Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Применение полимеразной цепной реакции для идентификации микобактерий и ее диагностическая значимость при туберкулезе крупного рогатого скота
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 16.00.03
Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Применение полимеразной цепной реакции для идентификации микобактерий и ее диагностическая значимость при туберкулезе крупного рогатого скота
На правах рукописи
Осяпова Елена Петровна
Применение полимеразной цепной реакции для идентификации микобактерий и ее диагностическая значимость при туберкулезе крупного
рогатого скота.
16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология.
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2004
Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко (ВИЭВ) и в Институте молекулярной генетики РАН.
Научные руководители: доктор ветеринарных наук А.Х.Найманов
кандидат медицинских наук В.В.Демкин
Официальные оппоненты: доктор биологических наук О.А.Верховский
(НПО «Нарвак»)
доктор биологических наук Л.Н.Черноусова (ЦНИИТ)
Ведущая организация: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина
Защита диссертации состоится «30» ЛАЛРКСЦЬ- 2004 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 006.033.01 в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко по адресу: 109428, Москва, Рязанский проспект, 24/1, ВИЭВ.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ. Автореферат разослан « » •ЛА.ОиЛ—_2004 г.
Ученый секретарь ___
диссертационного совета, >, -—
профессор с- ~ Н.П.Овдиенко
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
1.1. Актуальность темы. Среди инфекционных болезней животных особенного внимания заслуживает туберкулез крупного рогатого скота, наносящий большой экономический ущерб животноводству и представляющий серьезную опасность для здоровья людей в настоящее время.
Учитывая сложившуюся ситуацию по туберкулезу людей в мире, Всемирная организация здравоохранения и Международный союз борьбы с туберкулезом объявили туберкулез «Проблемой всемирной опасности» и «Экономическим бедствием XXI века», а 24 марта - «Всемирным днем борьбы против туберкулеза».
В России Постановлением правительства № 582 от 11 июня 1998 года утверждена целевая программа «Неотложные меры борьбы с туберкулезом в России на 1998-2004 годы», а Постановлением № 892 от 25 декабря 2001 г. утвержден Федеральный закон «О предупреждении распространения туберкулеза в Российской Федерации».
Известно, что основным звеном в проведении профилактических и оздоровительных мероприятий при туберкулезе животных является своевременная и точная диагностика болезни. Для прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота основным, массовым и доступным для применения в широкой ветеринарной практике методом является внутрикожная туберкулиновая проба с применением ППД-туберкулина для млекопитающих.
В настоящее время диагностика туберкулеза крупного рогатого скота имеет две основные проблемы: с одной стороны, выявление здоровых животных с парааллергическими или неспецифическими реакциями на туберкулин в благополучных хозяйствах, а с другой, недовыявление зараженных туберкулезом животных в неблагополучных хозяйствах. Поэтому, при проведении исследований на туберкулез в благополучных хозяйствах необходимо повысить специфичность, а в неблагополучных - чувствительность диагностических исследований.
Учитывая масштабность проведения исследований на туберкулез, отстандартизовать организмы всех исследуемых животных по реактивности из-за различных внешних и внутренних влияний мы не можем и вряд ли это возможно, так как в разных хозяйствах с различной эпизоотической ситуацией по туберкулезу имеются разные животные с различным проявлением микобактериальной инфекции. Поэтому, прижизненная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота на основе только аллергической внутрикожной туберкулиновой пробы в настоящее время становится недостаточной (А.Х. Найманов, 2004).
Лабораторные методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота являются трудоемкими, длительными (до 6 мес.) и не позволяют в короткие сроки поставить точный диагноз.
Одной из главных проблем при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота является выявление в благополучных хозяйствах реагирующих животных с парааллергическими реакциями, по причине сенсибилизации организма животных различными видами атипичных микобактерий (А.Н. Шаров, 1982, 1985; А.С. Донченко, 1991,1997; Н.П. Овдиенко, 1991; А.Х. Найманов, 2002).
Актуальность этой проблемы увеличивается из года в год. Так, по данным официальной ветеринарной статистики, в настоящее время в благополучных по туберкулезу хозяйствах РФ выявляется в 5,3 раза больше реагирующих на туберкулин животных, чем в неблагополучных хозяйствах.
Массовые выявления парааллергических реакций на туберкулин приводят к убою большого количества реагирующих здоровых животных, что увеличивает размеры экономического ущерба и вызывает обоснованные сомнения в правильности диагностика туберкулеза общепринятыми методами.
Поэтому, оценка диагностической ценности и изучение возможности применения современных методов исследований при диагностике туберкулеза является актуальной в настоящее время.
В последние годы для выявления возбудителей некоторых инфекционных заболеваний все большее распространение получают молекулярно-биологические методы, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР).
В 1983 г. К. Мюллис открыл принцип избирательного умножения нуклеотидных последовательностей, а в 1984 г. разработал метод ПЦР, позволяющий за несколько часов получать миллионы копий выбранного фрагмента ДНК, что приводит к накоплению ДНК в реакционной смеси.
Метод ПЦР основан на идентификации возбудителя болезни по видоспецифическому участку ДНК, позволяющий получить положительный результат при наличии в исследуемом материале единичных клеток возбудителя.
Для амплификации специфического ДНК-фрагмента методом ПЦР достаточно знать нуклеотидную последовательность двух коротких участков ДНК, окаймляющих фрагмент-мишень. На основе этих последовательностей химически синтезируют два олигонуклеотида (праймера), которые необходимы для полимеризации ДНК в каждом цикле ПЦР. Длина праймеров (обычно 20-30 нуклеотидов) должна быть такой, чтобы их последовательность была уникальна и не встречалась в других участках ДНК, присутствующей в реакционной смеси. ПЦР включает серию повторяющихся циклов. Поскольку число молекул ДНК удваивается в каждом цикле, то многократное их повторение приводит к нарастанию (амплификации) количества специфических фрагментов ДНК (ампликонов), которое затем выявляют методом электрофореза.
Преимущества ПЦР в лабораторной диагностике связаны с быстротой, высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет обнаруживать микроорганизмы, имеющиеся в исследуемом материале в очень малом количестве (D. Cousins et al., 1991; G. Buck et al., 1999).
Следует отметить, что в последние годы в нашей стране успешно испытаны тест-системы ПЦР при диагностике ящура, сибирской язвы, хламидиоза, классической чумы свиней и бруцеллеза.
В настоящее время проводятся исследования по изучению возможности применения полимеразной цепной реакции при диагностике туберкулеза людей и животных. Тем не менее, единого мнения об эффективности ПЦР при диагностике туберкулеза нет (D. Thierry et al., 1990,1992; B.B. Пунга, 1998).
Поэтому, учитывая сложную эпидемиологическую и эпизоотическую ситуации по туберкулезу в нашей стране, длительность проведения и недостаточную эффективность методов диагностики туберкулеза животных, изучение возможности применения ПЦР-систем при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота является весьма актуальным.
1.2. Цель исследований. Изучить возможность применения ПЦР-системы, построенной на амплификации генетической области senX3-regX3, для выявления и идентификации ДНК микобактерий, при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах и определить роль и место тест-системы senX3-regX3 в комплексе профилактических и оздоровительных мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота.
1.3. Основные задачи исследований:
1. Провести испытание ПЦР-тест-системы, основанной на амплификации генетической области senX3-regX3, для обнаружения ДНК микобактерий и идентификации М. bovis от М. tuberculosis и от других видов микобактерий.
2. Изучить влияние различных методов обработки патматериала от убитых животных на результаты ПЦР.
3. Изучить диагностическую ценность ПЦР-системы в экспериментальных условиях на зараженных М. bovis телках.
4. Провести сравнительную оценку диагностической ценности внутрикожной туберкулиновой пробы и ПЦР-системы в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах РФ.
5. Определить роль и место ПЦР-системы в комплексе профилактических и оздоровительных мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота.
1.4. Научная новизна.
Установлено, что ПЦР-тест-система, основанная на амплификации генетической области senX3-regX3, позволяет дифференцировать М. bovis от M. tuberculosis и от других видов микобактерий.
Установлено, что обработка патологического материала с помощью метода А.П.Аликаевой и метода Гона-Левенштейна-Сумиоши для выявления микобактерий не влияет на результаты исследований методом ПЦР.
Установлено, что при исследовании ПЦР-методом экспериментально зараженных туберкулезом телок возбудитель М. bovis находится в организме зараженных животных и не обнаруживается в крови, в то же время возбудитель М. bovis выделяется с мочой и обнаруживается ПЦР.
Установлено, что в благополучных по туберкулезу хозяйствах при исследовании проб крови от реагирующих на туберкулин коров, ПЦР-метод дает ложноположительные показания в 16,3 % случаях. При исследовании патматериала от больных туберкулезом животных ПНР-система дает положительные показания только в 45,5 % случаях.
Установлено, что при исследовани ПЦР-методом верхнего слоя плотной питательной среды, содержащей суспензию патматериала от больного туберкулезом крупного рогатого скота, при отсутствии роста культур микобактерий, выявляется ДНК возбудителя туберкулеза.
1.5. Практическая ценность. ПЦР-систему целесообразно использовать в лабораторной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота для идентификации М. bovis от М. tuberculosis и от других видов микобактерий и как дополнительный экспресс-метод при исследовании биоматериала от реагировавших на туберкулин и убитых с диагностической целью животных.
Результаты исследований включены в Наставление по диагностике туберкулеза животных (утверждено Департаментом ветеринарии МСХ РФ в 2002 г.).
По результатам проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по выявлению и дифференциации возбудителей М. bovis от М. tuberculosis и от других видов микобактерий методом полимеразной цепной реакции», рассмотренные и утвержденные на заседании ученого совета ВИЭВ (2003 г.).
1.6. Основные положения, выносимые на защиту. Полученные результаты исследований позволяют вынести на защиту следующие основные положения:
1. Материалы по изучению возможности выделения культур микобактерий и дифференциации культур М. bovis от М. tuberculosis и от других видов культур микобактерий методом ПЦР.
2. Результаты изучения диагностической ценности ПЦР в экспериментальных условиях на зараженных М. bovis телках.
3. Результаты изучения диагностической ценности ПЦР-метода в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах.
4. Целесообразность применения ПЦР-метода в лабораторной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота для дифференциации культур М. bovis от М. tuberculosis и от других видов микобактерий и в качестве дополнительного экспресс-метода при исследовании биоматериала от
реагировавших на туберкулин и убитых с диагностической целью животных.
1.7. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на:
• Международной научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики туберкулеза животных», Москва, 2003;
• Заседании ученого совета ВИЭВ, Москва, 2003;
• Межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, Москва, 2004.
1.8. Публикации результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано пять статей.
1.9. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 147 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений и списка литературы. Список использованной литературы включает 365 наименований, из них 134 иностранных автора. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 8 фотографиями.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и методы исследований. Работа выполнена в 2000-2003 гт. в лаборатории микобактериозов ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ), в лаборатории молекулярной диагностики Института молекулярной генетики РАН, в Вышневолоцком отделе ВИЭВ, в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах Московской, Рязанской, Пензенской и Смоленской областей РФ.
В Институте молекулярной генетики РАН и Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко были подобраны праймеры и отработана новая диагностическая система, основанная на амплификации генетической области senX3-regX3 и позволяющая идентифицировать и дифференцировать М. bovis от М. tuberculosis и от других видов микобактерий.
Исследования проводились в несколько этапов:
1. Исследования различных видов культур микобактерий.
2. Исследования экспериментально зараженных М. bovis телок.
3. Исследования в благополучных по туберкулезу хозяйствах, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями.
4. Исследования в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах.
Аллергические, бактериологические, патологоанатомические и гистологические исследования выполнены совместно с А.Х.Наймановым, И.В.Солодовой и В.С.Суворовым (ВИЭВ).
Исследования полимеразной цепной реакцией выполнены совместно с В.В.Демкиным и И.Н.Корневой (Институт молекулярной генетики РАН).
Исследования различных видов культур микобактерий проводили с целью изучения возможности дифференциации разных культур микобактерий ПЦР-методом. В работе использовали следующие музейные культуры микобактерий: М. tuberculosis, М. bovis, М. avium, М. paratuberculosis, М. kansasii, М. terrae, М. fortuitum, М. gordonae, М. marinum, М. phlei и М. scrofulaceum.
Всего исследовали 78 культур микобактерий: 22 культуры М. bovis, 14 культур М. tuberculosis и 42 культуры различных видов атипичных микобактерий, М. avium и М. paratuberculosis.
В Вышневолоцкий отдел ВИЭВ о.Лисий из благополучного по туберкулезу хозяйства были завезены 9 шестимесячных телок. Проведено заражение 6-ти телок культурой М. bovis (штамм М. bovis-8) и 3 телки составили контрольную группу животных.
Заражение проводили алиментарно, четырехкратно в дозе 0,2 мг культуры на 1 кг живой массы при каждом заражении, т. е. каждой телке было введено 80 мг культуры М. bovis (штамм М. bovis-8). При этом культуру М. bovis в дозе 20 мг вводили каждому животному 3 дня подряд каждый день, через 7 дней после 3-го заражения провели четвертое заражение - в той же дозе.
Аллергические исследования подопытных телок проводили внутрикожной туберкулиновой пробой с ППД-туберкулином для млекопитающих в дозе 10000 МЕ/0,2 мл через 7, 14, 21, 35, 65, 85, 110, 140, 200, 250, 300 и 360 дней после заражения. Телок контрольной группы исследовали в те же сроки, что и зараженных. В эти же сроки от всех экспериментальных животных брали пробы крови и мочи для проведения исследований ПЦР-методом.
Через год после первого заражения все подопытные телки были убиты.
Проведен патологоанатомический осмотр убитых животных и отобран патматериал для проведения лабораторных исследований на туберкулез.
В благополучных по туберкулезу хозяйствах, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями, аллергические исследования на туберкулез проводили методом симультанной туберкулиновой пробы с использованием ППД-туберкулина для млекопитающих и KAM. Для диагностического убоя отбирали животных с более выраженной реакцией на ППД-туберкулин для млекопитающих,
В благополучных по туберкулезу хозяйствах проведено исследование проб крови от 43 реагирующих на туберкулин коров ПЦР-методом. Проведен диагностический убой 26 реагирующих животных с последующим
патологоанатомическим и лабораторным исследованием патматериала на туберкулез.
В неблагополучных по туберкулезу хозяйствах аллергические исследования на туберкулез проводили внутрикожной туберкулиновой пробой с использованием ППД-туберкулина для млекопитающих. Реагирующими считали животных с увеличением толщины кожной складки на 3 мм и более.
В неблагополучных по туберкулезу хозяйствах проведено исследование проб крови ПЦР-методом от 83 реагирующих на туберкулин животных. Проведен убой 24 реагирующих животных с последующим патологоанатомическим, гистологическим и лабораторным исследованием патматериала от убитых коров Лабораторное исследование патматериала от убитых животных проводили в соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулеза животных» от 1986 г. и 2002 г.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования полимеразной цепной реакцией различных видов культур микобактерий.
При определении специфичности тест-системы senX3-regX3 в реакциях, в которых в качестве матриц использовали ДНК различных видов микобактерий (М. tuberculosis, М. bovis, М. avium, М. paratuberculosis, М. kansasii, М. terrae, М. fortuitum, М. gordonae, М. marinum, М. phlei, М. scrofulaceum), специфические амплихоны были получены только с ДНК М. tuberculosis и М. bovis, при этом полученные ампликоны имели разные размеры М. tuberculosis - 370 п.н. (полинуклеотидов), М. bovis - 440 п.н. (полинуклеотидов), т. е. система senX3-regX3 дифференцировала М. bovis от М. tuberculosis.
