Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Биологические свойства вируса и лабораторная диагностика ротавирусной инфекции птиц

РГб од

- 8 MA.Fi-1995-----------

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИИ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ САНКГ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ БЕГЕРИНАРНОЙ МВДйЩШ

На правах рукописи

ГУЛЯМОВ Нигматулло Кадыровкч

■ УЖ 619:5?£-00-1.12:616-074.98:636,5

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА И ЛАБОРАТОРНАЯ ДЖНОСТШ. РОТАЙпРУСНОЙ ИНФЕКЦИЙ ЛГИЦ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учено.; степени кандидата ветеринарных наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена ео Всероссийском научно-исследовательском ветеринарной институте птицеводства. .

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук АЛИЕВА. С.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор ЗЕЛЕНСКИЙ В. П.

кандидат ветеринарных наук, доцент СОНИН П. «.

Ведущая организация: Всероссийский Государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации вет-препаратов - .

Защита состоится А^ОД 1995 г. в_ча

на ааседании специализированного совета Д. 120. 20. 02 при Санк •Петербургской государственной академии ветеринарной медицины по адресу: 196084, г. Санкт-Петербург, ул Черниговская, 5.

С диссертацией .можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петер ской государственной академии ветеринарной медицины.

Автореферат разослан

IS- 1995 года.

Ученый секретарь специализированного совета доцент

Узюмова 0.1

I. ОЩАй ХАхАйСЕРЛСГШ-РАБ^У '

.■ктуальчость ;л>о<1лгыч, ^лорлые о ротавируснои тт?»чшпт У нтгц cooooäs« американский учонке /Mi.biv-qOloM ,fcj.c гц.. уаулд tl /,

KOfOf'i -i удалось яыякить вирусные часткпч, мор]Ч> логически сходные « [.ставдруелн» в содаряшмом кишечника у птэт, с r.prc паками .пиягев v ао* шанио4 сгзртчос:

■j '.пзч'зотк-еиио,. литературе кмаотоя единичные сообщения о ротави-русной инфекции среди цыплят с признаками »»«pc-, IC-I.'>

суток /Бяко-лт-г: J.A.. Ал«»» A.C., Д^ака««?» , Тульская /¡..и, Вашуко-O.G., i'or^a-oL ü.i!., Сербов G.H., 1991/,

Л>та~крусн с трудом поддаются выделению в культура клеток с применением обычных методик, что создает определенные трудности в диагностике заболевания /КоромыслоЕ Г.Ф., Авилов ¿.С., Гоголев «t.¡л., Соколова Н.Л. и др., 1Ь64/.

В настоящее время в стране нет средств и методов диагностики ро-тавируснол инфекции птиц и до сих пор не изучены биологически? сродства Еозбудителя указание-! болезни. Поэтому разработка л согоршекст.-л-нзнко -летода лабораторной диагностики является актуальнол ч умеет finition научное к практическое значение.

Цель г задачи работы. Целью нзшйх ксследован::.; явились разра0'<т-р.а яслитшп-е метода иммуноферментного анализа U'iWi) для диагностики ротавирусноп инфекции пткц. J соотпвтстьия с целью были постаеленч следующие задачи:

I. Изучить биологические, культуральние и антигенные свойства ротавируса птиц.

-2. разработать схему получения готериммунной сыворотки к ротавщу--су пткц и спешфтскжс компонентов Для иммунорерпентчого анализа.

■3, Отработать методику постановки пШ дая выявления антигена ро-тч'т.гусп птиц.

4. испытать иммуно^ерментнш ананиз для индикации антигена н организме экспериментально зараженных цыплят.

5. пспчтать ; "А для диагностики ротавирусноа инфекции птиц в ЛГО','3! одет,- очнчх условиях.

ihym.ui новизна. rfirepsHe р наш л стране изучены некоторые биологические, и.'льту,лльчые и антигенные cinerea ротавкруса птиц.• Разработана п/.е\п получении гкпериммунноя сыворотки к ротавирусу птиц и специфических компонентов для кммунофарыентного анализа. Отработана методика постановки '.Ш дня выявления антигена .вируса. Изучена кине-3 - .

тика накопления ротавирусного антигена птиц в организме экспериментально зараженных Цыплят. Разработана методика изготовления инактиви-рованного ротавирусного антигена дая проведения '.Ш. Дана сравнительная оценка "сьндвич"-варианта /Ы?А, выделения вируса е культуре клеток и электронно-микроскопического исследования при диагностике-данной инфекции. Установлена высокая чувствительность и специфичность ИМ пр обнаружении антигена ротавируса птиц.

