Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Эпизоотическая ситуация по респираторно-кишечным болезням молодняка крупного и мелкого рогатого скота в центральных районах Таджикистана

На правах рукописи

КУРБОНБЕКОВА Зилола Давлатовна

Эпизоотическая ситуация по респираторно-кишечным болезням молодняка крупного и мелкого рогатого скота в центральных районах Таджикистана

16 00 03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 2007

ООЗОБОБ4Э

003060649

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К И Скрябина» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ)

Научный руководитель доктор ветеринарных наук, профессор,

Заслуженный работник высшей школы РФ, Лауреат премии правительства РФ Белоусова Раиса Васильевна

Официальные оппоненты доктор биологических наук,

Соколова Надеяеда Львовна,

доктор ветеринарных наук, профессор Лауреат Государственной премии РФ Сухарев Олег Иванович

Ведущая организация государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ВНИТИБП)

С V,

Защита состоится « » 2007 г в часов на заседании дис-

сертационного совета Д 220 042 01 в Федеральном государственном образовательна учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К И Скрябина» (109472, Москва, ул Академика Скрябина, 23) Тел (495)377-93-83

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ

Автореферат разослан » /I ///¿¿А/2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета

ТН Грязнева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Проводимая земельно-аграрная реформа в республике Таджикистан в корне изменила ситуацию в отрасли животноводства Формирование многосторонних форм собственности привело к изменению ветеринарного обслуживания и технологии ведения животноводства Но как показывает практика, выращивание животных остается прежним и большое количество животных содержится на ограниченных территориях, не всегда благополучных по санитарно-гигиеническим условиям

В связи с этим, складывается постоянная опасность возникновения заболеваний разного характера В частности, проблема респираторно-кишечных заболеваний в Таджикистане выходит на одно из первых мест по количеству заболевших животных, проценту их отхода и, в целом, экономическим потерям Амирбеков M (1993), Сатторов И Т (1995) и др

Причиной возникновения данной патологии могут служить вирусы, бактерии, простейшие, гельминты и другие инфекционные агенты По данным Сюрина В H (1976), Соколова M H (1978), Глотова А Г (1998), Williams J R et al (1991) и др , ведущую роль в респираторно-кишечной патологии крупного и мелкого рогатого скота играют вирусы парагриппа-3 (ПГ-3), инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирусной диареи-болезнь слизистых (ВД), респираторно-синцитиальной (PC) и аденовирусной (Адено) инфекций, а так же хламидии

Учитывая сходные эпизоотологические данные, клинические и патологоанато-мические признаки заболеваний, вызываемых данной группой возбудителей, особую роль в дифференциальной диагностике занимают лабораторные исследования, которые включают обнаружение антигенов из патологического материала в реакции иммуной флюоресценции (РИФ), иммуноферментном анализе (ИФА), реакции диффузионной преципитации (РДП), выделение возбудителя из патологического материала в культурах клеток перевиваемых линий почки эмбриона коровы Taurus-1 (Т-1), эпителия коронарных сосудов теленка (КСТ), легкого эмбриона коровы (ЛЭК), почки теленка (Пт-80), фибробластов эмбриона мыши (ФЭМ) и первично-трипсинизированных фибробластов эмбриона кур (ФЭК) и его иденти-

фикацию в реакции нейтрализация (РН), реакции иммуной флюоресценции (РИФ), реакции связывания комплемента (РСК) и реакции торможения гемадсорбции (РТГАд), обнаружение антител в сыворотках крови больных и переболевших животных в РН, реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), реакции торможения гемагглютинации (РТГА), реакции связывания комплемента (РСК)

Решающим условием организации необходимых мер борьбы с респираторно-кишечными болезнями рогатого скота является установление роли инфекционных агентов в этой патологии

Цель работы - изучение этиологической роли вирусов в респираторно-кишечных инфекциях рогатого скота в хозяйствах Таджикистана

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи

1 Изучить эпизоотическую ситуацию по респираторно-кишечной патлогии рогатого скота в некоторых хозяйствах Таджикистана

2 Провести клиническое, патологоанатомическое обследование рогатого скота и вирусологические исследования клинического материала, полученного от животных из неблагополучных хозяйств

3 Определение этиологической роли вирусов и хламидий в инфекционной патологии телят и ягнят

4 Изучение некоторых биологических свойств выделенных изолятов

5 Усовершенствование лабораторной диагностики хламидиоза животных Научная новизна. Впервые изучена эпизоотическая обстановка по инфекционным агентам, вызывающим респираторно-кишечные заболевания у молодняка рогатого скота в четырех хозяйствах Таджикистана

Впервые в Таджикистане выделены возбудители вирусной диареи от крупного и мелкого рогатого скота, предложена для диагностических ветеринарных лабораторий наиболее чувствительная перевиваемая культура клеток КСТ для первичного выделения вируса ВД из патологического материала

Показано наличие антигенов рота-, коронавирусов и вирусной диареи в пробах биологического и патологического материала рогатого скота

Изучены некоторые биологические свойства выделенных изолятов

Впервые в Таджикистане разработаны условия получения специфического эрит-роцитарного хламидийного антигена для РНГА на основе выделенного изолята

Практическая значимость. Для диагностических ветеринарных лабораторий предложена наиболее чувствительная перевиваемая культура клеток КСТ для первичного выделения вируса ВД из патологического материала

Разработана тест-система на основе РНГА для выявления антител к хламидиям рогатого скота

Материалы исследований вошли в нормативно-техническую документацию на изготовление «Набора эритоцитарных диагностикумов для серодиагностики инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, аденовирусной, рес-пираторно-синцитиальной инфекций и хламидиоза крупного рогатого скота в РНГА» Набор удостоен диплома I степени и золотой медали 7-ой Российской Агропромышленной выставки «Золотая Осень» в 2005 году

