантиноксидазы, гидроарахидоновой и арахидоновой кислот были направлены на установление сдвигов в обменных процессах ней-трсфилов по показателям активности важнейшего фермента кислородного .метаболизма - супероксиддисмутазы и зависимости от этих сдвигов

способности клеток к образованию ЛРК на их поверхности. Одновременно предполагалось выявить в этих условиях резервную функциональную активность фагоцитов.

Установлено, что при внесении в среду инкубации <Й!С процесс спонтанного кэпообразования .возрастает в 3 раза за счет уменьшения рингообразования (в 2 раза). Количество клеток, образующих кэпы, уменьшается, но повышается сродство РсН к лиганду - интенсивность свечения мембран кзпов достоверно увеличивается. Инкубация нейтрофилов с НАДО приводит х ингибированию процессов кластеризации, как энергозависимых, так и спонтанных. Уменьшается количество клеток, образующих кэпы и пэтчи, и увеличивается почти в 2 раза количество клеток, образующих ринги. Интенсивность свечения кэпов заметно уменьшается. Активность антиоксиданткой системы защит клеток в присутствии ФМС и НАДН увеличивается незначительно. НСТ-тест выявил следующие закономерности: снижение количества НСГ-положитель-

чых клеток в 3 раза при внесении нейтрофилов в среду, содержащую 7

ИС (Ю- М), и увеличение в 1,5 раза в случае нахождения в среде 1АДН (Ю-б-Ю"7М). ,

Ингибирование процессов кластеризации наблюдалось и в присут-5твии ксантина и ксантиноксидазы, что выражалось в уменьшении интенсивности свечения кэпов. Количество рингов в присутствии ксантина и ксантиноксидазы возрастало в 2-3 раза. Содержание СОД в тетках изменялось в зависимости от концентрации. Существенное из-юнение показателей НСТ-теста наблюдалось лишь при совместном при-!енении ксантина и ксантиноксидазы.

При изучении влияния арахндоновой кислоты на способность кле-ок образовывать ЛРК на своих мембранах было обнаружено возрастало интенсивности свечения кэпов и количества клеток, образующих этчи (1,5 раза). Под влиянием гндроарахидсновой кислоты увеличи-алось количество кэпов с возросшей интенсивностью свечения мемб-

ШС НАда* ксаииш ксантмн- арахидоно- гидроарах.

. рксидаза вая к-та вис-та

Г.-р-ор Хенкса,2- I0"3 II, 3- 10"4М, 4- 10"5Ы

Рис, 2. Кэлообразование в системах, генерирующих ■кислородные радикалы

ран. Содержание СОД в нейтрофилах в присутствии этих кислот увеличивалось (относительно контроля).

Установленный ингибирующий эффект на процессы ценообразования таких веществ как НАДО, ксантина, ксантиноксидазы и активирующий для й!С, арахидоновой и гидроарахидоновой кислот, находятся в зависимости от концентрации этих веществ в инкубационной среде. Очевидно, их присутствие создает условия для генерации анион-радикал£ Og и для его дальнейшего превращения в ОН". Однако, степень воздействия на указанные метаболические процессы у разных веществ ра: лична. Этим в какой-то мере можно объяснить различия в конечном функциональном эффекте шютки.

' Серия опытов по изучению влияния солей металлов переменной валентности (Cu+2, Fe+^, Ре^, 2п Са**", на процессы кластеризации PcR мембран (с

Ьтх Ю

-3

20 -|

18 16 14 12 ТО

и *г

Мд

Са 2 Сы+2

-ь

контроль

ТО"4«

Ю"5Ы

10"бМ

Рис. 3. Влияние металлов переменной валентности на уровень люминесценции шт хЮ"3) кэпов

определением соотношения морфологических форм свечения) проводилась при сопоставлении с показателями восстановления НОТ и содержания СОД в нейтрофилах.

Интерес к этому вызван тем, что данным металлам, особенно ионам железа и меди, многие исследователи ( А4асЪ1 г, at а1., 1983; С\тег:1йЕв 1986; НаШтП в.,Ои«ог1с1ае 1986) отводят определенную роль в развитии процессов, направленных на поражение клеточных мембранных структур. Известно также, что при инфаркте миокарда изменяется уровень в крови таких микроэлементов как Хп , Си , Щ и др.