Практическая ценность. На основании проведенных исследований раз работана иммуноферментная тест-система для лабораторное диагностики ротавируснол инфекции птиц и временное наставление по ее применению. Показана перспективность применения 'ЛФА при проведении масса ада иссле ДОЕании. Простота и дешевизна постановки lííA делает реальным внедрени его о широкую производственную практику. Опыт применения !1¿A при рота вирусной инфекции будет полезен для диагностики других инфекций.

Апробация ваботы. Материалы диссертации доложены на Бсероссшско конференции ".Молодых ученых и аспирантов по птицеводству" (г. Сергиев Посад, 1993 г.), на .методическом и Ученом Советах всероссийского науч но-исследоЕательского Евтеринарного института птицеводства (Санкт-Пе-тербург-ЛомоносоЕ, 1994 и 1995 гг.).

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 4 печатных работах.

• Структура и объем работы. Диссертация изложена на 1зх страница} машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, вывода, практические предложения, списс литературы и приложение. Работа кллюстрирояана 16 таблицами, ÍÜ рису; ками. Список литературы включает 161 источник, в том числе 1£8 зарубежных источников.

2. ..1АТЕР/1АЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в I993-IS95 годах в отделе вирусологии Всероссийского науч но-иосле до вательского ветеринарного института птицеводе Еа.

В работе использовались штамм "ВНИВИП" ротавируса птиц и 2 изол, та, выделенные в неблагополучных птицеводческих хозяйствах по ротави русной икрекции, и штамм -II ротавируса обезьян.

3 качестве среды роста для клеток применяли среду йгла с добавлением 1С$-ноЛ сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков (пен циллин, стрептомицин по 100 ЕД я фунгизон 25 мкг). Поддерживающая ср да состояла из тех же компонентов, кроме сыворотки крупного рогатого

¡кота, о добавлением трипсина в дозе 10 мкг/мл.

Культура клеток. хЗ исследованиях использоезли первично- трилсини->иро_-аннук» культур клеток печени и почек куриных эмбрионов, а также :еревиЕаемуд культуру клеток мА-ХСИ (линия эмбриональной почки обсаъян >езус), предоставленную нам институтом вирусологии имени Д.и.йганов-;кого р.чоскиы.

Ьшотные. В экспериментах использовали 450 цыплят разного гозрас-■а, породы леггорн кросса "Хайсекс белый", 800 куриных эмбрионов &-I0 ¡уточнол инкубации, полученных из хозяйств, благополучных по острым гнфекционным заболеваниям, 20 кроликов породы "шиншилла" весом 2,5-3 т.

Заражение цыплят проводили пероральчо вируссодержащей культураль-ш жидкостью е объеме 1,0 мл.

Антигстгем 2 серологических методах служила культуральная жидкость, драенная штаммом "JHniilii" ротасируса птиц. ii работе использовали :робы помета и гомогенат кишечника (двенадцатиперстной, толо.!, подьз-югыод, слепо.; и ободочное) от экспериментально зараженных цнпллт, о 'шые пробы помета от птиц из птицехозяастн страны.

d качество отрицательного антигена испольэогали незараяеннуэт ■ультурапьнуп жидкость.

Методы. Концентрирование антигена проводили методом ультрафильт->алии на лабораторных ультрафильтрационных ячейках типа Фй-02, Для 'елъхроматогра]даческои очистки аотттгена использовали колонки, запол-генные макропорист им стеклом.

иммуноглобулины выделяли из сыворотки крови кроликон различными ¡посэбами: осаждением сернокислым аммонием; ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлплозе; гель-фильтрацией на сефадексе (?- -200; осаж-¡ением полиэхиленгликолеМ M.i'. G0CG (ПсГ-6000),

Икмужхлектрофорез проводили по

Концентрацию белка определяли расчетным методом путем измерения >птичееко,1 плотности раствора белка при длине еолны 280 нм (А.Гиллем, ].1Ьторн, 1957), а также'по методу

(I95X).

Jtor/нопероксидазныЛ конъкгат получали методом перйодатного окис-

:ения по

М.&лМгои, P.K.tfaiawt (1976) с последующей стабилизацией бор-'идридом натрия. Rt конъюгатов определяли отношением значений экстинк-;ки раствора конъюгата при длине еолны 403 нм к экстикции при длине •лны 280 нм (ЪХ. Vloiavn, , 1974).