Изучение возможности дифференциации культур микобактерий тест-системой senX3-regX3 провели на 78 культурах микобактерий (22 культуры М. bovis, 14 культур М. tuberculosis и 42 культуры различных видов атипичных микобактерий, М. avium и М. paratuberculosis).
При исследовании 22 культур М. bovis, специфические для М. bovis ампликоны размером 440 п.н. получены в 22 случаях, то есть исследуемые культуры М. bovis были правильно идентифицированы в 100 % случаях.
При исследовании 14 культур М. tuberculosis ампликоны размером 370 п.н. (М. tuberculosis) были обнаружены во всех 14 случаях, то есть культуры М. tuberculosis были правильно идентифицированы в 100 % случаях.
При исследовании 7 культур М. avium, ампликоны размером 370 п.н. (М. tuberculosis) и 440 п.н. (М. bovis) не были обнаружены ни в одном случае. Полученные результаты исследований позволяют считать, что тест-системой senX3-regX3 можно дифференцировать культуры М. bovis от М. tuberculosis и от культур М. avium.
При исследовании 6 культур М. paratuberculosis, специфические ампликоны для М. tuberculosis и М. bovis также не были обнаружены ни в одном случае. Полученные результаты исследований позволяют считать, что тест-системой можно дифференцировать М. bovis от М. tuberculosis и от культур М. paratuberculosis.
При исследовании 29 культур различных видов атипичных микобаьсгерий (5 культур М. kansasii, 4 культуры М. mannum - 1 группа по классификации Раньона; 3 культуры М. gordonae, 4 культуры М. scrofulaceum - 2 группа; 5 культур М. terrae - 3 группа; 3 культуры М. fortuitum, 5 культур М. phlei - 4 группа по классификации Раньона), специфические ампликоны для М. tuberculosis - 370 п.н. и для М. bovis - 440 п.н. не были обнаружены ни в одном случае.
Полученные результаты исследований позволяют считать, что тест-система senX3-regX3 является специфичной и позволяет в 100 % случаях дифференцировать М. bovis от М. tuberculosis и от М. avium, М. paratuberculosis и различных видов атипичных микобактерий 1, 2, 3, 4 группы по классификации Раньона.
Сравнительное изучение диагностической ценности ПЦР-метода и традиционных методов диагностики туберкулеза на экспериментально зараженных М. bovis телках.
С целью выявления начальной стадии проявления аллергических реакций на туберкулин у зараженных животных, аллергические исследования всех животных начали проводить через 7 дней после последнего заражения телок культурой М. bovis. В дальнейшем, аллергические исследования подопытных телок проводили внутрикожной туберкулиновой пробой с применением ППД-туберкулина для млекопитающих в дозе 10000 МЕ/0,2 мл через 14, 21, 35, 65, 85,110, 140, 200,250,300 и 360 дней после заражения.
В эти же сроки от всех 9 телок брали пробы крови и мочи для проведения исследований полимеразной цепной реакцией.
Результаты сравнительного изучения динамики проявления аллергических реакций на туберкулин и выявления возбудителя туберкулеза в крови и моче экспериментальных животных ПЦР-методом представлены в таблице 1.
В начальной стадии эксперимента, то есть через 7,14,21, 35 и 65 дней после заражения, зараженные М. bovis и контрольные телки не реагировали на внутрикожную туберкулиновую пробу, и только через 85 дней 2 зараженных М. bovis телки (№ 8635-8636 и № 8633-8634) стали слабо реагировать на внутрикожное введение ППД-туберкулина для млекопитающих с утолщением кожной складки на 3 мм. Через 140 дней после заражения все зараженные М. bovis телки реагировали на внутрикожное введение ППД-туберкулина для млекопитающих, с увеличением толщины кожной складки на 5-12 мм.
Сравнительная эффективность внутрикожной туберкулиновой пробы и ПЦР-метода на экспериментальных
телках
Инвентарный номер Исследования через (дней)
85 110 140 200 250 300 360
В/к ПЦР В/к ПЦР В/к ПЦР В/к ПЦР В/к ПЦР В/к ПЦР В/к ПЦР
кр. мч. кр. мч. кр. мч. кр. мч. кр. мч. кр. мч. кр. мч.
Контроль: 1.8631-8631
2. 8639-8640
3. 8637-8638
Зараженные М. bovis: 1.8627-8628 3 12 + 12 10 + 7 + 5 +
2. 8623-8624 - - - - ■ - 5 - - 5 - - 7 + - 6 - - 4 - -
3. 8625-8626 - - - - - - 8 - - 7 - - 7 - + 5 - - 4 - +
4. 8629-8630 - - - - - 5 - - 8 - - 6 - - 3 + + 7 - +
5. 8635-8636 3 - - 5 - - 8 - - 5 + - 7 - + 8 - + 8 - +
6. 8633-8634 3 - - 7 - - 12 - - 10 + - 9 - - 7 - + 7 - +
Обозначения: В/к - внутрикожная туберкулиновая проба;
кр. - кровь; мч. - моча;
- -отрицательный результат реакций; + -обнаружена ДНК М. bovis.
3 телки контрольной группы не реагировали на внутрикожное введение ППД-туберкулина для млекопитающих в течение всего эксперимента.
В течение первых 110 дней после заражения М. bovis не выявляли методом ПЦР в пробах крови и мочи. В дальнейшем М. bovis эпизодически, в единичных случаях, выявлялась в пробах крови у телок: № 8627-8628 - на 140 день, № 8635-8636 и № 8633-8634 - на 200 день, № 8623-8624 - на 250 день, № 8629-8630 - на 300 день после заражения. В остальные сроки исследования зараженных телок возбудитель туберкулеза в крови не определялся тест-системой senX3-regX3.
Резюмируя полученные результаты исследований, можно сделать вывод, что у экспериментально зараженных туберкулезом телок в крови М. bovis не обнаруживается с помощью использованной ПЦР-тест-системы или обнаруживается в единичных случаях. Единичные и кратковременные случаи выявления М. bovis в крови зараженных животных ПЦР-методом нельзя считать диагностическим признаком циркуляции возбудителя М. bovis в крови экспериментально зараженных туберкулезом телок.
Лучшие результаты выявления возбудителя М. bovis у зараженных телок ПЦР-методом были получены при исследовании мочи зараженных животных. Так, при исследовании у зараженных животных проб мочи ПЦР-тест-системой senX3-regX3, М. bovis была обнаружена у 3-х телок (№ 8627-8628, № 8625-8626 и № 8635-8636) - через 250 дней; у 4-х телок (№ 8627-8628, № 8629-8630, № 8635-8636 и № 8633-8634) - через 300 дней и у 5-ти телок (№ 8627-8628, № 8625-8626, № 8629-8630, № 8635-8636 и № 8633-8634) - через 360 дней после заражения. У телки № 8623-8624 в моче возбудитель туберкулеза не был обнаружен в течение всего опыта. То есть, первые выделения ДНК М. bovis из мочи зараженных животных полимеразной цепной реакцией были через 250 дней после заражения у трех телок, в дальнейшем, через 300 дней после заражения, М. bovis выделили у четырех зараженных телок, а в конце эксперимента возбудитель М. bovis выделили у пяти из шести зараженных телок. От трех животных контрольной группы возбудителя туберкулеза не выделили в течение всего эксперимента.
Из полученных результатов исследований следует, что при экспериментальном заражении туберкулезом, возбудитель М. bovis находился в организме зараженных животных, но не выявлялся в крови ПЦР-методом, в то же время исходная культура возбудителя М. bovis в 83,3 % случаях выделялась с мочой зараженных туберкулезом животных.
Через год после заражения подопытные телки были убиты с последующим патологоанатомическим осмотром и отбором патматерила для проведения лабораторных исследований на туберкулез методом ПЦР и традиционными лабораторными методами (таблица 2).
При патологоанатомическом осмотре убитых телок характерные для туберкулеза изменения (гранулемы в начальной стадии развития величиной с просяное зерно) были обнаружены только у двух зараженных животных (№ 8635-8636 и № 8633-8634) в бронхиальном и средостенном лимфатических узлах. При гистологическом исследовании патматериала у этих животных в
бронхиальном и средостенном лимфатических узлах обнаружены отдельные гранулемы, представляющие собой узелки с округлыми краями и центром в виде некроза: хорошо выражен слой эпителиоидных, лимфоидных и гигантских клеток.
При бактериологическом исследовании патматериала от всех подопытных животных традиционным методом посева суспензии патматериала на питательные среды, рост культур М. bovis был обнаружен через 4-5 недель после посева патматериала на питательные среды только у 2-х из 6-ти (33,3%) зараженных телок (№ 8635-8636 и № 8633-8634).
Из патматериала убитых контрольных телок рост культур М. bovis не выявили.
При исследовании этой же суспензии обработанного патматериала, использованной для посева на питательные среды, ПЦР-методом системой senX3-regX3 возбудитель туберкулеза не был выявлен ни в одном случае, независимо от метода обработки патматериала: по методу А.П.Аликаевой (исследовали взвесь патматериала) и по методу Гона-Левенштейна-Сумиоши (исследовали осадок после центрифугирования суспензии патматериала).
Учитывая слабый рост культур микобактерий на питательных средах и отрицательные результаты по ПЦР при исследовании патматериала от зараженных туберкулезом животных, мы провели дополнительные исследования ПЦР-методом верхнего слоя ранее засеянной питательной среды.
При исследовании верхнего слоя питательной среды ПЦР-методом, во всех пробах от 6 (100 %) зараженных телок был обнаружен возбудитель М. bovis. В контрольных пробах возбудителя туберкулеза не обнаружили.
Полученные результаты исследований показали, что возбудитель М. bovis находился в патматерале (в данном случае в лимфатических узлах зараженных туберкулезом животных) и в суспензии обработанного патматериала, но не выявлялся полимеразной цепной реакцией. В то же время, при исследовании ПЦР-методом верхнего слоя питательной среды, ранее засеянной суспензией обработанного патматериала, обнаруживалась ДНК исходной культуры М. bovis в 100 % случаях.
В дальнейшем, с целью выяснения сохранения вирулентных свойств выделенных микобактерий, мы провели заражение шести морских свинок и шести кроликов культурами микобактерий, выделенных от двух зараженных туберкулезом телок: № 8635-8636 и № 8633-8634. Через 3 месяца после заражения культурами микобактерий лабораторные животные были убиты. При патологоанатомическом осмотре убитых морских свинок и кроликов, характерные для туберкулеза изменения были обнаружены во всех случаях.
Полученные результаты проведенных исследований показали, что исходная культура возбудителя туберкулеза М. bovis (штамм М. bovis-8) сохранила свои вирулентные свойства при пассаже через телят, морских свинок и кроликов.
Сравнительный анализ результатов исследований экспериментально зараженных М. bovis телок
№ п/п Инвентарный номер Реакция на туберкулин в мм (перед убоем) Послеубойные исследования Исследование ПЦР-методом Исследование патматериала Исследование верхнего слоя питательной среды ПЦР-методом
патолого-анатомические гистологические крови мочи культу-ральный метод ПЦР-метод при обработке
по методу Али-каевой по методу Гона
1. Контроль: 8631-8632
2. 8639-8640 - - - - - - - - -
3. 8637-8638 - - - - - - - - -
4. Зараженные М. bovis: 8627-8628 5 - - - М. bovis - - - М. bovis
5. 8623-8624 4 - - - - - - - М. bovis
6. 8625-8626 4 - - - М. bovis - - - М. bovis
7. 8629-8630 7 - - - М. bovis - - - М. bovis
8. 8635-8636 8 + + - М. bovis М. bovis - - М. bovis
9. 8633-8634 7 + + - М. bovis М. bovis - - М. bovis
Обозначения: - - без изменений или отрицательный результат реакций;
+ - наличие изменений, характерных для туберкулеза.
Изучение диагностической ценности ПНР-метода в благополучных по туберкулезу хозяйствах, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями. Исследования провели в 12-ти благополучных по туберкулезу хозяйствах Пензенской, Рязанской и Смоленской областей, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями, то есть в хозяйствах, где при плановых аллергических исследованиях на туберкулез постоянно выявляются реагирующие на туберкулин животные с парааллергическими реакциями на туберкулин.
В этих хозяйствах аллергические исследования на туберкулез проводили методом симультанной туберкулиновой пробы с использованием ППД-туберкулина для млекопитающих и КАМ. От 43-х коров, реагирующих в большей степени на ППД-туберкулин для млекопитающих, взяли пробы крови и исследовали полимеразной цепной реакцией. При учете результатов исследований в 7 (16,3%) случаях был получен положительный результат по ПЦР-методу, то есть выделена ДНК М. Ьоу1з.
При дальнейшем выборочном диагностическом убое и патологоанатомическом осмотре 5 реагировавших на туберкулин и с положительными результатами по ПЦР при исследовании крови коров, характерных для туберкулеза изменений не обнаружили ни в одном случае. При лабораторном исследовании латматериала убитых животных возбудителя туберкулеза не выявили. При посеве суспензии обработанного патматериала на питательные среды, от всех 5-ти проб отмечался рост культур различных видов атипичных микобактерий. При исследовании этой же суспензии патматериала от убитых коров ПЦР-методом системой 5епХЗ-ге(£ХЗ, во всех случаях были получены отрицательные результаты.
Кроме того, в благополучных по туберкулезу хозяйствах провели диагностический убой 26 реагировавших на туберкулин коров. При патологоанатомическом осмотре убитых коров, характерных для туберкулеза изменений не обнаружили ни в одном случае. В дальнейшем провели исследования патматериала от этих 26 коров традиционными лабораторными методами исследований на туберкулез и ПЦР-методом.
При посеве суспензии патматериала, обработанного по методу А.П.Аликаевой, на питательную среду ФАСТ-ЗЛ от 26 убитых коров в 18 (69,2 %) случаях выявили рост атипичных микобактерий. 18 культур микобактерий в дальнейшем были исследованы полимеразной цепной реакцией и во всех случаях получен отрицательный результат.
При исследовании суспензии патматериала, обработанного по методу А.П.Аликаевой и по методу Гона-Левенштейна-Сумиоши, от 26 коров ПЦР-методом, во всех случаях получены отрицательные результаты.
Таким образом, при исследовании ПЦР-методом 26 проб патматериала, обработанного по методу А.П.Аликаевой и по методу Гона-Левенштейна-Сумиоши, а также при исследовании культур микобактерий, выросших на питательной среде, система вепХЗ-ге^З ни в одном случае не выявила
возбудителя туберкулеза из патматериала убитых с диагностической целью коров благополучных по туберкулезу хозяйств.
Изучение диагностической ценности ПИР-метода в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах. Изучение диагностической ценности ПЦР-метода в сравнении с другими традиционными методами прижизненной и посмертной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота, мы провели в 4-х неблагополучных по туберкулезу хозяйствах Рязанской и Московской областей.