Проведенный анализ результатов исследований свидетельствует о том, что металлы переменной валентности оказывали существенное влияние на процессы образования кэпов мембранами нейтрофилоп, Уровень люминесценции кэпов носил дозозависимый характер - понижался или не изменялся в присутствии повышенной концентрации металла в среде и возрастал при концентрации, близкой к физиологической.

22

Количество хэппирукяцих клеток соли данных металлов существенно увеличивали. Процесс восстановления нитро-синего тетразолия шел достаточно активно в присутствии , Ре^ и , а влияние на СОД - активность клеток носило дозозависимый характер. Максимальное снижение ферментативной активности наблюдалось при внесении в инкубационную среду ионов и Мс^. Ионы Ре+^, Са+^ практически не влияли на содержание СОД в нейтрофилах, лишь ионы Сего увеличивали.

Можно предположить, что снижение СОД - активности в этих условиях связано с повышением расхода фермента для связывания коротко-живущих кислородных радикалов, активно образующихся в условиях по-шения функциональной активности нейтрофилов, о чем может свидетельствовать усиление процессов кзпообразования.

Что касается хелатирующих металлы агентов, то механизм их действия основан на связывании бивалентных катионов л удалении их с поверхности мембран. Способностью образовывать халаты с металлами обладают зтилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДГА), гидроксиметиламинометан (трис), диэтилдитиокарбамат (ДЦК), ряд лекарственных препаратов.

Процессы кластеризации в присутствии ЗДГА характеризовались достовернш (р [_ 0,01) уменьшением интенсивности свечения кэпов, пэтчей и рингов. Снижение люминесценции кэпов шло на фоне увеличения клеток, способных их образовывать. Количество клеток типа пэтч и ринг было подвержено колебаниям в зависимости от концентрации хелатора в инкубационной среде. При добавлении в инкубационную среду триса не наблюдалось существенных изменений в процессе образования копов. Более выраженными эти изменения были при группировании РсИ в пэгчи. Снижалась интенсивность свечения ЛРК и уменьшалось количестпо клеток, их образующих. Инкубация ДЦК с нейтрофилами в пределах одной концентрации сопровождалась чёткой активацией кэпо-

образования (10~^М). При этом интенсивность свечения кэпов не изменялась, т.е. возрастала не степень мобилизации ЛРК, а увеличивалось число клеток, в которых интенсифицировались энергозависимые процессы.

При исследовании ферментативной активности установлено, что содержание СОД в нейтрофилах в присутствии ЗДГА не изменялось по сравнении с исходным уровнем. Нахождение в инкубационной среде три-са приводило к увеличению СОД клеток в 4-5 раз, ДЦК - уменьшало содержание СОД в нейтрофилах. Ингибирущий эффект хелатора зависел от его концентрации. Действие сДГА и триса в НСТ-тесте также зависело от концентрации и выражалось в уменьшении количества форма-зан-полокительных клеток. Иммуностимулирующий эффект был отмечен при использовании ДЦК и носил дозозависимый характер.

Эксперименты по изучению регуляции процессов кэпообразова'ния нейтрофилов были выполнены с использованием различных веществ, молекулы которых обладают регуляторны-ми свойствами, реализуемыми преимущественно на уровне клетки и субклеточных структур. Это молекулы эндогенного происховдения, фармакологические агенты, а также иммуномодуляторы различной природы.

В качестве эндогенных молекул были использованы препараты изолированных внеклеточных рецепторов макрофагов (Рц), специфически связывающих арсанилаттироэин, анти-рецептор (АРц), нативный с й-белком — —К-<5елок "снят" после обработки

дезоксихолатом, апЫ к — против 1?-белка; —

"снят" И-белок с молекулы и, наконец, сам 5-6елок.