"Сэнднкч"-метод ИФА ставили по методу tl a" (1976).

Статистическую ббработку проводили по методу Стьюдента-Фишера.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОМНЩ'1

3.1. Культуралыше свойства ротавируса птиц

Одной из биологических моделей, которую широко используют для выделения вирусов, является культура ткани различного происхождения /Сергеев В.А, 1976/.

Для изучения культуральных свойств ротавируса птиц проведен отбор твщехся в нашем распоряжении клеток для культивирования и накопления ротавируса птиц и различных изолятов, наиболее чувствительных к цито-патогенному делстзюо ротавируса.

В предварительных исследованиях было установлено, что решающее значение для репликации ротавируса птиц в культуре клеток имеет обработка заражаемого вируса трипсином. С этой целью в вируссодержащий материал добавляли 10 мкг/вд трипсина и выдерживали при 20-25°С в течение 20 минут на контакт, после чего использовали для заражения клеток.

Перед заражением питательную среду удаляли и монослой клетки трехкратно отмывали средой игла без сыворотки.

Адсорбция вируса продолжалась в течение I часа при 37°С в термостате. После адсорбции клетки один раз отмывали промывочным раствором и вносили поддерживающую среду. Далее проводили инкубацию при 37°С в термостате и исследовали на наличие ЦПД. Через 46 часов после заражения проявилось Ш1Д - клетки округлялись образуя пустые пространства и отторгались от стекла. Полная гибель клеток наступила на четвертые сутки.

В контроле вирус трипсином не обрабатывали и в поддерживающую среду не вносили.

Без обработки вируса трипсином репродукция вируса в культуре клеток не установлена.

Последующие пассирования проводили после трехкратного замораживания и оттаивания вируссодержащей культуральной жидкости, центрифугированием при 1000 об/мин, в течение 10 минут.

Выделенный нами штамм ротавируса птиц прошел 5 пассажей в культуре клеток печени куриных эмбрионов и перевиваемой линии мА-104 с дозой трипсина 10 мкг/мл и стабильно воспроизводился в титре ХО"6,0-КГ6'5 ТЦД^мл.

В последующих пассажах наличие выраженного цитопатогенного действия при контроле под электронным микроскопом отмечалось постоянно, чк

говорит о репликации вируса в данных клеточных культурах. При этом ■Е. препаратах первично зараженных культур и в материалах разного у рос го

(

обнаруживались как однокапсидныв так и двухкапсиднне полнче частипн с преобладанием последч/х о диамет.ом 40-45 им, окруженных ен;/?1 енлям плоек каисомосог с коротки;« отростками, напоииналядаи спица колеса, шутроншьа слои капсулы прикреплялся к ьтим отросткам и има.ч ггд обода колеса.

Длд определения оптимальных заражающих доз, обеспечивающих максимальное накопление вируса в культуральнол среда, были проведены исследования по заражению культуры клеток МА—104 из расчета на клетку в дозах: 0,001; 0,0I; 0,1; 1,0 ТЩЦ^/мл ротавируса птиц.

Наиболее активное размножение Еяруса, независимо от штамма, установлено при заражении культуры в дозе 0,01 ТЦД^ на клетку. Титр вирусов через 24 часа составил 5,0- О,I ТЦДдц/мл, достигал максимальной величины через 48 часов 6,5- 0,3Ьо ТЩ^/мл к сохранился на этом уровне до конца опыта. ведение вируса в высоких дозах вызывает сокращение времйчи «ксгмалыиго накопления вируса до ¿1 часо", но при дальнейшем пассировании вирусного материала наступает снижение его ин-¡¡экционяоа активности. 'Накопление вируса, хотя и кор;елиронано с развитием цитопатических изменений, однако активность вируса з хысоких титрах отмечали и при наличии незначительных цитопатических изменений.

С учетом результатов опытов по заражению культуры клеток различными дозами рируса, нами при накоплении вируса в качестве заражающей использовалась доза 0,01 'ГЦДзд на клетку.

Сравнительное иэучетгте накопления ротавируса птиц в роллернои и стационарной культурах клеток мА-104 при прочих равных усдоЕйях показало значительное преимущество первого способа культивирования. 3 рол-перноп культуре вирус накапливался в значительно более высоком титре, чем»стационарной культуре клеток.