Опытные серии набора РНГА апробированы в 6-ти ветеринарных лабораториях РФ, показана их высокая чувствительность и специфичность

Материалы исследований используются в учебном процессе по дисциплине «Вирусология» в ФГОУ ВПО МГАВМиБ

Апробация результатов диссертации. Результаты работы доложены и обсуждены на Международной конференции молодых ученных (ВНИТИБП 2002, 2004), на научно-производственной конференции молодых ученных посвященной к 40-летию ветеринарно-биологического факультета и 110-летию СИ Афонского ФГОУ ВПО МГАВМиБ (Москва, 2006), на международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию Я Р Коваленко (Москва, 2006), на межкафедральном совещании профессорско-преподавательского состава ФГОУ ВПО МГАВМиБ (Москва, 2006)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, в т ч 6 статей в сборниках научных трудов, 1 статья - в научном журнале

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 177 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практиче-

ское использование научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (172, источника, из которых 83 отечественных и 8-9 иностранных авторов) Работа содержит 27 таблиц, 31 рисунок, 5 страниц приложений

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Широта распространения респираторно-кишечных инфекций крупного и мелкого рогатого скота в некоторых регионах Таджикистана,

2 Определение этиологической роли вирусов и хламидий в инфекционной патологии телят и ягнят,

3. Выделение и изучение некоторых биологических свойств полевых изолятов, участвующих в формировании пневмоэнтритов у молодняка рогатого скота, 4 Усовершенствование лабораторной диагностики хламидиоза животных

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 2002-2007 годы на кафедре ветеринарной вирусологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ, ФГУ Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория РФ, а так же в Среднеазиатском ящурном институте и хозяйствах центрального района Таджикистана

При изучении эпизоотической ситуации по респираторным и желудочно-кишечным заболеваниям использовали данные отчетов государственных ветеринарных служб республики Таджикистан и результаты собственных исследований

В работе использовали 94 пробы сыворотки крови КРС, из них 42 пробы от телят, 214 проб сыворотки крови MPC, из них 30 проб от ягнят, 16 проб парных сывороток крови от телят и ягнят; 35 проб патологического материала (смывы из носовых полостей и прямой кишки больных телят, ягнят и от абортировавших овцематок, кусочки внутренних органов от павших телят и ягнят, кровь от больных ягнят и телят, фекалии от абортировавших овцематок)

Лабораторные исследования по диагностике смешанных вирусных респираторно-кишечных инфекций и хламидиоза крупного рогатого скота осуществляли в

соответствии с «Методическими указаниями по лабораторной диагностике вирусных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота» (1978), «Методическими указаниями по лабораторной диагностике хламидийных инфекций у животных» (1999)

Гипериммунные сыворотки против вирусов ПГ-3 и ВД КРС были получены на кроликах массой 2,5-3 кг на кафедре ветеринарной вирусологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ

Выделение и культивирование изолятов проводили на перевиваемых культурах клеток- ЛЭК, КСТ, Т-1, ГТг-80, ФЭМ и на 6-ти дневных куриных эмбрионах (КЭ) Идентификацию выделенных вирусов и хламидий проводили в реакциях РН, РТГАд, РИФ, ПЦР и световой микроскопии (на хламидии)

Для приготовления эритроцитарного хламидийного антигена использовали ак-ролеинизированые, танизированые эритроциты барана

Инфекционную активность полученных вирусов определяли путем титрования в чувствительных КК, выражая титр вируса в 1g ТЦД5о/м1, по обще принятой методике Reed и Mench (1938)

Для решения отдельных вопросов при обработке и анализе статистических данных, касающихся распространенности болезней животных, особенностей эпизоотической ситуации и математической обработке цифрового материала, были использованы методики, описанные по ред Бакуловым И А и Третьяковым А Д (1979) и «Методических указаниях по эпизоотологическому исследованию» Баку-ловымИАидр (1982)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение эпизоотической ситуации по респираторио-кишечной патологии рогатого скота в некоторых хозяйствах Таджикистана

Анализ эпизоотической ситуации по данным отчетов государственных ветеринарных служб республики Таджикистан показал, что среднее количество больных с симптомами респираторно-кишечной патологии в 1997-2004 гг среди КРС составило 35 %, павших 15 %, среди MPC больных 29 %, павших 18 %

Рис. 1. Среднее количество больных н павших животных с симптомами реснирэторно-кишечнпй патологии в четырех неблагополучных хозяйств

в 1997-2004 гг.

Нами проведен эпизоотический анализ в 4-х неблагополучных хозяйствах по респираторво-кишечным заболеваниям в Таджикистане. Результаты представлены на рисунке 1, как видно на рисунке 1 в 1997-2004 гг. среди КРС заболеваемость составила 25,0-27,1 %, падеж 11,6-13,7 %, среди MPC заболеваемость 16,3-23,0 %, падеж 10,5-16,3 %.

Клиническое, ri а тологоа н а том и ч е с ко е обследование рогатого скота и серологические исследования сывороток крови от животных из неблагополучных хозяйств

При обследовании животных в четырех неблагополучных хозяйствах наблюдали следующие основные клинические признаки: лихорадку, отказ от корма, ринит и конъюнктивит, кашель и диарею, гибель животных. Основные патологоанато-мические изменения характеризовались: катаральным воспалением легких, кровоизлияниями в тонком и толстом отделах кишечника и увеличением регионарных лимфатических узлов.

Данные серологических исследований сывороток крови от 94 голов (в т.ч. молодняк - 52 голов, коров - 44 голов, быков-производителей - S голов) КРС и 214 голов (в т.ч. молодняк - 36 голов, овцематок - 72 голов, баранов-производителей -71 голов, коз - 35 голов) MPC из четырех неблагополучных хозяйств, представлены в таблице 1.