В 2-х неблагополучных по туберкулезу хозяйствах Рязанской области от 83 реагирующих на туберкулин коров исследованы пробы крови ПЦР-методом и получены положительные результаты ПЦР в 15 (18,1%) случаях. При выборочном диагностическом убое 5-ти реагирующих на туберкулин и давших положительные показания по ПЦР животных, характерные для туберкулеза изменения были обнаружены в 2-х случаях, у остальных убитых животных характерные для туберкулеза изменения не были обнаружены. При культуральном исследовании патматериала от трех животных без видимых для туберкулеза изменений, рост культур возбудителя туберкулеза также не выявили. Однако, при постановке биопробы, лабораторные животные пали через 1 месяц после заражения с характерными для туберкулеза патологоанатомическими изменениями.
Из представленных результатов исследований следует, что наиболее достоверным показателем инфицированное™ туберкулезом крупного рогатого скота при исследовании патматериала от реагирующих на туберкулин животных, была и остается биопроба на лабораторных животных.
В дальнейшем, с целью выяснения диагностической ценности ПЦР-метода системы senXЗ-regXЗ в сравнении с утвержденными традиционными методами посмертной лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота, провели исследования патматериала от больных туберкулезом коров.
Так, в 2-х неблагополучных по туберкулезу хозяйствах Московской области исследовали пробы патматериала от 24 реагировавших на туберкулин и убитых с диагностической целью животных (таблица 3).
При патологоанатомическом осмотре 24-х реагирующих на туберкулин животных, характерные для туберкулеза изменения были обнаружены в 22 (91,6 %) случаях. Следует отметить, что характерные для туберкулеза изменения наблюдали, в основном, в средостенных, бронхиальных и заглоточных лимфатических узлах. В некоторых случаях характерные для туберкулеза изменения обнаруживали в легких, печени и брыжеечных лимфатических узлах. В одном случае характерные для туберкулеза изменения были обнаружены в надвыменных лимфатических узлах. Отмечались и генерализованные формы поражения туберкулезом.
При дополнительном гистологическом исследовании лимфатических узлов и легких выявлены многочисленные мелкие и крупные гранулемы, имеющие
тенденцию к распространению и образующие в капсуле лимфоузлов дочерние гранулемы, а в легких вызывающие специфический плеврит.
Обнаружение у убитых животных такого большого процента характерных для туберкулеза изменений, генерализация процесса и обширность поражения лимфатических узлов и внутренних органов показало тяжелую степень поражения туберкулезом коров.
При культуральном исследовании патматериала от 24 животных был выявлен рост культур М. bovis в 15 (62,5 %) случаях, а в 9-ти случаях рост культур М. bovis не выявили.
Рост культур М. bovis характеризовался редкими, мелкими, гладкими, шаровидными, цвета слоновой кости колониями микобактерий.
При исследовании патматериала от 22 явно больного туберкулезом крупного рогатого скота (с характерными для туберкулеза изменениями) полимеразной цепной реакцией, положительный результат был получен в 10 (45,5 %) случаях, а культуральным методом в 15 (62,5 %) случаях, то есть ПЦР-методом туберкулез подтвержден в меньшем проценте, чем культуральным методом.
Тем не менее, ПЦР-методом дополнительно подтвержден туберкулез в трех случаях, когда из патматериала реагировавших на туберкулин коров, с характерными для туберкулеза изменениями, не была выделена культура М. bovis проведенными бактериологическими исследованиями.
Результаты исследований несколько зависели от метода предпосевной обработки послеубойного материала. Так, результаты исследований по ПНР совпали в 9-ти (90 %) случаях при предпосевной обработке патматериала по методу А.П.Аликаевой и методу Гона-Левенштейна-Сумиоши.
В одном случае положительный результат по ПНР был получен при обработке патматериала от больного туберкулезом животного по методу А.П.Аликаевой, в то время как эта же проба дала отрицательные показания по ПЦР при обработке ее по методу Гона-Левенштейна-Сумиоши.
В одном случае методом ПЦР выявили возбудителя туберкулеза при обработке патматериала методом Гона-Левенштейна-Сумиоши, но отрицательный результат по ПЦР был получен при обработке этого же материала по методу А.П.Аликаевой.
Таким образом, при предпосевной обработке патматериала по методу Гона-Левенштейна-Сумиоши, ПЦР дала положительные результаты в 10-ти случаях, и по методу А.П.Аликаевой также в 10-ти случаях.
Следует особо отметить, что лучшие результаты исследований ПЦР-методом мы получили при исследовании выделенных культур микобактерий и верхнего слоя засеянной питательной среды, где рост культур не был выявлен бактериологическим методом.
Сравнительный анализ результатов исследований патматериала от реагировавших на туберкулин коров из
неблагополучных по туберкулезу хозяйств
Количество исследованных животных Методы исследования
В/к проба (мм) патолого-анатомический гистологический культу-ральный ПЦР-метод (система вепХЗ-ге 8X3)
патматериал, при обработке по методу: культуры, выросшие на питательной среде ФАСТ-ЗЛ
А.П.Алика-евой Гона
24 + 24 + 22 + 22 + 15 + 10 + 10 + 21
-2 -2 -9 -12 -12 - 1
100% 91,6% 91,6% 62,5 % 45,5 % 45,5 % 95,4 %
Примечание: В/к проба - внутрикожная туберкулиновая проба; + - положительный результат; - - отрицательный результат.
Так, при исследовании выделенных культур микобактерий и верхнего слоя питательной среды при отсутствии роста культур микобактерий, М. bovis выявлена в ПЦР-системе senX3-regX3 в 21 (95,4 %) из 22 случае.
При исследовании проб патматериала от 2-х реагировавших на туберкулин и убитых коров, у которых туберкулез не был подтвержден проведенными патологоанатомическими, гистологическими и бактериологическими исследованиями, ПЦР-методом также не был обнаружен возбудитель туберкулеза.
Резюмируя весь изложенный в представленной работе материал, можно сделать общее заключение о том, что в настоящее время ПЦР-метод представляет несомненную диагностическую ценность для дифференциации М. bovis от М. tuberculosis и от других видов культур микобактерий при лабораторных исследованиях. Считаем, что ПЦР-систему senX3-regX3 целесообразно использовать для идентификации культур микобактерий, а также при послеубойной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота, как дополнительный экспресс-метод для исследования патматериала от убитых животных при лабораторных исследованиях на туберкулез.
4. ВЫВОДЫ
1. Установлено, что при исследовании различных культур микобактерий ПЦР-тест-система, основанная на амплификации генетической области senX3-regX3, идентифицирует М. bovis от М. tuberculosis и от М. avium, М. paratuberculosis и различных видов атипичных микобактерий 1, 2, 3, 4 группы по классификации Раньона в 100 % случаях.
2. При исследовании ПЦР-методом экспериментально зараженных животных установлено, что возбудитель М. bovis находится в организме зараженных животных и не обнаруживается в крови. В то же время, исходная культура возбудителя туберкулеза в 83,3 % случаях выделяется с мочой зараженных животных и обнаруживается ПЦР-методом.
3. Показано, что при исследовании патматериала от экспериментально зараженных животных культуральным методом, рост культур М. bovis выявляется в 33,3 % случаях. При исследовании этого же материала ПЦР-методом, ДНК возбудителя туберкулеза не обнаруживается.
4. При исследовании ПЦР-методом верхнего слоя питательной среды, засеянной суспензией патматериала от зараженных туберкулезом телят, ДНК М. bovis выявляется в 100 % случаях.
5. Установлено, что предварительная обработка патматериала с помощью методов А.П.Аликаевой и Гона-Левенштейна-Сумиоши не влияет на результат полимеразной цепной реакции.
6. Показано, что в благополучных по туберкулезу хозяйствах, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями,
при исследовании проб крови от реагирующих на туберкулин коров, ПЦР-метод дает ложноположительные показания в 16,3 % случаях.
7. Установлено, что при исследовании патматериала от убитых с диагностической целью коров с парааллергическими реакциями и выделении у них культуральным методом в 69,2 % случаях атипичных микобактерий, ПЦР не дает ложноположительных результатов.
8. Показано, что при исследовании патматериала от больных туберкулезом коров из неблагополучных хозяйств, ПЦР-метод дает положительные результаты в 45,5 % случаях.
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. ПЦР-метод целесообразно использовать для идентификации и дифференциации М. bovis от М. tuberculosis и от других видов культур микобактерий.
2. ПЦР-метод может быть использован при послеубойной лабораторной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота, как дополнительный экспресс-метод при исследовании патматериала от убитых с диагностической целью животных.
На основании результатов проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по выявлению и дифференциации возбудителей М. bovis от М. tuberculosis и от других видов микобактерий методом полимеразной цепной реакции», рассмотренные и утвержденные на заседании ученого совета ВИЭВ (2003 г.).
6. СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Осипова Е.П., Найманов А.Х., Корнева И.Н., Демкин В.В. Использование полимеразной цепной реакции при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. Инфекционные и протозойные болезни сельскохозяйственных животных, рыб и пчел. Труды ВИЭВ, т. 73, Москва, 2003 г. С. 107-109.
2. Корнева И.Н., Демкин В.В., Найманов А.Х., Осипова Е.П. Применение ПЦР для обнаружения микобактерий туберкулеза у животных. Научное обеспечение АПК Сибири, Монголии, Казахстана, Беларуси и Башкортостана. Материалы 5-й Международной научно-практической конференции. Новосибирск, 2002 г. С. 421-424.
3. Корнева И.Н., Осипова Е.П., Найманов А.Х., Демкин В.В. Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции. Генодиагностика инфекционных заболеваний. Сборник тезисов 4-й Всероссийской научно-практической конференции. Москва, 2002 г. С.
4. Найманов А.Х., Овдиенко Н.П., Осипова Е.П., Солодова И.В., Суворов B.C. Полимеразная цепная реакция (система senX3-regX3) при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. Материалы международной научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики туберкулеза животных». Журнал «Ветеринарная патология», № 1-2 (9), Москва, 2004 г. С. 96-99.
5. Найманов А.Х., Овдиенко Н.П., Осипова Е.П., Солодова И.В., Суворов B.C., Корнева И.Н., Демкин В.В. Полимеразная цепная реакция (система senX3-regX3) при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. Журнал «Ветеринария». В печати.
Принято к исполнению 26/05/2004 Заказ № 234
Исполнено 27/05/2004 Тираж: 100 экз.
ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www autoreferat ru
РНБ Русский фонд
2007-4 4651
23
\> 1Л fltV/i
2004
Оглавление диссертации Осипова, Елена Петровна :: 2004 :: Москва
1. Введение
2. Обзор литературы
2.1. Общая характеристика заболевания.
Возбудитель, эпизоотологические данные и клиническое проявление туберкулеза у крупного рогатого скота
2.2. Методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота
2.3. Методы прижизненной диагностики
2.3.1. Туберкулинодиагностика (аллергическая диагностика, внутрикожная туберкулиновая проба)
2.3.2. Серологическое исследование
2.4. Методы послеубойной (посмертной) диагностики
2.4.1. Патологоанатомическое исследование
2.4.2. Бактериологическое исследование
2.4.2.1. Бактериоскопическое исследование
2.4.2.2. Культуральное исследование
2.4.2.3. Биологическое исследование (биопроба)
2.5. Полимеразная цепная реакция при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота
3. Собственные исследования
3.1. Материалы и методы
3.1.1. Исследования различных видов культур микобактерий
3.1.2. Исследования экспериментально зараженных М. bovis телок
3.1.3. Исследования в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах
3.1.4 Сбор биоматериала, обработка его и выделение ДНК перед постановкой полимеразной цепной реакции 3.1.5. Методика постановки полимеразной цепной реакции с использованием тест-системы senX3-regX
4. Результаты исследований
4.1. Исследования полимеразной цепной реакцией различных видов культур микобактерий
4.2. Сравнительное изучение диагностической ценности ПЦР-метода и традиционных методов диагностики туберкулеза на экспериментально зараженных М. bovis телках
4.3. Изучение диагностической ценности ПЦР-метода в благополучных по туберкулезу хозяйствах, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями
4.4. Изучение диагностической ценности ПЦР-метода в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах
Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Осипова, Елена Петровна, автореферат
1. Актуальность темы. Среди инфекционных болезней животных особенного внимания заслуживает туберкулез крупного рогатого скота, наносящий большой экономический ущерб животноводству и представляющий серьезную опасность для здоровья людей в настоящее время.
Учитывая сложившуюся ситуацию по туберкулезу людей в мире, Всемирная организация здравоохранения и Международный Союз борьбы с туберкулезом объявили туберкулез «Проблемой всемирной опасности» и «Экономическим бедствием XXI века», а 24 марта - «Всемирным днем борьбы против туберкулеза».
В России Постановлением правительства № 582 от 11 июня 1998 года утверждена целевая программа «Неотложные меры борьбы с туберкулезом в России на 1998-2004 годы», а Постановлением № 892 от 25 декабря 2001 г. утвержден Федеральный закон «О предупреждении распространения туберкулеза в Российской Федерации».
Известно, что основным звеном в проведении профилактических и оздоровительных мероприятий при туберкулезе животных является своевременная и точная диагностика болезни. Для прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота основным, массовым и доступным для применения в широкой ветеринарной практике методом является внутрикожная туберкулиновая проба с применением ППД-туберкулина для млекопитающих.
В настоящее время диагностика туберкулеза крупного рогатого скота имеет две основные проблемы: с одной стороны, выявление здоровых животных с парааллергическими или неспецифическими реакциями на туберкулин в благополучных хозяйствах, а с другой, недовыявление зараженных туберкулезом животных в неблагополучных хозяйствах. Поэтому, при проведении исследований на туберкулез в благополучных хозяйствах необходимо повысить специфичность, а в неблагополучных - чувствительность диагностических исследований.
Учитывая масштабность проведения исследований на туберкулез, отстандартизовать организмы всех исследуемых животных по реактивности из-за различных внешних и внутренних влияний мы не можем и вряд ли это возможно, так как в разных хозяйствах с различной эпизоотической ситуацией по туберкулезу, имеются разные животные с различным проявлением микобактериальной инфекции. Поэтому, прижизненная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота на основе только аллергической внутрикожной туберкулиновой пробы в настоящее время становится недостаточной (А.Х. Найманов, 2004).
Лабораторные методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота являются трудоемкими, длительными (до 6 мес.) и не позволяют в короткие сроки поставить точный диагноз.
Одной из главных проблем при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота является выявление в благополучных хозяйствах реагирующих животных с парааллергическими реакциями, по причине сенсибилизации организма животных различными видами атипичных микобактерий (А.Н. Шаров, 1982, 1985; А.С. Донченко, 1991,1997; Н.П. Овдиенко, 1991; А.Х. Найманов, 2002).
Актуальность этой проблемы увеличивается из года в год. Так, по данным официальной ветеринарной статистики, в настоящее время в благополучных по туберкулезу хозяйствах РФ выявляется в 5,3 раза больше реагирующих на туберкулин животных, чем в неблагополучных хозяйствах.
Массовые выявления парааллергических реакций на туберкулин приводят к убою большого количества реагирующих здоровых животных, что увеличивает размеры экономического ущерба и вызывает обоснованные сомнения в правильности диагностики туберкулеза общепринятыми методами.
Поэтому, оценка диагностической ценности и изучение возможности применения современных методов исследований при диагностике туберкулеза является актуальной в настоящее время.
В последние годы для выявления возбудителей некоторых инфекционных заболеваний все большее распространение получают молекулярно-биологические методы, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР).
