Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Биологические и морфологические особенности микобактерий и диагностика туберкулеза непрямым методом иммунофлюоресценции

- л^

. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОШИСТВЕНШХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ШСТИТУТ ЭКСПЕКЫЕНТЛЛШО:! ВЕТЕРИНАРИИ СИБИРИ И ДАЛЬНЕГО БОСТОКА

11а правах рукописи

.'¿ЖАРОВ гай АНАТОЛЬЕВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МОРШОШЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ШКОБАКТЕРИК И. ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА. НЕПРЯМЫМ МЕТОДОМ 1ИМУНСШЮРЕСЦЕНЦИИ

16.00X3 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание.ученой степени доктора ветеринарных наук

Новосибирск - 1993

' Работа выполнена в лаборатории по изучению туберкулеза сельскохозяйственных животных Дальневосточного зонального научно-исследовательского ветеринарного института

Научные консультанты: доктор•ветеринарных наук, профессор Л.С. Донченко доктор ветеринарных наук, Б.Ф. Керимжанова

Официальные оппоненты: Доктор ветеринарных наук, заслуженный деятель науки РФ

- профессор А.И. Кузин Доктор ветеринарных наук, профессор М.А. Сафин Доктор ветеринарных наук, профессор Б.Я. Хайкин.

Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко

Защита диссертации состоится 9 ' 1993г.

в. часов на заседании специализированного совета Д.СШ.23.Ы при Институте экспериментальной ветеринарии ■ Сибири и Дальнего Востока ( 633128, Новосибирская область, а. Краснообсн, СО РАСЙН, ИЭВСи ДВ ).

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО РАСХН

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного

совета, доктор ветеринарных наук

1993г.

А.А.Самоловов

I. ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность пгсоблемн. Всесторонним изучением возбудителя туберкулеза неоспоримо доказаны многообразие форм его существования, большая вариабельность морфологии (полиморфизм) и широкий диапазон изменчивости его биологических свойств (плеоморфизм).

Многими исследователями описаны многочисленные морфологические варианты микобактерий, отличающиеся от типичной палочковидной формы ,• среди которых особое внимание заслуживают бактерии, . дефектные по.клеточной стенке - Л-формы (З.Н.Кочемасова с соавт., 1980; З.С.Земскова, И.Р.Дорозккова, 1384).

Повреждения, связанные с дефектом или частичной утратой кле-точнЬй стенки, вызывают глубокие морфологические и функциональные изменения микроба, при этом он сохраняет способность длительно персистировать, а такие реверсировать в исходный микробный вид. Факторы индукции Л-форм шкобактерий многочисленны, они представлены различными химическими соединениями, биологическими агентами, физическими воздействиями.

Однако, отсутствие достаточных знаний о роли факторов индукции Л-форм и сравнительного анализа их Л-трансформирущего действия на возбудителя туберкулеза не позволяет пока оценить истинное значение этих форм в эпизоотическом процессе и эффективности противотуберкулезных мероприятий.

Вместе с тем, роль факторов шщукцшг и сравнительный анализ их Л-трансформирущего действия с ка;.щым годом приобретает в инфекционной патологии все большее значение в связи с расширением и углублением наших представлений о механизме образования и тех структурных изменениях, которые претерпевают клетки в процессе их Л-трансформации (Н.Л.Вершилова с соавт., 1972; В.Я.Тимаков, Г.Я.Каган,'1973; П.А.Триленко, 1973, 1976; А.И.Кузин, 1977, 1980;

П. А. Баку лов, Т.Я.Зеленцова, I9SL; Ы.Г.Кирпленно, I'J8ü; П.Е.Савченко, 198ь; .'.i.A.JaTäiii, I9Go; Б.П.Урбан, IC8l , ISGI; B.C.'Федосеев, ICGC, 1981, IS85, IC83; C.ü.Прозоровский с соавт., 1981; A.A. Щеткин, ICSI; Т.П.Байтерякова, 1983; Б.Ф.Кериыглнова, 1991).

В последние годы с нзпенением патоыорфологической картины туберкулеза, сочетавшей как специфические, так и неспецифпческие морфологические реакции с выраженным аллергическим компонентом и перспстенгдей возбудителя в Л-йорме, все большее значеше приобретают методы лабораторной диагностики (¡.¡.¡.¡.Авербах с соавт., 1968; Б.Е.Кнорлнг, 1978; J.Н.Левина, ICSI; II.II.Коваленко, ICS3, 1969). Поэтому разработка наделазых методов н средств диагностики туберкулеза по-прс;шему остается ЕатлойшеЛ задачей исследователей. Определений интерес в этой связи представляет тзднофлюоресцентнкй метод, пироко применяемый в различных областях иг.злунолопш, шк-робполопш, по пенашедшпй дол-люго пршленешш в лабораторной диагностике туберкулеза сельскохозяйственных шшотных.

Существенным его преимуществом является обнаружение и идентификация искомого антигена среди других смешанных антигенов. 11м-г'С'1;о.*1:ооресдсптш,:1 метод может быть попользован для обнаружения различных корпускулярных или растворимых антигенов при условии их фиксации па поверхности пли внутри клеток. Чувствительность его колеблется от I-IüJ - 5"1С° микр.клеток в I мл, в то время как обычные имтупологичоекие реакции требуют содер::хишя в I г:л

л г

гзвесп .3*10 - - 2,i3*IC-J микр.клеток {'¿.II.Левина, 19-32; Л::чен, 1-7 4; У. -срр::, ..1сймер, ±¿7.1).

...оль л задачи исследованн::. отсутствие наде.'лшх методов ешв-ления п ^ассифмкацп:: Л-трш1с;Т.отшровашшх вариантов г/лкобактсрпИ, а также ог^адггсошюеть научных сведений о патоморТюзе Л-форм побудили пас -ропести комплексное изучение Л-форм туберкулеза

(индукция, стабилизация, реверсия, микроскопическая*структура) и на основе полученных данных разработать научные рекомендации по диагностике и профилактике туберкулеза сельскохозяйственных вотных.

Для достижения намеченной цели били поставлены следунцие задачи:

- изучить условия и некоторые закономерности Л-трансформации мпкобактерий туберкулеза под действием поверхностно активных веществ, культуры клеток в организме лабораторных и сельскохозяйствен-' кнх животных;

- определить специфичность и диагностическую ценность непрямого метода шлаунофлзооресценщш для ищшкащш и идентификации бактериальных форм туберкулеза и Л-трансфорглированных вариантов мпкобактерий ;

- вылепить методами патоморфологического и микробиологического исследований связь тканевых проявлений с Л-формами мпкобактерий туберкулеза;

- установить возможность непользованля непрямого метода имыуно-ушооресценщш параллельно с культуральным для индикации и идентификации мпкобактерий в биоматериале :швотных из хозяйств с различной эпизоотической ситуацией по туберкулезу.

Научная новизна. Установлено, что Л-трансформация микобак-терий туберкулеза - закономерный процесс, происходящий под действием поверхностно активных веществ (лизоцика, глицина), в культуре клеток макрофагов п в организме ишотных, способствующий обеспечению сохранности и разнообразию Их биоморфологии.

Разработан способ получения Л-форм мпкобактерий в культуре перптонеалы-шх макрофагов белых мышей.

Получены новые данные, расширяющие представления о динамике

и характере морфологической и (функциональной трансформации шко-баитерий in vitro u in vivo . Показана возмо:хность явления трансформации" шкобактерий БЦК в организме вакцинированных телят, способность их длительно персистировать в организме.

Установлено, что несмотря на дефект клеточной стенки, Л-фор-мы- шкобактерий туберкулеза сохранили антигенную специфичность и серологическую активность, последняя была несколько ниже, чем у исходной бактериальной культуры. JI-формы, полученные экспериментальным путем в зависимости от факторов индукции, отличаются по антигенному составу. У Л-вариантов, полученных in vitro , в достаточной мере сохранялась клеточная стенка, а у Л-форм, полученных in vivp,отмечалось значительное нарушение клеточной стен--ки, кдк следствие этого - преобладание антигенов цитоплазмы и ци-топлазматической мембраны.

Установлено, что естественный патоморфоз ответнкх туберкулезных реакций на введение в организм Л-форм микобактерий протекает по неспецифическому пути, а степень неспецифических изменений зависит от глубины изменчивости персистируыцего в организме возбудителя.

В условиях эксперимента доказано, что срок появления туберкулезных антигенов и их первоначальный уровень зависит от био-. морфологических форм возбудителя туберкулеза. В дальнейшем с воз-■расташем длительности заболевания эта зависимость нивелируется. Наиболее чувствительным и специфичным из испытанных методов серодиагностики туберкулеза оказывается непрямой метод флюоресци-рувдих антител, позволяющий с большой достоверностью диагностировать заболевание морских свинок через сутки после заражения независимо от характера биоморфологии возбудителя туберкулеза.

Установлено, что реакция иыглунофдюоресценции обладает высо-

кой специфичностью в отношении видовой идентификации бактериальных и Л-форм микобактерий, как лабораторных штаммов, так и культур, полученных .из биоматериала больных туберкулезом животных. Непрямая иммунофлюоресценция позволила установить локализацию антигенов в клетке Л-форм,-

Доказано на разнообразном секционном материале, что использование непрямой тмунофшооресценции в комплексе с методом посева повышает специфичность и информативность микробиологической диагностики туберкулеза, обеспечивает надежный контроль за эпизоотическим состоянием стад по туберкулезу.

В процессе комплексного использования рутинного метода посева и непрямой иммунофлюоресценции уточнена частота и соотношение выделения бактериальных и Л-форм микобактерий туберкулеза в зависимости от эпизоотического состояния хозяйства по туберкулезу.

ХеРДаТДЧИ.Ш Д .праштасш ттотсхь.. Результаты исследования Л-трансфорлации микобактерий туберкулеза, свойств Л-форм и реверсии их в бактериальную форму, позволяют подойти к этому явлению с более широких общебиоюгичесних позиций и сделать вывод, что для микобактерий туберкулеза Л-трансформация вполне закономерна и новые, научные факты могут быть использованы для целевой программы'научных изысканий, а также практических.критериев оценки и прогнозирования эпизоотической ситуации по туберкулезу как в отдельном хозяйстве, так и в целом по региону. Полученные данные в совокупности с материалами различных научных ■ учреждений послужили основанием для разработки ряда научных и практических рекомендаций к наставлений по диагностике и профилактике туберкулеза тлвотных с учетом возможности Л-трансформа-ции возбудителя туберкулеза.

Аптюбадия габоты. Материалы работы долопены и обсуццены на заседаниях Ученого совета ДальЗНИШ (1986-1992); ¿курской областной научной конференция "Ветеринарная наука на службе производства" (Благовещенск, 1987); зональной научной конференции "Профилактика и ликшщация основных болезней сельскохозяйственных "д-вотных" (ВлагоЕещенск, 1289);¡зональной научно-практической конференции "Проблемы ветеринарии Пршлорекого края" (Владивосток, 1ЭЭ0); Воесоюзшх координационных совещаниях исполнителей НИР по туберкулезу страны (Новочеркасск, 1989; Махачкала, 1990); Всероссийском координационном совещании исполнителей НИР по туберкулезу страны (Ст,:ск, 1923 ); на научной конференции, посЕЯщен-ной 70-летию лаборатории эпизоотологии, диагностики и- профилактики туберкулеза и паратуберкулеза ШЭВ (Уосква, 1992); научной сеосш общего годичного собрания Дальневосточного отделения БАСХНКД (Хабаровск, 1990); научной сессии общего годичного собрание Дальневосточного., .отделения. РАСХН (Хабаровск, 1992, 1993 ).

Публикация результатов Есследокани/т. Но теме диссертации опубликовано 22 работы в.сборниках научных трудов СО ВАСШШ, ДВО РАСХН и бюллетене ВИЗЕ, ^риалах "Ветеринария", "Нроблеш туберкулеза", материалах научных конференций и в других научно-производственных изданиях.

Объем и струцтурц дцссертдцпд. Диссертация изложена на страницах машинописи, иллюстрирована 33 таблицами и 56 рисунка-ш, состоит из введения, обзора литературы, результатов"собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений и приложения. Список литературы включает 637 источников, е том числе '359 отечественных и 278 иностранных. Текстовая часть диссертации составляет 327 страниц.