Таблица 1. Исследование сывороток крови КРС

Наименова- Исследование сывороток крови

ние молодняк % коров % быков %

болезни КРС полож. полож. произв полож.

ПГ-3 42/10* 65,2 44 68,2 8 75

ИРТ 42/10* - 44 - 8 -

ВД 42/10* - 44 - 8 -

PC 42/10* 8,7 44 - 8 -

Адено 42/10* - 44 - 8 -

Хлам. 42/10* 52 44 100 8 100

Примечание * - парные пробы сывороток крови

Как видно из данных табл 1, у КРС были обнаружены антитела к вирусам ПГ-3 - 65,2-75,0 %, PC - 8,7 % и хламидиям - 52-100 %

Таблица 2. Исследование сывороток крови MPC

Наимено- Исследование сывороток крови

вание молодняк % по- овце- % баранов % коз %

болезни MPC лож. маток полож. произв. полож. полож.

ПГ-3 30/6* 26,7 72 46,1 71 47,1 35 14,2

ИРТ 30/6* - 72 1,9 71 1,4 35 -

ВД 30/6* - 72 1,9 71 2,8 35 -

PC 30/6* - 72 5,8 71 17,1 35 -

Адено 30/6* - 72 3,8 71 4,2 35 4,7

Хлам 30/6* 70 72 86,5 71 80 35 72

Примечание * - парные пробы сывороток крови

Как видно из данных табл 2, в сыворотках крови MPC были обнаружены антитела к вирусам ПГ-3 - 14,2-47,1 %, ВД - 1,9-2,8 %, Адено - 3,8-4,7 %, ИРТ - 1,41,9 %, PC - 5,8-17,1 % и хламидиям - 70,0-86,5 %

Полученные данные свидетельствует о широкой циркуляции указанных агентов среди животных обследованных хозяйств

Определение этиологической роли вирусов и хламидий в инфекционной

патологии телят и ягнят

Для доказательства этиологической роли указанных агентов были взяты парные пробы сыворотки крови и патологический материал от больных и павших животных Результаты исследований парных сывороток крови представлены в табл 3.

Таблица 3. Исследование парных сывороток крови рогатого скота

№ п/п Вид животного, возраст Результаты исследований

ПГ-3 ВД Хламидни

I проба II проба I проба II проба I проба II проба

1 Бычок 5 дн. 0 1:256 0 0 1 :64 1 • 64

2 Телочка 7 дн. 1:256 1 :512 0 0 0 0

3 Бычок 10 ан. 1-256 1:512 0 0 1 • 32 1 128

4 Телочка 13 дн 1:64 1 :64 0 1-256 0 0

5 Телочка 15 дн 1-32 1:128 0 0 0 0

6 Телочка 2 мес. 1:32 1 .512 0 0 0 0

7 Бычок 2 мес. 0 1:128 0 1 : 256 0 0

8 Телочка 2 мес 1:64 1-256 0 0 0 1-64

9 Телочка 8 мес. 1:32 1:256 0 0 1 : 64 1:256

10 Бычок 8 мес 0 0 1:32 1 :512 0 1:256

11 Ягненок 10 дн. 1:32 1 : 64 1 :64 1 : 512 0 1 • 128

12 Ягненок 10 дн 0 1 :32 1:64 1 . 1024 0 1 64

13 Ягненок 10 дн 0 1 :1024 0 0 0 1:256

14 Ягненок 3 мес. 0 0 0 1:256 0 1:128

15 Ягненок 4 мес 0 1 :32 0 0 1 .32 1 . 512

16 I Ягпснок 4 мес. 0 0 0 1-256 0 1 256

Как видно из таблицы 3, установлен прирост титра антител в четыре и более раз во вторых пробах к вирусам ПГ-3, ВД и хламидиям К вирусу ПГ-З у 8-ми телят, у 4-х ягнят; к вирусу ВД у 3-х телят и 4-х ягнят, к хламидиям у 4-х телят и 6-ти ягнят Полученные данные свидетельствуют об этиологической роли вирусов ПГ-3, ВД и хламидий

При исследовании патологического материала от больных и павших животных использовали ИФА для индикации вирусных антигенов (рота-, коронавирусов и вируса ВД) Из 35 исследованных проб в 13-ти обнаружены антигены рота- и коронавирусов у телят (2-х голов), вирусной диареи у ягнят (5-ти голов), ротавируса и вирусной диареи у абортировавших овцематок (6-ти голов)

При выделении вирусов на перевиваемых культурах клеток ЛЭК, Т-1, КСТ, ФЭМ, Пт-80 и на КЭ выделено 9 изолятов, из которых 7 идентифицированы 4 -изолята вируса ВД, 1 - изолят вируса ПГ-3 и 2 - изолята хламидий

При вирусологическом исследовании материала от MPC на перевиваемой культуре клеток Т-1 был выделен цитопатогенный агент, вызывающий во 2-м пассаже гемадсорбцию с эритроцитами морской свинки и в дальнейшем идентифицирован в РТГАд, РИФ и РН как вирус ПГ-3 (табл 4)

Таблица 4. Выделение и идентификация цитопатогенных агентов от мелкого рогатого скота

№/ЦПА Вид животного и патологического материала Выделено на культуре клеток Идентификация ЦПА

РТГАд - ПГ-3 РИФ РН ИФА - ВД рдп-вд ПЦР-ВД

ПГ-3 ВД ПГ-3 ВД

Т-1 Пт-80 КСТ ЛЭК [ ФЭМ

1 ягненок об/но об/но об/но 1)б/но об/но + + - + - - - -

смыв с носовых путей

2 ягненок не об/но не об/но не об/но Ш1А не об/но с а ю С о - - + н/и н/и + 1 6 4 +