В 1983 г. К. Мюллис открыл принцип избирательного умножения нуклеотидных последовательностей, а в 1984 г. разработал метод ПЦР, позволяющий за несколько часов получать миллионы копий выбранного фрагмента ДНК, что приводит к накоплению ДНК в реакционной смеси.
Метод ПЦР основан на идентификации возбудителя болезни по видоспецифическому участку ДНК, позволяющий получить положительный результат при наличии в исследуемом материале единичных клеток возбудителя.
Для амплификации специфического ДНК-фрагмента методом ПЦР достаточно знать нуклеотидную последовательность двух коротких участков ДНК, окаймляющих фрагмент-мишень. На основе этих последовательностей химически синтезируют два олигонуклеотида (праймера), которые необходимы для полимеризации ДНК в каждом цикле ПЦР. Длина праймеров (обычно 20-30 нуклеотидов) должна быть такой, чтобы их последовательность была уникальна и не встречалась в других участках ДНК, присутствующей в реакционной смеси. ПЦР включает серию повторяющихся циклов. Поскольку число молекул ДНК удваивается в каждом цикле, то многократное их повторение приводит к нарастанию (амплификации) количества специфических фрагментов ДНК (ампликонов), которое затем выявляют методом электрофореза.
Преимущества ПЦР в лабораторной диагностике связаны с быстротой, высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет обнаруживать микроорганизмы, имеющиеся в исследуемом материале в очень малом количестве (D. Cousins et al., 1991; G. Buck et al., 1999).
Следует отметить, что в последние годы в нашей стране успешно испытаны тест-системы ПНР при диагностике ящура, сибирской язвы, хламидиоза, классической чумы свиней и бруцеллеза.
В настоящее время проводятся исследования по изучению возможности применения полимеразной цепной реакции при диагностике туберкулеза людей и животных. Тем не менее, единого мнения об эффективности ПЦР при диагностике туберкулеза нет (D. Thierry et al., 1990, 1992; В.В. Пунга, 1998).
Поэтому, учитывая сложную эпидемиологическую и эпизоотическую ситуации по туберкулезу в нашей стране, длительность проведения и недостаточную эффективность методов диагностики туберкулеза животных, изучение возможности применения ПЦР-систем при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота является весьма актуальным.
2. Цель исследований. Изучить возможность применения ПЦР-системы, построенной на амплификации генетической области senX3-regX3, для выявления и идентификации ДНК микобактерий, при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах и определить роль и место тест-системы senX3-regX3 в комплексе профилактических и оздоровительных мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота.
3. Основные задачи исследований:
1. Провести испытание ПЦР-тест-системы, основанной на амплификации генетической области senX3-regX3, для обнаружения ДНК микобактерий и идентификации М. bovis от М. tuberculosis и от других видов микобактерий.
2. Изучить влияние различных методов обработки патматериала от убитых животных на результаты ПЦР.
3. Изучить диагностическую ценность ПЦР-системы в экспериментальных условиях на зараженных М. bovis телках.
4. Провести сравнительную оценку диагностической ценности внутрикожной туберкулиновой пробы и ПЦР-системы в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах РФ.
5. Определить роль и место ПЦР-системы в комплексе профилактических и оздоровительных мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота.
4. Научная новизна.
Установлено, что ПЦР-тест-система, основанная на амплификации генетической области senX3-regX3, позволяет дифференцировать М. bovis от М. tuberculosis и от других видов микобактерий.
Установлено, что обработка патологического материала с помощью метода А.П.Аликаевой и метода Гона-Левенштейна-Сумиоши для выявления микобактерий не влияет на результаты исследований методом ПЦР.
Установлено, что при исследовании ПЦР-методом экспериментально зараженных туберкулезом телок возбудитель М. bovis находится в организме зараженных животных и не обнаруживается в крови, в то же время возбудитель М. bovis выделяется с мочой и обнаруживается ПЦР.
Установлено, что в благополучных по туберкулезу хозяйствах при исследовании проб крови от реагирующих на туберкулин коров, ПЦР-метод дает ложноположительные показания в 16,3 % случаях. При исследовании патматериала от больных туберкулезом животных ПЦР-система дает положительные показания только в 45,5 % случаях.
Установлено, что при исследовани ПЦР-методом верхнего слоя плотной питательной среды, содержащей суспензию патматериала от больного туберкулезом крупного рогатого скота, при отсутствии роста культур микобактерий, выявляется ДНК возбудителя туберкулеза.
5. Практическая ценность. ПЦР-систему целесообразно использовать в лабораторной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота для идентификации М. bovis от М. tuberculosis и от других видов микобактерий и как дополнительный экспресс-метод при исследовании биоматериала от реагировавших на туберкулин и убитых с диагностической целью животных.
Результаты исследований включены в Наставление по диагностике туберкулеза животных (утверждено Департаментом ветеринарии МСХ РФ в 2002 г.).
По результатам проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по выявлению и дифференциации возбудителей М. bovis от М. tuberculosis и от других видов микобактерий методом полимеразной цепной реакции», рассмотренные и утвержденные на заседании ученого совета ВИЭВ (2003 г.).
6. Основные положения, выносимые на защиту. Полученные результаты исследований позволяют вынести на защиту следующие основные положения:
1. Материалы по изучению возможности выделения культур микобактерий и дифференциации культур М. bovis от М. tuberculosis и от других видов культур микобактерий методом ПЦР.
2. Результаты изучения диагностической ценности ПЦР в экспериментальных условиях на зараженных М. bovis телках.
3. Результаты изучения диагностической ценности ПЦР-метода в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах.
4. Целесообразность применения ПЦР-метода в лабораторной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота для дифференциации культур М. bovis от М. tuberculosis и от других видов микобактерий и в качестве дополнительного экспресс-метода при исследовании биоматериала от реагировавших на туберкулин и убитых с диагностической целью животных.
7. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на:
• Международной научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики туберкулеза животных», Москва, 2003;
• Заседании ученого совета ВИЭВ, Москва, 2003;
• Межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, Москва, 2004.
8. Публикации результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано пять статей.
9. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 147 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений и списка литературы. Список использованной литературы включает 365 наименований, из них 134 иностранных автора. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 8 фотографиями.
Заключение диссертационного исследования на тему "Применение полимеразной цепной реакции для идентификации микобактерий и ее диагностическая значимость при туберкулезе крупного рогатого скота"
6. ВЫВОДЫ
1. Установлено, что при исследовании различных культур микобактерий ПЦР-тест-система, основанная на амплификации генетической области senX3-regX3, идентифицирует М. bovis от М. tuberculosis и от М. avium, М. paratuberculosis и различных видов атипичных микобактерий 1, 2, 3, 4 группы по классификации Раньона в 100 % случаях.
2. При исследовании ПЦР-методом экспериментально зараженных животных установлено, что возбудитель М. bovis находится в организме зараженных животных и не обнаруживается в крови. В то же время, исходная культура возбудителя туберкулеза в 83,3 % случаях выделяется с мочой зараженных животных и обнаруживается ПЦР-методом.
3. Показано, что при исследовании патматериала от экспериментально зараженных животных культуральным методом, рост культур М. bovis выявляется в 33,3 % случаях. При исследовании этого же материала ПЦР-методом, ДНК возбудителя туберкулеза не обнаруживается.
4. При исследовании ПЦР-методом верхнего слоя питательной среды, засеянной суспензией патматериала от зараженных туберкулезом телят, ДНК М. bovis выявляется в 100 % случаях.
5. Установлено, что предварительная обработка патматериала с помощью методов А.П.Аликаевой и Гона-Левенштейна-Сумиоши не влияет на результат полимеразной цепной реакции.
6. Показано, что в благополучных по туберкулезу хозяйствах, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями, при исследовании проб крови от реагирующих на туберкулин коров, ПЦР-метод дает ложноположительные показания в 16,3 % случаях.
7. Установлено, что при исследовании патматериала от убитых с диагностической целью коров с парааллергическими реакциями и выделении у них культуральным методом в 69,2 % случаях атипичных микобактерий, ПЦР не дает ложноположительных результатов.
8. Показано, что при исследовании патматериала от больных туберкулезом коров из неблагополучных хозяйств, ПЦР-метод дает положительные результаты в 45,5 % случаях.
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. ПЦР-метод целесообразно использовать для идентификации и дифференциации М. bovis от М. tuberculosis и от других видов культур микобактерий.
2. ПЦР-метод может быть использован при послеубойной лабораторной диагностике туберкулеза крупного рогатго скота, как дополнительный экспресс-метод при исследовании патматериала от убитых с диагносической целью животных.
На основании проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по выявлению и дифференциации возбудителей М. bovis от М. tuberculosis и от других видов микобактерий методом полимеразной цепной реакции», рассмотренные и утвержденные на заседании ученого совета ВИЭВ от 2003 г.
Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2004 года, Осипова, Елена Петровна
1. Авилов В.М., Пылинин В.Ф. Эпизоотическое состояние по туберкулезу в РСФСР и меры борьбы с болезнью. // Ветеринария. 1992. - №1. - С. 3-9.
2. Айганов А.Р. Патоморфологическая выраженность туберкулеза крупногорогатого скота из неблагополучных пунктов. // Система мер борьбы с туберкулезом сельскохозяйственных животных. 1991. - Новосибирск. - С. 4456.
3. Айганов А.Р. Патоморфология экспериментального туберкулеза телят. // Система мер борьбы с туберкулезом сельскохозяйственных животных. -1991. Новосибирск. - С.56-62.
4. Александров Н.А. Специфичность туберкулиновой пробы при фасциолезе и эхинококкозе. // Ветеринария. 1969. - № 10.
5. Аликаева А.П. Туберкулез. Лабораторные исследования в ветеринарии. // М. -Сельхозгиз. 1964. - т. 3. - С. 238-254.
6. Аликаева А.П. Упрощенный метод выделения и выращивания чистых культур туберкулезных бацилл из патологического материала. // Советская ветеринария. 1940. - №11 - 12. - С. 47-50.
7. Аликаева А.П., Жерносек Т.П. Упрощенный метод типирования туберкулезных культур. // Ветеринария. 1950. - №4. - С.56-57.
8. Аляпкина Ю.С., Аксенов М.Ю., Чернов Б.К., Гинзбург А.Л. Количественный ПЦР-анализ: разработка системы определения содержанияамплифицированного фрагмента ДНК. // Молекулярная генетика. Микробиология и вирусология. М. - Медицина. - 1994. - №5. - С. 22-26.
9. Ю.Антонов Б.И. ПЦР и серологическая диагностика без знака равенства. // Медицинский центр «Наследственность». Н. Новгород. - 2002.
10. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. // Л. Медгиз. - 1962. - 180 с.
11. Белоусов А.В. Люминесцентная бактериоскопия микобактерий туберкулеза. // Лабораторное дело. 1965. - №5. - С. 312-313.
12. Н.Благодарный Я.А. Источники туберкулеза и меры профилактики. // Алма-Ата. Казахстан. - 1980. - 245 с.
13. Благодарный Я.А. Туберкулез как антропозооноз. // Алма-Ата. Кайнар. -1972. - 199с.
14. Боганец Н.С., Хайкин Б.Я., Панкратов А.Д. Видовой состав микобактерий в хозяйствах с различной эпизоотической ситуацией // Паразиты и вызываемые ими болезни в Сибири. Новосибирск, 1997. - С. 17-19.
15. Бойко А.А., Сапегина Е.П. Туберкулез крупного рогатого скота. // Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности. 1991. - 92с.
16. Боль Б. К. Патологоанатомическое вскрытие сельскохозяйственных животных. // М. Госил. - 1953. - 335с.
17. Бортюк Я.А. Молекулярное клонирование ДНК M.bovis BCG. // Труды ВИЭВ. -М.- 1988(89).-С. 26-28.
18. Булавин С., Хон Ф. Об атипичных микобактериях как причине сенсибилизации. // Ветеринарная газета. 1999. - №9-10. - С.7.
19. Буряк Е.И. Эффективность разных способов прижизненной диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота. // Ветеринария. 1986. - №6. - С.23-26.
20. Варенко Ю.С., Бескровный П.С. Модификация метода Калфина для выращивания микобактерий туберкулеза. // Проблемы туберкулеза. 1978. -№3. - С. 74-76.
21. Варенко Ю.С., Ластков О.А., Бескровный П.С. Способ ускоренного выращивания микобактерий туберкулеза. // Лаб. дело. 1980. - №1. - С. 45-47.
22. Василев В.П. Микобактериозы и микозы легких. // София. Медицина ифизкультура. 1971. - 283с.
23. Васильева Н.П. Сравнительная характеристика чувствительности микроскопических методов выявления микобактерий туберкулеза. // Лаб. дело. 1973. - №1. - С. 32-34.
24. Васильева Н.П., Аникин В.А. Диагностические возможности методики люминесцентной микроскопии и оптимизация культурального метода диагностики туберкулеза. // Тр. Московского НИИ туберкулеза. М. - 1981. -С. 40-45.
25. Васин А.В. К вопросу о влиянии внешних факторов на аллергическое состояние при туберкулезе крупного рогатого скота. // Ветеринария. 1951. -№12. -С. 29-30.
26. Вейсфейлер Ю.К. Биология и изменчивость микобактерий туберкулеза и атипичные микобактерии. // Будапешт. Изд. Академии наук Венгрии. -1975.- 327с.
27. Вишневский П.П. Серодиагностика туберкулеза у крупного рогатого скота с помощью фиксаций комплемента. // Тр. ГИЭВ. 1928. - т.5. - вып.2. - С. 16-22.
28. Вишневский П.П. Туберкулез крупного рогатого скота. // М. Сельхозгиз. -1937.- 173с.
29. Воробьева З.Г., Лазовская А.Л. Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота с применением агглютинации латекса. // Проблемы профилактики и лечения заболеваний сельскохозяйственных животных. Н. Новгород. - 1993.
30. Воробьева З.Г., Лазовская А.Л. Реакция агглютинации латекса при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. // Эффективные меры борьбы с туберкулезом сельскохозяйственных животных. Казань. - 1991. -С. 37-41.
31. Воробьева З.Г., Лазовская А.Л., Лукин Ю.В. Реакция латекс-агглютинации для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. // Ветеринария. -1996.- № 4. С. 27-28.
32. Воробьева З.Г., Лазовская АЛ., Слинина К.Н. Микросферные тесты для диагностики инфекционных заболеваний эукариотов. // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 1998. - №4. - С. 59-62.
33. Воронкова Г.Н. Метод люминесцентной микроскопии в диагностике туберкулеза. // Лаб. дело. 1986. - №6. - С. 106-108.
34. Временное наставление по постановке и учету реакции агглютинации латекса с набором препаратов для выявления специфических антител кмикобактериям туберкулеза. // Утверждено Ветфармсоветом 17.12.98. протокол № 5.
35. Вышелесский С.Н. К вопросу об отличии активного и неактивного туберкулеза крупного рогатого скота с помощью методов: реакции связывания комплемента, мейостагминовой реакции и офтальмореакции. // Архив вет. наук. 1913.-Т.1.-С. 1-42.
36. Вышелесский С.Н., Бухтилов Ф.Н. О роли комплекса мероприятий в борьбе с туберкулезом крупного рогатого скота. // Ветеринария. 1956. - №5. - С. 2126.
37. Говоров A.M. Разработка мероприятий по специфической профилактике туберкулеза крупного рогатого скота. // Научные труды УИЭВ. 1953. - Т.20. -С. 115-125.