Основцнс подо-.оншт. енноспшо на защиту.

- характеристика морфологических и биологических свойств Л-форм микобактерий туберкулеза, метода, средства их получения и выделения;

- Л-трансформация микобактерий туберкулеза с общебиологических позиций;

- специфичность и диагностическая ценность непрямого метода им-муиофлюоресценили для выявления и идентификации бактериальных.и Л-трансфорлированных вариантов микобактерий туберкулеза;

- патоморфологическое, серологическое и аллергическое исследова-.ние на туберкулез при экспериментальной инфекции у лабораторных ¡¡швотных;

- патоморфологическое, микробиологическое и шшунофлгаоресцентное исследование биоматериала от кивотных, реагирующих на туберкулин, из хозяйств с различной эпизоотической характеристикой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в лаборатории туберкулеза животных Даль-ЗНИЕИ, кафедре микробиологии и вирусологии Семипалатинского зооветеринарного института, кафедре .патологической анатомии Благовещенского государственного медицинского института и в хозяйствах Дальнего Востока в соответствии с утверяденнкш'планами •научно-исследовательских работ в период 1981 - 1992гг.

Научные эксперименты по изучению возможности воспроизведения процесса Л-трансформации микобактерий под влиянием лизоцима и глицина как факторов, действие которых наиболее вероятно в условиях иммунного и неиммунного организма, были•предприняты нами на начальной стадии работ в этом направлении. В качестве модели в работе использовали микобактёрии туберкулеза бычьего вида (шт.

- IL -

vallée 1НКИ).

Жизнедеятельность ■ культур поддер;:сивалась еженедельным суб-культивироЕанием их на жидкой , среде Тщн-Ш, не содержащей альбумин. Бактериальные клетки ресуспендировали в небольшом объеме этой среды, чтобы получить-в конечном счете оптическую плотность О,L3 при 450' нм для включения их в реакционную систему, содержащую IG,0 мл Твпн-альбуминовой среды при рН7, 1-7,2.

В тех случаях, когда применялась сахароза, то её вносили в L,34 M концентрации, a Mg++ ( в виде MgSO^ ) из расчета 1,1 мкг/мл. Испытали концентрацию лизоцима от 50 до 2L0 мкг/мл и глицина от 0,5 до 1,5% (вес/объемы). Бюксы содержались в термостате при 37° С а в целях постоянного щадящего ресуспендирования вращались на вируторе I об/мин (рацпредложение й 24 от IU.Ü2.I987). Культуры через ка-здые 24 ч изучали на изменение морфологической структуры с помощью фазово-контрастного микроскопа. Также проведено изучение способности клеточных культур макрофагов различного происхоздения вызывать как биологические, так и структурные изменения микобактерий.

Опыты ставили с двумя эталонными штаммами шкобактерий Ы. bovis ( vallee ) Ы. avium (Ф-83), полученными из ГНКИ. Сопоставление результатов заражения культуры клеток различными инфицирующими дозами позволило установить-, что соотношение 5-6 ¡■.шкобактерий на I макрофаг наиболее отвечает целям эксперимента по изучению функционального и морфологического состояния микобак-терий и макрофагов в процессе их взаимодействия. Макрофаги получали и культивировали по методике И.Я.Учитель (1978) с нашими . видоизменениями ( Методические рекомендации "Получение 1-форм шкобактерий туберкулеза в культуре перитонеальных макрофагов белых мышей", 1986 ),

Через I, 2, 3, 4; 6, 7, 20 ч после заражения клеток покровные стекла с макрофагами извлекали из питательной среды и окрашивали по Циль-Нильсену. Среду культивирования инфицированных макрофагов центрифугировали при 1СШ об/мин в течение 1С- шн', осадок засевали на питательные среды. Одновременно проводили микроскопию осадка.

При проведения последующих исследований следили за изменением микобактерий туберкулеза в организме лабораторных животных,' устойчивых к туберкулезу. В качестве экспериментальной модели выбрали белых крыс, так как они проявляют высоковыраленную природную устойчивость к возбудителю туберкулеза '(Н.Ф.Гамалея, 1529; И.Я.Драбкина, 1957; В.И.Пузик, 1966; И.Л.Кусывицкий, 1987).

Изучение возможности Л-трансформации ж форм персистирования микобактерий туберкулеза проводили на белых крысах. Опыт проведен на 42 крысах массой 200 - 300 г. Они были разделены на 2-е равные .группы по 21 голове в катдой. Накануне опыта у них вызывался экссудат путем инъекции в полость бршзны 0,9$ стерильного физиологического раствора, подогретого до 38° С. Через 24 ч инт--раперитонеалыю вводилась культура исследуемого штамма возбудителя туберкулеза. Первую группу ствотных заражали полевой культурой микобактерий бычьего вида "Кировская", вторую - возбудителем бычьего вида шт "vallée ", в 7 сроков через 1,5,7,9 ч и I,.2, 5 суток из бршной полости крыс получали транссудат, из ' которого готовили натпвные п окрашенные по Циль-Нильсену мазкп. После получения транссудата .тавотных подвергали декапитации, вскрывали и гомогенаты взятых стерильно участков легких, печени, селезенки и сачьника засевали на питательные среды для выделения бактериальных и Л-форм микобактерий туберкулеза.

Для изучения форм персистирования микобактерий ЩВ£ в орга-

низме сельскохозяйственных животных в благополучном по туберкулезу хозяйстве было прюбретено 24 теленка в возрасте до 10 дней. Телята были разделены на 2-е группы:, б - в контроле и 18 в опыте. Кормление и содержание телят обеих групп было одинаковым. По окончании молозивного периода из их рациона было исключено цельное молоко и обрат. Животных кормили заменителем цельного молока (5ЦМ), а в дальнейшем.- сухим обезжиренным молоком (СОМ) по зоотехническим нормам. По окончании молозивного периода телятам опытной группы привили вакцину ЕЦЕ внутрикожно в дозе-1 мг сухого вещества в 0,3 мл растворителя.

Локализацию п персистенцию вакцинного штамма БЩ в.организме привитых телят устанавливали при убое их через 20 дней, 2, 6, 13, 21, ЗС мес. после вакцинации с проведением лабораторных исследований.

С этой целью комплексному микробиологическому и биологическому исследованию посредством многократных повторных пассажей были подвергнуты кусочки кожи на месте введения вакцины, лимфатические узлы (подчелюстные, предлопаточные, паховые, портальные, мезентериалыше), внутренние органы (легкие, почки, селезенка). Посев биоматериала проводили на среду Левенштейна-Пенсена и среду Школышковой в модификации Дорожковой.

При получении гипериммунных сывороток против сферопластов и бактериальных форм микобактерий ими иммунизировали кроликов. В её основу была взята схема Б.Е.Кноринг (1969), применявшаяся для получения антимикобактериальных сывороток. Кроликов иммунизировали по следунцей схеме: животным антиген вводили 4 раза, с 6 дневным интервалом, внутривенно подготовленной в день опыта взвеси сферопластов в физиологическом растворе (концентрацией I мг/мл) в постепенно возрастающих дозах (0,1; 0,3; 0,6; 1,0).

Подобным образом производили иммунизацию кроликов и бактериальной формой микобактерий туберкулеза. Забор крови осуществляли одномоментно на 7-е сутки после последней инъекции. Сыворотку заготавливали в стерильных условиях по общепринятым методам и сохраняли в замороженном состоянии. Для определения величины титра антител в сыворотке использовали реакцию связывания комплемента (РЖ).

Бактериологические и Л-препараты для иммунолшинесцентного метода.исследований готовились из культур, выращенных на плотной питательной среде Левенштейна-Иенсена, лшдкой синтетической среде Сотона, полужидкой среде Школьниковой в модификации Дородовой, .питательной среде Свердловского НИИ туберкулеза. Питательные бреды для вырадиЕания культур готовились по общепринятым методикам.

На среде Левенштейна-Иенсена микобактерий, как правило, выращивали в течение 21-дня. На среде Сатона культуры для приготовления мазков выращивали в зависимости от характера роста в интервале от 7 до Ф дней пли.от 10 до 21 дня. На среде Школьниковой Л-культуры выращивали от 21 до 45 дней. Необходимым условием получения бактериальных препаратов для иммунолшинесцентного метода окрашивания являлось приготовление гомогенной микробной суспензии.

Приготовленные мазки высушивались на воздухе и затем фиксировались. Были испробованы как химические, так и физические методы фиксации препаратов": пламя, прогревание в сушильном шкафу при 65° С в течение 2 ч , метанол, этиловый спирт, эфир.

Поскольку при высушивании и фиксации Л-формы в значительном количестве разрушаются, мы параллельно провелп постановку непрямого метода гдшунофпйоресценции на окрашивание глвых не уиксиро-

ванных клеток, исключающих этап приготовления мазков и последу-вдую фиксацию.

В качестве одного из вариантов было использовано цриготовле-ние мазков из делипоидизированных микобактерий. Для обезнирива-ния иикобактерий был испытан Теен-80. Способ приготовления препаратов из биоматериала (лимфатические узлы, паренхиматозные орга-ш, участки к о--и) заключался в следущем: ткани измельчали, гомогенизировали, центрифугировали, осадок после центрифугирования ресуспендпровали в физиологическом растворе.

Окраску препаратов непрямым методом имщнофлюоресценции выполняли в 2-х вариантах. В первом случае на фиксированный и просушенный мазок наносили кашш разведенной или цельной сыворотки. Обработку препаратов проводили при температуре + 37° С во влажной камере в течение 2С'мин. Затем сыворотку с препарата тщательно смывали струей водопроводной воды в течение I мин и 1С-2С млн отмывали фосфатным буферным раствором (рН 7,2 - 7,4). После двукратного ополаскивания дистиллированной водой препараты высушивали на Еоздухе или осторожным промоканием фильтровальной бумагой. После этого их окрашивали лш.шнесцирувдей сывороткой против глобулинов кролика. Условия окрашивания препаратов флюоресциру-щей сывороткой были аналогичны уке описанным.

Во втором случае культуры Л-форл в виде ресуспендированно-го осадка (биоматериал) в физиологическом растворе помещали в количестве и,5 мл в 3-й конические пробирки. В первую пробирку помещали С,2 мл диагностической иммунной сыворотки (против сфе-рошхастов либо бактериальной формы микобактерий). Сыворотки добавляли в рабочем разведении. Для контроля специфичности реакции во вторую пробирку помещали нормальную кроличью сыворотку в разведении, соответствующему промежуточной иг.иунной сыворотке. В

третью контрольную пробирку сыворотку не вносили. Пробирки инкубировали в терлостате при 37° С в течение 30 мин. После инкубации исследуемый материал трехкратно отмывали фосфатным буферным раствором рй-7,2 посредством центрифугарования при 1,5 - 2,0 тыс. об/мин. К осадку добавляли смесь флюоресцирующих антиглобулинов - лшинесцирующую сыворотку против глобулинов, меченную изоцпа-натом флюоресцеина и бычий альбумин, меченный родамином, для контрастирования неспевдфического свечения в препарате. Л^линес-цирувдую смесь добавляли во все пробирки по 0,2 мл. Инкубировали при комнатной температуре в течение мин. Затем снова трехкратно отмывали буферным раствором. Из осадка готовили препараты по типу раздавленной капли.

Просмотр окрашенных препаратов осуществляли под лкминес-центным микроскопом марки ?,Ш-2 с использованием возбуждающих фильтров Т-2.1. Объектив х 90, апертура 1,25, окуляр - 7 или 10°, сила тока 4,5 А.

Для микроскопии с иммерсией применяли диметилфталат. Для ¡ликрофотографии (черно-белой) использовали фотоапарат "Зенит" и фотопленку 250 Ед. Оценку интенсивности свечения производили по четырех плюсовой системе: ++++ - очень яркая изумрудно-зеле-' ная лшинесценция периферии клетки, внутри клеточных включений; +++ - яркое периферическое и даффузное свечение; ++ - слабое свечение; + - люминесценция отсутствует.