смыв с носовых путей

3 ягненок не об/но | не 1 об/но 1 не об/но 1. 114 л _ Ье об/по не об/но - - + н/и н/и + 1.6 4 +

слизистая трахеи

4 ягненок не об/но не об/но не об/но Ш1 л не об/но не об/но - - + н/и н/и + 1 6 4 +

смыв с носовых путей

Примечание «об/но» - обнаружено, «не об/но» - не обнаружено, «НЦА» - нецитопа-тогенный агент, «-» - отрицательный результат, «+» - положительный результат, «н/и» -не исследовано

Как видно из данных табл 4, на перевиваемых культурах клеток КСТ, Т-1, Пт-80, ЛЭК, ФЭМ изолировано 3 агента, которые не вызывали характерного цитопа-тического эффекта Они были идентифицированы в РИФ, ИФА и РДП как вирус ВД

На перевиваемых культурах клеток ЛЭМ, ФЭМ и КЭ были выделены 2 изолята из носовых смывов абортировавшей овцематки и ягненка На третьем пассаже они проявляли цитопатический эффект, у куриных эмбрионов на седьмой день отмечали задержку роста, кровоизлияния на теле зародыша и кровенаполнение сосудов желточного мешка На четвертом пассаже в культуре клеток ЛЭК и ФЭМ инфекционные титры были в пределах 4,5 1§ Т1ДД5о,мл и 5,0 ^ ТЦД5о/мл, соответственно В КЭ инфекционный титр составлял 6,0-6,5 ^ ЭИД50/М1

Данные световой микроскопии инфицированных КК и мазков из желточных мешков зараженных КЭ, окрашенных по Стемпу и Романовскому-Гимза, показали наличие характерных ретикулярных и элементарных телец хламидий как в клетках, так и вне клеток Выделенные изоляты были нами совместно с сотрудниками

ГУ НИИЭМ имени академика Н Ф Гамалея РАМН к м н Колковой НИ и сотрудниками Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории к б н Лобовой Т П идентифицированы в РИФ и ПЦР как хламидии

Таблица 5. Выделение и идентификация цитопатогенных агентов от молодняка крупного рогатого скота

Патологический материал Выделено на культуре клеток Идентш >икация ЦПД

РИФ taiï ® S eu a < © в s а § ч eu a û< Як С И

КСТ Т-1 Пт-80 ЛЭК ФЭМ

смыв с прямой кишки об/но об/но об/но об/но об/но + + + 1:8 +

Примечание: «об/но» - обнаружено, «+» - положительный результат.

При вирусологическом исследовании материала от КРС на перевиваемых культурах клеток (КСТ, Т-1, Пт-80, ЛЭК, ФЭМ) был выделен один изолят из смывов прямой кишки теленка Изолят проявлял ЦПД на всех перевиваемых культурах КСТ, Т-1, Пт-80, ЛЭК, ФЭМ, но наивысший титр вируса ВД был на культуре КСТ - 7,5 lg ТЦД50/МЛ Выделенный агент был идентифицирован в РИФ, ИФА, РДП и РН как вирус ВД КРС (табл 5)

Таким образом, на основании проведенного мониторинга сделано заключение о широкой циркуляции вирусов ПГ-3, ВД, ИРТ, Адено и PC инфекций, корона- и ротавирусов, а также хламидий в 4-х хозяйствах Таджикистана Доказана этиологическая роль вирусов ПГ-3, ВД и хламидий в возникновений респираторно-кишечных инфекций у молодняка КРС и MPC

Изучение некоторых биологических свойств выделенных изолятов

Следующей задачей было изучение некоторых биологических свойств выделенных изолятов

Изолят вируса ПГ-3 вызывал ЦПД на всех 5-ти используемых культурах клеток (Т-1, Пт-80, КСТ, ЛЭК, ФЭМ) Наибольшее накопление вируса происходило на Т-1 вирус накапливался к пятому пассажу в титре 7,0 lg ТЦД5о/мЛ (на 4-5 сутки) Гемадсорбцию обнаруживали на Т-1 на 2-м пассаже на 3 сутки

Из четырех изолятов вируса ВД только, один из них вызывал ЦПД на культуре клеток КСТ (из смыва прямой кишки теленка) Цитопатический эффект проявлял-

ся на втором пассаже Инфекционный титр пятого пассажа составлял 7,0-7,5 ТЦДзо/м, на 3-4 сутки Три изолята оказались не цитопатогенными (из смывов носовых путей и слизистой трахеи ягнят), но были идентифицированы РИФ, РДП, ИФА и ПЦР как вирус ВД

Как видно из таблицы 6 цитопатическое действие вируса ВД наблюдали на КСТ (7,5 ^ ТДЦ5о/„п), а вируса ГТГ-3 на Т-1 на 3-5 день после 3-го пассажа, инфекционный титр составлял 7,0 ]§ ТЦД50/МЛ в пятом пассаже

Таблица 6 Некоторые биологические свойства изолятов вируса ПГ-З и вируса ВД

№ п/ п Исследование патологического материала Выделение на перевиваемых культурах клеток

Вид животного, возраст Патологический материал ВД на КСТ ПГ-З на Т-1

И пассаж III пассаж V пассаж II пассаж III пассаж V пассаж

1 Бычок, 1,5 мес. смывы с прямой кишки + + 7,5 ^ ТЦД50/МЛ - - -

2 Ягненок, 2 дн слизистая трахеи - ± ± - - -

3 Ягненок, 1 мес. смывы с носовых путей - ± ± - - -

4 Ягненок, 1 мес смывы с носовых путей - + ± - - -

5 Ягненок, 3 мес смывы с носовых путей - - - - + 7,0 Ы ТЦД50/М1

Примечание: «-» - отрицательный результат; «+» - положительный результат;

«±» - не специфическая дегенерация.