38. Говоров A.M., Целлариус И.И., Тесля А.Е., Кассич Ю.Я. Совершенствование биологического и аллергического методов диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. // Проблемы борьбы с туберкулезом и паратуберкулезом животных. Воронеж. - 1965. - С. 74-80.
39. Голышевская В.И., Ахунов М.Б., Бибергаль Е.А. Совершенствование методов микробиологической диагностики туберкулеза. // Проблемы туберкулеза. -1987.-№ 12-С. 42-43.
40. Голышевская В.И., Гинзбург А.Л., Леви Д.Т. и др. Выявление микобактерий с помощью ПЦР у детей и подростков. // Проблемы туберкулеза. М. -Медицина. - 1996. - №1. - С.27-29.
41. Голышевская В.И., Корнев А.А., Черноусова Л.Н. и др. Микробиологическая диагностика туберкулеза. // Вестник Российской академии медицинских наук. 1995.-№7.
42. Гондарук И.П. О туберкулиновых реакциях у крупного рогатого скота, пораженного фасциолезом. // Соц. животноводство. Киев. - 1952. - №12. -С. 31-34.
43. Гребенникова Т.В., Грабовецкий В.В., Кальнов С.Л., Непоклонов Е.А., Шумский Я. И. Дифференциальная диагностика микобактерий методом полимеразной цепной реакции. // Ветеринария. -1999. №3. - С. 17-20.
44. Григоров В., Бибиков Ф., Надточий О. Туберкулез животных и возможные пути оздоровления поголовья. Проявление эпизоотического процесса в Краснодарском крае. // Ветеринарная газета. 1999. - №9-10. - С.7.
45. Гришина Т.Д., Шагинян И.А., Пузанов В.А. и др. Идентификация возбудителя туберкулеза в клиническом материале с помощью метода ПЦР. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1995. - №1. - С.36-39.
46. Гусева Е.В., Сатина Т.А., Фомина Т.А. Применение ПЦР в диагностике инфекционных болезней сельскохозяйственных животных. // Научные основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов. -Щелково. 1996. - С. 38-40.
47. Давыдовский И.В. Туберкулез. // Патологоанатомическая анатомия и патогенез болезней человека. М. - Медгиз. - 1956. - С. 473-536.
48. Дворникова М.А. Послеубойная диагностика туберкулеза у крупного рогатого скота. // Научные труды Саратовского СХИ. Саратов. - 1974. -Т. 15. - С. 24-28.
49. Добин М.А., Кокуричев П.И. Практикум по ветеринарной патологической анатомии и вскрытию. // JI. М. - Сельхозиздат. - 1963. - 240с.
50. Донченко А. С., Донченко В.Н. Люминесцентная микроскопия в диагностике туберкулеза. // Ветеринария. 1977. - №6. - С. 100-102.
51. Донченко Н.А. Роль ареактивных к туберкулину телят в эпизоотологии туберкулеза крупного рогатого скота. // Зооантропонозные болезни, меры профилактики и борьбы. Мн. - 1997. - С. 75-76.
52. Донченко Н.А. Течение туберкулеза крупного рогатого скота у животных, инфицированных микобактериями комплекса avium intracellularae. // Автореф. канд. ветер, наук. ВИЭВ. - М. - 1991. - 19 с.
53. Дополнения (изменения) к Наставлению по диагностике туберкулеза животных, утвержденному Главветупром Госагропрома СССР 25.02.1986. // Утв. Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ 18.10.1998.
54. Драбкина P.O. Микробиология туберкулеза. // М. Медгиз. - 1963. - 255с.
55. Евглевский А. А. Совершенствование аллергической диагностики и специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота. — Автореф. дисс. канд. вет. наук. Воронеж. - 1992. - С. 26.
56. Ефимычев И.В. Как правильно трактовать полученный результат при диагностике методом ПЦР. // Медицинский центр «Наследственность». Н. Новгород. - 2002.
57. Жак Н.Ф., Морейн Е.М. Упрощенный метод приготовления и окраски мазков для микобактерий туберкулеза люминесцентным методом. // Лаб. дело. -1986.-№6.-С. 364-365.
58. Иванов М.М. Некоторые вопросы борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота и специфичность туберкулиновых реакций. // Бруцеллез и туберкулез. Материалы международной конференции МЭБ. М. - Колос. - 1967. - С. 204214.
59. Иванов М.М. Туберкулин и аллергическая диагностика туберкулеза. // Труды ВГНКИ, МСХ СССР. 1959. - том №8. - С. 3-10.
60. Иванов М.М., Шаров А.Н. К вопросу дифференциации специфических и парааллергических реакций на туберкулин. // Материалы научно-производственной конференции ГНКИ. 1970. - С. 44-46.
61. Илибаев Х.М. Морфологическое проявление туберкулеза крупного рогатого скота в хозяйствах Центрального Казахстана. // Вест. с.-х. науки Казахстана. -1992. -№3.-С.118-121.
62. Ильиных Л.А. Ускоренный способ бактериологической диагностики туберкулеза. // Система мер борьбы с туберкулезом с.-х. животных. Новосибирск. -1991. - С.30-35.
63. Инструкция по применению набора реагентов для обнаружения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса M.tuberculosis, M.bovrs методом полимеразной цепной реакции (Политуб). // Утв. Минздравом РФ 14.11.97.
64. Исаков М.Т., Звягина С. Показатели крови телят при экспериментальном заражении микобактериями туберкулеза. // Тр. Уз. НИВИ. 1982. - т.32. -ч.1. -С. 36-39.
65. Кальченко М.М., Федорова В.М., Косолапое Е.А. Патологоанатомические изменения и их локализация при туберкулезе крупного рогатого скота. // Профилактика и лечение с.-х. животных и птицы. Межвузовский сб. науч. тр. -Одесса. 1988.-С. 14-17.
66. Карташова В.М., Полякова О.А. Индикация патогенных бактерий в молоке и молочных продуктах. // М. Колос. - 1973. - С. 48-52.
67. Кассич Ю.Я. Значение РСК при диагностике туберкулеза. // Ветеринария. -1982.-№5.-С. 24-27.
68. Кассич Ю.Я., Кочмарский В. А., Завгородний А.И. Эффективностькомплексного метода диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. // Проблемы научного обеспечения животноводства Молдавии. Кишинев. -1990.-С.11-12.
69. Кассич Ю.Я., Тихонов П.М. Совершенствование и сравнительное изучение методов обработки материала отобранного из объектов внешней среды для культуральной диагностики туберкулеза. // Ветеринария. 1984. - №59. - С. 16-18.
70. Кисел ев B.C. Туберкулез. // Инфекционные и инвазионные болезни крупного рогатого скота. М. - 1956. - С. 87-107.
71. Коваленко И.В. Иммунолюминесцентная индикация L-форм микобактерий. // В сб.: Санаторное лечение больных туберкулезом. Мн. - 1982. - С.131-134.
72. Коваленко И.В. JI-формы микобактерий туберкулеза : Клиническое значение и выявление. // Мн. Наука и техника. - 1989. - 104с.
73. Коваленко И.В. Современные методы микробиологической диагностики туберкулеза. // Тр. ЦНИИ туберкулеза МЗ СССР. -1981. т.31. - С. 98-103.
74. Коваленко С.А., Бавин В.Г., Яковлев А. Ф. Использование полимеразной цепной реакции в медико-биологической практике. // Бюлл. Всеросс. НИИ генетики и разведения с.-х. животных. 1994. - вып. 139. - С. 3-7.
75. Кокуричев П.И. Симультанная проба для диагностики туберкулеза. // Ветеринария. 1966. - №4. - С. 28-30.
76. Кокуричев П.И. Туберкулез сельскохозяйственных животных. // М. -Сельхозгиз. 1954. - 210 с.
77. Кокуричев П.И., Домнин Б.Г., Ведерников B.C. Результаты послеубойного исследования крупного рогатого скота, реагировавшего на туберкулин. // Болезни с.-х. животных и птиц, их профилактика и лечение. Л. - 1973. -вып.34. - С. 66-70.
78. Кокуричев П.И., Карабаинов М.А. О специфичности туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота, зараженного фасциолезом. // Сб. науч. тр. Ленинградского института усовершенствования ветер, врачей. 1957. -вып.И.-С. 81-85.
79. Кокуричев П.И., Сахаров С.Ф. Гнойные процессы и реакции на туберкулин у животных. // Сб. работ Ленинградского ветинститута, 1973. №34. - С. 62 -65.
80. Колокшанская Л.Б. Характеристика и дифференциация микобактерий, выделенных при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. // Ав-тореф. канд. ветер, наук. Витебский ВИИ. Витебск. - 1974. - 17с.
81. Кочмарский В.А. Роль послеубойных исследований крупного рогатого скота при определении благополучия хозяйств по туберкулезу. // Автореф. канд. ветер, наук. М. - 1983. - 19с.
82. Кривцова А.Е., Туркебаева К.А. Экспериментальный туберкулез у крупного и мелкого рогатого скота. // Ветеринария. 1980. - №1. - С. 29-30.
83. Кудрова М.Г., Мирлина Е.Д., Маничева О.А. ПЦР диагностика комплекса Mycobacterium tuberculosis: визуализация результата с помощью авидин-биотиновой системы. // Биотехнология. - 1996. - №2. - С. 48-55.
84. Кузин А.И. Латентная туберкулезная инфекция и ее значение в эпизоотологии туберкулеза крупного рогатого скота. // Автореф. докт. ветер, наук. М. -1977.
85. Кузин А.И. Материалы к изучению туберкулеза крупного рогатого скота в Вологодской области. // Автореф. канд. ветер, наук. М. - 1963. - 16 с.
86. Кузин А.И. Оздоровление животноводческих хозяйств от туберкулеза. // М. -Россельхозиздат. 1987. - 138с.
87. Кузин А.И. Туберкулез сельскохозяйственных животных и его профилактика. // М. Россагропромиздат. - 1992. - 190 с.
88. Лаанес С.Х., Тюри Э.И. Развитие экспериментального туберкулеза при заражении морских свинок в яичко. // Пробл. туберкулеза. 1961. - №5. -С. 94 -96.
89. Лакман Э.Д. Диагностическое значение РСК при туберкулезе крупного рогатого скота. // Проблемы ветеринарно-санитарного обеспечения животноводческих ферм и комплексов. Саратов. - 1983. - С. 13-17.
90. Лакман Э.Д. РСК при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. // Ветеринария. 1981. - №4. - С. 31-32.
91. Лакман Э.Д. Серологическая диагностика туберкулеза. // В кн.: Профилактика инфекционных болезней животных в промышленных комплексах. Омск. -1976.-С. 81-83.
92. Лакман Э.Д., Шлыгин И.В. РСК с антигеном Сибирского НИВИ в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. // Тр. Сибирского науч.-исслед. вет. ин. Омск. - 1975. - С. 58-61.
93. Латышев А. С. Дифференциация типоспецифических и псевдоаллергических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота с помощью внутривенной пробы. // Сб. Новосиб. НИВИ. 1968. - вып.З. - С. 185-187.
94. Латышев А.С. О природе сомнительных и неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота. // Научн. труды Новосибирской НИВС, 1971. 4 - С. 179-181.
95. Лебедева Л.В., Цырульников Г.В. Замораживание как методконсервирования патологического материала, направляемого для исследования на наличие БК. // Пробл. туберкулеза. 1969. - №6. - С. 63-65.
96. Луценко Т. А. О возможности использования реакции связывания комплемента для раннего выявления туберкулеза. // 5 ый Всесоюзный съезд врачей фтизиатров. - М. - 1950. - С. 28-32.
97. Луценко Т.А. Смешанные антигены для реакции связывания комплемента на туберкулез. // Ветеринария. 1961. - №12. - С. 57-60.
98. Ляпунова А.Д., Брнллнантова С.А., Пресман Г.П. Сравнительная характеристика микобактерий туберкулеза на двух плотных питательных средах. // Лаб. дело. 1984. - №7. - С. 442-443.
99. Ляпунова А.Д., Пашков Ю.Н., Пресман Г.П. Выбор метода для лучших условий роста микобактерий туберкулеза. // Лаб. дело. 1981. - №10. - С. 621622.
100. Макаров Ю., Васильченко Г., Сорокина А. Петрухин М. Сапрофиты. Туберкулез животных и возможные пути оздоровления поголовья. // Ветеринарная газета. №9-10. - 1999. - С.7.
101. Маккавейская А.Н. Значение фекалий в распространении туберкулеза крупного рогатого скота. // Сб. науч. тр. Ленинградского института усовершенствования ветеринарных врачей. Л. - 1953. - С. 8-9.
102. Маккавейская А.Н. К вопросу о выделении туберкулезного возбудителя с молозивом реагирующих на туберкулин коров. // Тр. Ленингр. НИВИ. Л. -1939.-№1.-С. 3-10.
103. Мальков И.Г. Дифференциация Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis от атипичных методами ДНК гибридизации и ПЦР. // Афтореф. канд. ветер, наук. М. - ВИЭВ. - 1993. - 21с.
104. Мальков И.Г. Дифференциация культур микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов с помощью ДНК-зонда. // Ветеринария. -1993.- №2. С. 52-54.
105. Мальков И.Г. Идентификация комплекса М. tuberculosis M.bovis с помощью полимеразной цепной реакции. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1993. - №4. - С. 404-406.
106. Мальков И.Г. Нетрадиционные методы анализа в ускоренной диагностике патогенных микобактерий. // Проблемы ветеринарной санитарии. М. - 1992.- вып.2. С. 3-17.
107. Мальков И.Г. Экспресс диагностика туберкулеза методами ДНК-зондов и полимеразной цепной реакции. // АгроНИИТЭИ ММН. - 1992. - №12. - С. 1518.
108. Мальков И.Г., Артюшин С.К., Фомин Б.А., Коромыслов Г.Ф. Разработка метода идентификации микобактерий бычьего и человеческого видов с использованием ПЦР. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1993. - №2. - С. 27-30.
109. Манукян З.К. К вопросу о неспецифической реакции у крупного рогатого скота, инвазированного фасциолезом. // Тр. Армянского НИВИ. 1955. - т.8. -С. 12-14.
110. Мартма О.В. Ускоренный метод культивирования туберкулезных микобактерий. // Ветеринария. 1958. - №3. - С. 74-76.
111. Мартма О.В., Тяхнас К.К. Туберкулез крупного рогатого скота и ликвидация его в Эстонской ССР. // Сб. науч. тр. Эст. НИИ животноводства и ветеринарии. 1982. - №53. - С. 38-45.
112. Маслов Е.В., Бойко А.А., Хорьков И.А. Оптимизация непрямого иммуноферментного анализа для выявления антител к М. bovis. // Ветеринария. 1986. - № 10. - С. 64-68.
113. Матаев Б.Г., Джумаев М.Д., Иванова Ю.Ф., Абдулаев У.А. Патологоанатомический контроль убойных животных на туберкулез. // Биологические основы повышения продуктивности и охраны здоровья животных. Сб. науч. трудов Тадж. СХИ. Душанбе. - 1988. - С. 21-23.
114. Методические рекомендации по уточнению диагноза на туберкулез у крупного рогатого скота благополучных хозяйств и определению видовой принадлежности культур микобактерий. //Харьков. 1987.
115. Методические указания по диагностике туберкулеза животных. // Утверждены ГУБ Мин. сельского хозяйства СССР 11.02.76.