За специфическую люминесценцию бактериальных форм клеток гшкобактерй принималось свечение периферии клеток в виде ярко зеленых ободков, которые резко контрастировали не только с фоном препарата, но и с центральной частью клеток. Выявленные таким путем микобактерии представлялись значительно увеличенными в размерах. При наблюдении Л-структур наблвдшш яркое специфическое

- IS -

изумрудно-зеленое свечение периферии и в некоторых случаях диффузное в цитоплазме клеток. Альбумин, меченный родамином, контрастировал фон и тканевые элементы, окрашивая их в оранжевый цвет. Специфичность, иглглунологических реакций в мазках из глико-бактерий устанавливали дополнительной постановкой контрольных • опытов.

При экспериментальном изучении патогенности Лчформ микобак-терий туберкулеза использовали ранее разработанные и изученные модели патологических процессов, вызываемых типичными бактериальными формами микробов (E.H.Левина, 1968).

D опытах были использованы следующие возбудители туберкулеза: лабораторный штамм i.i. bovis- полученный в IHKI1; нестабильная культура Л-форгл ¡.¡.bovis ' (Серышево-88), выделенная из биоматери-ата норовы, которая реагировала на туберкулин; условно-стабильная культура Л-форл'1.1. bovis (Серышево-87), выделенная из биоматериала коровы, которая также реагировала на туберкулин. Условно-стабильная культура пропша 26 пассажей и сохранялась в лаборатории более 2 лет, ни разу.не дав реверсии при многократных контрольных высевах на среду Левенштешга-Ленсена и полу;щдкие срвды без Л-трансформпруыцих агентов.

В качестве экспериментальной модели для заражения в опыт были взяты морские свинки с массой 25Q-3CQ г. (всего 120 штук), разделенные на 4 .группы, из которых последняя группа являлась контрольной, а остальные три были подвергнуты заражению. Первую группу морских свинок заразили У. bovis ( vallee ), вторую -культурой ГЛ. bovis (Серышево-€8) и третью - культурой M.bovis (Серышево-87). Инфект вводили подкогло в паховую область. В соответствующие сроки после заражения, запланированные для каддой серии опытов, животных обескровливали. Морфологические изменения

в органах лшвотных изучали на вскрытии и- гистологически. Производили посев биоматериала на среды Школышковой и Левенштейна. Ткани и органы яивотных исследовали в РСК и непрямым методом флюоресцирующих антител.

В клиническом разделе-работы исследован биоматериал 372 т-вотных, реагирующих на туберкулин, в том числ/з - 44 .тавотных с различными сроками давности вакцинации ЕЦЕ. .

Для выявления микобактерий туберкулеза использовали плотные питательные среды Финн-П и Левенштейна-Иенсена согласно "Настав- -лению по диагностике туберкулеза животных" (1986).

Исследование на Л-формы проводили согласно. "Методическим рекомендациям по вцделению Л-форл микобактерий туберкулеза из патологического материала" (И.Р.Дороякова и соавт., 1980). Выделенные куйьтуры Л—форм пассировали на среде Школышковой с целью получения реверсии. При отсутствии реверсии в течение 5-6 последовательных пассаяей культуры относили к условно-стабильньил. Все выделенные при 'посеве или полученные в результате реверсии- культуры микобактерий изучали, согласно положению № 558 МЗ СССР "Об унификации микробиологических исследований при туберкулезе" (1978). Лекарственную чувствительность определяли методом абсолютных концентраций на.среде Левенштейна- Иенсена и оценивали по общепринятым критериям. Устойчивыми считали микобактерии туберкулеза, даыцие рост при концентрации стрептомицина 5 мкг/мл, изо-ниазида-1, ПА.СК-1, этионамида-30, римфампицина-ЗО' и этамбутола-5 мкг/мл.

■Одновременно с посевом биоматериала производили заражение морских свинок подколшым введением Ь,1 мл гомогената биоматериала в правую паховую область. .

¿огласно разработанным наш методическим рекомендациям

"Обнаружение типичных и измененных форм микобактерий туберкулеза непрямым методом яммунофлгооресценции" (Новосибирск, 1993) проводили иммунологическое исследование биоматериала.

В работе использовали эталонные штаммы микобактерий туберкулеза бычьего вида ( vallée. ); птичьего вида (Ф-83); человеческого вида ( Dt/st ), M.kansasii (П-Ф)'| полученные с паспортом из музея 1НКИ. Шгаш ЕЦ2 - обычный вакцинный штамм (серия 539 контроль 1482). Л-Еарианты I,i. bovis (vellee ), 1Л.tuberculosis (Dt/st ), M.avium (Ф-83), M.kansasii (II-Ф) - полученные эк-спершлентальным путем.. Сферошгасты LI.bovis-( vallée ), Ы.tuberculosis ( Dt/st ), ¿í. avium . (Ф-83), M.kansasii . ( II-ö) -получены по способу И.В.Коваленко (1989) в нашей модификации (рацпредложение JS ¡24, 1987). Также использовали культуры микобактерий, находящиеся б коллекции лаборатории - ДальЗНИЕИ ДВО РАСХН: M. scrofulaceum , M.gordone , U. battey , M.phlei , M.sme-gmatis.

Помимо этого использовали полевые культуры бычьего вида (Кировская, СерышеЕО-б7, _С0рышево-88); человеческого вида (47, 49); птичьего вида (Петух), а также культуры кислотоустойчивых сапрофитов, которые бшш выделены из-почвы и водоемов Амурской и Сахалинской областей.

В экспериментах были задействованы 24 теленка, 80 кроликов, 560 морских свинок, 180 белых мышей и 60 белых крыс. Животных содержали в виварии института. Экспериментальную работу осуществляли в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" (1977).

Методики отдельных экспериментов, научно-производственных опытов и эшзоотологических исследований изложены в соответст-вувдих разделах диссертации.

Полученные данные обработаны с помощью методов альтернативного варьирования и вариационной статистики. Среднее геометрическое Ш. геом.), Среднее арифметическое (М), ошибка средней (и), показатель Достоверности (Т) рассчитывались.по общепринятым формулам (И.И.Ашмарин,.А.Л.Воробьев, 1952; Д.С.Каминский, 1934; И.Т.Шевченко и соавт., 1979). За основу выводов и предложений были взяты результаты контролируемых.опытов, проведенных в лабораторных и производственных условиях. Отдельные исследования выполнены в соавторстве с Т.И.Байтеряковой, Н.Г.Кириленко, Г.А.Васильченко, Г.А.Гавриловой, Н.М.Мандро, А.А.З^игоренко.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Л-трансформация микобактерий туберкулеза,функциональные, морфологические особенности Л-форм микобактерий Большая роль в процессе индукции Л-форм в условиях гтхроорганизма принадлежит лизоциму, который можно обнаружить практически на всех этапах эволюции: у бактериальных вирусов, бактерий, простейших, растений, насекомых, жизотных и человека. Его функциональная роль на разных этапах эволюции различна, а структурная организация характеризуемся рядом вариаций, общее число которых исчисляется несколькими десятками (О.Б.Бухарин, Н.В.Ва -сильев, 1974).

Результат действия лкзсцима на бактериальную клетку может найти свое проявление в виде ряда эффектов, которые применительно к популяции или отдельным клетка,1 проявляются в лизисе, бак-териоста'зе, бактерицидном действии, изменении морфологии и способности к окраске, повреждении клеточных структур, нарушении деятельности ферментативных систем ( Н.Ра11еег1а1 е*;.8й. , 1939).

Ка начальном этапе экспериментальных исследований предприняли попытку выяснить в опытах in vitro сравнительную чув-. ствительность к Л-трансформирувдему действию лизоцима и глицина возбудителя туберкулеза бычьего вида. При этом следует-отметить, что Есе исследования в этом направлении посвящены изучению Л-траисформацпи "Л.tuberculosis и очень немногие - трансформации, ¡.¡.bovis .

^полненные исследования по влиянию лизоцима, глицина и их со-.четаиного действия на возбудителя туберкулеза бычьего вида с последующи подцертлнием жизнеспособности форд несбалансированного роста и изучению процесса их трансформации в Л-нфорш на различных питательных средах показали, что лизоцим не только индуцирует образование сферопластов, но также является стабилизи-рущим фактором в процессе их роста в Л-формы.

В реакционной системе, содер;:ащей лизоцим и глицин в оптимальных концентрациях (лизоцим IQ0 мкг/мл, глицин 1,2 вес/объема) а также сахарозу и Mg"*, на 8-е сутки возникали .формы несбалансированного роста в виде .шаров - сферопластов, большинство из которых содержали темные гранулы.

Результаты опытов также показывают, что для образования и стабилизации сферопластов необходим Mg44". При наличии ü,34 М сахарозы и оптимальной концентрации лизоцима и глицина клетки при отсутствии Mg ++ лизировагш на четвертый день культивирования. При 0,ь7 мкг/мл Mg ++ лизис задерживался до 5-го дня и в течение 2-й недели отмечали небольшое количество сферопластов. При оптимальной концентрации Mg'14" I,i мкг/мл. наблюдался незначительный лизис и образование большого количества сферопластов. При концентрации 1,6 мкг/мл и выше припухлость клеток была небольшой и сферопласты не образовывались. Было также установлено,

что лизоцш обладает способностью'затормаживать развитие шко-бактерий туберкулеза.

Для поддерглния жизнеспособности форм несбалансированного роста и изучения процесса перехода их в Л-форш в качестве питательных субстратов использоЕали обогащенный агар для плевропнев-моние подобных организмов и среду Школьниковой в модификации Дороякоаой.

Л-тип колоний на инокуллрованном сферопласташ агаре для плевропневмоние подобных организмов был обнаружен на. Г7-е сутки. Колонии бшш с нежным кружевным краем л врастащим в среду центром, темного цвета. В их структуре преобладали шаровидные тела и в меньшем количестве полиморфные организмы. Видимый рост на среде Школышковой был отмечен на 3-4-е сутки после внесения нуль-туры сферопластов.

Микроскопическое исследование выявило значительное количество небольших- структур Л-типа. Типичные Л-структуры'получили через 3-4 пассаяа на среде Школьниковой.

Наиболее типичный и регистрируемый путь развития Л-форл ми-кобактерий был получен при предварительном культивировании шко-бактерий в гидкой среде, содер-тащей лизоцш, глицин, сахарозу и соли магния, при этом сферопласты, образовавшиеся в системе лизо-цим-гливдн были•• аналогичны прсмеяуточным форлам, наблвдаемым у других видов.

Особый интерес в плане объяснения возможных механизмов Л-траясформаций патогенных бактерий в организме животных и человека, представляет деятельность лизосомальннх клеточных структур (А.А.Покровский и В.А;Тутельян, 1976).

Однако вопрос о функциональном и морфологическом состоянии шкобактерий, подвергшихся фагоцитозу, в силу некоторых методи-

ческих затруднений остается недостаточно изученным. Поэтому определенный интерес представляют результаты выполненных экспериментов по ивдукции Л-форм шкобактерий туберкулеза в культуре клеток макрофагов лабораторных животных. Эксперименты проводили с двумя штаммами шкобактерий: м.bovis (vallee) u И.avium (5-83)

Репродукция шкобактерий вызывала у части популяции манрофа-

1 «

гов дегенерацию кариоплазмы с последующи распадом цитоплазмати-ческих структур клеток. Наиболее часто встречавшейся формой.дистрофии является кариорексис и вакуолизация ядерного вещества.

Одновременно отмечен регрессивный метаморфоз как в.макрофагах, так и у ынтрацеллшярно расположенных шкобактерий. Эти процессы были более выражены в культуре макрофагов ба^ых мшей, менее - кролика и весьма слабо в культуре клеток морской свинки. Наряду с процессами дегенерации, размножения и частичной потери кислотоупорности шкобактерий регистрировали как в цитоплазме макрофагов, так и внеклеточко измененные клетки ¡Л. bovis и LI. avium , имеющие округлую форму (сферического тела) от 6 до 27 мш в диаметре. Они тлели хорошо просматриваемый контур внешней оболочки и претерпевали"изменения в окраске, теряя кислотоустойчи-вость. Через 2 ч инкубации Ькрашивались в красный, розовый, а через 3 ч и более - в синий цвёт.. Максимальное число сферических форм отмечалось, через 3 ч после заражения. Сферические тела формировались как в вакуолях макрофагов, так и в микроколониях ш-кобактерий, находящихся в интрацеллюлярной среде культуры клеток. Вкход сферических тел из макрофагов проходил путем почкования, а такие в результате выброса, сопровождающегося разрушением макрофагов. Иногда встречались сферические образования более крупного размера. Эти структуры тлели красно-бу^ю окраску, неровную на-рупную оболочку и нередко значительная часть их была занята ва-

куолями. Было установлено, что сферические тела способны увеличиваться в размерах и делиться,.причем механизм деления оказался иным, чем у исходных бактерий. Как правило, наблвдали неравномерное бхшарное деление, при котором две дочернин клетки имели различные размеры.