Специфичность цптопатогедного действия, вызываемого ротавирусом чтиц, была подтверждена в опытах нейтрализации вируса со специ^ичес-<ол птаерпммугаюд кроличьем сывороткол.

3.2. Получение специфических компонентов для иммунофер-ментного анализа

3.2,1. Получение гипериммуннои сыворотки, иммуноглобулинов и ишунопероксидазных конъюгатов

. Гипериммунизацией кроликов с концентрированным очищенным ротави-)усным .антигеном была 'получена сыворотка крови кроликов с прецгагати-■¡утсшек активностью 1:54. Г

3 сравнительна опытах по выделению иммуноглобулинов разными методами установлено, что использование ПЗГа-б^О и ионообменноЛ хроматографии на ДЭА«-целлхшозе позволяет получить наиболее очищенные иммуноглобулины, даодие при исследовании методом иммуноэлектрофореза одну линую преципитации, соответствующую фракции иммуноглобулина класса ( ¿а ). Однако наибольшее абсолютной активностью обладали иммуноглобулины, выделенные осааденеем ПЭГом-бОСО. Кроме того, иммуноглобулины, выделенные осаждением 113Гом-6000, обеспечивают наибольшую чувствительность е й£А.

Для конъюгации с пероксидазой хрена фирмы (ОлаинеДЪ - 2,1) &

" =3,0) использовали ¿<3 6- с показателями титра в РДН 1:256 и удельно,; активностью 1:30,8. Активность полученных нами конъю-гатон составила в "сэндеич"-варианте от 1:80 до 1:640. Установлен прямо пропорциональная зависимость активности конъюгата от удельной активности иммуноглобулина.

Специфичность иммунопероксидазных конъюгатов проверяли е "сэндвич "-методе ИМ путем постановки реакции с нормальным (не зараженной культураиьно.1 жидкостью) в гетерологичшши антигенами вирусоЕ болезнен птиц (ньюкаслской болезни, инфекционного ларинготрахеита, инфекционного бронхита, болезни Гамборо и аденовирусной инфекций птиц). Во всех случаях реакция была отрицательное (0Д4^ ^ 0,1).

■ цроведенными исследованиями установлено, что очистка конъюгата не влияет на чувствительность и специфичность ИФА. Наличие в конъюга-те избытка несвязаЕшеися пероксидааы не вызывает повышения фоновой окраски, так как неспецифическол сорбции ее препятствует наличие в промывном буфере детергента твина-20 и хлористого натрия. На основани. иолученных результатов мы пришли к заключению о нецелесообразности проведения в дальнейшем очистки конъюгатов от несвязавшейся пероксмда зы.

3.2.2. цраготоаленив антигена для проведение ИРА

Одним мэ важных условий проведения иммунологического анализа является получение высокоактивных диагностических компонентов. В зару бежной литературе для постановки серологических реакций (РДП, РЗГА) используется вируссодержащая культуральная жидкость / Голх^?. Ц.Д.^ио, 11о£1978/. Однако в настоящее время нет единых уело вий получения антигена, а значит, к нет стандартного специфического антигена.

Дяя последовать! била использована вируссодержащая жидкость клр-точчнх культур зараженных разными пижмами ротавируса птиц. Резулт-та-тн этих исследованил представлены в таблице I,

Таблица I

Активность ачтигонов ротавируса в Щ>А в вавчсго^стя

от штамма

Штамм Биологический актив. ИМ

тцд50/ш

внияш 6,5- 0,4 1:260

Изолят 1Ь 2 6,5 ± 0,5 1:64 •

Изолят № 3 6,0 ± 0,1 1:32

Установлено, что наиболее высокой активность в У.ЬА обладает штамм ШИй.Л ротавируса птиц.

Известно, что активность антигена во многом зависит от степени 1«зрушения клеток, содержащих вирионы. Такие приемы как гомогени.чшг.'я, замораживание и оттаивание разрушают клетки, но не достаточно. Па-зтп-му нами дополнительно бил использован метод озвучивания вируссодпряя-щел жидкости ультразвуком различной амплитуды.

