Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка и испытание селективных питательных сред для культивирования Actinobacillus pleuropneumoniae

На правах рукописи

КАРАБАНОВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА И ИСПЫТАНИЕ СЕЛЕКТИВНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE

Специальность 16.00.03 - Ветеринарная микробиология,

вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

МОСКВА 2004

Работа выполнена на кафедре микробиологии и иммунологии Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

Научный руководитель: -доктор ветеринарных наук, профессор

Д.И. Скородумов

Официальные оппоненты: - доктор ветеринарных наук

Н.Т. Татаринцев (МГУПБ)

- доктор ветеринарных наук Л.Д. Демидова (ВНИИВСГЭ)

Ведущая организация — Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ).

Защита диссертации состоится 200в часов

на заседании Диссертационного совета Д 212.149.03 при Московском государственном университете прикладной биотехнологии по адресу: 109316, Москва, ул. Талалихина, д.ЗЗ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПБ.

Автореферат разослан «уЛД> 200^Г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор ветеринарных наук У

/О //^7/ У Смирнова И.Р.

W0fff

2004-4 27456

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди респираторных инфекций свиней широко распространены болезни, вызываемые представителями семейства Pas-teurellaceae. В пределах данного семейства, наряду с P.multocida, значительную роль в инфекционной патологии свиней играет Actinobacillus pleuropneumoniae - возбудитель актинобациллезной пневмонии свиней (М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, 1986; Л.Я. Романова, В.Ф. Финенко, 1987; МА Сидоров, Ш.М. Мицаев Д.И. Скородумов, 1989; F. Touil, R. Higgins, 1988; J. Hommer, E.M. Kamp, W.LA Lioeffen et.al., 1999).

В основе борьбы с любой инфекционной болезнью лежит эффективная диагностика. Методы серодиагностики актинобациллезной пневмонии свиней (РСК, РА, иммуноферментный метод) большинство авторов рассматривают как групповые, полезные преимущественно при оценке эпизоотической ситуации в хозяйстве. Основным методом лабораторной диагностики актинобациллезной пневмонии свиней остается бактериологическое исследование (М.А Сидоров, Д.И. Скородумов, Н.И. Лаврентьев, 1981; Л.Я. Романова, В.Ф. Финенко, 1987; A. Gunnarson, 1979; K.R. Mittal, R. Higgins, 1984; R. Nielsen, 1988).

При острых вспышках болезни и исследовании свежих легочных поражений изоляция культуры возбудителя не представляет особой сложности. Труднее выделить A. pleuropneumoniae из старых пневмонических очагов и особенно из миндалин, носовой и трахеобронхиальной слизи из-за сильного загрязнения материала сопутствующей микрофлорой. Многие аспекты экологии A. pleuropneumoniae недостаточно ясны, их изучение требует исследования материалов, содержащих значительное количество бактериальных контаминантов (МА Сидоров, Д.И. Скородумов, 1978; М.Ф. Мильков 1987; F. Castryck, 1984; Т. Gram, 1996; U. Hinrichs, V.F. Ohlinder, S. Pesh et. al., 1999). Таким образом, для повышения эффективности бактериологической диагностики актинобациллезной пневмонии свиней и изучения экологии возбудителя необходимо применение питательных сред с селективными свойствами. В зарубежной литературе имеются единичные сообщения о попытках конструирования и использования питательных сред подобного типа (КА Gilbride, 1983; M.J. Jacobsen, 1995).

Отечественные бактериологи целенаправленных исследований в данном направлении не проводили. В связи с изложенным, мы поставили перед собой задачу по конструированию и испытанию селективных питательных сред для культивирования Apleuropneumoniae.