При посеве жидкой фазы культивирования инфицированных макрофагов на среда Школьниковой были получены культуры. JI-форм мико -бактерий туберкулеза. Для всех Л-культур была характерна гетерогенная зернистость, состоящая из гранул, шаровидных тел различной величины и оптической плотности, а также больших.гладких или зер- • нистых тел, расположенных единично или колониями.

При пассировании в течение 2 лет все культуры сохраняли способность к репродукции.

Описанные формы микобактерий, наблюдавшиеся в нормальных макрофагах, неподвергавшпхся воздействию антибиотиков л других химпопрепаратов, по-видимому, отражают исход их взаимодействия

с клеткой: репродукцию, деструкцию, образование Л-структур.

»

Культивирование макрофагов в условиях, приближенных к естественным, позволяет результаты взаимодействия их с микобакте-рияш туберкулеза перенести на целостный организм и считать макрофаги одним из факторов, обуславливавших Л-трансформацию возбудителя туберкулеза в организме .тавотного.

Установленное в экспериментах in vitro выраженное Л-тран-сформирукщее действие культуры макрофагов лабораторных животных, а также сочетанного действия лизоцима и глшщна предопределило дальнейшее проведение исследовашш по изучению процесса Л-тран-сформацпи млкобактерий в оштах in vivo как в оргшшзме лабораторных так и сельскохозяйственных жиеотных.

Опыты по'индукции Л-форм шкобактерпй туберкулеза in vivo

проводили А.СааЕ^всЬ, С.Ьиса, е.Сааоп, С.Найи (1970);И.Р. Дорохова (1974); З.Н.Кочемасова и др. (19Ю); Б.С.Федосеев, Л.Ж.Мусин (1981); Б.ш.Кершаарова (1991).

Однако, вводя шкобактерий в макроорганизм, они немедленно воздействовали на них лекарстбенными препарата!®, что безусловно не отражало полноты картины взаимоотношения- в системе макро-микроорганизм. Поэтому в своих исследованиях исключили применение медикаментов, а в качестве экспериментальной модели бшт выбраны белые крысы.

Результаты исследований показали, что в бршной полости белых крыс плел место процесс Л-трансформации ыикобактерий туберкулеза (шт "vall.ee " и культура "Кировская"), выразившийся в образовании форм несбалансированного роста и нестабильных Л-форл. Первые признаки Л-трансформацпп ыикобактерий в организме белых крыс били отмечены уже через I ч после начала эксперимента. 3 этот срок в натпвных.мазках из транссудата бршной полости крыс обнаружены округлые шарообразные структуры, напошнащие большие вакуоли правильной формы и располагающиеся чаще небольшими скоплениями, а также зернистые образования неопределенной формы. Посев органов животных через 5-7 ч с момента опыта дал самый разнообразный рост: чистой культуры типичных шкобактерий туберкулеза, смеси шкобактерий туберкулеза а Л-форм, зернистых микроструктур незавершенного Л-цпкла и чистых культур Л-колоний. В последующие сроки (7 и 9 ч , 1,2 и 5-е сутки) у животных количество Л-оорм продолжало постепенно нарастать, представлены они были обширными скоплениями са1,шх различных по форме, размерам и гомогенности гранул с включением единичных сферопластоподобных образований, шаровидных тел различных размеров и оптической плотности, иногда с зернистым содержимым 0 целью доказатель-

стеэ того, что Л-форлы, полученные в результате посевов биоматериала от зараженных крыс, являются измененными формами микобакте-рий туберкулеза, провели последовательные пассажи их через модифицированную синтетическую среду. В ходе пассажей было установлено, что Л-формы, выделенные в результате посева биоматериала крыс спустя 2-е суток после заражения, реверсируют при пересеве на свежую среду, а Л-формы, полученные из биоматериала крыс при убое в конце 5-х суток, реверсировали на 3-4 пассаже.

По мере пассирования культуры Л-форм микобактерий бычьего вида на модифицированной среде Школьниковой наблюдали постепенное изменение морфологии описанных структур. Зернистость её становилась более гетерогенной, давая начало образованию обширных полей негомогенной зернистости. Постепенная гомогенизация зернистости приводила к формированию из нее палочковидных форм, образующих серпантинообразные скопления микрокультур в виде "кос", которые при одном из очередных контрольных высевов на среду Левенштейна-Иенсена давали рост микобактерии туберкулеза. Результаты проведенных исследований убедительно подтверждают, что Л-формы микобактерий туберкулеза могут быть получены" и з экспериментах in vivo -при моделировании инфекционного процесса у жквотных. При этом могут быть получены как начальные этапы Л-трансформации микобактерий туберкулеза (формы несбалансированного роста, сферо-пласты), так и нестабильные культуры Л-форм, способные к достаточно быстрой реверсии в исходные бактериальные формы. Стабильные' же культуры Л-йор.1 при выполнении эксперплента не были получены.

В последние годы на высоком методическом уровне получен ряд фактов, которые позволяют характеризовать процессы диссемииацип и разрушения антигенов микобактерий при противотуберкулезной вакцинации. В связи с этим большой-интерес представляет изучение

форм и сроков персистирования микобактерий -ЕЦЕ в организме вакцинированных с учетом возмо7лости Л-трансфорлации микобактерий туберкулеза и вегетирования их не только в измененной форме, но и в виде структур с дефектом клеточной стенки или полностью лишенных её. С этой целью комплексному микробиологическому и биологическому исследованию посредством многократных повторных пассажей был подвергнут биоматериал вакцинированных телят через.20 дней, 2, 6, 13, 21, 30 месяцев после вакцинации. Исследования при изучении возможности индукции и персистннции вакцинного штамма ШД в организме привитых телят позволили установить, что у;яе через 20 дней в. организме вакцинированного животного под влиянием его-естественной резистентности.происходила интенсивная Л-трансформация бактериальнкх клеток вакцины ЕЩ в Л-формы. В начале подобной Л-трансформации подвергается часть 'микробной популяции, о чем свидетельствует одновременное выделение на протяжении первых 2 месяцев смеси бактериальных и Л-форм ЦЩ.

Позднее на смену бактериальным приходят нестабильные Л-фор-мы, в которых биологические изменения еще не закрепились окончательно и при удалении их из-под влияния макроорганизма (который в данном случае является Л-трансформиругацим фактором и индуцирует эти изменения) удается наблщдать возрфцение их к исходной бактериальной форме. После 13 месяцев в организме привитых телят вакцина ЕЦЕ продол;иет пёрсистировать в 'виде условно-стабильных Л-форм и стойко сохраняет способность воспроизведения в-виде типичных Л-колокий и мо;:;ет пёрсистировать в таком состоянии в организме вакцинированного (срок наблюдения 30 месяцев).

В посевах биоматериала от телят и пассажных ;швотннх после 3-4 недель инкубации Л-формы вакцинного штамма ЕВД чаще всего выявлялись в виде больших, округлых и вытянутых неправильной фор-

мы тел, заполненных кегомогенной зернистостью. Иногда эти большие тела подвергались как бы разрушению и зернистое содержимое выходило за пределы их, образуя более или менее обширные скопления. Дальнейшее пассирование этих Форм in vitro на средах без Л-трансфоршруадпх агентов- позволило наблвдать два пути последовательных морфологических превращений, один из которых приводил к переходу указанных структур в бактериальные формы и как завершающий этап это - получение реверсии. Другой - к более или менее длительному воспроизведению подобных себе условно-стабильных форм, состоящих из скоплений темных и светлых шаровидных тел разной величины и оптической плотности, зернистых структур и ваку-олизированных форл или постепенной гибели их.

Анализ результатов шкробиологического'исследованпя лимфатических узлов, паренхиматозных органов и кожи■ вакцинированных телят, а также органов пассажных животных, зараженных гомогеяатом указанных субстратов в возрастном аспекте позволил выявить последовательную динамику Л-трансфор.:ации вакциш в организме привитых телят. Все это позволило .заключить, что в ходе развития вакцинного процесса в организме ;швотных аттенуировашше микобактерш вакцинного шташа ЕЩ претерпевают ряд существ а:пых изпепбпкй, валюСшим из которых является их Л-трансфорлацпя.

Таким образом, проведенные исследования на примере гашиш ЕЦЕ позволили установить, что opraini3M крупного рогатого .скота явллется ncqmsi '1-транс$орляЕуащш фактором и мо;,:ет без допсяш-тельного воздействия Л-трансфоршруицих веществ индуцировать различные формы изменчивости ызкобактерии вплоть до стабплыах Л-.^орм.

Результаты исследований (с лпзоциглогл п гдшшом, в культура макрофагов -ллотнгх,, в организме :.лвотнкх с паленой культурой и

при вакцинации телят ЫЩ) позволяют сдалать выеод, что возбудитель туберкулеза, проникший в организм животного, может изменять свои морфологические и биологические свойства, превращаясь в Л-формн или близшю ил варианты, способные длительно существовать в нем. Снижение реактивпостп организма пли воздействия каких-то других неблагоприятных факторов могут способствовать реверсии Л-форм в вирулентную бактериальную культуру со свойственными ей особенностями метаболизма, размножения и т.д.

2. Особенности методики окрашивания бактериальных и Л-форм микобактерий с помощью непрямого метода иммунофлюоресценции

Использованию иммунофшюоресцентного метода в практике предшествовала большая поисковая работа экспериментального характера, в задачи которой входила отработка на модели бактериальных и Л-форл микобактерий туберкулеза оптимальных параметров реакции и возможности ее пршленения в производственных лабораториях.

В первой серии опытов исследования проводились с бактериальным! культурами, выращенными .на плотных питательных средах Левен-штейна-Иенсена и Оинн-2.

3 эксперименте были использованы 'Л..bovis (шт. volles ), ! i. tuberculosis (шт. Dt/st ).

В число используемых фиксирующих средств вошли следующие: пламя, прогревание в сушильном шкафу при 65° С в течение 2-х ч, метанол, этилоеый спирт, эфир.

Результаты исследования микобактерий непрямым методом флюоресцирующих антител сопоставлялись с данными, полученными при окрашивании мазков по Циль-11ильсеку. Просмотр подготовленных мазков на люминесцентном микроскопе показал, что специфической,

очень яркой флюоресценции микробных клеток ни в одном случае выявить не удалось. Наиболее четкая и яркая флюоресценция микобак-терий (++++, -ьнн, ++) наблюдалась в некоторых полях зрения препаратов, зафиксированных метанолом, нагреванием в сушильном шкафу и пламенем. При этом,.однако, число выявляемых данным методом бактериальных клеток было.незначительным (1и—17 в поле зрения), а морфология клеток не всегда сохранялась. В препаратах, зафиксированных с помощью эфира и этилового спирта лишь изредка встречались неярко флюоресцирулцие (+, ++) либо диффузно окрашенные мелкие конгломераты клеток. Одновременно в аналогичных препаратах по Циль-Нильсену выявилось большее число микобактерий.

Таким образом, независимо от испытанных приемов фиксации, по-ло.1сптельных результатов при окрашивании шдлунскЗшооресцентным методом мазков, приготовленных из'культур с плотных питательных сред, получено не было.

В следущей серии экспериментов была сделана попытка повысить интенсивность свечения микобактерий при условии выращивания их на дидких питательных средах. Параллельно изучена возможность Ш/мунофлюоресценции Л-форл микобактерий. 'В эксперименте были использованы условно-стабильные Л-форш микобактерий, полученные в культуре макрофагов мышей. В наших условиях наиболее простой и удобной для приготовления из шлещихся жидких питательных сред оказалась синтетическая среда Сотона. Для культивирования Л-форм микобактерий использовали две питательные среды: Школьниковой в модификация- Дорога-совой и Свердловского НИИ туберкулеза.