Таблица 2

Влияние озвучивания антигена на его активность

я п/п Амплитуда ультразвука (мкм) Титр антигена Е ИФА

I Без озвучивания 1:128

2 6 Г: 256

3 12 1:512

Л 18 1:512

5 24 1:512

6 ■ 30 1:512

Сравнение антигенов, полученных из одного и того же Еируссодер-жацего материала, обработанного ультразвуком в разном режиме (частота-20 кГц; мощность-150 Вт; время-30 с; амплитуда-6-30 мкм), показало, что обработка антигена ультразвуком с амплитудой 12 мкм повышает его активность на 1-2 К^о^ . использование ультразвука более высокой амплитуды не зрективно и вызывает чрезмерное нагревание вируссодержамей ■жидкости, что монет повлечь за собой денатурацию вирусного белка.

Ь

В соответствии с современными требованиями к диагностикудам е широкую лабораторную практику допускаются только инактивированные препараты. В связи с этим е нашу задачу входило изучить возможность инактивации ротаЕируса птиц. При этом мы руководствовались следукщкми основными принципами: инфекционная активность вируса должна быть полностью утрачена; антигенная активность вируса должна быть максимально сохранена.

ИнактиЕирувдее действие (формальдегида на Еирус было установлено через 12 часоЕ экспозиции в присутствии 0,2% препарата. Увеличение времени экспозиции до 24 часов вызывало аналогичный эффект при концентрации формальдегида 0,1%. Однако -использование формальдегида приводит к сильному снижению титра антигена в ИФА,

при обработке Еируссодержащего материала растворами димерэтилен-имина инактиЕация ротавируса птпц наступает уже через 6 часов при концентрации препарата 0,2%. при этом титры антигена-ротавируса в иФА не изменяются по сравнению с первоначальными.

Антиген контролировали на специфичность путем постановки "сэнд-вич"-Еарианта КМ с гетерологичными антигенами вирусов болезней птиц (инфекционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита, ньюкаслской болезни, болезни Гамборо и аденовирусное инфекции птиц), ¿о всех случаях результаты были отрицательными, что свидетельствует о специфичности полученного антигена. Титр в ИФА составил 1:512.

3.3. Отработка методики постановки И£А для выявления антигена ротавируса птиц

Иммуноферментная тест-система для выявления ротавирусного антигена на основе твердофазного МА с использованием полистироловых планшет (Е1А?>К -тест) включала подбор дозы и условий фиксации специфического иммуноглобулина, рабочего разведения конъюгата, оптимизацию физико-химических параметров проведения ЙФА.

При выбора оптимальной дозы сорбируемых антител учитывали отношение величины оптической плотности (ОД^ц) положительного контроля (р) к величине 0Д^50 отрицательного контроля ), при различных разведениях сорбируемого со стандартной дозой антигена ротавируса птиц (1:32), Значение ОД^зд в лунках с положительным антигеном достигает максимума при концентрации 4а 6- , равной 10 мкг/мл, и составляет 1,0. Экстинкция продукта пероксидазной реакции при концентрации <$а 0>* , равной 12,5 - 15,0 мкг/мл, также равна 1,0. Однако при увеличен^ дозы Зч более 10,0 мкг/мл увеличивается значение 0Д^50 отрицательного контроля; что приводит к уменьшению значения Р/Н . 10

3 результате проведенных экспериментов устаюклеио, что сорбируемый иммуноглобулин О- в концентрации 10,0 мкг/мл обеспечивает максимальную экстинкцию положительного антигена ЮД^дд = 1,0) при допустимом значение фона = 0,1). имевшаяся разница «начеши ОД^д при анализе положительного и отрицательного антигенов указывает, что кон-иентр^ция б- , равная 10,0 мкг/мл, является оптимальной при постановке и*>А дяк выявления антигена ротавирусной инфекции птиц.

При выборе оптимального значения рН буферного раствора для сорбции специфического ¿а на полистироловых планшетах были взяты буферные растворы с рН '1,4; 7,2; 5,6; 11,0.

Анализируя полученные результаты по влиянию рН на сенсибилизирующую активность специфического <йд , сделали вывод, что интенсивность реакции достигает максимума при р«1 9,6. При подборе оптимально темпе-ратурко-Еременных режимов адсорбции специфических к ротавирус-

нои инфекции птиц установлено, что насыщение поверхности лунок полистироловых планшетов наступало при 37°3 через 2 часа, при 20°0 - через 4 часа, а при 4°С - через 16 часов. Однако для удобства нами в дальнейшем сорбция проводилась в течение 16-ХЬ часов при 4°С. При сравнительном изучении сорбционных свойств полистиролавых мккропанелей отечественного (Санкт-Петербургские завод медицинских полимеров) л зарубежного производства {""йи^аАлс.^ Швейцария) установлено, что для постановки твердофазного тк при выделении ротавируского антигена птиц возможно использование обоих типов планшет.