Цель и задачи исследования. Разработать жидкую среду обогащения (накопительную) и плотную селективную среду для диагностического культивирования A. pleuropneumoniae.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи: —

- оптимизировать состав жидкой и плотной питательных сред для диагностического культивирования A. pleuгopneumoniae, с использованием в качестве основы доступных отечественных коммерческих питательных сред;

- определить качественный состав и оптимальное количественное соотношение противомикробных веществ в селективных питательных средах для культивирования A. pleuгopneumoniae;

- провести оценку разработанных селективных питательных сред по основным параметрам, характеризующим рост A. pleuгopneumoniae, и селективным свойствам;

- испытать сконструированные селективные питательные среды для выявления A. pleuгopneumoniae в животных тканях.

Научная новизна. Научно обоснованы:

- оптимальный состав жидкой и плотной питательных сред для диагностического культивирования A. pleuгopneumoniae с использованием в качестве основы доступных отечественных коммерческих микробиологических сред;

- качественный состав и оптимальное количественное соотношение противомикробных веществ в селективных жидких и плотных питательных средах для A. pleuгopneumoniae;

- использование жидкой накопительной и плотной селективной питательных сред в схеме бактериологического исследования на актино-бациллезную пневмонию свиней.

Практическая ценность работы. Разработаны жидкая накопительная и плотная селективная питательные среды для культивирования A. pleu-гopneumoniae.

Определена целесообразность использования сконструированных селективных питательных сред для выделения A. pleuгopneumoniae из материала, контаминированного сопутствующей микрофлорой.

Предложена схема бактериологического исследования на актинобациллезную пневмонию свиней, предусматривающая применение жидкой и плотной селективных питательных сред.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: межкафедральном заседании сотрудников ветеринарно-санитарного факультета МГУПБ (2003) и Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, (2003).

Публикации. Материалы диссертации отражены в четырех опубликованных печатных работах.

Основные положения, выносимые на защиту: • Состав оптимизированных жидкой и плотной питательных сред для диагностического культивирования A. pleuгopneumoniae.

• Состав жидкой накопительной и плотной селективной питательных сред для A. pleuropneumoniae.

• Схема бактериологического исследования на актинобациллезную пневмонию свиней с использованием жидкой и плотной селективных питательных сред.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав, выводов и списка литературы, содержащего 166 библиографических ссылок, в том числе иностранных 85. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 26 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования

Работа выполнена в период с 2000 по 2003 гг. на кафедре микробиологии и иммунологии Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

Материал для бактериологического исследования брали от убойных свиней на Таганском мясокомбинате и ЗАО «Кузнецовский свинокомплекс», а также от павших и убитых с диагностической целью животных из хозяйств, неблагополучных по респираторным болезням свиней (АОЗТ «Комплекс» Череповецкий район Вологодской области; СПК «Кущев-ский», Краснодарский край). Всего бактериологическому исследованию подвергнут материал от 42 свиней, в том числе от 19 клинически здоровых и 23 с явлениями пневмонии.

В опытах использовали референтные штаммы A. pleuropneumoniae ССМ 5869, ССМ 5870, ССМ 5871, М 62, К 17, К 98; штаммы из музеев бактериальных культур кафедр микробиологии и иммунологии МГУПБ и МГАВМиБ: B.subtilis, S. aureus NCTC 8530, S.epidermidis AFCC 14990, S. typhimurium № 415; 'E. coli 02; P. multocida P19 (серовар D), а также С. albicans.

При конструировании питательных сред применяли: питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой (НПО «Питательные среды», г. Махачкала); агар для культивирования микроорганизмов, сухой (ГРМ-агар, МНПЦ ГИП г. Оболенск); питательный агар сухой АСД (Ставропольский НИИ вакцин и сывороток, г. Ставрополь); МПА; питательный бульон для культивирования микроорганизмов, сухой (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), бульон на переваре Хоттингера с содержанием 120 мг/% аминного азота; МПБ.

В качестве добавочных ростовых и антитоксических компонентов питательных сред использовали дрожжевой экстракт, глюкозу, стерильную сыворотку крови крупного рогатого скота (ООО «Биолот», Санкт-Петербург).