Результаты опытов показали, что в препаратах, приготовленных из микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов, выращенных на глдкой питательной среде Сотона, отмечалась яркая специфическая флюоресценция периферии клеток с различной интенсивное-

тыо свечения ( от -н- до ++++).

Морфология клеток и контур были четко выражены. Сравнение препаратов с мазками, окрашенными по Циль-Нильсену, показало отсутствие принципиальных различий в их количественной характеристике .

Испытание различных приемов фиксации показало, что сверкшо-щая зеленовато-желтая специфическая флюоресценция клеток с четко выраженным ободком и морфологией наблюдается при использовании метилового спирта. Несколько менее выраженная флюоресценция наблюдалась при сТдксации мазков пламенем и длительным щадящим нагреванием мазков при температуре 65° С (+++). Уменьшение и некоторая неравномерность в интенсивности свечения клеток (+, +++) отмечались при использовании в качестве фиксирующей жидкости этилового спирта и эфира.

Таким образом, наилучшим методом фиксации, почти неуменьшаю-щш.1 интенсивность свечения, оказались препараты, которые были обработаны метанолом. Практически аналогичные результаты получили и при фиксации препаратов.пламенем спиртовки и в сушильном шкафу при 65° С в течение 2 ч.

В сеязи с особенностями метаболизма, осмотической хрупкости, медленного роста и Недостаточной жизнеспособностью во внешней среде Л-форм микобактерий туберкулеза, были поставлены специальные опыты по созданию оптимальных условий, исключающих в процессе фиксации мазков разрушение Л-структур микобактерий. Из фиксирующих средств, апробированных при приготовлении бактериальных препаратов, использовали пламя, прогревание в сушильном шкафу, метанол. Параллельно осуществляли постановку иымунофлюоресценции на живых нефиксированных клетках, исключающую этап приготовления мазков и последующую фиксацию.

Результаты исследования Л-форл микобактерий непрямым методом флюоресцирующих антител сопоставляли с данными, полученными при просмотре препаратов фазовок'онтрастншл микроскопом.

Исключение этапа приготовления мазков и последующей фиксации показало, что в этом случае сохраняется все многообразие элементов Л-колонии микобактерий. Несколько менее выраженное многообразие элементов Л-колоний наблкдалрсь при щадящей фиксации мазков пламенем, разрушение и некоторая неравномерность в регистрации элементов Л-колоний отмечались при исцрльзовании метанола и прогревания в сушильном шкафу при 65° С в течение 2-х ч.

Таким образом, исключение этапа приготовления мазков и последующей их фиксации наряду с щадящей фиксацией препаратов пламенем сохраняет все многообразие Элементов Л-форм и не уменьшает интенсивность флюоресцентного свечения.

Одновременно было отмечено значение некоторых технических деталей при получении.микобактериальных суспензий. Опытным путем пришли к выводу о необходимости использовать Твин-80 для растирания конгломерата микобактериальной пленки, снятой с поверхности среды иотона, при приготовлении мазков для иммунолкыинесцент-ного метода окрашивания. Исследования показали, что в мазках, приготовленных из бактериальных клеток, выращиваемых более 7 -18 суток, интенсивность свечения бактерий по мере старения культуры снижалась, а Л-формы независимо от срока культивирования сохраняли интенсивность свечения. Просмотр микобактериальных мазков, окрашенных ишунофяшресцентшм методом, показал следующее. На протяжении первых С-ти недель хранения препаратов с момента их приготовления в мазках отмечалась яркая специфическая «флюоресценция периферии клеток, интенсивность свечения которых соответствовала четыре:.! крестам (++++). Значительное снижение интенсив-

ности специфической флюоресценции микробных, клеток (до ++) регистрировалось в микобактериальных мазках, начиная с 9-й недели. Результаты проведенных опытов .свидетельствуют о том, что при комнатной температуре срок хранения приготовленных по определенной методике микобактериальных-мазков не' доляен превышать 35 дней. При более длительном хранении "изменяется и разрушается антигенная структура клеток, в результате чего их специфическую окраску воспроизвести не удается.

Отработка различных способов постановки реакции непрямой им-мунофлюоресценвди, обеспечившая получение четких, стабильных результатов, позволила приступить к решению основных задач нашего исследования: изучению возможности использования иммунофлюорес-центного метода для оценки антигенной и серологической активности бактериальных форм и Л-Еариантов микобактерий различных видов.

3.Антигенная и серологическая активность бактериальных форм.

и Л-вариантов микобактерий полученных экспериментальным путем

В работе было использовано 28 штаммов и культур различных микроорганизмов. Из них 24 относилось к группе микобактерий, 2 -к микроорганизмам рода Нокардио и 2 составили так называемую контрольную группу, в которую вошли микроорганизмы, гетерологич-нне ыикобактериям. Видоезя принадлепшость бактериальных форм микобактерий распределялась следующим образом: I штамм, 2 культуры принадлежали к ыикобактериям туберкулеза бычьего вида, I штамм, 2 культуры к микобактериям туберкулеза человеческого вида, I штамм, I культура к микобактериям птичьего вида, I штамм', 5 культур - к атипичным микобактериям, 7 культур - к кислотоустойчивым сапрофитом.

В опытах попользовали культуры Л-форм шкобантерий человеческого, бычьего, птичьего видов и представителя первой группы по Нап^опа.',1.капвав11. Л-формы, минобактерий получили экспериментальным путем при пассировании на полуяидких средах с Л-ивдуци-рукщими агентами, а также при заражении культуры макрофагов белых мышей соответствующими видами микобактерий. Антигенную специфичность бактериальных форл и Л-вариантов выявили при перекрестном серологическом анализе антисывороток к бактериальной форме и к сферопластам шкобактерий. В первой серии опытов изучали взаимодействие антисывороток к интактным микобактериям с антигенами, приготовленными из убитых нагреванием бактериальных форм. Постановкой РСК устанавливали внутриродовые связи шкобактерий. В антисыворотке к микобактериям бычьего вида выявлены комплементсвязыванцие антитела в высоком титре .(1246,0 + 2,2), в таком же титре сыворотка реагировала с микобактериями человеческого вида, что свидетельствует о их тесном антигенном родстве. Перекрестные реакции с другими микобактериями имели место в титре сыворотки от 145,0 + 7,7 до Зь4,0 + 2,46 (Ко,01). Антисыворотка с микобактериями человеческого вида также давала перекрестные реакции с микобактериями бычьего вида в разведении, соответствующему ее титру. Перекрестные реакции с другими представителяш рода отмечались в титре 147,6 + 4,50 до 306,0 + 3,28 (Р< 0,01). Сходные результаты были получены при изучении сывороток к остальным видам микобактерпй. Сыворотки к сферопластам микобактерпй реагировали с бактериальными культурами в титре от 35,05 + 3,88 до 38,ьь + 1,95.

Таш.1 образом, при перекрестном изучении антисывороток к бактериальным фор,гам и сферопластам микобактерпй в РСК выявлены антигенные взаимосвязи мезду всеми исследованными видами микобак-

терий. Наиболее тесными они проявились у микобактерий бычьего и человеческого видов при использовании сывороток против интакт-ных микобактерШ. Это, по-видшому, было следствием поверхностного расположения родоспецифических антигенов. Использованныэв качестве антигена Л-варианты вступали во взаимодействие с-сыворотками против бактериальных культур. Титры сывороток в реакции с Л-формами, полученными в пробирках, были на 4 порядка ниже, а с Л-формами, выделенными от животных - на 6 порядков ниже, чем при взаимодействии с бактериальными культурами (Р4 0,Ы).

Полученные результаты свидетельствуют о наличии антигенных связей между'Л-формами и исходными родитеяъскили культурами, а также подтверждают существование у Л-форм общих с родительскими культура:™ антигенных детерминант, которые очевидно, локализованы ь цитоплазматическок мембране или цитоплазме.

Полученные данные свидетельствуют, что сыворотки против сферопластов микобактерий содержали более низкие титры компле-ментсвязыЕакщих антител к гомологичным антигенам, чем антибактериальные сыворотки. Перекрестные реакции отмечали в титре сыворотки от 46,23 + 4,11 до 139,7 + 2,03.'

Таким образом, -более низкие титры комплементсвязывалцих антител в сыворотках, полученных при иммунизации сферопластами, свидетельствуют о некотором снижении их антигенности, поскольку ■ ишуногенные потенции у микобактерий, очевидно, в большей степени связаны с поверхностными клеточными структурами. Утрата последних у сферопластов и Л-форм способствует .большему выявлению антигенных детерминант цитоплазматической мембраны и .цитоплазмы.

Полученные результаты исследований показывают, что сферо,-пласты и Лнформы обладали серологической активностью и антигенной специфичностью, однако уровень серологической активности

был ниже, чем у исходных бактериальных культур.

Родоспешфпчейкие детерминанты выявлены у микобактерии как в клеточной стенке, так и цнтоплазматической мембране и.цитоплазме, что обуславливает перекрестные реакции мевду интактными бактериальными культурами -и Л-форлами микобактерий.

Целью дальнейшие опытов было выявление специфического свечения микобактерий туберкулеза в препаратах из чистых культур и дифференцирование микобактерий бычьего,.человеческого а птичьего видов с помощью непрямого метода флюоресцирующих антител. В работе использовали кроличьи иммунные сыворотки к бактериальной форме и сферопластам' микобактерий перечисленных видов.

Для контроля препараты обрабатывали гетерологичными иммунными сыворотками (туляремийной к бруцеллезной)', а также сывороткой крови здоровых кроликов.

При обработке изучаемых штаммов микооактерий туберкулеза бычьего, человеческого и птичьего видов гомологичными иммунными сыворотками клетки микобактерий дали яркую специфическую флюоресценцию ободков, которые контрастировали с фоном препарата и цен-' тральной частью клеток. В контрольных препаратах свечения, сходного. со специфическим, не наблюдали. Установлено, что в случаях воздействия на микобактерии бычьего вида сыворотки М. tuber -

culosiß,a на микобактерии человеческого вида сывороткой «1.bovis те и другие бактерии светились в окрашенных препаратах так же ярко.(++++), как и после воздействия на них гомологичными иммунными сыворотками. В тех случаях, но после воздействия сывороткой Ll.aviun , наблюдалась едва заметная '(+) или очень слабая (+) флюоресценция клеток. Обработка мазков, приготовленных из микобактерий птичьего вида сывороткой М.bovis или и.tuberculosis с последувдшл окрашиванием соответствующим, яоньюгатом, ни в од-

ном случае не-привели к флюоресценции этих бактерий.

Определенный интерес цредставляют результаты перекрестной обработки. Л-форы шкобактерий .сывороткой к бактериальном культурам. Сыворотки к бактериальным фордам взаимодействовали только,. с гомологичными Л-вариантами; При этом наблюдали максимально интенсивное специфическое свечение. При использовании приема контрастирования цитоплазма Л-форл окрашивалась неспецифическим альбумином, меченным родамином, в оранжевый цвет, периферическое свече-гае было специфическим и имело изумрудно-зеленую окраску. Характер распределения антигенов у Л-форм шко бактерий наблюдали также цри обработке сыворотками к сферопластам. При этом отметили , что сыворотки к- сферопластам взаимодействовали с гомологичными антигенами в более высоких титрах от 29,ьО'+ 1,93 до 63,51 + 2,2б , чем с гетерологичными от 6,38 ± 2,28 до 6,91 + 2,46, что свидетельствует о сохранении у Л-форм антигенной специфичности. Причем, титры сыворотки бшш выше в реакции с Л-вариантами, выделенными из организма животных (63,51 + 2,98). Слабая флюоресценция в перекрест!шх реакциях отмечалась в титрах сыворотки от 6,38 ¿ 2,28 до 11,68 + 2,07 и очевидно возникала вследствие открытия общих родоспевдфических глубиннорасположенных антигенов, в равной степени присущих обеим разновидностям Л-вариантов. При помощи лшинесцентной микроскопии препаратов Л-форм, обработанных сывороткой к сферопластам, отмечено яркое периферическое и диффузное свечение большей части шкроструктурных алементов шкроколо-нии Л-форл. Встречались разнообразные клетки со светящимися гранулами преципитата в цитоплазме и шаровидные образования с изумрудно-зеленым ореолом. При перекрестных реакциях у Л-форм микобак-терий бычьего и человеческого видов наблюдали одинаково интенсивное периферическое свечение, что свидетельствует о локализации у

них на поверхности общих антигенных детерминант.