На основании проведенных исследований наши установлено, что при постановке "сэндвич"-метода «ФА.контрольные » испытуемые антигены необходимо исследовать, начиная с раз ведения 1:4, так как при меньшем • разЕеденид возрастает значение ОД450 отрицательного контроля, что может обусловить увеличение числа ложноположителъннх результатов.

при выборе сроков инкубации антигена а конъюгата бняи использованы следующие параметры: 30, 60, 90, 120 минут. На основании полученных результатов было установлено, что оптимальное время инкубации на всех этапах - 90 минут.

Важным условием при проведении ИФА является Еыбор рабочего разведения конъюгата. С этой целью использовали разведения конъюгата 1:80 - 1:800 при использований стандартной дозы антигена (1:32).

Максимальное значение экстинкции 'положительного контроля (ОД^дд = 1,0) установлено при разведении конъюгата 1:80 - 1:200. Однако максимальное значение Р/^ , равное 10,0, отмечали при разведений конъюгата 1:200 в овязм с тем, что при наименьших разведениях

конъюгата увеличивается значение ОД^д отрицательного антигена.

В дальнейшей работе использовати 10 мкг/шг сорбируемых антител и рабочее разведение конъюгата 1:200 (Сб = 11,6 мкг/мл, СП31 = 5,1 мкг/ мл), что обеспечивало высокий уровень регистрируемой оптической плотности при наибольшей разнила между положительными и отрицательными контролями. Отрицательные контроли при использовании рабочей дозы сорбируемых и коньюгата имели низкую экстинкцию (0,05-0,1), В результате показатели положительных и отрицательных контролен различались между собой в 10-20 раз и более. При таком диапазоне, измерений облегчается визуальный учет реакции, что особенно важно при кассовых полевых испытаниях.

При визуальной оценке результатов "сэндвич"-метода ИФА окраску продукта пероксидазной реакции, полученную при анализе испытуемого материала, сравнивали с окраской, полученной при использовании положительного и отрицательного стандартов. Учет результатов проводили по 4-х крестовой системе: + + + + - интенсивная коричневая окраска, *■ + + - коричневая окраска,

+ - светло-коричневая окраска, + - желтая окраска,

- окрашивание отсутствует.

При визуальной оценке результатов за титр антигена принимали такое его разведение, которое обеспечивает окраску продукта ферментативной реакции на " +

Сравнение титров антигенов при визуальной и инструментальной оценке показало полное совпадение результатов исследований.

Вследствие ограниченности,информации по использованию ША при инфекционных болезнях птиц для оптимизации физико-химических параметров нами проведено изучение влияния различных буферных систем на специфичность и чувствительность анализа, С этой целью нами были испытаны Б различных буферных систем на основе 0,01 М фостатно-буферного (ФБР) рН 7,2 с включением различных ингредиентов, препятствующих неспецифической сорбции: твин-20; ; нормальная бычья сыЕоротка (ИБО), бычин сывороточный альбумин (БСА). Наилучшие результаты получены при использовании в качестве промывного буфера 0,01 М ФБР рН 7,2 + С,5 1,1 + 0,05$ твин—20, который обеспечивает наибольшее значение Р/1/ ~ 10,0 при достаточно низком фоне.

На заключительном этапе проведения ИМ в качестве субстрата использовали 5-аминосалициловую кислоту рН 6,0 в присутствии 0,0С5;£ Н>0_.

17

Дяя выбора оптимального времени проведения субстратно,: ргэкции мредь-л.ши значение ОД^ к положительном и отрицательном консолях ч^раз 10, --¡О, 30, 1и, 50 минут.

Результаты исследований показали, что оптимально» *ремя прогеди--п^я субогратно-1 реакции 30 минут.

3.4. Испытание иммуноферментного анализа в лабораторных

условиях

Отсутствие ярких клинических признаков и патологоанатамическ&х изменений при ротавирусной инфекции птиц и поли&тиологичность желудочно-кишечных растроиств не всегда позволяет проведение достоверной диагностики, 3 то же время высокая контагиозность вируса и возцдстиая восприимчивость к нему птиц требуют быстрой и своевременной диагностики заболевания. ^ связи с этим для борьбы с ротаьирусноа шаекииеи птиц требуется разработка и применение методов экспресс-диагностнки,

Результаты наших исследование по получению специфических компонентов и отработанные нами условия постановки нМ показали, что данным метод может быть использован при выявлении антигена ротавирусной инфекции птиц.