В качестве селективных факторов применяли: кристалвиолет (фабрика химреактивов, г. Львов); раствор бриллиантового зеленого 1%-й (ОАО «Московская фармацевтическая фабрика»); Амфотерицин В (АКО «Синтез», г. Курган); Bacitracin, В — 5150; Tylosin, PA 9503; Cloxacillin sodium 106НО826; Nistatin (Sigma chemical CO). Для определения чувствительности A. pleuropneumoniae к антибиотикам использовали также стандартные бумажные диски с 27 антибиотиками.

Чувствительность A. pleuropneumoniae к антибиотикам определяли методом диффузии в агар с применением стандартных бумажных дисков и методом серийных разведений в жидких питательных средах (М.Д. Биргер, 1973). Ингибирующее действие красителей выявляли методом предельных разведений. Общее количество бактериальных клеток устанавливали при помощи стандарта мутности ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича и нефеломет-рически. Количество жизнеспособных бактериальных клеток определяли методом посева серийных десятикратных разведений исследуемой взвеси бактерий на поверхность плотной питательной среды, а также методом предельных разведений в жидкой питательной среде с вычислением концентрации микробных клеток методом наиболее вероятных чисел (Н.С. Егоров, 1986).

Выбор оптимального соотношения исследуемых компонентов в составе базовых и селективных питательных сред осуществляли согласно методу В.В. Бирюкова (1968).

Оценку качества сконструированных питательных сред проводили по следующим показателям: чувствительность питательной среды; скорость роста, период генерации; выход бактериальных клеток на 1 мл среды; селективные свойства среды; сохранение стабильности биологических свойств культивируемого микроорганизма (Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям, 1980).

При исследовании материалов от свиней выделены и идентифицированы на уровне рода или вида 156 культур бактерий.

На первоначальном этапе идентификации, после установления формы клетки и окраски по Граму, использовали идентификационные схемы P.J. Quinn и соавт. (1994). В случае необходимости у бактерий, отнесенных к определенному роду или группе родов, изучали дополнительные ферментативные характеристики с использованием рутинных тестов, а также пластин биохимических для дифференциации энтеробактерий (ПБДЭ) производства Нижегородского НИИЭМ.

Зависимость бактерий от НАД определяли в тесте "сателлитного" роста на сывороточном питательном агаре. Полученный цифровой материал обрабатывали, используя общепринятые методы математической статистики (И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев, 1962; Н.С. Ростова, 1977).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Сравнительная оценка ростовых свойств общеупотребительных коммерческих жидких и плотных питательных сред

На первом этапе исследований провели сравнительную оценку доступных для диагностических лабораторий коммерческих плотных и жидких питательных сред с целью выбора наиболее оптимальных, как основы для конструирования селективных питательных сред. О ростовых свойствах испытанных питательных сред судили по выходу бактериальных клеток A.pleuropneumoniae на 1 мл среды. Результаты исследований показали, что в испытанных жидких питательных средах накопление клеток в 1 мл сред через 20 ч инкубирования колебалось в пределах 8,86 - 9,12, в плот-ных-9,17—9,27 (log). Исходя из представленных результатов, в качестве базовых питательных сред, как доступных и достаточно эффективных, для дальнейшей работы взяли питательный бульон и питательный агар производства НПО «Питательные среды» г. Махачкала.

Конструирование оптимальной жидкой питательной среды для A. pleuropneumoniae

Исследовали влияние на рост A. pleuropneumoniae в базовой питательной среде добавочных компонентов: дрожжевого экстракта, сыворотки крови крупного рогатого скота, глюкозы. В качестве показателя выхода процесса использовали накопление общего количества бактериальных клеток в 1 мл питательной среды через 20 ч инкубирования при 37-38 °С. Для каждого единичного фактора предварительно определяли «лимитирующую», «стационарную» и «ингибирующую» области, путем варьирования его содержания в среде на фоне постоянного уровня остальных факторов. На рис. 1 приведены результаты испытания различных концентраций глюкозы. Аналогичным, образом исследовали влияние на рост A.pleuropneumoniae дрожжевого экстракта и сыворотки крови.