Перекрестные реакции между другими видами Л-форл микобактерий сопровождались преимущественно диффузным свечением.

Таким образом, с помощью-реакции непрямой иммунофлюоресцен-вди у бактериальных форм.и Л-форм микобактерий была выявлена антигенная специфичность и серологическая активность. Уровень последней был ниже у Л-вариантов, чем у родительских культур. Отдифференцировать бактериальные формы и Л-варианты шкобактерий бычьего и человеческого видов оказалось не возможным^ Получение в этом случае неспевдфических результатов можно объяснить близким антигенным родством между микобактериями человеческого и бычьего видов. Это предположение находит свое подтверждение в работах Л.М..Моделя (1951), U.U.Авербаха и др. (1976). Им удалось доказать, что антигенное различие между микобакт'бриями человеческого и бычьего видов практически едва обнаруживаемо. И, напротив, серологическое различие между протеинами этих микобактерий и ми-кобактериями птичьего вида выражены четко.

Целью следующей серии опытов было изучение возможности дифференцирования микобактерий туберкулеза и группы атипичных мико-бактерий с помощью непрямого метода флюоресцирующих антител. Для исследования, е данном эксперименте мы использовали иммунную кроличью сыворотку, содержащую антитела к микобак^ериям туберкулеза бычьего вида (щт "vallee "). Титр комплементсвязывавдих антител сыворотки составлял 1:640. Изучение возможности отличия возбудителя туберкулеза от атипичных шкобактерий проводилось на модели бактерий туберкулеза бычьего вида (культура "Кировская?. Этот возбудитель достаточно вирулентен, типичен по своим морфологическим, культуральным, биохимическим п антигенным свойствам, неотличим по характеру свечения от микобактерий человеческого

вида. Просмотр микобактериальных мазков, окрашенных с помощью бычьей туберкулезной сыворотки в разведении 1:16, показал, что из 13 культур атипичных микобактерий у 8 серологических связей с вирулентными бактершми туберкулеза обнаружено не было. Во всех случаях- эти микобактерии или совсем, не флюоресцировали или давали очень слабую'флюоресценцию (+, +).

В эту группу гетерологических микобактерий, легко дифференцируемых непрямым методом флюоресцирующих антител от микобактерий туберкулеза бычьего- вида, вошло 2 культуры кислотоустойчивых сапрофитов, полученных из почвы и почти вся группа музейных.штаммов (.M.kansasii ,■ Ll.gord.oae , М. battey , М. phlei , M.emeg-matie за исключением lu.scrofulaceum.

Остальные 5 культур атипичных кислотоустойчивых микобактерий, взятых в опыт и"2 штамма ¡ликроорганпзмов рода Hooardia дали различной степени.перекрестные реакции с микобактериями туберкулеза бычьего типа.

Однако, имея одинаковый характер свечения с микобактериями бычьего вида, бактериальные клетки атипичных микобактерий в подавляющем большинстве случаев отличались от них по своим морфологическим признакам (форма, величина).

При увеличении разведения сыворотки 1:40 число перекрестных реакций снизилось до 33,3^, а при разведении I:8u - до 1,1%. В последнем случае яркая флюоресценция лишь у одной культуры 05 I8IS). Использование диагностической сыворотки в разведении 1:16С поз-позволило практически полностью исключить положительные реакции у культур, взятых в опыт. Наличие неспецифической флюоресценции отмечалось лишь у одного штамма ß I8IS, однако ее интенсивность снизилась (++). При разведении сыворотки-1:320 ни одна из исследованных культур не давала перекрестных реакций.

В группе микроорганизмов рода НосагсИа увеличение разведения сыворотки от 1:16 до I:8С привело к исчезновению неспецифической реакции у одного (50%) только штамма. Штамм ¡'и Б01 удалось отдифференцировать лишь при использовании разведения сыворотки 1:160.

Результаты опытов свидетельствуют, что перекрестные реакции, часто появлявшиеся при использовании иммунных сывороток низких титров (неснецяфическую флюоресценцию), мокно исключить путем использования сыворотки с более высоким титром. Подводя итоги исследованию по разделу иммунофлюоресценции, могно сделать заключение, чт.о с помощью РСК и нецряыого метода ишупо-ошюоресценщш у бактериальных форм и у Л-вариантов микобактерий была выявлена антигенная специфичность и серологическая активность, уровень последней у Л-вариантов был нипэ, чем у родительских культур. Антигенные связи Л-форл с исходными бактериальными культурами свидетельствуют о сохранении у них родоспецифических антигенных детерлинант в цитоплазматической мембране и цитоплазме.

Дифференцирование бактериальных форл и Л-вариантов микобактерий бычьего и человеческого видов не представилось возможным ввиду их тесного антигенного родства.

Обнаружена обратно .пропорциональная зависимость мегду чувствительностью и специфичностью применявшихся иммунологических методов РСК и ПИФ.

Обладая большой чувствительностью по сравнению с ШО, РСК* была невысоко специфична в выявлении еидоеых особенностей как бактериальных форм, так и Л-вариантов шкобактерий..

4. Патологоанатомичесноё и микробиологическое исследование органов в тканей лабораторных животных при экспериментальном туберкулезе

Экспериментальное заратсение морских свинок условно-стабильными и нестабильными Л-формаш микобактерий туберкулеза позволило установить, что Л-фюрмы микобактерий обладают некоторыми патогенными свойства!®. Они проявились в способности ус- • ловно-стабильннх Л-фюрд микобактерий вызывать вялотекущий туберкулезный процесс, с четко выраженным неспецифическим компонентом. Нестабильные Л-форыы■вызывали бурно прогрессирующее туберкулезное воспаление с ярко выраженными аллергическими проявлениями, несвойственными типичному туберкулезу у морских свинок, зараженных бактериальными формами возбудителя туберкулеза бычьего вида.

Характерно, что и специфический, и неспецифический компоненты воспаления развивалось волнообразно. Maw ними отмечалась некоторая обратная взаимосвязь. При максимальном развитии неспецифических реакций (2 недели) специфические изменения почти полностью исчезали, и наоборот, при максимальном развитии специфических изменений (месяц) проявления неспецифического воспаления резко уменьшались.- Морфологические реакции, возникающие у-чувствительных к туберкулезу морских свинок в ответ на введение условно-стабильных Д-форм Микобактерий, как и ранние тубер-кулоподобные образования (через сутки после заражения) так и более поздние туберкулезные изменения (через месяц после заражения), а также наблюдавшиеся в более поздние сроки (через 2-3 месяца) бугорки о неполным заживлением часто локализовались пери-васкулярно, что в определенной мере указывало на гематогенный характер инфекции. Наряду с этим, отмечено не свойственное обыч-

поду течению экспериментального туберкулеза вовлечение в процесс мелких и крупных кровеносных сосудов.

Продолжительное наблюдение за экспериментальными животными позволило нам также установить факт длительного персистирования возбудителя в организме экспериментальных животных в Ьиде типичных Л-форм и других переходных форм Л-цикла.

Полученные выше результаты исследований указывают на наличие у зараженных морских овинок туберкулезного процесса, что, в соответствии с целями нащей работы, явилось необходимым условием для их иммунологического обследования.

Применение непрямого метода флюоресцирупцих антител позволило с достоверностью диагностировать заболевание туберкулезом морских свинок уже через сутки после заражения как бактериальной формой, так и Л-форлами туберкулеза, о чем свидетельствовало превышение средних значений титра антигена во всех трех группах диагностического уровня. При этом уровень антигена на 2 недели не только подтверждал наличие заболевания у всех животных, но и позволял судить о том, животные какой из обследованных групп были заражены бактериальными формами (5,16 ± 1,99), нестабильными Л-фордами (8,06 + 1,37) и условно-стабильными Л-форлами мико-бактерий (4,81 ± 1,36). Через й-1и недель после заражения титры антигенов гомогенатов животных, зараженных бактериальными фордами и нестабильными Л-формами имели практически одинаковый уровень (16,23 + 1,58; 13,81 ± 2,19), а уровень антигенов у животных, заражешшх условно-стабильными Л-фюрлами туберкулеза на 2 порядка регистрировался ниже (4,23 + 1,76).

Результаты сопоставления динамики регистрации туберкулезных антигенов в РСК существенно отличаются от зависимости, определенных в реакции шлмунофдюоресценции. Б гомогенатах морских

свинок, зараженных условно-стабилышш Л-формами возбудителя туберкулеза, через сутки туберкулезные антигены ь РСК не достигав диагностического уроагш (1:8), однако у животных, зараженных бактериальными и нестабильными Л-формами, на этот срок они составили соответственно 128,09 +.2,90 и 124,61 + .2,01. Б период 2-4 недели после заражения у животных количество антигенов, за исключением животных, зараженных условно-стабильными Л-формами туберкулеза, прогрессивно нарастало. К концу 8-й недели уровень антигенов в среднем был равен 1:64 у морских свинок, зараженных бактериальными формами микобактерий и 1:48 у свинок, зараженных нестабильными Л-формами микобактерий. Б группе животных, зараженных условно-стабильными Л-формами туберкулеза в этот период отмечено повышение титра антигенов (1:94), что в определенной мере можно связать с их реверсией, подтвержденной путем бактериологического исследования.

По данным нашего исследования,.наиболее чувствительным и специфичным из испытанных методов оказался непрямой метод флюоресцирующих антител. Только этот метод позволил с большей достоверностью диагностировать заболевание морских свинок через сутки после заражения всеми культурами микобактерий туберкулеза.

Чувствительность реакции связывания комплемента несколько уступала чувствительности иымунолшинесцентного метода диагностики туберкулеза у морских свинок. При заражении морских свинок условно-стабильными Л-формами микобактерий применение этой реакции подтверждало заболевание у животных лишь через 2-3 недели после их заражения. Причем реакция связывания комплемента сопровождалась наибольшим числом неспецифических реакций (6,6;2).

Результаты проведенного сравнительного изучения показали, что непрямой метод сТшооресцируиц^ах антител по своей чувствительности

и специфичности превосходит РСК при диагностике экспериментального туберкулеза у морских свинок.

Одновременно с серологическим исследованием провели изучение интенсивности аллергических реакций у зараженных ;швотных. У свинок, зараженных бактериальными формами и нестабильными Л-фор-шш микобактерий туберкулеза, через.две недели тлели место реакции, определяемые как сомнительные. При доследующих сроках наблюдения интенсивность аллергических показателей в данных группах кивотных возрастала, наиболее резко во второй, что было связано с реверсией Л-форм микобактерий, которая была подтверждена бактериологическими исследованиями. 'К 6-8 неделям заболевания, примерно за две недели до конца срока зкизни кивотных, у *этих групп животных, аллергия выпала. У животных, инфицированных условно-стабильными Л-формами, в процессе заболевания интенсивность аллергической реакции непрерывно возрастала. На 2-й неделе наблюдения результаты туберкулиновых реакций у гсивотннх были- отрицательйыми, а к 4-й неделе они слабо положительные, начиная с 6-8 недели -оценивались как положительные (диаметр папулы свыше 10 мл). К концу срока наблюдения почти все животные реагировали на туберкулиновую пробу.

В целом необходимо отметить, что чувствительность аллергической реакции уступала-'чувствительности серологических реакций в опыте, так как она подтверждала наличие туберкулезной инфекции у животных на 2 недели позднее.

Выполненные исследования по серодиагностике различных бя'о-морфологаческпх форм возбудителя туберкулеза позволили сдалать следукщее заключение. Срок появления туберкулезных антигенов и их первоначальны;" уровень зависит от биоиорфологпческих форм возбудителя туберкулеза.' Б. дальнейшем с возрастанием длительное-

ти заболевания эта зависимость нивелируется (в указанные сроки 'найлвдения). Наиболее чувствительным и специфичным из всех испытанных методов серодиагностики туберкулеза оказывается непрямой метод флюоресцирующих антител, позволяющий с большей достоверностью диагностировать заболевание морских свинок уже спустя сутки после заражения различными по биоморфологии возбудителями туберкулеза.

5. Индикация биоморфологических форм микобактерий . туберкулеза методом посева.п иммунофлюоресценции

в биоматериале от животных, реашрущих на туберкулин

Определенный интерес для нас представляло лабораторное ис-.следование биоматериала от животных, не имеющих специфических для туберкулеза изменений.