Некоторые биологические свойства изолятов хламидий представлены в таблице 7 Изоляты хламидий культивировали на аналогических культурах клеток (Т-1, Пт-80, КСТ, ЛЭК, ФЭМ) Однако изоляты хламидий накапливались на ФЭМ и ЛЭК

Как видно из данных табл 7, ЦПД наблюдали только на ФЭМ и ЛЭК, на 10 день инфекционный титр составлял 4,5-5,0 ^ ТЦЩо/мл в четвертом пассаже При морфологическом исследовании инфицированных КК, окрашенных по Романов-скому-Гимза, обнаруживали включения темно-фиолетового цвета в цитоплазме клеток и вне клеток При окрашивании по Стемпу обнаруживали включения округлой и лунообразной формы ярко красного цвета в цитоплазме клеток

Таблица 7. Некоторые биологические свойства изолятов хламидии от MPC

№ п/ п Исследование патологического материала Выделение на перевиваемых культурах клеток и куриных эмбрионов

Вид животного Патологического материал Хламидии на ФЭМ Хламидии на ЛЭК Хламидии на курин/эмб

II пассаж III пассаж IV пассаж II пассаж III пассаж 'IV пассаж II пассаж III пассаж IV пассаж

1. Абортировавшая овцематка, 2 г смывы с носовых путей ± + 1п К? H 1 + •SP J »1 ± + - J in H S СП

2. Ягненок 3 мес. смывы с носовых путей ± + м | 1Л Э •г, Я H - - - ± + » 1 VD S m

Примечание- «-» - отрицательный результат,«+» - положительный результат;

«±» - не специфическая дегенерация.

В дальнейшем данные изоляты культивировали в 6-ти дневных эмбрионах, заражая в желточный мешок На седьмой день инкубации отмечали задержку роста, кровоизлияние на теле зародыша и обильное наполнение кровеносных сосудов желточного мешка К четвертому пассажу инфекционный титр был в приделах 6,0-6,5 18 ЭИДзо/м,

Таким образом, в результате вирусологических, серологических и молекуляр-но-биологических исследований были выделены и идентифицированы изоляты вируса вирусной диареи, вируса парагриппа-3 и хламидии

Усовершенствование лабораторной диагностики хламидиоза рогатого скота

Обширное распространение хламидиоза в республике Таджикистан и причиняемый им экономический ущерб, проблемы создания новых методов диагностики хламидиоза, особенно для массовых исследований, стали одним из наиболее важных для современного животноводства

Реакция непрямой гемагглютинации широко и заслужено используется при диагностике ВД, Адено- и РС инфекций, ИРТ и ПГ-3 Клиническая картина хламидиоза у молодняка очень сходна с вышеуказанными болезнями При диагности-

ке хламидиоза для обнаружения антител используется РСК, которая недостаточно чувствительна и трудоемка. Исходя из выше изложенного, следующей нашей задачей было подобрать условия получения специфического эритроцитарного хла-мидийного антигена на основе выделенных изолятов.

Исходным материалом специфического эритроцитарного антигена служили: культуральная жидкость инфицированных культур клеток Л ЭК и ФЭМ (титр 4,05,0 ТЦЦ5й'МП) и желточные мешки от зараженных КЭ (титр 6,0-6,5 ЭИД^д) выделенным 2-мя из опятам и хламидий, а так же хламидийний антиген Щелковского биокомбината.

Проводили сенсибилизацию акролиинизированых и танизированых эритроцитов барана на ФБР при рН 6,4; 7,4 8,4; при температуре +4°С; +18-20°С; +37°С; время инкубации 1, 2 и 5 часов.

3 б

месяцы

иэолят хламидий и куежных эчбококах нзолит №1 клаМИДИИ на ФЭМ

антигон Щелковского биокам&нната □ «олт хламидми ив ЛЭК

Рис. 2. Чувствительность специфического хламидинного эритроцитарного антигена.

В результате наиболее эффективным оказался лишь один специфический эрит-роцитарный антиген, где в качестве антигена использовался изолят №1, которым сенсибилизировали эритроциты барана в фосфатном буфере рН=б,4 при +37ПС в течение 2- часов.

При хранении данный эритроцитарный антиген не терял своей активности и специфичности в течение 1-го года (срок наблюдения).

Задачей следующего этапа было испытание полученного эритроцитарного антигена в РИГА на специфичность и чувствительность с различными образцами сывороток.

Таблица 8. Изучение специфичности и чувствительности эритроцитарного антигена в РНГА с Гомо- и Гетерологичными сыворотками

Наименование сывороток Титр антител

Гетеро-логичные против вируса ИРТ 0

против вируса ВД 0

против вируса Адено 0

против вируса РС 0

Гомологичные Против хламидии (набор РСК Казанского ВНИВИ) 11,0 1оё2

Против хламидии (набор РСК ВНИиТИБП) 9,0 1ОЙ2

Как видно из таблицы 8, полученный эритроцитарный хламидийный антиген с гетерологичными сыворотками давал отрицательные результаты Титр антител с гомологичными сыворотками составил 9,0 и 11,0

Результаты исследования полевых парных проб сывороток, полученных от рогатого скота с респираторно-кишечным синдромом представлены в таблице 9 Как видно из таблицы 9, полученный хламидийный эритроцитарный антиген выявлял сероконверсию к хламидиям с кратностью прироста в четыре и более раз, результаты в РНГА коррелировали с результатами РСК