Экспериментальную работу по выявлению антигенов проводили на цыплятах 1-, 14- и 28- суточного возраста. Опытных цыплят зараз аи- пер.>-рально ротавирусом птиц (штамм "йНУ'Л") в дозе 1,0 мл, 3 контрольной группе ввели питательную среду без ви.уса.

Клиническое проявление заболевания у экспериментально зараженных цыплят отмечено на 3-й сутки опыта и характеризовалось угнетением, отказом от корма и выделением водянистых фекалий желтого цвета. Гибели цыплят за время наблюдения не было.

Для изучения накоплен/я вируса е кишечном тракте ежедневно из опытных и контрольной групп убивали по 5 цыплят, продолжительность опыта составила 15 суток.

при исследовании методом иЗД гомогената из различных отделов кишечника цыплят, зараженных ротавирусом птиц, вирусный антиген выявлялся в тканях двенадцатиперстной, тощей, подвздошной, ободочной кяшок с 4-го по 6-ой день после заражения, максимальное количество обнаруживали в тканях двенадцатиперстной я тощей кишок на 5-ый день (ОД450 ^ 1,0). Затем количество его постепенно уменьшалось к на 5-ыи день антиген не выявлялся совсем. Яри выделении вируса в культуре клеток, с использованием гомогенатов из этих отделов кишечника, наблюдались положитель-13

ные результаты с 4-го по Ю-нй день после заражения. Электронно-микроскопические исследования на наличие вирусных частиц подтверждались с 4-го по 6-ой день в двенадцатиперстной, тощей и ободочной кишках, с 5-го по 6-ой день после заражения - в подвздошной кишке. Л слепых кишках методом иЗА антиген обнаруживали' с 5-го по 6-ой день.

Культура клеток оказалась более чувствительной пря сравнении лМ

л ЕМ,

При исследовании гомогената из отделов кишечника от цыплят контрольное группы результаты били отрицательными.

Выявление антигена ротавируса птиц в пробах помета экспериментально зараженных цыплят разного возраста "сэндвич"-методом ИМ показа®? , что вирусный антиген обнаруживается с 3-го по Ю-ш день после заражения. Максимальное количество выявляется с 5-го по 7-ой день ЮД^О^Г.О).

Электронно-микроскопическим исследованием ротавирус птиц выявлялся с 5-го по 5-ый день после заражения.

Проведенные сравнительные исследования по лабораторной диагностике ротаЕирусноЙ инфекции птиц методом КЗА, выделением Еируса в культуре клеток и электронно-микроскопически показали определенные преимущества ИФА, так как он обладает высокой чувствительностью, позволяет выявить вирусный антиген до 10-го дня после зараженгя, прост в постановке. На проведение анализа затрачивается 3-4 часа.

Оценивая в целом диагностическую значимость Шк при выявлении антигена ротавируса птиц, следует заключить, что он может быть использован с целью экспресс-диагностики данного заболевания.

3.5. Испытание иммуноферментного анализа в производственных условиях

Успешное испытание метода имадунофермантнога анализа при экспериментальной ротавирусной инфекции птиц позеолило приступить к оценке его диагностических возможностей при естественно протекающее инфекции.

При изучении диагностической ценности ИФА нами были исследованы пробы помета спонтанно больных рот гаируснол инфекцией птиц в нескольких птицеводческих хозяйствах нашей страны.

При обследовании хозяйств нами было установлено, что у цыплят породы белый леггорн до двухмесячного возраста болезнь проявлялась внезапно одновременно в разных помещениях. Заболеваемость составляла ¿5-20/5, в отдельных залах - ¿5-31$. Продолжительность -заболевания 7-ХС суток. . I ■

Больные цшлята были малоподвижны, с взъерошенным опьрзнкем. У отдельных цыплят наблюдали диарею с выделением еодянкстых фекалии желтого цвета, отсутствие аппетита и угнетенное состояние. Гибель цыплят начиналась спустя три дня с момента появления клинических признаков. Количество паьших цыплят увеличаьадось. достг«гая максимума на 4-7 день болезни, после чего быстро снижалось. Падеж в отдельных' птичниках достигал Ъ%.