На следующем этапе определяли эффект совместного влияния дрожжевого экстракта, сыворотки крови и глюкозы на величину урожая микробных клеток.

Рис. 1. Влияние концентрации глюкозы в жидкой питательной среде на рост А pleuropneumoniae

Схемы планирования эксперимента для трех факторов на трех уровнях представлены в табл. 1 и 2. Анализ полученных данных показывает, что наибольший выход бактериальных клеток на 1 мл среды (1,3x10") был получен в питательной среде № 4, где компоненты находились на втором уровне. Увеличение или уменьшение содержания компонентов дает отрицательный эффект. В соответствии с полученными результатами для А. р1еигорпеишотае в данной питательной среде оптимальное содержание дрожжевого экстракта и сыворотки крови крупного рогатого скота составляет 3,5% (объем/объем), глюкозы - 0,2% (вес/объем).

Таблица 1

Схема планирования эксперимента для трех факторов на трех уровнях и накопление микробных клеток A.pleuгopneumoniae в 1 мл жидкой питательной среды

№ варианта питательной среды Дрожжевой экстракт, % Сыворотка КРС, % Глюкоза, % М.к./мл, 1x10'

1 1,5 1,5 0,1 0,8

2 1,5 5,5 0,2 1,0

3 1,5 3,5 0,3 0,95

4 3,5 3,5 0,2 1,3

5 3,5 1,5 0,3 0,68

6 3,5 5,5 0,1 1,2

7 5,5 5,5 0,3 1,0

5,5 3,5 0,1 1,1

9 5,5 1,5 од 0,95

Таблица2

Влияние различных концентраций компонентов питательной среды! на накопление общего количества клеток Л. pleuгopneumoniae

Компоненты Содержание компонентов питательной среды

питательных сред на различных уровнях

I уровень 11 уровень Ш уровень

Дрожжевой экстракт, % М 15 5^5

эффект -0,07 0,07 0,02

Сыворотка КРС, % 1Л И 15

эффект -0,18 0,13 0,08

Глюкоза, % <Ц. 0^2 ОД

эффект 0,04 0,09 -0,11

Конструирование жидкой накопительной питательной среды для Л. р1еигорпеипюшае

После оптимизации состава жидкой питательной среды исследовали чувствительность А pleuropneumoniae к некоторым антибиотикам и красителям с целью отбора веществ, не оказывающих существенного ингиби-рующего действия на рост А pleuropneumoniae.

Для качественной оценки действия антибиотиков на рост А pleu-ropneumoniae использовали метод диффузии в агар с применением стандартных бумажных дисков (27 антибиотиков различных групп). Из красителей были испытаны кристалвиолет и бриллиантовый зеленый.

Результаты исследования показали целесообразность дальнейшего испытания линкомицина, клоксациллина, тилозина, амфотерицина В, нистатина, бацитрацина и кристалвиолета. У этих антибиотиков и красителей была определена МПК. Результаты определения МПК антибиотиков представлены в табл.3.

Таблица 3

МПК антибиотиков для Л. р1еигорпеитошае (п =6)

Принимая во внимание, помимо ингибирующих свойств, спектр биологического действия, стоимость антибиотиков, удобство их растворения, для дальнейших испытаний взяли бацитрацин, тилозин, амфотерицин В и кристалвиолет.

Результаты оптимизации количественного соотношения указанных ингибиторов в жидкой питательной среде представлены в табл. 4 и 5. В качестве базовой жидкой питательной среды использовали среду с оптимизированным составом добавочных компонентов.