Таблица 9 Исследование парных проб сывороток крови от рогатого скота

№ п/п ^^телят парные пробы сыворотки РСК РНГА

титр антител кратность нарастания титр антител кратность нарастания

№1 1-ая 1.32 1:16

2-ая 1:128 4 1:128 8

№2 1-ая 1-2 1-32

2-ая 1.64 32 1-1024 32

№3 1-ая 1-64 1-32

2-ая 1-256 4 1:128 4

№4 1-ая 1:4 1:64

2-ая 1:256 64 1:2048 32

титг ^<N2 5 1-ая 1-32 1:16

2-ая 1 128 4 1.128 8

№6 1-ая 1 4 1:16

2-ая 1.64 16 1-128 8

№7 1-ая 1.4 1:32

2-ая 1:256 64 1.1024 32

№8 1-ая 1:2 1:64

2-ая 1-128 64 1-1024 16

№9 1-ая 1:32 1:32

2-ая 1-512 16 1:512 16

1-ая 1:4 1-32

№ 10 2-ая 1:256 64 М024 32

Таблица 10 Сравнительные исследования полевых сывороток крови в РСК н РНГА

Наименование реакции Всего исследовано полевых сывороток крови Результаты исследования

положительных отрицательных сомнительных

РСК 308 93 212 3

РНГА 308 95 210 3

93

Диагностическая чувствительность =-х 100 = 97,8 %

95

210 95+ 210

Специфичность --х 100 = 99,0% Совпадаемость = - х 100 = 99,0 %

308 212

При исследовании 308 полевых проб сыворотки от КРС (см таблицу 10), было установлено, что диагностическая чувствительность полученного эритроцитарно-го антигена по отношению к РСК составила 97,8 %, специфичность и совпадаемость - 99,0 %

Таким образом, разработан и апробирован высокочувствительный и специфический диагностикум для выявления антител к хламидиям рогатого скота в сыворотке крови больных и переболевших животных в РНГА Составлена нормативно - техническая документация на диагностический набор для серодиагностики хла-мидиоза в реакции РНГА Документация утверждена в установленном порядке Департаментом Главного управления ветеринарии МСХ РФ 21 01 2004 г № 13-502/0890

ВЫВОДЫ

1 Показана эпизоотическая ситуация по респираторно-кишечной патологии рогатого скота в некоторых хозяйствах республике Таджикистан (с 1997 по 2004 гг ) Установлено, что среднее количество больных с респираторно-кишечной патологией составило среди КРС 25,0-27,1 %, среди MPC 16,3-23,0 %, павших 11,613,7 % и 10,5-16,3 % соответственно

2 Эпизоотологическими, серологическими и вирусологическими исследованиями в 4-х хозяйствах Таджикистана выявлена широкая циркуляция вирусов ПГ-3, ВД, Адено-, ИРТ, PC, рота-, коронавирусов и хламидий Наличие антигенов рота-, коронавирусов и вируса вирусной диареи в пробах патологического материала

свидетельствуют об участии этих возбудителей в этиологии желудочно-кишечных болезней рогатого скота в обследованных хозяйствах

3 Установлена этиологическая роль вирусов ПГ-3, ВД и хламидий в возникновении респираторно-кишечных инфекций среди телят и ягнят Выделено и идентифицировано 7 изолятов По результатам идентификации изоляты были отнесены один изолят к ПГ-3, четыре изолята к ВД, два изолята к хламидиям

4 Из 5-ти перевиваемых культур клеток (Т-1, КСТ, ЛЭК, Пт-80, ФЭМ) изолят вируса ПГ-3 репродуцировался в культурах клеток Т-1, титр составлял 7,0 ^ ТЦД50/МЛ, изолят вируса ВД в культуре клеток КСТ, титр был в пределах 7,0-7,5 ТЦЦ50/МЛ на пятом пассаже, изоляты хламидий культивировались в культурах клеток ЛЭК и ФЭМ (инфекционный титр составлял 4,5 и 5,0 ^ ТЦД^/мп соответственно) и в куриных эмбрионах, инфекционные титры был в приделах 6,0-6,5 ^ ЭИД50/МТ

5 Разработаны условия получения специфического эритроцитарного хлами-дийного антигена для РИГА на основе выделенного изолята Показано, что куль-туральный антиген, полученный на культуре клеток ФЭМ был, наиболее эффективен для сенсибилизации эритроцитов барана при рН=6,4 ФБР, 1=3 7°С в течение 2-х часов

6 Получен эритроцитарный антиген для выявления антител к хламидиям рогатого скота в сыворотке крови больных и переболевших животных Диагностическим титром при хламидиозе рогатого скота по результатам исследования сыворотки крови в РНГА следует считать 1 16 и выше

7 Установлена чувствительность эритроцитарного хламидийного антигена по отношению РСК, которая составила 97,8%, специфичность и совпадаемость 99,0%

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1 Культура клеток КСТ была использована для получения вирусного материала при изготовлении диагностических препаратов в условиях Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории

2 Разработанная тест-система на основе РНГА для выявления антител к хлами-диям КРС и MPC была использована при постановке диагноза на хламидиоз в ветеринарных лабораториях РФ

3 Материалы исследований вошли в нормативно-техническую документацию на изготовление «Набора эритроцитарных диагностикумов для серодиагностики инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), вирусной диареи (ВД), аденовирусной (Адено), респираторно-синцитиальной (PC) инфекций и хламидио-за крупного рогатого скота в РНГА» технические условия и временное наставление по применению набора

4 Материалы исследований используются в учебном процессе по изучению возбудителей респираторно-кишечных инфекций на кафедре ветеринарной вирусологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1 Для первичного выделения вируса ВД из патологического материала ветеринарным лабораториям рекомендуется использовать наиболее чувствительную перевиваемую культуру клеток КСТ

2 Разработанная тест-система на основе РНГА для выявления антител к хлами-диям рогатого скота рекомендуется для применения в ветеринарных лабораториях при постановке диагноза на хламидиоз