Однако, следует отметить, что лимфоидная ткань значительного числа лимфатических узлов от этих животных была гиперплазиро-вана. и в 18-и случаях содержала очажки некроза размером с просяное зерно.

На питательных средах микобаятерии туберкулеза были выделены: из биоматериала у 25,7% исследованных животных, их ассоциации с Л-формами - у.18,8^, только Л-варианты микобактерий - у 7,9$. При этом у 3 животных были выделены условно-стабильные, а у 5 -нестабильные Л-варианты. В целом культуралышй метод позволил. выявить ыикобактерии туберкулеза в биоматериале у 53 (52,4$) животных.

Сравнительный анализ результатов посева и реакции иммуно-. флюоресценции показал, что метод НИФ оказался эффективным при выявлении бактериальных форл. В этом случае его результаты нез-

начптельно (о,9#) превышали данные посева. Культуральный метод позволил выделить Л-формы мико бактерий у 27 (26,7$) животных, из них 19 (18,8$) в смеси с бактериальными.

Иммунофлюоресцентный анализ позволил.обнаружить Л-трансфор-мированные варианты у 19 (18,8$) животных. Причем, совпадение результатов культурэльного и н/лдунофлюоресцентного методов при . выявлении Л-вариантов отмечено в 7 (6,9$) случаях. Исключительно с помощью НИФ Л-формы определены у 12 (II,животных. При наличии роста Л-форм на питательной среде в одном (0,9,1) случае они не были обнаружены при исследовании методом НИФ. При изучении в лшинесцентном микроскопе морфология Л-вариантов была разнообразна. Они обладали как периферическим';, так и диффузным свечением.

Анализируя вышеизложенное, следует отметить 'результативность иммунофлюоресцентного метода. Он позволил выявить возбудитель дополнительно у 12 (11,8^) животных с гиперплазией лимфатических узлов.

Преимущество иммунофлюоресцентного метода при выявлении Л-вариантов Еытекает из ряда причин. Во-первых, низкая жизнеспособность форм гетероморфного роста вне организма часто препятствует их обнаружению при посеве, во-вторых, метод выявляет в биоматериале даже некислотоустойчивые клетки Л-форм, погибалцие при обработке серной кислотой в процессе посева на питательную среду.

Параллельно с исследованием биоматериала от животных, не имеющих туберкулезных изменений, провели исследование биоматериала от животных 3-х хозяйств с различной степенью неблагополу- ■ чня в отношении туберкулеза. Степень неблагополучия хозяйств по туберкулезу определяли с учетом характера течения инфекции в

стаде л уровня распространения заболевания среди животных.. Первое хозяйство -.с ограниченным течением туберкулеза в течение 12 месяцев.с заболеваемостью зивотшос туберкулезом до от среднегодового их наличия в хозяйстве. Второе хозяйство со значительным цроцентом (до 25%) заболеваемости. Третье хозяйство -заболеваемость животных более 25%.

Бактериологическая характеристика хозяйств после первичной "аллергической диагностики выглядела следующим образом. В первом хозяйстве -из биоматериала от 58 реагирующих на туберкулин животных у 10 с очаговым, 8 с инфильтративным туберкулезом и у 3 - без поражений отмечалось'выделение бактериальных фора микобактерий (36,2;$).. Ассоциация бактериальных и Л-форм микобактерий была выявлена у 3 животных с очаговым, а у 7 - с инфильтративным туберкулезом (17,25), Л-форлы были выявлены из биоматериала 8 животных, не тлеющих туберкулезных поражений и от 3 с поражениями, носившими очаговый характер (18,9#), из них от 5 - только нмму-нофлюоресцентным методом {8,6%).

Во втором хозяйстве.в биоматериале от 60 реагирующих на туберкулин животных отмечали сочетание бактериальных и Л-форл микобактерий у 6 больных животных с очаговым и у 8 с' инфильтративным туберкулезом и у 6 без поражений туберкулезного характера (33,3,^). При этом бактериальные фор® были выделены в чистом виде от 8 животных с очаговым и от 5 с инфильтративным характером поражений (21,6^). Л-формы были определены у 4 больных очаговым туберкулезом и у ? - без поражений (18,3,?), из них у 8 обоими методами и у 3 - только КИФ (5^).

В третьем хозяйстве из биоыатериала от 85 животных, реагирующих на туберкулин, ассоциация бактериальной и Л-формы микобактерий была выявлена у 19 (22,3) животных, а именно у 13 - с

иншильтратиЕным и у 6 - с крупно-очаговым туберкулезом внутренних органов.

Только Л-форма,в 3 случаях нестабильные,вегетировали у 2 больных животных с инфильтративным и у 3 - с диссемшшрованнкм туберкулезом (5,83). Бактериальные формы микобактерий были обнаружены в биоматериале от 21 животного с очаговым, от 8 - с диссс-глшшроЕэнныгл течением туберкулеза и у 5 животных, не имеющих поражений туберкулезного характера (40^)., из них от 8 только методом иммунофлгаоресценции (9,4^).

Через 45-30 дней 'швотные данных хозяйств бшт подвергнуты повторной аллергической диагностике, реагирующих на тубер1су."лн животных .убили на мясокомбинате. У всех животных на секции поражения носили однородны"; характер - очагово-инфильтративный, за исключением поражений,зарегистрированных у - 2-х 'животных третьей группы, они носили крупно-очаговый характер.

При исследовании биоматериала методом посева и нмцукофшь оресценции отметили снижение выделения мнкобактерш" как в классической форме, так и Л-Еариантов. Причем Л-форш шкобактерш: туберкулеза были выявлены методом пмлунофлюореоцегащи за исключением одного случая.

Комплексному глкробнологпческому, гслмунофлюоросцентному и биологическому исследованию посредством многократных повторных пассажей был подвергнут бломатеркал от животных, т еапзрувдпх па туберкулин, с различными сроками вакцинации. Возраст вакцлга-.о-ванных животных составил 4-5 лет, процепт реагируит-Х от исследованного поголовья достигал единицы, исследования проводились перед выходом животных на.пастбище.

Результаты :ззупофлеореецэптного и глкро^'лслогпчосгого исследовали." ¿аоматорпата, полученного от ваккяпл^овапиг:: гво?!;:^,

реагировавших на туберкулин, а также из органов зараженных этим биоыатериалом морских свинок, были следувдие. Микробиологическими исследованиями вцделены бактериальные фор.ш ЩК в Э (20,3/1) . случаях: 6 культур непосредственно из материала от вакцинированных животных и 3 (6,7$) из органов пассажных животных.- Кроме того-, в результате микробиологического исследования выделено в об-.щеы сложности 14 культур Л-Дорм (31,7$), которые при последующих пассажах in vitro (в 3 случаях) и in vivo (в 4 случаях) дали реверсию в бактериальные формы.

Несколько иные результаты получены при исследовании материала от вакцинированных .тавотных НИФ. В обоих случаях и при выявлении бактериальных и Л-форм Еакцины ЕЦК по количеству находок последний метод превзошел бактериологический.

НИФ Л-формы были обнаружены дополнительно в 6 (13,6$) наблюдениях,из них в 2-х (4,5$) непосредственно в материале от вакцинированных животных и в 4-х .(3,9$) случаях в органах пассажных животных. Увеличение числа находок Л-форм как и бактериальных форм микобактерий данным, методом можно объяснить потерей ими жизнеспособности вне организма либо нахождением единичных .особей возбудителя туберкулеза в биоматериале. Все выделенные культуры микобактерлй и ревертантов Л-форм подвергли углубленному микробиологическому исследованию, дополнив его непрямым методом им-мунофлюоресценции. С этой целью их изучили с точки зрения морфологических свойств, биохимических особенностей, лекарственной чувствительности, вирулентности и видовой принадлежности. Полученные результаты проведенных исследований позволили нам сделать заключение о принадлежности выделенных штаммов и ревертантов Л-форм к шкобактерпзл ЬЦЕ.

Наряду с бактериальными форда]ли в 14 (31,7$) случаях были

выделены микроорганизмы, отнесенные наш к Л-форлам микобактерий туберкулеза. Из этого числа культур Л-форм 7 (50$) оказались нестабильными и в результате 2-4 последовательных; пассажей in vitro без Л-трансформирупцих агентов они реверсировали в бактериальные форлы'ЕЦЗ. Это явилось прямым" доказательством их видовой принадлежности к шкобактериям туберкулеза. Остальные культуры Л-форм, не давшие реверсии в бактериальные 'формы на протяжении 3-8 последовательных пассажей,были определены как условно-стабильные.

Их видовую принадлежность к шкобактериям доказали в реакции иммунофлюоресценции, а также этим методом подтвердили результаты микробиологических исследований по видовой принадлежности выделенных культур.

Применяемые в настоящее время бактериоскопия и посев не всегда позволяют получить адекватную информацию об истинном наличии возбудителя в биоматериале. А поскольку отрицательный результат микробиологических исследований является в определенной степени критерием специфичности аллергической реакции, то выявление нерегистрируемых культуральным методом вариантов возбудителя тлеет важное значение в оценке эпизооотического состояния животных по туберкулезу.

¡Летод иммунофлюоресценции оказался пригодным-и инфорлатив-ным для определения различных бпоморфологических форм возбудителя туберкулеза и их антигенов в препаратах из биоматериала при индикации и идентификации бактериальных культур.

Современная диагностика туберкулеза, опираясь на инструментальные методы, должна максимально использовать возможности иммунологических приемов. Для широкого внедрения иммунофлюорес-центных тестов в ветеринарную практику необходимо наладить про-

' ишлешюе изготовление диагностических сывороток для определения антигенов микобактерий в .тканях организма.

ВЫВОДЫ

1. Л-трансфорлация микобактерий туберкулеза в Л-формы закономерный процесс, постоянно происходящий In vitro в in vivo и обеспечивающий сохранность и разнообразие их биоморфологии.

2. Наиболее типичный и регистрируемый путь развития Л-тран-сформацпи микобактерий получен при предварительном их культивировании в яидкой среде, содераащей лизоцим (100 мкг/мл), глицин (1,2 вес/объема), сахарозу (ü,34 М) и соли магния (1,1 мкг/мл). При этом сферопласты, образовавшиеся в системе лизоцим-глицин, аналогичны промежуточным фордам, наблюдаемым у других видов бак-тори". Лизоцим не только индуцирует образование сферопластов, но такпе является стабилизирующим фактором в процессе их перехода

в Л-форлы.

3. Культивирование макрофагов в условиях, приближенных к естественным, позволяет результаты -взаимодействия их с шкобактериями туберкулеза перенести на целостный организм и считать ¡\х одним из факторов, обуславливающих Л-трансфорлацию возбудителя туберкулеза в организме глвотного. Описанные формы микобактерий, наблюдавшиеся в нормальных макрофагах, не подвергавшиеся гоздействию антибиотпков и- химиопрепаратов, по-еидимому, отрата-:зт еозмоглый исход их взаимодействия с клеткой (репродукцию, деструкцию, образование Л-структур).

4. Наличие типичных микроструктур в Л-колониях ыикобактерп; туберкулеза, способность их к длительной репродукции, отсутствие pcLopoim в исходный бактериальный вид дают основание отнести по-

лученные трансфорлированные культуры микобактерий туберкулеза (под действием макрофагов) к условно-стабильным Л-формам. Морфо-. логические элементы, выделенные в процессе Л-трансформации из организма крыс, мало -отличаются от-аналогичных-элементов, -выявленных в процессе Л-трансфорлации in vitro.

5. В организме вакцинированных телят в ходе развития вакцинного процесса введенные в организм аттенуированные микобакте-рии вакцинного штата ЕЦЕ претерпевают ряд существенных изменений, важнейшим из которых является их Л-трансформация. При этом сам организм телят является мощным Л-трансфоршрунцим фактором и мояет индуцировать без, дополнительного воздействия Л-трансфорш-руицих веществ различные формы изменчивости микобактерий вплоть до образования стабильных Л-форм.

6.. Реакцией непрямой пмлунофлюоресцешщи у бактериальных и Л-форм микобактерий выявлена антигенная специфичность и серологическая активность. Уровень последней был низе у Л-вариантов, чем у родитаяьсних культур. Специфическое взаимодействие Л-форм в реакщш непрямой шлмупофлюоресценцин с гомологичными сыворотками подтверждает наличие у лих видоспецафических детерминант, локализированных в сохранившихся поверхностных структурах.