При анализе влияния препаратов на нейтрофил по вышеуказанным показателям выявляется определенная взаимосвязь сдвигов. Препараты, действие которых сопровождалось повышением интенсивности свечения кэпов (Рц), пэтчей (К-белок) или тех и других одновременно [ ^^ > вызывали усиление активности СОД и увеличение ко-

ЛИцества НСТ+ клеток, а также ИАН. В тех случаях, когда такой эффект в отношении рецепторного аппарата нейтрофилов отсутствовал •• ( апН R ), не было и стимуляции функции нейтрофилов, хотя количество кэпообразующих клеток было повышено.

При исследовании влияния бактериальных и вирусных антигенов стафилококковый токсин (CT), ге~ магглютинин вируса гриппа (штамп нд ), HBSAg были выявлены сходные в общем закономерности: увеличение интенсивности свечения кэпов и'клеток, их образующих, уменьшение числа рингов, как правило, сопровождавшееся значительным увеличением содержания СОД в ней-трофилах (при CT - в 10 раз), повышением ИАН и количества формазан-положительных клеток. Исключение составили пониженные показатели НСТ-теста при воздействии на нейтрофилы гемагглютинина гриппа.

Действие фармакологических средств (изоптин, нифекард, этимизол, аспирин), относящихся к различным группам'лекарственных препаратов, было различным. Это связано, очевидно, с разным химическим строением и отличиями в механизмах воздействия на рецепторы нейтрофилов. Влияние препарата, относящегося к группе антагонистов кальция - изоптина, характеризовалось некоторым уменьшением уровня люминесценции кэпов, пзтчей и рингов и снижением числа HCT* клеток, а также индекса активации нейтрофилов. Другой препарат этой же группы - нифекард, существенно нз влиял на мембранные структуры нейтрофилов. Выраженным иммуномодулирутоцим эффектом обладал препарат группы антифеинов - этимизол, который оказывал действие и на подвижность FcR в плоскости мембраны, и стимулировал фагоцитарную активность нейтрофилов.

Воздействие ацетилсалициловой кислоты сопровождалось четкой активацией кэпообразования. Уровень люминесценции кэпов возрастал, что свидетельствовало о повышении степени мобилизации ЛРК. Этого не наблюдалось при образовании пэтчей и рингов. Увеличение клеток

типа "ринг" в популяции нейтрофилов шло за счет уменьшения количества клеток, образующих пэтчи. Уровень активности СОД был понижен. В цитохимических опытах установлено достоверное повышение числа нейтрофилов, поглотивших НСГ, и увеличение ИАН. Механизм действия аспирина на рецелторный аппарат и функцию нейтрофила можно связать с его разносторонним влиянием на метаболизм (на гексозомоно-фосфатный шунт, реакции ксантин-ксантиноксидаэа, образование халатов с Cu+2 и др.). С этим многие исследователи связывают и противовоспалительное действие салицилатов (. Younes п. at el., 1978).

Таким образом, в опытах in vitro были определены основные закономерности изменений функционального состояния рецепторного аппарата нейтрофилов в зависимости от различных условий и концентрации веществ в среде. В большинстве случаев установлена связь процессов экспрессии рецепторов с кислородным метаболизмом нейтрофила и показана возможность их регулирования.

Между изменениями функциональной активности рецепторного аппарата мембранных структур и нейтрофила в целом, как правило, обнаруживалась прямая взаимосвязь, в которой роль пускового механизма в отношении функции всей клетки принадлежит, очевидно, рецепторам (их стимуляции). Используя различные вещества, действие которых на рецепторный аппарат нейтрофилов опосредовано через метаболизм клетки или реализуется другими механизмами, функционирующими на клеточном и субклеточном уровнях, была показана возможность направленно-го# воздействия на активность рецепторного аппарата.

В связи с вышеизложенным, естественно, возникает вопрос, какие механизмы лежат в основе изменений функции нейтрофилов при заболеваниях человека, в патогенезе которых данные клетки имеют большое значение, и какую роль при этом могут играть события, происходящие на их поверхности?

Это послужило основанием для предпринятых нами сравнительных

исследований функциональной активности рецепторного аппарата ней-трофилов при различных формах ишемической болезни сердца, иу здоровых лиц.