116. Методы лабораторной диагностики туберкулеза. // ГОСТ 26072 84 (СТ СЭВ 3457 - 81) " Животные и птица сельскохозяйственные".
117. Мирлина Е.Д, Маничева О.А., Вишневский Б.И. и др. Диагностика комплекса Mycobacterium tuberculosis методом ПЦР. // Биотехнология. 1994. -№11-12.-С. 31-34.
118. Молев А.И., Никаноров Б.А., Полумисков А.Н. Неспецифические реакции на туберкулин у крупного рогатого скота, пораженного актиномикозом и эхинококкозом. // Тр. Кировского и Пермского с.-х. институтов. 1971. - С. 80-87.
119. Мюллис К.Б. Необычайная история о том, как родилась полимеразная цепная реакция. // В мире науки. 1990. - № 6.
120. Найманов А.Х. Туберкулинизация крупного рогатого скота. //
121. Ветеринария. 1980. - № 6. - С. 39-40.
122. Найманов А.Х. Аллергическая диагностика микобактериальных инфекций крупного рогатого скота. // Афтореф. дисс. докт. вет. наук. ВИЭВ.- М. 1993. -29с.
123. Найманов А.Х., Нуратинов Р.А., Дубовой И.С. Применение диагностических тестов в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах. // Ветеринария. 1990. - №1. - С. 31-33.
124. Найманов А.Х., Косенко В.И., Дубовой И.С. Применение «booster effect» при диагностике туберкулеза для довыявления больных туберкулезом животных. // Тр. ВИЭВ. 1991. - Т.69. - С. 136-144.
125. Найманов А.Х., Косенко В.И., Якушева О.В. Туберкулез крупного рогатого скота при естественном и искусственном заражении. // Тр. ВИЭВ. -1991.-Т.69.-С. 144-150.
126. Найманов А.Х. Проблемы диагностики и профилактики туберкулеза крупного рогатого скота в современных условиях. // Ветеринарная патология. 2004. - №1-2 (9). - С. 18-23.
127. Налетов Н.А. Восстановительные изменения при туберкулезе легких крупного рогатого скота. // Автореф. докт. ветер, наук. MB А. 1949. - 16 с.
128. Налетов Н.А. К вопросу о локализации туберкулезных очагов в зависимости от ворот инфекции. // Архив патологии. 1948. - №5. - С. 57-63.
129. Налетов Н.А. Первичный комплекс изменений при туберкулезе телят. // Сб. работ молодых ученых в области ветеринарии ВАСХНИЛ. 1940. - С. 124 -128.
130. Налетов Н.А. Развитие патоморфологических изменений при туберкулезе крупного рогатого скота. // Тр. первой межреспубликанской конф. по вопросам ликвидации туберкулеза и бруцеллеза в животноводстве. Мн. -1959. - С. 42-46.
131. Наставление по диагностике туберкулеза животных. // Утв. Департаментом ветеринарии 18.11.2002 г.
132. Нейков П. Патоморфологические исследования при туберкулезе у телят, выращиваемых на промышленной основе. // Ветер, сб. 1994. - София. -т. 102. - бр. 6/7. - С. 18-20.
133. Нестеренко Л.Н., Аксенов М.Ю., Гришина Т.Д. и др. Тест системы на основе ПЦР для идентификации возбудителя туберкулеза. // Проблемы туберкулеза. - 1994 - №2. - С. 29-32.
134. Новак Д. Д. Атипичные туберкулиновые реакции у крупного рогатогоскота и их дифференциация. // Проблемы борьбы с туберкулезом и паратуберкулезом с.-х. животных. Воронеж. - 1965. - С. 91-100.
135. Новак Д. Д. Туберкулез крупного рогатого скота. // Алма Ата. - Кайнар. -1984.- 158с.
136. Новак Д.Д. Туберкулез сельскохозяйственных животных. // Алма Ата. -1977.- 144 с.
137. Новак Д.Д. О диагностике туберкулеза и дифференциации туберкулиновых реакций. // Ветеринария, 1973. № 4. - С. 48-49.
138. Нуратинов Р.А. Внутривенная туберкулиновая проба в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. // Современные проблемы профилактики зоонозных болезней и пути их решения. Гродно. - 1987. - С. 89.
139. Нуратинов Р.А. Выявление больных туберкулезом животных, анергичных к туберкулину. // Сб. научных трудов Северокавказского и Прикаспийского НИВИ. Новочеркасск. - 1987. - С. 18-26.
140. Обухов И.Л., Груздев К.Н. Лабораторная диагностика инфекционных болезней методом ДНК-амплификации при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). // Сб. науч. трудов ВГНКИ. 1995 (1996). - т.57. - С. 36-45.
141. Обухов И.Л., Груздев К.Н., Панин А.Н. Использование полимеразной цепной реакции в практических ветеринарных лабораториях. // Ветеринария. -1997.-№2.-С. 24-27.
142. Объедков Г.А., Сюсюкин В.А., Карпова Г.А. Механизм иммунного ответа при экспериментальном туберкулезе животных. // Ветеринария. 1983. -№12. - С. 24-25.
143. Овдиенко Н.П. Эпизоотология и диагностика туберкулеза крупного рогатого скота в условиях интенсификации животноводства. // Дисс. докт. ветер, наук. М. - 1990. - С. 440.
144. Овдиенко Н.П., Козин И.А. Применение РНГА для дифференциальной диагностики неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота. // Тр. ВИЭВ. 1979. - т. 43. - С. 102-107.
145. Овдиенко Н.П., Найманов А.Х. Изучение динамики аллергических реакций на внутрикожное введение туберкулина для млекопитающих. // Бюлл. ВИЭВ. 1983. -т.51. - С. 42-46.
146. Овдиенко Н.П., Кадочкин A.M., Найманов А.Х., Иванова Н.А., Козин А.Н., Ткачев-Кузьмин А.В., Косенко В.И., Якушева О.В. Выделение микобактерий и чувствительность крупного рогатого скота к туберкулину. // Ветеринария. -1988.-№9.-С. 26-28.
147. Овдиенко Н.П., Найманов А.Х. Ранняя диагностика туберкулеза. // Животноводство. 1994. - №2-3. - С. 25-26.
148. Овдиенко Н., Якушева О., Суворов В. Туберкулез животных и возможные пути оздоровления поголовья. Ставим диагноз. Дифференциальная патоморфологическая диагностика. // Ветеринарная газета. 1999. - №7-8. -С.5.
149. Одаренко К.И. Обнаружение туберкулеза у убойных животных Семипалатинского мясокомбината. // Тр. Казахского НИВИ. Алма-Ата. -1961. - т.10. - С. 232-237.
150. Панин А.Н., Обухов И.Л., Шипулин Г.А., Груздев К.Н. Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод ПЦР. // Ветеринария. 1997. - №7. - С. 19-21.
151. Поддубский И.В. Методы борьбы с туберкулезом крупного рогатого скотав СССР. // Вестник с-х. науки. 1957. - № 5. - С. 67-73.
152. Поддубский И.В. Современное состояние ветеринарной науки и практики по борьбе с туберкулезом крупного рогатого скота и птицы. // Проблемы борьбы с туберкулезом и паратуберкулезом с.-х. животных. Воронеж. -1965. - С. 14-29.
153. Попов С.А. Дифференциация культур микобактерий туберкулеза методами газовожидкостной хроматографии. // Автореф. дисс. канд. ветер, наук. М. -1991.-25с.
154. Приймак А.А., Владимирский М.А., Шипина Л.К. и др. ПЦР быстрый и высокочувствительный метод определения возбудителя туберкулеза в биологических материалах. IIРМЖ. Пульмонология. - 1995. - №3. - С. 61-64.
155. Протасов А.И. Аллергические реакции при туберкулезе крупного рогатого скота в зависимости от состояния организма и активности процесса. П Автореф. дис. докт. ветер, наук. ЛВИ. Л. - 1960. - 35с.
156. Протасов А.И. О комплексном исследовании туберкулином крупного рогатого скота. // Ветеринария. 1956. - № 11. - С. 32-35.
157. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных. Сборник санитарных и ветеринарных правил. // М. -Информационно-издательский центр Госкомсанэпидемнадзора России. -1996.-С. 160-169.
158. Пунга В.В. Выявление туберкулеза в современных условиях. // Русский медицинский журнал. Пульмонология. 1998. - т.6. - №17. - С. 1130-1131.
159. Розанцев К.Э. Цепная полимеразная реакция in vitro новый подход в диагностике. // Бюл. ВИЭВ. -1991. - вып.75-76. - С. 47-50.
160. Ротов В.И., Кокуричев П.И, Савченко П.Е. Туберкулезсельскохозяйственных животных. // Киев. Урожай. - 1973. - 381с.
161. Ротов В.И, Кокуричев П.И., Савченко П.Е., Трач Ю.А. Туберкулез сельскохозяйственных животных. // Киев. Урожай. - 1978. - 237с.
162. Румачик И.И. Методические основы лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. // Ветеринария. 1987. - № 12. - С. 6264.
163. Румачик И.И., Солонеко А.А. Особенности аллергических исследований на туберкулез. // Ветеринария. 1984. - № 9. - С. 30-31.
164. Сафин М.А. Совершенствование диагностики, профилактики и мер ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота. // Дис. докт. ветер, наук. -Казань. 1980. - 363с.
165. Сафин М.А., Галкина Е.Б. Влияние гормональных препаратов на течениеэкспериментального туберкулеза. // Матер, науч. конф. КГВИ. 1971. - С. 251-252.
166. Сафин М.А., Идрисов Г.З. Современные методы диагностики и меры борьбы с туберкулезом животных. // Казань. Таткнигоиздат. - 1992. - 168с.
167. Сахно В.М. К вопросу дифференциальной диагностики туберкулеза. // Ставрополь. 1991. - С. 42-43.
168. Созинов В.А., Федоряко В.П., Нечваль И.Т. и др. Роль атипичных микобактерий в эпизоотическом процессе // Ветеринария, 1996. № 2. - С. 1719.
169. Столповский Ю.А., Удина И.Г. Гены древних "заговорили". // Природа. -1994.-№5.-С. 44-50.
170. Струков А.И., Соловьева И.П. Морфология туберкулеза в современных условиях. // М. Медицина. - 1976. - 256 с.
171. Субботина С.Г. Совершенствование некоторых приемов бактериологической диагностики туберкулеза. // Научные аспекты формирования интеллектуальной собственности специалистов АПК России. -Воронеж. 1993. - С. 97-98.
172. Субботина С.Г. Совершенствование экспрессной бактериологической диагностики туберкулеза. // Воронеж. 1993. - 13 с.
173. Суханов И.П. Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции. // Автореф. дисс. канд. биол. наук. ВГНКИ. М. - 1999. - 19 с.
174. Сысоев В.А. Диагностическая ценность внутрикожной аллергической пробы. // Диагностика болезней животных и профилактика их на фермах и комплексах. 1984. - С. 62-65.
175. Тажгалиев Н.М. Предварительная обработка патологического материала при диагностике туберкулеза сельскохозяйственных животных. // Бюл. ВИЭВ. 1983. - вып.51. - С. 37-38.
176. Тихомирова M.JI., Лазовская А.Л., Леви Д.Т. Проблемы диагностики бычьего туберкулеза у крупного рогатого скота. // Актуальные проблемы фтизиопульмонологии. Нижний Новгород. - 1991. - С. 94-101.
177. Ткаченко А.Ф. Сравнительные морфологические изменения начальных форм туберкулеза. // Тр. Одесского СХИ. Одесса. - 1951. - т.6. - ч.2. - С. 9399.
178. Туберкулез. // Санитарные правила СП 3.1.093 96. - Ветеринарные правила, ВП 13.3.1325 - 96.
179. Туберкулез животных и меры борьбы с ним. // Под ред. Кассича Ю.Я. -Киев. Урожай. - 1990. - 304с.
180. Туберкулез сельскохозяйственных животных. // Под ред. Шишкова В.П., Урбана В.П. М. - Агропромиздат. -1991. - 255с.
181. Тузова Р.В. Туберкулез крупного рогатого скота, методы его диагностики и профилактики. // Минск. Ураджай. - 1978. - 96с.
182. Тузова Р.В. Туберкулез сельскохозяйственных животных и птицы. // Минск. Ураджай. - 1983. - 263с.
183. Тузова Р.В., Образцова М.Н. Патологоанатомические изменения у крупного рогатого скота туберкулезных изоляторов. // Материалы научно-производственной конф. БелНИВИ. 1964. - С. 14-16.
184. Урбан В.П., Широбокова М.М., Данко Ю.Ю. и др. Аллергическая диагностика туберкулеза. // В кн.: Профилактика и ликвидация заразных болезней с.-х. животных. Сб. науч. тр. ЛВИ. Л. - 1985. - С. 80-85.
185. Урбан В.П., Широбокова М.М., Калитин Н.М., Зубков А.П. О специфичности туберкулиновой пробы при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. // Матер, науч. конф. Л. -1971. - вып.5. - С. 28-29.
186. Ушаков В. Т., Дмитриев А.П., Паутов Ю.П. Патологоанатомические и гистологические изменения у коров реагирующих на туберкулин. // Совершенствование мер борьбы с туберкулезом сельскохозяйственных животных. Алма - Ата. - 1988. - С. 132-136.
187. Фаизов Т.Х., Алимова A.M. Значение полимеразной цепной реакции в инфекционной патологии. // Тез. докл. науч. конф. по проблемам ветеринарии и животноводства. Казань. - 1995. - С. 4-5.
188. Фаизов Т.Х., Шилова В.И. Разработка экспресс методов выделения ДНК из микобактерий туберкулеза. // Тез. докл. респ. науч. конф. "Достижения Казанской ветеринарной школы - в практику животноводства". - Казань. -1991.-С. 31-32.
189. Федюшин В.П., Утешев А.И. О неспецифических туберкулиновых реакциях у крупного рогатого скота, инвазированного фасциолезом. // Ветеринария. 1952. - № 6. - С. 19-21.
190. Финкель Е.А., Михайлова Л.В. Биологический метод исследований при туберкулезе. // Фрунзе. Кыргызстан. - 1976. - 556с.
191. Хазипов Н.З., Сафин М.А., Идрисов Г.З. Туберкулез крупного рогатого скота. // М. Агропромиздат. - 1985. - 128с.
192. Ходун Л.М. Выделение атипичных микобактерий от не реагирующих на туберкулин животных. // Ветеринария . 1990. - № 6. - С. 29-30.
193. Ходун Л.М. Выделение атипичных микобактерий от животных благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйств. // Разработка средств и методов борьбы с туберкулезом животных. Новосибирск. - 1990. -С. 124-132.
194. Ходун JI.M. Проблема серологической диагностики туберкулеза. // Профилактика и диагностика болезней животных. Новосибирск. - 1983. - С. 119-127.
195. Ходун Л.М. Современные проблемы научных исследований диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. // Методы диагностики и профилактики бруцеллеза и туберкулеза животных. Омск. - 1988. - С. 89- 94.
196. Ходун Л.М., Цунская Н.И. Метод иммуноферментного анализа для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. // Туберкулез сельскохозяйственных животных. Омск. - 1989. - С. 31-34.
197. Хоменко А.Г. Вопросы борьбы с туберкулезом людей и животных. // Ташкент. Медицина. - 1990. - 208с.
198. Цыбанов С.Ж., Вишняков И.Ф. Перспективы использования методов анализа генома для диагностики вирусных и бактериальных болезней животных. // Информ. бюл. УкрААНИЭКМ. 1994. - С. 69-70.