Из табл. 4 видно, что максимально близкий к контролю показатель выхода процесса наблюдали в среде №8; сходный с ним показатель - в среде № 1. Однако расчет эффектов (табл. 5) свидетельствует об оптимальности только компонентного состава среды №8 (кристалвиолет в разведении 1:1 000 000; бацитрацин - 220 мкг/мл; тилозин - 1 мкг/мл; амфотерицин В - 5 мкг/мл).

Таблица 4

Схема планирования эксперимента для четырех факторов на четырех уровнях и накопление микробных клеток в 1 мл жидкой накопительной питательной среды

№ варианта питательной среды Кристалвиолет (разведения, г/мл) Бацитрацин, мкг/мл Тилозин, мкг/мл Амфотерицин В, мкг/мл М.к./мл 1 х 109

1 1:1200 000 55 1 20 1

2 1:1200 000 110 11 5 0,73

3 1:1200 000 165 16 15 0,59

4 1:1200 000 220 6 10 0,69

5 1:1000 000 110 6 20 0,9

6 1:1000 000 55 16 10 0,55

7 1:1000 000 165 11 15 0,59

8 1-1000 ООО 220 1 5 1,06

9 1:800 000 165 11 10 0,54

10 1:800 000 220 1 15 0,89

И 1:800 000 55 6 5 0,78

12 1:800 000 110 16 20 0,44

13 1:600 000 220 16 5 0,27

14 1:600 000 165 6 20 0,37

15 1:600000 110 1 10 0,42

16 1 600000 55 11 15 0,30

17 - - - - 1,1 контроль

Таблица 5

Влияние различных концентраций ингибиторов на накопление общего количества клеток Л. pleuгopneumoniae

Компоненты питательной среды Содержание компонентов питательной среды на различных уровнях

I уровень II уровень III уровень IV уровень

Кристалвиолет, г/мл эффект 1:1200 ООО 0,12 1:1000 000 0,15 1:800 000 0,03 1:600 000 -0Д9

Бацитрацин. мкг/мл эффект 55 0,03 110 165 220 0,10

-0,01 -0,10

Тилозин, мкг/мл эффект 1 0,21 6 0,05 11 16

-0,09 -0,17

Амфотерицин В. мкг/мл эффект 5 0,08 10 5 20 0,05

-0,08 -0,04

Сравнительная оценка ростовых свойств оптимальной жидкой и накопительной питательных сред

На данном этапе работы провели сравнительную оценку разработанных жидкой накопительной и базовой оптимальной питательных сред.

При культивировании на каждой из питательных сред определяли следующие параметры роста А р1еигорпеитошае: продолжительность лаг - фазы и экспоненциального роста, время генерации, чувствительность питательной среды. Также исследовали частоту диссоциации А. р1еигорпеитошае на этих средах.

На рис. 2 представлены графики, выражающие зависимость количества колониеобразующих единиц (КОЕ) от времени культивирования в базовой и накопительной питательных средах.

1,3 1,2 ■> 1.1 -1 1 -О 0,9 -; -- 0,8

0,4 0,3 0,2 0,1 О

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324

и час

Рис. 2. Кривая роста А. pleuгopneumoniae на оптимальной и селективной жидких питательных сред

При росте в оптимальной питательной среде лаг-фаза составляла два часа, экспоненциальная фаза занимала 7 ч, время генерации равнялось 1,01 ч. При развитии популяции на накопительной питательной среде отмечаются те же закономерности, но продолжительность лаг-фазы в среднем увеличивалась до трех часов, время генерации равнялось 1,35 ч; КОЕ достигает своего максимума на 1-2 ч позднее, чем на оптимальной среде.

Но, несмотря на некоторое отставание в росте во времени, количество колониеобразующих единиц на накопительной питательной среде в итоге достигает почти того же количества, что и на оптимальной питательной среде.

Чувствительность жидких оптимальной и накопительной питательных сред выясняли путем определения количества микробных клеток в одной и той же взвеси бактерий методом наиболее вероятных чисел (НВЧ) при посеве на эти среды. Чувствительность накопительной среды была на 13,4% меньше оптимальной, что для многих накопительных сред с выраженными селективными свойствами обычное явление.