Среди обследованных (117 человек) с ишемической болезнью сердца (ИБС) преобладали больные стенокардией напряжения Л-Ш функциональных классов. Это лица, у которых выраженность клинических проявлений стенокардии существенно зависит от их физической активности и от психоэмоционального состояния. Группу больных острым трансмуральным инфарктом миокарда (ИМ) составил 21 человек. Диагноз основывался на жалобах пациента, данных клинического наблюдения, характерных изменений на ЖГ, данных лабораторных исследований. У больных стенокардией напряжения (п=25) проводилась велоэрго-метрическая проба (В2П), позволяющая создать условия повышенного функционирования сердечно-сосудистой системы, при которых выявляются скрытые в условиях обычной активности признаки ранних патологически* изменений.

Исследования показали, что в группе здоровых лиц (16 человек) уровень люминесценции кэпов, пэтчвй и рингов тотчас после проведения ВЭП оставался неизменным. Количество клеток, образующих кэпы и пэтчи, также практически не менялось. Через три часа посла ВЭП достоверно уменьшалась величина интенсивности их свечения.

Проведение В37 в группе больных стенокардией вызывало достоверное увеличение интенсивности свечения кэпов (р /0,01) при незначительном уменьшении клеток, их образующих. На изменялся уровень люминесценции пэтчей и рингов, но возрастало число пэтчей (р £ 0,01) и вдвое уменьшалось количество клеток, образующих ринги. Наименьшее значение уровня люминесценции всех трех морфологических форм свечения мембран было зарегистрировано через три часа после В31.

Используя полученные нами данные, был произведен расчет ряда дополнительных критериев (Кульберг А.Я, с соавт., 1933), отражаю-

щих процессы, происходящие на поверхности нейтрофилов крови людей при проведении велозргометрической пробы. Было установлено, что группа здоровых лиц отличается от группы больных стенокардией повышенной сорбцией лиганда, интенсивными онергозависимыми процессами, которые могут в определенных условиях привести к шэдингу ли-ганд-рецепторного комплекса. В свою очередь группа больных стенокардией характеризуется заниженными процессами сорбции лиганда, повышенной ригидностью мембран и выраженностью процессов парабиоза.

Влияние дозированной физической нагрузки приводит к изменению данных показателей в обеих группах. Наибольших отклонений они достигают через три часа после ее проведения. Но каждая из обследуемых групп по-своему реагирует на нагрузку. Так, в группе здоровых лиц при уменьшении общо Л сорбции лиганда мембранами клеток, возрастает, спонтанная агрегация ЛРК, уменьшается шодинг ЛРК. Группа больных стенокардией отвечает на нагрузку также снижением общей сорбции лиганда, но в меньшей степени, чем здоровые лица.

У больных острым инфарктом миокарда результаты исследований способности нейтрофилов крови связывать ли-ганд, меченный люминофором, позволили представить следующую цепь событий. .

Повышенное образование в очаге повреждения иммунных комплексов приводит к высокой степени ассоциации их с поверхностью мембран фагоцитов. Неспособность нагруженных РсЯ к латеральной диффузии влечет их "сдирание" лигандеми и к развитию десенситизации нейтрофилов в фазе острого ИМ, 0 сбросе рецепторов свидетельствует существенное снижение интенсивности свечения кэпов, по сравнению с клетками больных стенокардией и группой здоровых лиц. Процесс активации нейтрофилов отражают и данные, полученные с помощью НСТ-тес-та: в группе больных острым-ИМ установлено достоверное увеличение (в 1,5 раза количества формазан-положительних клоток (р / 0,01) и ИАЛ.