199. Черноградский И.Г., Захаров В.Г. Безглицериновые среды дляисследований при туберкулезе. // Ветеринария. 1973. - № 4. - С. 113-114.
200. Чуканов В.И. Основные принципы лечения больных туберкулезом. // Русский медицинский журнал. Пульмонология. 1998. - № 17. - т.6. - С. 1140-1141.
201. Шаров А.Н. Вопросы диагностики туберкулеза. // Ветеринария. 1985. -№4.-С. 7-10.
202. Шаров А.Н. К вопросу диагностики туберкулеза. // Ветеринария. 1982. -№9.-С. 16-17.
203. Шаров А.Н. Парааллергические реакции на туберкулин у крупного рогатого скота. // Тр. ГНКИ. 1969. - вып. 16. - С. 159-166.
204. Шаров А.Н., Лукава М.А. Применение микобактериальных антигенов для реакции агглютинации. // Сб. науч. тр. ВГНКИ. 1991 (1992). - т.53. - С. 87-95.
205. Шаров А.Н., Лукава М.А., Лакман Э.Д. Испытание аллергенов для реакции агглютинации при диагностике туберкулеза у крупного рогатого скота. // Ветеринария. 1996. -№1. - С. 15-17.
206. Шаров А.Н., Седов В.А. Тест системы ПЦР при туберкулезе. // Ветеринария. - 1998. - № 3. - С. 20-22.
207. Шаров А.Н., Ерошенко Л.А., Суханов И.П., Кальнов С.Л., Гребенникова
208. Т.В., Грабовецкий В.В. ПЦР при диагностике туберкулеза. // Ветеринария. -2000.-№10.
209. Шаров А.Н. Проблемы ПЦР-диагностики туберкулеза. // Ветеринарный консультант. 2003. - № 21-22. - С. 14-15.
210. Шебанов Ф.В. Туберкулез. // М. Медицина. - 1976. - 464с.
211. Шевцев М.В. Изучение неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота. // Тез. докл. 2-ой Республиканской научно-производ. конфер. молодых ученых. Харьков. - 1986. - С. 144-146.
212. Штуйкис В.В., Куприте О.А. Патологоанатомическая диагностикатуберкулеза крупного рогатого скота. // Ветеринария. 1959. - т.45. - №9. - С. 33-34.
213. Щуревский В.Е. Туберкулез крупного рогатого скота и его взаимосвязь с туберкулезом человека. // В кн.: Вопросы взаимосвязи туберкулеза человека и животных. Алма - Ата. - 1981. - С. 8-13.
214. Щуревский В.Е., Овдиенко Н.П., Найманов А.Х., Якушева О.В. Аллергическая диагностика туберкулеза крупного рогатого скота. // Сб. науч. трудов. Пути ликв. инф. инваз. болезней с.-х. животных. Новосибирск. -1985.-С. 12-13.
215. Щуревский В.Е., Якушева О.В., Овдиенко Н.П. Патологоанатомическая диагностика туберкулеза. // Ветеринария. 1980. - №10. - С. 31-33.
216. Юдин Г.А. Значение парааллергии в диагностике туберкулеза животных. // Ветеринария. 1972. - №9. - С. 96-98.
217. Юдин Г. А. Парааллергические туберкулиновые реакции при диагностике туберкулеза животных. // Тр. ВИЭВ. М. - 1967 - т.ЗЗ - С. 292-297.
218. Юдин Г.А. Причины, распространение, дифференциация и профилактика неспецифических реакций на туберкулин. // Ветеринария. 1987. - № 12. -С.29-32.
219. Юсковец М.К. Туберкулез сельскохозяйственных животных и птиц. // Минск. 1965. - 449 с.
220. Ярных B.C., Арсеньев Д. Д. Проблемы ветеринарной науки в условиях промышленного животноводства. // Вестник с.-х. наук. 1973. - № 4. - С. 6275.
221. Ященко Т.Н., Мечева И.С. Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе. // М. Медицина. - 1973. - 260 с.
222. Almassy К., Takats G. Agardiffusions precepitacos vizgalatok gumokoros allotok versavjaval. // Magyar Allator wosok lapja. - 1961. - vol.16. - №10. -P. 345 - 346.
223. Auer L. Assessment of an ELISA for the detection of cattle infected with Mycobacterium bovis. // Auster. Yet. J. 1987. - v.64. - №6. - P. 172-176.
224. Ballagi-Pordany A. Application of polymerase-chain reaction (PCR) in veterinary virology. Thesis, Swed. Univ. of agr. sciences. Uppsala. - 1995. - 133p.
225. Bang J. Ueber die Vererbung der Tuberkuloseanfalligkeit beim Rinde. // Annales de Institut Pasteur. -1931. vol. 116. - P. 252-253.
226. Barry Т., Glennon M., Smith Т., Gannon F. Detection of Mycobacterium bovis in bovine blood by combined PCR and DNA probe methods. // Veterinary Record.-1993. v.132. - P.66-67.
227. Bashiruddin J., Nicholas R., Santini F., Ready R. Use of polymerase chainreaction to detect mycoplasma DNA in cattle with contagious bovine pleuropneumonia. // Veter. Rec. 1994. - v. 134.- № 10. - P. 240-241.
228. Beck G., Bibrack B. Pathologiach anatomische, histologische und kulturelle diagnostilo der Mycobacterien unter besonderer Berucksichtrigung der fleischeschaulichen Vorschriften. // Tierarzti. Umsch. - 1971. - v. 26. - № 5. - P. 196-201.
229. Blancou J. Comparison de techniques de diagnostic de la tuberculose bovine. // Rev. Elev. Met. 1972. - v.25. - № 1. - P. 29-35.
230. Blancou J. Recherche du bacille de Koch dans le sang et les muscles da bovins tuberculoux. // Elevage Med. Veter. 1976. - v. 29. - № 1. - P. 11-15.
231. Bochdalek R. Bodania nad Zachowaniem sic odczynu tuberculinowego odczynu hemaglutynala gruzlic zego. // Med. Wet. 1972. - vol. 28. - P. 279- 281.
232. Boddinghaus В., Rogall T. Detection and identification of mycobacteria by amplification ofrRNA.//J. Clin. Microbiol. 1990. - v. 28.-P. 1751-1759.
233. Bonme K. Noch immer das "Problem" der Tuberkulose-Schutzimpfung. Tuberk.- 1927.-№48.-P. 383 -384.
234. Boom R., Sol C., Salimans M., Jansen C., Wertheim-van Dillen P. Rapid and simple methods for purification of nucleic acids. // J. Clin. Microbiol. 1990. - v. 28.-P. 495-503.
235. Bose M., Chander A., Das R. A rapid and gentle method for the isolation of genomic DNA from mycobacteria. // Nucleic Acids Research. 1993. - v. 21. -№10. - P. 264-272.
236. Brisson-Noel A. Rapid diagnostics of tuberculosis by amplification of mycobacterial DNA in clinical samples. // Lancet. 1989. - y. 4. - № 2. - P. 10691071.
237. Brisson-Noel A., Aznar C., Chureau C., Nguyen S., Pierre C., Bartoli M., Bonete R., Pialoux G., Gilquel В., Garrigue G. Diagnosis of tuberculosis by DNA amplification in clinical practice evaluation. // Lancet. 1991. - v. 338. - P. 364366.
238. Brisson-Noel A., Gilquel В., Lecossier D., Levy-Frebault V., Hance A. Rapid diagnosis of tuberculosis by amplification of mycobacterial DNA in clinical samples. // Lancet. 1989. - v. 2. - № 8671. - P. 1069-1071.
239. Buck G., O'Hara L., Summersgill J. Rapid simple method for treading clinical specimens containing Mycobacterium tuberculosis to remove DNA for polymerase chain reaction. // J. Clin. Mlicrobiol. v.30. - P. 1331-1334.
240. Buddie В., Aldwell F., Preffer A., De Lisle G., Corner L. Experimental Mycobacterium bovis infection of cattle : Effect of dose of M. bovis and pregnancy on immune responses and distribution of lesions. // N. Z. veter. J.-1994.- v.42. -№5.-P. 167-172.
241. Calmette A., Potter A. Sur le titrage des tuberculines. // Annales de Institut Pasteur. - 1926. - P. 5-10.
242. Chou Q. Russell M., Birch D., Raymold J., Block W. Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improues low-copy-number amplifications. // Nucleic. Acids Res. v.20. - P. 1717-1723.
243. Clarridge J., Shawar R., Shinnick Т., Plikaytis B. Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. // J. Clin. Microbiol. 1993. - v.31 - P. 2049-2056.
244. Coates A., Nicolai H., Pallen M. et al. The 45 kilodalton molecul of Mycobacterium tuberculosis identified by immunobloting and monoclonal antibodies as antigenic in patietits with tuberculosis. // J. Exp. Pathol. 1989. - v.70 (2)-P. 215-225.
245. Collins D., De Lisle G., Collins J., Costello E. DNA restriction fragment typing of Mycobacterium bovis isolates from cattle and badgers in Ireland. // Veterinary Record. 1994. - v.134. - № 26. - P. 681-682.
246. Collins D., Hilbink F., West D. Investigation of Mycobacterium paratuberculosis in sheep by fecal culture, DNA characterisation and the polymerase chain reaction. // Veter. Microbiol. 1995. - v.45. - №4. - P. 311-318.
247. Collins D., Stephens D., De Lisle G. Comparison of polymerase chain reaction tests and fecal culture for detecting Mycobacterium paratuberculosis in bovine faeces. // Veter. Microbiol. 1993. - v.36. - № 3,4. - P.289-299.
248. Cousins D., Williams S., Ross В., Ellis T. Use of a repetitive element isolated from M. tuberculosis in hybridization studies with M. bovis. // Veter. Microbiol -1993. v.37. - № 1,2. - P. 1-17.
249. Cousins D., Wilson S., Francis В., Gow B. Use of polymerase chain reaction for rapid diagnosis of tuberculosis. // J. Clin. Microbiol. 1991. - v.30. - P. 255-257.
250. Crawford A. Tuberculin reactions in cattle showing no visible lesions on postmortem. // JAVMA. 1936. - v.8. - P. 562.
251. Crews К. Post-mortem findings in bovine tuberculosis reactors. // Surveillance. -1991. v.18. - № 1. - P. 14-15.
252. De Wit D., Steyn L., Shoemaber S., Sogin M. Direct detection of
253. Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens by DNA amplification. // J. Clin. Microbiol. 1990. - v.28. - P.2437-2441.
254. De Wit D., Weotton M., Allan В., Steyn L. Simple method for production of internal control DNA for Mycobacterium tuberculosis polymerase chain reaction assays. // J. Clin. Microbiol. 1993. - v.31. - P.2204-2207.
255. Diernhofer K. Versuche uber die praktische verwendbarkeit der simultanprobe mit verschiedenen tuberkulinen in der bekampfung der rinder tuberkulose. // Winer tierarzti. 1963. - vol. 50. - №1. - P. 18-37.
256. Dorobantu R. Demers pentru о intelegere corecta a combaterii tuberculozei bovine. // Med. Veter. Cresterea anim. 1994. - №1. - P. 16-17.
257. Dziadek J., Jowska R.A., Jaworski A. Poznawcze i aplikacyjne badaniagenetyczne szczepow Mycobacterium w swietly najnowszych osiagniec biologi i molecularnej. // Postepy Mikrobiol. 1992. - v.31. - P. 159-162.
258. Eisenach K., Cave M., Bates J., Crawford J. Polymerase chain reaction amplification a repetitive DNA sequence specific for Mycobacterium tuberculosis. //J. Infect. Dis. 1990. - v.161. - P. 977-981.
259. Eisenach K., Crawford J., Bates J. Genetic relatednes among strains of the Mycobacterium tuberculosis complex. // Am. Rev. Respir. Dis. 1986. - v. 133. - P. 1065-1068.
260. Eisenach K., Sifford M., Cave M., Bates J., Crawford J. Detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum samples using a polymerase chain reaction. //Am. Rev. Respir. Dis. 1991. - v. 144. - P. 1160-1163.
261. Fetcu A., Muresan G., Fagora V. Obsevatii privind incidenta unor reactii paraallergice si pseudoalergice, constatate au ocazia interpretarii tuberculinarilor prin T.C.G. // Med. Wet. 1969. - v.25. - №2. - P. 89-99.
262. Fifis Т., Plackett P., Corner A., Wood P. Purification of a major M. bovis antigen for the diagnosis of bovin tuberculosis. // J. immunology. 1989. - v.29. - P. 91-101.
263. Flis J., Lubkowski J. Korelacja miedzy dodathin odczynem tuberculinowym a wynikami badan poubozowych bydla tuberculinododatni ego na tezebie wojewodztwa olsztynkiego. //Med. Wet. 1969. - v.25. - №2. - P. 78-89.
264. Fodor T. Interaction of tubercle bacilli with different biological characteristics in animals. // Tuberkulozis. 1960. - v. 13. - P. 294 - 295.
265. Fodor Т., Kis. A. A microscopes vizsgalat szerepe a mycobacteriological laboratorium minosegi munkujanal ellenorzeselen. // Pneumol. Hang. 1985. -V.38.-P. 133-137.
266. Folgueria L., Delgado R., Palenque E., Noriega A. Detection of Mycobacterium tuberculosis DNA in clinical samples by using a simple lysis method and polymerase chain reaction. // J. Clin. Microbiol. 1993. - v.31. - P. 1019-1021.
267. Forbes В., Hicks K. Direct detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens in a clinical laboratory by polymerase chain reaction. // J. Cln. Microbiol. 1993. - v.31. - P. 1688-1694.
268. Frawcis S., Seiler R., Wilkie I. The sensitivity and specificity of various tuberculin testing bovine PPD and other tuberculins. // Veter. Rec. 1978. - v.103.-№19. - P. 420-425.
269. Fries J., Patel R., Piessens W., Wirth D. Genus and species - specific DNA probes to identify mycobacterial using polymerase chain reaction. // Molecular and cell. Probes. - 1990. - №4. - P. 87-105.
270. Glennon M., Jager В., Dowdall D„ Maher M. PCR-based fingerprinting of Mycobacterium bovis isolates. // Veter. Microbiol. 1997. - v.54. - №3/4. - P.235-245.
271. Guha A., Sarkar P. Study of tuberculosis among cattle in Calcoutta. // Ind. Vet. J. 1970. - v.47. - №3. - P. 196-200.
272. Hance A., Grandchamp В., Levy-Frebault V., et al. Detection and identification of mycobacteria by amplification of mycobacterial DNA. // Molec. Microbiol. -1989. №3. - P.843-849.
273. Hawkey P. The role of polymerase chain reaction in diagnosis of mycobacterial infections. // Rev. Med. Microbiol. №5. - P. 21-32.
274. Hejlicer K., Benes M., Soukur M. Zdroje a priciny vzniku novych bovinnich tuberkuloz v okrese po eliminaci bovinni tuberkulozu. // Vet. Med. 1970. -v.15. -№6/7. - P. 361 - 367.
275. Hermans P., Schuitema A., D. Van Solingen, et al. Specific detection of Mycobacterium tuberculosis complex strains by polymerase chain reaction. // J. Cln. Microbiol. 1990. - v.28. - №6. - P. 1204-1213.