При патологоанатомическом вскрытии отмечали сильную гиперемию слизистой кишечного тракта. Тонкий и толстый отделы кишечника были наполнены коричневатой жидкостью. Слепые отростки вздуты.

Полученные данные позволили нам подозревать наличие ротавирусной инфекции птиц в обследованных хозяйствах. Для уточнения этиологии заболевания мы провели исследования в "сэндвич"-варианте иМ с пробами помета от спонтанно больных цыплят.

Исследования показали, что ротавирусный антиген в максимальном количестве 53,1$ выявлен у птиц яичного направления, в то время как максимальное количество положительных проб у птиц мясного направления составило 26,5$.

При анализе частоты обнаружения ротавирусного антигена в различных возрастных группах установлено, что у цыплят месячного Еозраста антиген выявляется в 47,1$ случаев. Затем частота обнаружения вируса постепенно снижается и в 100-сутосном возрасте характеризуется минимальными показателями (10$).

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют, что в птицеводческих хозяйствах различного направления регистрируется рота-вирусная инфекция, что требует разработки способов борьбы с ней для снижения экономических потерь.

ВЫВОДЫ

1. Первично-трипсинизированная культура клеток печени 12- 14- суточных куриных эмбрионов и перевиваемая линия МА-104 могут быть использованы для культивирования и накопления ротавируса птиц.

2. Специфическая иммунная сыворотка к ротавирусу птиц, полученная путем гипериммунизации кроликов концентрированным, очищенным антигеном, является высокоактивной, специфичной, пригодной для выделения иммуноглобулина класса . Сыворотка стабиль напри хранении в лиофя-лизированном состоянии.

3. Выделение иммуноглобулина класса С- кроликов осаждением ПЗГом-6000 позволяет получить высокоочнщенный иммуноглобулин, обеспе-чиЕащий наивысшую- чувствительность в ИФА.

4. йонъюгаты, полученные перйодатным методом, активны, специфичны, стабильны при хранении в лиофилизированном состоянии. Для получения высокоактивных конъюгатоЕ возможно использование пероксидазы хрена фирмы "Олайне" или "

5. Разработан и освоен способ получения высокоактивного, специфического, инактивированного антигена ротаЕируса птиц для постановки ИМ. Обработка антигена ультразвуком с амплитудой 12 мкм увеличивает активность на 1-2 Ьод,,. Наиболее щадящие условия инактивации рогагаруса птиц обеспечиваются применением димерэтиленимина в концентрация 0,2^ в течение 6 часов при 37°С. Антиген стабилен при хранении в лио-фгошзированном состоянии.

6. "Сэндвич"-метод ИФА позволяет выявлять ротаЕирусный антиген

в пробах помета с 3-го по 10-ый день после заражения. Кроме того, антиген выявляется в тканях кишечника с 4-го по 8-ой день после заражения. Отработанные параметры проведения твердофазного И£А позволяют использовать конъюгат без предварительной очистки от несвязавшейся пероксидазы.

7. Сравнительная оценка ИФА, электронной микроскопии и выделения вируса в культуре клеток для индикации антигена ротавируса птиц свидетельствует о высокой чувствительности и специфичности иммунофермент-ного метода.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований предложено "Временное наставление по применению иммуноферментного анализа для диагностики ро-тавирусной инфекция птиц".

СЛИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТШЕ ДИССЕРТАЦИЯ:

I. ГулямоЕ H.K. 1 отаЕиру.сная инфекция птиц./Двз. докл. на Всероссийской конференции молодых ученых и аспирантов по птицеводству. Г. CspTiiaB Посад, 1Й93.-С. 11-42.

С. Гулямов Н.К. Культивирование ротаЕируса птиц, (в печати)

3. АлиеЕ A.C., Гулямов Н.К. Лабораторная диагностика ротавирус-ной инфекции птиц, (в печати)

4. Алиев A.C., Гулямов Н.К., Дяавадов Э.Д. ИлмуноферментныЛ анализ дяя диагностики ротавирусной инфекции птиц, (в печати)

ГУЛЯМОВ НИТМАТУЛЛО КАЛЫРОИИ АВТОРЕФЕРАТ

Подписано в печать 13.04.95.Формат 60x84 1Дб.Еум.писч. Печ.л.1,0. Б.л.О,5. Тира* 100. Зак.270. РШ СШ5У35.

Издательство Санкт-Петербургского университета экономики п Финансов.

I9I023,Санкт-Петербург,Садовая ул.,21.