Таблица I

Показатели функционального состояния рецепторного аппарата нейтрофилов у здоровых лиц и больных ИБС

Здоровые лица ■ { п =23) Стенокардия (п =96? Острый ИМ (п =21)

Общая сорбция лигацца 41+1,4 39+1,1 22+2,0|з^

Энергозависимая ассоциация ЛРК 0,70*0,03 0,61+0,02 0,47+0,03]^

Спонтанная агрегация ЛРК • 0,46+0,01 0,46+0,01 0,55±0,02*ЦХ

Выраженность парабиоза 0,36+0,01 0,41+0,01 0,47+0,02^х

Ригидность мембран 0,22+0,01 0,2510,05 0,28+0,02**

Шэдинг ЛРК 13,3+0,48 II,3+0,36 9,3+0,45|лк

Примечание: х - статистически достоверно между группой больных стенокардией и здоровыми лицами; дае - статистически достоверно между группой больных острым Ш и здоровыми лицами; - статистически достоверно между .группой больных стенокардией и острым Ш. •

Проведенный сравнительный анализ состояния рецепторного аппарата нейтрофилов и функционально связанных с ним метаболических процессов в клетке и на ее поверхности (по избранным нами критериям) у людей с острым инфарктом миокарда и с различными формами ише-мичесхой болезни сердца позволяет сделать следующие заключения.

При остром трансмуральном инфаркте миокарда структурные и функциональные изменения рецепторного аппарата нейтрофилов носят однонаправленный характер и выратены в значительно большей степени, чем у больных стенокардией. Они проявляются в резком снижении общей сорбции лиганда, увеличении процессов спонтанной агрегации, уменьшении энергозависимых ассоциаций линагд-рецепторных комплексов, что в конечном итоге ведет к повышенной ригидности мембран и выраженным процессам парабиоза.

При возникновении очага некроза в миокарде фагоцитарная акгиь ность нейтрофилов возрастает, тогда как в группе больных стенокардией напряжения существенного отклонения фагоцитарной активности от норм не наблюдалось.

Что касается метаболизма нейтрофилов, тб генерация активных форм кислорода при фагоцитозе сопровождается измеиением активности СОД у больных ИБС. У боль'них стенокардией напряжения уровень СОД полиморфно-ядерных лейкоцитов был в 1,6 раза ниже, чем в клетках здоровых людей, а у больных острым инфарктом миокарда - в 8 раз ниже контрольных значений.

Таким образом, количественные критерии, отражающие структур-*ую и функциональную организацию рецепторного аппарата нейтрофилов 1ериферической крови, могут служить для целей дифференциальной ди-1ГНОСТИКИ инфаркта миокарда. Полученные.данные явились предметом )зобретения "Способ дифференциальной диагностики острого инфаркта шокарда и стенокардии", авторское свидетельство # 1704011.

ВЫВОДЫ-

1. Изменения функциональной активности рецепторного аппарата ¡ейтрофилов под влиянием различных факторов экзогенного и эндоген-:ого происхождения (метаболически активных соединений, антигенов, ммуномодуляторов, фармакологических препаратов) выражались в раз-ичной интенсивности флюоресценции трех морфологических форм сва-ения (кэпы, пэтчи, ринги) с одновременными количественными сдвига-и в соотношении клеток, их образующих. Выраженность и общая на-равленность сдвигов зависели от химической структуры веществ, их :тцентрации, характера воздействия на метаболизм клетки и от имму-элогической активности.

2. Ингибиторный анализ процессов формирования лиганд-рецептор-а комплексов на поверхности нейтрофилов с использованием соедине-

ний внтиоксидпнтного действия, а также систем, генерирующих кислородные радикалы, выявил определенную взаимосвязь процессов экспрессии рецепторов с характером воздействия на кислородэависимый метаболизм клетки. Показана возможность регулирования этих процессов.

3. При воздействии фармакологических агентов, бактериальных и вирусных антигенов, иммуномодуляторов различной природы и др., несмотря на отличия в механизме действия веществ, в большинстве случаев обнаруживалась прямая взаимосвязь между изменениями активности рецепторного Аппарата мембранных структур нейтрофилов и функцией всей клетки в целом. Усиление процессов кэлообразования, как правило, сопровождалось повышением ПАН и НСТ-теста и наоборот. При отсутствии эффекта в отношении рецепторного аппарата, как правило, не было и стимуляции функции нейтрофилов.