7. Родоспецифичесете детерлшанты выявлены у- микобактерий туберкулеза как-в клеточной стенке, так и в цитоплазматической мембране и цитоплазме, что обуславливает перекрестные реакции мезду интактпымн бактериальными культурами и Лт-форлачи микобак-терпй.

8. Дифференцировать методом ишунофлюоресценции бактериальные форды и Л-варианты шкобактерий бычьего и человеческого еи-дов не представилось возможным. Полученные неспецифические результаты-.диагностических тестов можно объяснить близким антигенным

родством между ыикобактериями человеческого и бычьего видов и недостаточной специфичностью антигенов.

9. Неспецифические результаты окрашивания шкобактерий туберкулеза непрямым- методом флюоресцирующих антител (если они тлеют место)..могут.быть исключены путем использования высокоразве-денных т.шунных туберкулезных сывороток на первом этапе обработки-препарата.

10. Экспериментальное заражение морских свинок условно-стабильными и нестабильными Л-формами микобактерий туберкулеза позволило установить, что они обладают некоторым патогенными свойствами. Эти свойства проявились в способности первых вызывать вялотекущий туберкулезный процесс с'четко выраженным неспецифическим кошонентом, а вторых - бурно прогрессирукщее туберкулезное воспаление с ярко выраженными аллергическими проявлениями, не свойственными течению туберкулеза у морских свинок, зараженных бактериальными формами возбудителя туберкулеза бычьего вида.

11. Специфический и неспецифический компоненты туберкулезного воспаления развиваются волнообразно. Между ними отмечается обратная взаимосвязь: при максимальном развитии неспецифических реакций (2 недели) специфические изменения почти полностью исчезали, и наоборот, при максимальном развитии специфических изменений (I месяц), проявления неспецнфического воспаления резко уменьшались. Наряду с этим отмечено не. свойственное обычному течению экспериментального туберкулеза вовлечение в процесс мелких и крупных кровеносных сосудов во внутренних органах.животных.

12. При экспериментальном туберкулезе в организме морских свинок образуются туберкулезные антигены, обнаруживаемые такими диагностическими тестами как непрямой метод фшооресцирувдих антител и РСК. Срок появления туберкулезных антигенов и их первоначальный уровень зависит от биоморфологических форм туберкулеза.

С возрастанием длительности заболевания эта зависимость нивелируется.

13. Непрямой метод флюоресцирующих антител позволяет с большой достоверностью диагностировать заболевание морских свинок туберкулезом спустя сутки после их заражения независимо от характера биоморфологии возбудителя туберкулеза. Чувствительность аллергической реакции в опытах на морских свинках уступает чувствительности этого метода.

14. При оценке и прогнозировании эпизоотической ситуации в оздоравливаемых и неблагополучных по туберкулезу пунктах необходимо учитывать возможность трансформации возбудителя туберкулеза в Л-формы, которые потенциально способны не только длительно поддерживать эпизоотический процесс, но и периодически его активизировать за счет перехода в бактериальные формы.

15. Сравнительным изучением биоматериала от реагирующих на туберкулин животных установлено, что бактериологическое исследование не в полной мере способно изолировать из него возбудителя туберкулеза (52,4$). Пммунофпюоресцентннм методом из такого био-матсрпала в.59,3$ случаев возможно идентифицировать возбудителя туберкулеза.

Этот метод целесообразно использовать при эпизоотической оценке по туберкулезу стад крупного рогатого скота ^ случае завоза здоровых животных, проведении заключительных оздоровительных мероприятий.

пргаяшше: да практики

I. Научные предложения по Бкявденшэ и идентификации Л-форм мпкобактерий включены в проект Наставления по диагностике тубер-

куле за животных, представлений в Главное управление ветеринарии ЫСХ Российской Федерации (1932).

2. Обнаружение типичных и измененных форм микобактерий туберкулеза непрямым методом цымунофлюоресценциа (методические рекомендации) . Утверждены и одобрены для внедрения НЕС АПК Амурской области, секцией инфекционных и инвазионных болезней сельскохозяйственных животных Россельхозакадемин (1991).

3. Бактериологический контроль при проведении аллергических исследований на туберкулез крупного рогатого скота (методи-чвские рекомендации). Утверждены и одобрены для внедрения НТО АПК Амурской области.(секцией ветеринарии ДБО БАСПШ (1990).

4. Методика определения норлативов затрат при лабораторной диагностике туберкулеза и бруцеллёза животных (методические рекомендации) . Утверждены и одобрены для внедрения НТС АПК Амурской области и секцией ветеринарии ДБО РАСХН (1991).

5. Выделение и индикация Л-форл микобактерий туберкулеза (методические рекомендации). Утвервдены и одобрены для внедрения НТС АПК Амурской области.и секцией ветеринарии ДВО РАСХН (1291).

С. Получение Л-форл микобактерий туберкулеза в культуре пе-рнтонеальных макрофагов белых мышей (методические рекомендации). Утверждены НТО ОУСХ Амурского облисполкома (1986),

7. Дифференциация туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота (методические рекомендации). Утверждены и одобрены для внедрения НТС АПК Амурской области (1289).

8. Диагностика п меры 'борьбы с туберкулезом пятнистых оленей (методические рекомендации). Утверждены и одобрены для внедрения НТС АПК Приморского края (1990).

2. Диагностика, меры борьбы и профилактика туберкулеза крупного рогатого скота - Аыурупрполиграфиздат НТО сельского

хозяйства - 1987.- 25 с".

СПИСОК РАБОТ', .ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО HJffi ДИССЕРТАЦИИ

1.' Рубцова И.Н., Макаров Ю.А., Байтерякова Т.И. Первичная лекарственная устойчивость атипичных шкобактерий, выделенных, от.крупного рогатого скота и объектов внешней среды //Сб.науч. тр. /КазНЛЕИ.- Алма-Ата, IS8I. - С..33-37.

2. Байтерякова Т.Н., Макаров Ю.А. Результаты исследований на туберкулез в разных эпизоотических ситуациях //Ветеринария. - IS82. - J2.K1. - С. 61-52.

3. Байтерякова Т.Н., Макаров Ю.А., Рубцова И.Н. Персистиро-ваняе шкобактерий в организме крупного, рогатого скота //Пробл. туберкулеза. - 1982. - J6 II. - С. 59-62.

4. Байтерякова Т.И., Макаров Ю.А., Рубцова И.Н. Показатели РБТЛ у экспериментально зараженных шкобактериями кроликов //Ветеринария. - 1982. - В 3. - С. 29-30.

5. Макаров Ю.А., Кириенко Н.Г., Зейнулина Р.Х. Внутриклеточное размножение шкобакт.ерий туберкулеза //Ветеринария. -1985. - П I. -С. 34-35.

G, Макаров ¡O.A., Кириленко Н.Г. Взаимодействие шкобактерий. с макрофагами в культуре клеток //Ветеринария. - 1986. - JC8. ■- С. 40-42.

7. Получение Л-форм шкобактерий туберкулеза в культуре перитонеальных макрофагов мышей: Метод, рекомендации /ВАСХНИЛ.' Снб. отд-нпе. ДальЗИИШ; Сост. Икаров Ю.А., Гаврилова Г.А. -Новосибирск, 1986. - 6 с.

8. Макаров Ю.А., Гаврилова I.A., Макарова ГЛ.11. Л-трансфор-пация :.т.кобактерий туберкулеза в культуре перитонеальных макро-

yai'OE :л!еот1Ш2 /Лб. науч. тр. /ЗЛСЕШ. Сиб. отд-ние. 1Ю2С и ДБ. - Новосибирск, 1287. - С. 32-33.

2. Макаров 2.А., Васнльченко i.A., Шитый AT. Диагностика, мерк оорьбы п профилактики туберкулеза крупного рогатого скота.--Благовещенск, 1287. - 25 е.

1ь. Макаров Ю.А., Баспльченко Г.А., Гаврллова i .А. Результаты исследований на туберкулез в неблагополучном районе //Сб. науч. тр. /БЛЛКЖ. 1пй. отд-ние. Даль^Е-ШТ. - Новосибирск, ïl'SC.

- 17-21.

11. Макаров Û.A., 1аврилова Г.А. Особенности эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота на Дальнем Востоке //Тез. докл. науч.-практ. конф. "Ветеринарная паука на .сл-/.::бе АПК"._ - Благовещенск, ISC6. - С. 23-24.

12. Макаров »U.A., Кириленко IÏ.1. Л-трансформация микобакте-pnii туберкулеза в культуре перитонеальных макрофагов белых шпей //Бет. ВИЗВ. - , 1987. - Вып. G4. - С. 34-37.

13. Макаров ¡O.A. Оценка благополучия по туберкулезу при па-рааллергаческих туберкулиновых реакциях //Тез. докл. регион, науч. -произв. конф. /ВАСХНИЛ. Спб. отд-ние. - Новосибирск, IC83.

- С. 3-7.

14. Макаров Ю.А., Васильченко Г.А. Внедрение научно-обоснованной системы мероприятий по оздоровлению хозяйств от бруцеллеза и туберкулеза //Тез. докл. регион, науч.-произв. конф. /БАСХНИЛ. Сиб. отд-ние. - Новосибирск, 1289. - С. 10-13.

15. Макаров ID.A. Л-формы ш-шобактерпй туберкулеза //Науч.-техн. бнхх. /ВАСХНКЛ. Сцб. отд-ние. ДальЭППЗ-1. - Новосибирск, ISSu. - Вып. 1/2. - С. 3-8.

13. Макаров ^.А., Гагр-шова I.A., Макарова M.II. Нммунофпю^ орссцзнтнкй 1Л2ТОД при диагностике Л-форм микобактерик туберкуле-

за // Об. науч. ту. /ОЛОШШ. Оиб. отд-ние. ИЭБ-J и ДВ. - Новосибирск, ГОСъ. - u. 73-77.

17.Макаров I3.A. О'орс.:к перснстирования кикобактерий в организме крупного рогатого скота //Об. науч. тр. /2А0ХШШ. Сиб.

отд—нио. ¡1320 и ДВ. - Новосибирск, 13Э0. - С. G5-70.

18. .Макаров Ю.А., Гаврнлова Г.А., Заспльченко Г.А. Неспеци-Глческне туберкулиновые реакции в хозяйствах Дальнего Востока /Дауч.-техн. бпл. /ВА0ХШ1Л. Оиб. отд-ше. ДальЗНИШ. - Новосибирск, 1290. - Бкп. 1/2. - С. 6-Ц.

1С. .Макаров Ю.А., Гаврнлова I.A., Басильчепко Г.А. Лабораторий контроль при проведении аллергических исследований ::'лвот-ш'х па туберкулез //Науч.-техн. бил. /РАСХН. Сиб. отд-ние. Даль-ЗНХЗЛ. - Новосибирск, IS2I. - Вып. 0. - 0. 7-9.

Макаров ¡O.A. Диагностика туберкулеза .методом шллунофлю-оресцснцпи е общем диагностическом комплексе //Науч.-техн. бюя. /ГАЛИ. Спб. отд-ние. ДальЗНПЕ!. - Новосибирск, 1991. - Вып. 0.

21. Макаров 1С.А. Индикация Л—йюргл микобактерий туберкулеза //Тез. докл. Зоесотоз. науч. кону., посвященной 140-летию Харьковского зооветеринарного института. Дарьи, гос. аграр. ун-т; Харьк. cooegt. пп-т. - Харьков, I'OSI. - С. IC0-I3I.

22. .Макаров 2.Х., Васнльченко i.A. Пзучегде Л-трансформа-ггл :.::кобактерий ЕЦЗ в организме вакцинированных телят //Науч.-то:ш. й:п. /1А0ХП. Дальневост. отд-ше. ДальЗНИШ. - Новосибирск, 1002. - В:-1 п. 1. - \j. 23-25. I

Подписано к печати 02.11.93 г. Формат 60x84/16 Объем 2 п.л. Тираж 100 экз. Заказ »ШОЭ

Редакционно-полиграфическое объединение СО РАСХН, ротапринт 633128, Новосибирская область, п.Краснообск