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Новые подходы к терапии респираторно-кишечных вирусных инфекций крупного рогатого скота с использованием препарата Фоспренила /Красота Ю А , Алексеева H Ю , Аксенова Е И , Курбонбекова 3 Д , и др //Новые подходы в технологии производства ветеринарных биопрепаратов Сб науч.тр ВНИТИБП -Щелково ВНИТИБП-2002-С 137-140

2. Биологическая эффективность использования Фоспренила в системах in vitro» /Красота Ю А , Алексеева H Ю , Шарапова H Е , Курбонбекова З.Д, и др

//Новые подходы в технологии производства ветеринарных биопрепаратов Сбнаучтр ВНИТИБП -Щелково. ВНИТИБП-2002 - С 141-143

3 Распространение респираторно-кишечных инфекций в условиях республики Таджикистан /Курбонбекова 3 Д, Косумбеков М , Вазир Я , Белоусова Р В и др //Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов Сбнаучтр ВНИТИБП - Щелково-ВНИиТИБП - 2004 - С 143-147

4. Выделение и идентификация вирусов парагриппа-3 и вирусной диареи от молодняка крупного и мелкого рогатого скота с респираторно-кишечной патологией /Курбонбекова 3 Д, Вазир Я, Третьякова И В , Белоусова Р В , и др //Вопросы физико-химической биологии в ветеринарии Сб науч тр МГАВМиБ -М МГАВМиБ - 2006 -С 103-110

5. Вазир Я Изучение антигенной активности моновалентной и бивалентной вакцины против аденовирусной вирусной инфекции и вирусной диареи крупного рогатого скота /Вазир Я , Курбонбекова 3 Д, Третьякова И В , Белоусова Р В //Вопросы физико-химической биологии в ветеринарии Сб науч тр МГАВМиБ -М • МГАВМиБ - 2006 - С 100-103

6 Эпизоотическая ситуация среди молодняка крупного и мелкого рогатого скота с респираторно-кишечной патологией в Центральных районах Таджикистана /Курбонбекова 3 Д , Бобоев Г, Вазир Я., Лобова Т П, и др \\Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных Сб науч тр ВИЭВ -М ВИЭВ - 2006 - С 84-87

7 Курбонбекова З.Д Циркуляция вирусов парагриппа-3, вирусной диареи и хламидии у рогатого скота с респираторно-кишечной патологией в центральных районах Таджикистана /Курбонбекова 3 Д, Вазир Я, Лобова Т П , Белоусова Р В //Международный научно-практический журнал по фундаментальным и прикладным вопросам ветеринарии «Ветеринарная патология» - 2007 -№1 (20) - С 137139

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25 09 2000 г Подписано в печать 28.04 07 Тираж 100 экз Уел п л 1 Печать авторефератов (495) 730-47-74,778-45-60

Актуальность проблемы. Проводимая земельно-аграрная реформа в республике Таджикистан в корне изменила ситуацию в отрасли животноводства. Формирование многосторонних форм собственности привело к изменению ветеринарного обслуживания и технологии ведения животноводства. Но как показывает практика, выращивание животных остается прежним и большое количество животных содержится на ограниченных территориях, не всегда благополучных по санитарно-гигиеническим условиям.

В связи с этим, возникает постоянная опасность возникновения заболеваний разного характера. В частности, проблема респираторно-кишечных заболеваний выходит на одно из первых мест по количеству заболевших животных, проценту их отхода и, в целом, экономическим потерям Амирбеков М. (1992), Сатгоров И. Т. (1995) и др.

Причиной возникновения данной патологии могут служить вирусы, бактерии, простейшие, гельминты и другие инфекционные агенты. По данным Сюрина В.Н. (1976), Соколова М.Н. (1978), Глотова А.Г. (1998), Williams J.R. et al (1991) и др. ведущую роль в респираторно-кишечной патологии крупного и мелкого рогатого скота выполняют следующие вирусы: парагриппа-3 (ПГ-3), инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирусной диареи - болезни слизистых (ВД), респираторно-синцитиальной (PC) и аденовирусной (Адено) инфекций, а так же хламидии.

Решающим условием организации необходимых мер борьбы с респира-торно-кишечными болезнями рогатого скота является установление роли инфекционных агентов в этой патологии.

Цель работы - изучение этиологической роли вирусов в респираторно-кишечных инфекциях рогатого скота в хозяйствах Таджикистана.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Изучить эпизоотическую ситуацию по респираторно-кишечной патологии рогатого скота в некоторых хозяйствах Таджикистана.

2. Провести клиническое, патологоанатомическое обследование рогатого скота и вирусологические исследования клинического материала, полученного от животных из неблагополучных хозяйств.

3. Определить этиологическую роль вирусов и хламидий в инфекционной патологии телят и ягнят.

4. Изучить некоторые биологические свойства выделенных изолятов.

5. Усовершенствовать лабораторную диагностику хламидиоза животных. Научная новизна. Впервые изучена эпизоотическая обстановка по инфекционным агентам, вызывающим респираторно-кишечные заболевания у молодняка рогатого скота в четырех хозяйствах Таджикистана.

Впервые в Таджикистане выделены возбудители вирусной диареи от крупного и мелкого рогатого скота, предложена для диагностических ветеринарных лабораторий наиболее чувствительная перевиваемая культура клеток КСТ для первичного выделения вируса ВД из патологического материала.

Показано наличие антигенов рота-, коронавирусов и вирусов вирусной диареи в пробах биологического и патологического материала от рогатого скота.

Изучены некоторые биологические свойства выделенных изолятов. Впервые в Таджикистане разработаны условия получения специфического эритроцитарного хламидийного антигена для РНГА на основе выделенного изолята.

Практическая значимость. Для диагностических ветеринарных лабораторий предложена наиболее чувствительная перевиваемая культура клеток КСТ для первичного выделения вируса ВД из патологического материала.

Разработана тест-система на основе РНГА для выявления антител к хла-мидиям рогатого скота.