4. У больных стенокардией напряжения в отличии от здоровых людей функциональнее состояние рецепторного аппарата нейтрофгшов характеризовалось снижением процессов кэпообразования за счет уменьшения общей сорбции лиганда и повышением вязкости мембран (высокое значение ригидности), препятствующей слиянию образующихся ли-ганд-рецепторных комплексов. Физическая нагрузка приводила к большему снижению процессов сорбции лиганда, резкому сокращению числа клеток, способных восстанавливать нитро-синий тетразолий, и уменьшению индекса активации нейтрофилов.

5. При остром трансмуральном инфаркте миокарда структурные и функциональные изменения рецепторного аппарата нейтрофилов носили однонаправленный характер и проявлялись в снижении общей сорбции лиганда,'увеличении процессов спонтанной агрегации, уменьшении энергозависимых ассоциаций лигакд-рецепторнкх комплексов и в конечном итоге повышенной ригидностью мембран. Фагоцитарная активность нейтрофилов возрастала.

6. Количественные показатели, отражающие структурную и функциональную организацию рецопторного аппарата нейтрофилов периферической крови, могут служить дополнительными критериями дифференциальной диагностики острого инфаркта миокарда и стенокардии. Наиболее информативным тестом является показатель интенсивности флюоресценции мембран типа "кэп".

СПИСОК РАБОТ ПО.ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Богословская С.И., Сабитова А.И., Белоусова С.С., Чалык Н.Е., Стенина О.И., Пахомов Д.А. Хелатообразующие свойства этимизола при интоксикации металлами переменной валентности // Тезисы докл. I Всесоюзного съезда токсикологов.-Ростов-на-Дону, 1986.-С.5G.

2. Петяев И.М., Чалык Н.Е,, Сабитова А.И., Бебеико С.Я,, Под-эемельников Е.В., Пахомов Д.А. Механизмы иммуномодуляцни ионами двухвалентной меди // Иммунодефициты и аллергия: Тезисы докл. Все-союзн. симпозиума.-М., I986.-C.II4.

3. Пахомов Д.А., Чалык Н.Е., Стенина О.И., Петяев И.М. Новые иммунохимические методы в практике здравоохранения // Актуальные вопросы гигиены в сельскохозяйственном производстве: Межвузовский научный сборник.-Саратов, 1987,-0,100-104.

4. Богословская С.П., Чалык Н.Е., Сабитова А.И. Действие ан-тифеинов на процессы, участвующие в формирований общей неспецифической устойчивости организма // Центральная регуляция вегетативных функций / Теэиеи докл. УП научной конференции.-Тбилиси, 1987,-С.97.

5. Богословская С.И., Сабитова А.И., Чалык Н.Е., Субботина Б.Г., Бебешко С.Я., Филимоновская Л.С., Белоусова С.С., Клочков В.А. Разработка методов контроля индивидуального подбора терапии антагонистами кальция больных ИБС // У1 Всесоюзный съезд фармакологов / Тезисы докладов.-Ташкент, I988.-C.I52.

6. Чалык Н.Е. Функциональное состояние рецепторного аппарата нейтрофилов у больных ИБС // Первый Всесоюзный иммунологический ■ съезд (Сочи, 1989).-М., I989.-T.I.-C.I28.

7. Бебетко С.Я., Каткова Н.Б., Капиносова.A.A., Темкин Б.М., Чальш Н.Е., Райков А.Н,.Новые возможности ранней диагностики ише-мической болезни сердца // Актуальные проблемы терапевтической патологии.-Саратов, I989.-C.II7-I2C.

8. Чалык Н.Е., Гохович Г.Г., Богословская С.И. 'Влияние металлов переменной валентности на лиганд-рецепторный комплекс и супер-оксиддиснутазную активность нейтрофилов // Физиология и патология перекисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза.-Полтава, I99I.-C.I00.

9. Богословская С.И., Белякова Н.И., Чалык Н.Е., Бородкина Ю.С, Изучение имыунотропного действия этимиоолв // Нейрофизиология на рубеже двух тысячелетий / Тезисы докладов Международной конференции. -Санкт-Петербург, 1992.-С.241.'

стс.. Ь&х-У^У