276. Himes E. Histologic examination of bovine tissue suspected of being tuberculous. // Mem. I simp. Intern. Lab. Diag., Guanajuato. Mexico. - 1977. -v.l. - P. 1-8.
277. Hratwigk H., El-Ahwal A. Untersuchungen uber die Bedeutung der Fasciolose als Ursache positiver. Tuberculin-reaktionen beim Rind. // Berl. Munch. Tierarztl. Wsch. 1968. - v.81. - №16. - P. 315-316.
278. Jivanesku I., Cioloca Т., Coman M. Contributia diagnosticului histologic la asanerea tuberculozei taurinelor in fermele Trustului I.L.S. // Timis Luerari Sti. Ser. Med. Vet. 1978. - v.15. - P. 135-137.
279. Jivanesku I., Cioloca Т., Paul W. Asanarea tuberculosei la taurinele din termole trustului I.A.S. Timis cu contributia diagnosticulai histopatologic. // Lucr. Sti. Ser. Med. Vet. (Inst. Agron.Timisosrs). 1977. - v.14. - P. 151-153.
280. Johnson H., Ranney A. Tuberculosis and its eradication. // Anim. Dis. 1956. -P.213-221.
281. Klobouk A., Pavlas M. Dulezite problemy diagnostiky tuberkulosy pri plneni celostatniho ubolu v tlumeni tuberculosy u domacich svirat. // Veterinarstvi. -1957. v.l. - №7. - P. 2-7.
282. Kostrzenski W., Paclerska Pobratyn H., Surmiak B. Mikrobiologiczne badania specymenow tkankowych bydla tuberkulino - dodatniego podanego ubojowi diagnostycznemu na terenie wojewodztwa Opolskiego. // Pneumon. Pol. - 1978. -v.46. - №9. - P. 655 - 662.
283. Kuzmak J., Grundboeck J. Polymerase chain reaction (PCR)-nowa metoda w biologii molekularnej. I I Med. Weter. 1993. - v.49. - №4. - P. 151-154.
284. Lepper A. Serological responses in experimental bovine tuberculosis. // Nat. Inst.Anim. Health. Q. 1977. - v. 17. - P. 10-15.
285. Lesslie J., Nancy C. Practical application of bovine tuberculin PPD in testing cattle in Great Britain. // Vet. Record. 1976. - v.98. - №9. - P. 170 - 172.
286. Lipkin E., Shalom A., Knatib H., Soller M. Milk as a source of deoxyribonucleic acid and as a substrate for the polymerase chain reaction. // J. Daiey. Sc. 1993. - v.76. - №7. - P. 2025-2032.
287. Little Т., Naylor P., Wilesmith J. Laboratory study of Mycobacterium bovis infection in badgers and calves. // Veter. Rec. 1982. - v. 111. - №24. - P. 550-557.
288. Lucos A. Problemes actuels dans la prophylaxie de la tuberculose bovine. // Bull. Acad. Veter. Fr. 1972. - v.45. - №6. - P. 255-292.
289. Madic J. Lancana reakci ja polimeraze i mogucnosti njezine primjene u dijagnosticiranju zaraznih bolesti. // Praxis veter. 1993. - v.41. - №2/3. - P. 155160.
290. Magdalena, Juana, Vachee, Anne, Supply, Philip, Locht, Camille. Identification of a New DNA Region Specific for Members of Mycobacterium tuberculosis Complex. // J. Clin. Microbiol. 1998. - v.36 - P. 937-943.
291. Manjunath N., Shankar P., Rajan L., Bhargava A., Saluja S., Shriniwas D.
292. Evaluation of a polymerase chain reaction for the diagnosis of tuberculosis. // Tubercle. -1991. v.72. - P.21-27.
293. Manual of recomendet diagnostic techniques and requirements for biological product for lists A and В diseases. // France. 1989. - P. 196-215.
294. Markovic P., Nicolic В., Liesevic Z. Prilog proucavanju nespecificnih tuberculinskin reakcija u goveda primenom razredenog tuberculina. // Veterin. Glasmik. 1967. - v.21. - №1. - P. 25-28.
295. Marmur J. A procedure for isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. //J. Mol. Biol. 1961. - v.3. - P. 208-218.
296. Meyer-Lie W. Investigation of air and dust as venictes for tuberculosis bacteria in sanatorium wards and offices. // Acta tuberculosum Scand. 1953. -v.28. - P.3-4.
297. Middlebrook G. A hemolytic modification of the hemaglutination test for antiboides against tubercle bacillus autigens. // J. Of Clinical Investigation. 1950. -v.29.- №11. -P. 1480-1485.
298. Mlyazaki Y., Koga H., Kohno S., Kaku M. Nested polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples. // J. Clin. Microbiol. 1993. - v.31. - P.2228-2232.
299. Monaghan M., Kazda J., McCill K., Quinn P., Cook B. Sensitisation of cattle to bovine and avian tuberculins with Mycobacterium cookii. // Vet. Rec. 1991. -v.29. - P. 33-35.
300. Nanna J., Neill S. Use of PPD and phosphatide antigens in an ELISA to detect the serological response in experimental bovin tuberculosis. // Research in Veterinary Science. 1989. - v.47. - P. 43-47.
301. Neill S., Cassidy J., Hanna J., et al. Detection of Mycobacterium bovis infection in skin test negative cattle with an assay for bovine interferon-gamma. // Veterinary Record. 1994. - v.135. - №6. - P. 134-136.
302. Niemann S., Harmsen D., Rusch-Gerdes S., Richter E. Differentiation of Clinical Mycobacntrium tuberculosis Complex Isolates by gyr В Seguence Polymorphism Analysis. //J. Clin. Microbiol. 2000. - v.38. - P. 3231-3234.
303. Noordhoek G., Kolk A., Bjine G., et al. Sensitivity and specificity of PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis: a blind comparison study among seven laboratories. // J. Clin. Microbiol. 1994. - v.32. - P. 277-284.
304. Osten N., Schutz W. Nachweiverfahren fur Mykobakterien aus Untersuchugsmaterial. Kultur und Tierversuch. // Med. Lab. 1974. - v.27. - №6.-P. 131-138.
305. Ostertag R. Grundsatzliches zur bekampfung und tiglung der tuberculose des rindes und zur frage der ueberleitung des bekampfung verfahrens in das tilgungverfahren. // B.T.W. 1936. - v.69. - P. 23-24.
306. Pao C., Yen Т., Moa J., Fiss E., Chang C. Detection and identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA amplification. // J. Clin. Microbiol. 1990. -v.28. - №9. - P. 1877-1880.
307. Pao C., Yen Т., Moa J., Fiss E., Chang C. The detection of mycobacterial DNA sequences in uncultured clinical speciments with cloned M. tuberculosis DNA as probes. // Tubercle. -1988. v.69. - №1. - P. 27-36.
308. Patel R., Fries J., Piessens W., Wizth D. Sequence analysis and amplification by polymerase chain reaction of a cloned DNA fragment for identification of Mycobacterium tuberculosis. // J. Clin. Microbiol. 1990. - v.28. - №3. - P. 513518.
309. Peter J. Detection and identification of Mycobacterium by DNA amplification. // J. Clin. Microbiol. 1990. - v.28. - №9. - P. 1853-1864.
310. Piffenbach P., Koth E. Beitrag zum vorkommen von Friiveranderunger der chronischen Eutertuberculose des Rindes. // Msch. Vet. Med. 1969. - v.24. - №3. -P. 97-99.
311. Plikaytis В., Eisenach K., Crawford J., Shinick T. Differentiation of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG by a polymerase chain reaction assay. //Mol. Cell. Probes. 1991. - v.5. - P. 215-218.
312. Psikal I. Practicke moznosti pouziti enzymatickeho zmnozeni nukleovychkyselin PCR ve veterinari virologii. // Veterinarstvi. 1993. - v.43. - №5. - P. 188190.
313. Report of a who (Fao) Oie consultation on animal tuberculosis vaccines. // Geneva. World Health Organization. 1995. - 35p.
314. Ridley D., Ridley M. Rational for the histological spectrum of tuberculosis. A basis for classification. // Pathology. 1987. - v.19. - №2. - P. 186-192.
315. Ritacco V., Kantor I., Barrera L. Assessment of the sensitivity and specificity of ELISA for the detection of mycobacterial antibodies in bovine tuberculosis. // J. Vet. Med., Ser. B. 1987. - v.34. - №2. - P. 119-125.
316. Roberts M., McMillan C., Coyle M. Whole chromosomal DNA probes for rapid identification of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium complex. //J. Clin. Microbiol. 1987. - v.25. - №7. - P. 1239-1243.
317. Roder K. Ursachen der unspeciflschen tuberculinreaktion Tierarztl. // Umschau Munchen. Paris. - 1963. - v.18. - P. 107-108.
318. Rodriguez J., Mejia G., Portillo P. Species-specific identification of Mycobacterium bovis by PCR. // Microbiology. 1995. - v.141. - P. 2131-2138.
319. Rogall Т., Flohr Т., Bottger E. Differentiation of Mycobacterium species by direct sequencing of amplified DNA. // J. Clin. Microbiol. 1990. - v.136. - P. 19151920.
320. Ross В., Raios K., Jackson K., Dwyer B. Molecular cloning of a highly repeated DNA element from Mycobacterium tuberculosis and its use as an epidemiological tool. // J. Clin. Microbiol. 1992. - v.30. - P. 942-946.
321. Sakhre P., Vyas S. The incidence of Mycobacterium tuberculosis in milk from clinically healthy udders of tuberculin positive Kankry cows. // Food Farm Agr. -1978. v.9. - №9. - P. 259-260.
322. Schroder K., Topfer M. Der nachweis von tuberkulose-bacterien in Untersuchunasmaterial Verleich von kultur und Tierversuch. // Prax. Pneumol. -1974. v.28. - №7. - P. 361-363.
323. Schroeder A., Brett P. Jour. Amer. Med. Assm. // 1919. - v.54. - P. 157-158.
324. Shankar P., Manjunath N. Lakshmi R., et al. Identification of Mycobacterium tuberculosis by polymerase chain reaction. // Lancet. 1990. - v.335. - №3686. - P. 423-425.
325. Shankar P., Manjunath N., Mohan K.K., Prasad K., Behari M., Ahuja G. Rapid diagnosis of tuberculosis meningitis by polymerase chain reaction. // Lancet. -1991.-v.337.-P. 5-7.
326. Shawar R., El-Zaatari F., Nataraj A., Clarridge J. Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by two-step polymerase chain reaction and nonisotopic hybridization methods. // J. Clin. Microbiol. 1993. - v.31. - P. 61-65.
327. Sing M. ELISA in the diagnosis of pulmonary tuberculosis. // Indian J. Chest Dis. Apll. Sci. 1985. - v.27. - №7. - P. 164-170.
328. Sing M. The guinea-pig virulence of Indian tubercle bacilli. // Am. Rev. Resp. Dis. 1964. - v.89. - №1 - P. 1.
329. Sjobring U., Mecklenburg M., Andersen A., Miorner H. Polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis. // J. Clin. Microbiol. 1990. -v.28. - №10. - P. 2200-2204.
330. Spryszak A., Zorawski C., Wisnewski Z. Krajowy standart tuberculiny PPD ssakow. // Med. Weter. 1970. - v.26. - №10. - P. 598 - 600.
331. Spryszak A., Zorawski C. Badania nad zwiekszeniem specyficznosci porownawczego testu tuberculinowego. // Med. Weteryn. 1968. - v.24. - №7. - P. 397-401.
332. Sreevatsan S., Escalante P., Pan A., Musser J. Identification of a polymorphic nucleotide in oxy specific for Mycobacterium bovis. // J. Clin. Microbiol. 1996. -V.34-P. 2007-2010.
333. Sritharan V., Barker R. A simple method for diagnosing M. tuberculosis infection in clinical samples using PCR. // Mol. Cell. Probes. 1991. - v.5. - P. 385395.
334. Tammemagi L. A study of tuberculosis like lesions in cattle slaughtered in Queensland meatworks. //Austral. Veter. J. - 1973. - v.49. - №11.- P. 507-511.
335. Telenti A., Marchesi F., Balz M., Bally F., Bottger E., Bodmer T. Rapid identification of mycobacteria to the species level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis. //J. Clin. Microbiol. 1993. - v.31. - P. 175-178.
336. Thierry D., Brisson-Noel A., Levy-Frebault V., Nguyen S., Guesdon J., Giequell B. Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence, IS 6110, and its application in diagnosis. // J. Clin. Microbiol. 1990. - v.28. - P. 2668-2673.
337. Thierry D., Chureau C., Aznar C. The detection of Mycobacterium tuberculosis in uncultured clinical specimens using the polymerase chain reaction and a nonradioactive DNA probe. // Mol. Cell. Probes. 1992. - v.6. - P. 181-191.
338. Tunkl В., Bakotic L., Romic Z., Forsek Z. Prilog diagnostic senzibelizacije goveda sm tuberculosis humanus. // Veterin glasnik. 1959. - v. 13. - №12. - P. 1028-1029.
339. Urbanczik R., Petersen K. Uberlegung zum entwicklung der bacteriologie und der experimentallen chemoterapie von mycobacteriosen. // Prax. Klin. Pneumol. -1985. v.39. - №11. - P. 421-430.
340. Vidal C. Glycerol and carlonhydrate utilisation. // J. of bacteriology, Amer. Rev. Tuberc. 1934. - №30. - P. 343-344.
341. Vitale F., Capra G., Maxia L., Reale S., Vesco G., Caracappa S. Detection of Mycobacterium tuberculosis complex in cattle by PCR using milk, lymph node aspirates, and nasal swabs. // J. Clin. Microbiol. 1998. - v.36. - № 4. - P. 10501055.
342. Vizy L., Takats G. A szarvasmarha humokoros fertozottsegenek megallapitassa komplementukotesi probaval. // Magyar. Allatorv. Lapja. 1964. - v.9. - P. 361365.
343. Wards В., Collins D., De Lisle G. Detection of Mycobacterium bovis in tissues by polymerase chain reaction. // Veter. Microbiol. 1995. - v.43. - №2/3. - P. 227240.
344. Weber A., Lutz H., Bauer K. Zur erkennung von Mycobacterium bovis -reinbektionen in rinder bestanden. // Berl u munch Tierztl. Wschr. 1938. - v. 101. -№9. - P. 302-307.
345. Weil A., Plikaytis B.B., Butler W.R., Woodley C.L, Shinnck T.M. The mtp 40 gene is not present in all strains of Mycobacterium tuberculosis. // J. Clin. Microbiol. 1996 - v.34 - P. 2309-2311
346. Wilson S., McNerney R., Nye P., Godfrey-Faussett P., Stoker N. Voller A. Progress toward a simplified polymerase chain reaction and its application to diagnosis of tuberculosis. // J. Cin. Mcrobiol. 1993. - v.31. - P.776-782.
347. Winship P. An improved method for directly sequencing PCR amplified material using dimethyl sulphoxide. // Nucleic Acids Res. 1989. - v.17. - P. 12661268.
348. Wood P., Corner L., Rothel J. A field evaluation of serological and cellular diagnostic tests for bovine tuberculosis. // Austral. Veter. J. 1991. - vol.68. - №9. -P. 286-290.
349. Zumarraga M., Bigi F., Alito A., Romano M., Cataldi A. A 12,7 fragment of the Mycobacntrium tuberculosis genome is not present in Mycobacterium bovis. // Microbiologic 1999,-v. 145-P.893-897.