Материалы исследований вошли в проект нормативно-техническую документацию на изготовление «Набора эритроцитарных диагностикумов для серодиагностики инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, аденовирусной, респираторно-синцитиальной инфекций и хламидиоза крупного рогатого скота в РНГА». Набор удостоен диплома I степени и золотой медали 7-ой Российской Агропромышленной выставки «Золотая Осень» в 2005 году.

Опытные серии набора РНГА апробированы в 6-ти ветеринарных лабораториях РФ, показана их высокая чувствительность и специфичность.

Материалы исследований используются в учебном процессе по дисциплине «Вирусология» в ФГОУ ВПО МГАВМиБ.

Апробация результатов диссертации. Результаты работы доложены и обсуждены на Международной конференции молодых ученных (ВНИТИБП 2002; 2004); на научно-производственной конференции молодых ученных, посвященной к 40-летию ветеринарно-биологического факультета и 110-летию С.И. Афонского ФГОУ ВПО МГАВМиБ (Москва, 2006); на международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию Я.Р. Коваленко (Москва, 2006); на межкафедральном совещании профессорско-преподавательского состава ФГОУ ВПО МГАВМиБ (Москва, 2006).

Основные положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Широта распространения респираторно-кишечных инфекций крупного и мелкого рогатого скота в некоторых регионах Таджикистана;

2. Определение этиологической роли вирусов и хламидий в инфекционной патологии телят и ягнят;

3. Выделение и изучение некоторых биологических свойств полевых изоля-тов, участвующих в формировании пневмоэнтеритов у молодняка рогатого скота;

4. Усовершенствование лабораторной диагностики хламидиоза животных.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, в т.ч. 6 статей в сборниках научных трудов, 1 статья - в научном журнале.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 177 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практическое использование научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (172, источника, из которых 83 отечественных и 89 иностранных авторов). Работа содержит 27 таблиц, 31 рисунок, 5 страниц приложений.

4. ВЫВОДЫ

1. Показана эпизоотическая ситуация по респираторно-кишечной патологии рогатого скота в некоторых хозяйствах республике Таджикистан (с 1997 по 2004 гг.). Установлено, что среднее количество больных с респираторно-кишечной патологией составило среди КРС 25,0-27,1 %, среди МРС 16,3-23,0 %, павших 11,6-13,7 % и 10,5-16,3 % соответственно.

2. Эпизоотологическими, серологическими и вирусологическими исследованиями в 4-х хозяйствах Таджикистана выявлена широкая циркуляция вирусов ПГ-3, ВД, Адено-, ИРТ, PC, рота-, коронавирусов и хламидий. Наличие антигенов рота-, коронавирусов и вируса вирусной диареи в пробах патологического материала свидетельствуют об участии этих возбудителей в этиологии желудочно-кишечных болезней рогатого скота в обследованных хозяйствах.

3. Установлена этиологическая роль вирусов ПГ-3, ВД и хламидий в возникновении респираторно-кишечных инфекций среди телят и ягнят. Выделено и идентифицировано 7 изолятов. По результатам идентификации изоляты были отнесены: один изолят к ПГ-3, четыре изолята к ВД, два изолята к хламидиям.

4. Из 5-ти перевиваемых культур клеток (Т-1, КСТ, ЛЭК, Пт-80, ФЭМ) изолят вируса ПГ-3 репродуцировался в культурах клеток Т-1, титр составлял 7,0 lg ТЦЦ50/Ш; изолят вируса ВД в культуре клеток КСТ, титр был в пределах 7,0-7,5 lg ТЦЦ50/МЛ на пятом пассаже; изоляты хламидий культивировались в культурах клеток ЛЭК и ФЭМ (инфекционный титр составлял 4,5 и 5,0 lg ТЦД50/МЛ соответственно) и в куриных эмбрионах, инфекционные титры был в приделах 6,0-6,5 lg ЭИД5о/мл.

5. Разработаны условия получения специфического эритроцитарного хламидийного антигена для РНГА на основе выделенного изолята. Показано, что культуральный антиген, полученный на культуре клеток ФЭМ был, наиболее эффективен для сенсибилизации эритроцитов барана при рН=6,4 ФБР, t=37°C в течение 2-х часов.

6. Получен эритроцитарный антиген для выявления антител к хламидиям рогатого скота в сыворотке крови больных и переболевших животных. Диагностическим титром при хламидиозе рогатого скота по результатам исследования сыворотки крови в РНГА следует считать 1:16 и выше.

7. Установлена чувствительность эритроцитарного хламидийного антигена по отношению РСК, которая составила 97,8 %, специфичность и совпадаемость 99,0 %.

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Культура клеток КСТ была использована для получения вирусного материала при изготовлении диагностических препаратов в условиях Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории.

2. Разработанная тест-система на основе РНГА для выявления антител к хламидиям КРС и МРС была использована при постановке диагноза на хламидиоз в ветеринарных лабораториях РФ.

3. Материалы исследований вошли в нормативно-техническую документацию на изготовление «Набора эритроцитарных диагностикумов для серодиагностики инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), вирусной диареи (ВД), аденовирусной (Адено), респираторно-синцитиальной (PC) инфекций и хламидиоза крупного рогатого скота в РНГА»: технические условия и временное наставление по применению набора.

4. Материалы исследований используются в учебном процессе по изучению возбудителей респираторно-кишечных инфекций на кафедре ветеринарной вирусологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ.

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Для первичного выделения вируса ВД из патологического материала ветеринарным лабораториям рекомендуется использовать наиболее чувствительную перевиваемую культуру клеток КСТ.

2. Разработанная тест-система на основе РНГА для выявления антител к хламидиям рогатого скота рекомендуется для применения в ветеринарных лабораториях при постановке диагноза на хламидиоз.