Для изучения влияния ингибиторов жидкой накопительной питательной среды на частоту диссоциации A.pleuropneumoniae сопоставляли этот показатель при культивировании на жидких оптимальной и накопительной питательных средах. На оптимальной и накопительной питательных средах данный показатель в зависимости от штамма соответственно составил 2,2 % и 2,6 %, т.е. частота диссоциации A.pleuropneumoniae на сравниваемых средах существенно не отличалась.

Конструирование оптимальной плотной питательной среды для Л. р1еигорпеитошае

В качестве базовой среды использовали питательный агар производства НПО «Питательные среды» (г. Махачкала) на основе панкреатического гидролизата панциря криля. При выборе оптимальных соотношений в составе питательной среды дрожжевого экстракта, сыворотки крови крупного рогатого скота и глюкозы испытывали те же концентрации добавок, которые брали для жидкой питательной среды. Посевы инкубировали 20 ч при 37-38 °С.

Схема планирования опыта и полученные результаты представлены в табл. 6 и 7. По результатам данного исследования видно, что наибольшее накопление бактериальных клеток получено на средах № 6 и № 8. Однако оценка эффектов показала, что наивысшие их значения соответствуют содержанию в питательной среде дрожжевого экстракта и сыворотки крови на Ш уровне (5,5 %), а глюкозы на I уровне (0,1 %). Исходя из полученных результатов дополнительно была испытана питательная среда состава: глюкоза - 0,1 %, сыворотка крови и дрожжевой экстракт - 5,5 %. Плотная питательная среда данного состава обеспечила выход микробных

клеток в расчете на 1 мл среды выше, чем в питательных средах вариантов № 6 и № 8 - 1,85х109м.к./мл.

Таблица 6

Схема планирования эксперимента для трех факторов на трех уровнях и выход бактериальных клеток A. pleuropneumpoшae на 1 мл оптимальной плотной питательной среды

№ варианта питательной среды Дрожжевой экстракт, % Сыворотка КРС, % Глюкоза, % М.кУмл 1'х 10®

1 1,5 1,5 0,1 0,95

2 1,5 5,5 0,2 1Д

3 1,5 3,5 0,3 0,9

4 3,5 3,5 0,2 1,5

5 3,5 1,5 0,3 1,0

6 3,5 5,5 0,1 1,83

7 5,5 5,5 0,3 1,5

8 5,5 3,5 0,1 1,83

9 5,5 1,5 0.2 1,74

Таблица 7

Влияние различных концентраций компонентов питательной среды на накопление общего количества клеток A. pleuropneumoniae

Содержание компонентов питательной

Компоненты питательных сред среды на различных уровнях

1 уровень 11 уровень III уровень

Дрожжевой экстракт. % 3,5 51

эффект -0,38 0,062 0,3

Сыворотка, % 31 51

эффект -0,16 0,03 0,13

Глкжоза»% (Ц. 02 0.3

эффект 0,16 0р9 -0,25

Конструирование плотной селективной питательной среды

В качестве базовой использовали оптимизированную плотную питательную среду. За основу был взят качественный состав и базовые уровни ингибиторов, использованные при конструировании жидкой накопительной питательной среды. Результаты исследований представлены в табл. 8 и 9.

Как видно, оптимальное соотношение антибактериальных веществ соответствует варианту среды №8, содержащей 220 мкг/мл бацитрацина; 1 мкг/мл тилозина; 5 мкг/мл амфотерицина В и кристалвиолета в разведении 1:1 000 000. Среда данного состава в наименьшей степени ингибирует рост A.pleuгopneumoniae.

Таблица 8

Схема опыта и результаты оптимизации количества антибактериальных веществ в плотной селективной питательной среде

Антибактериальные вещества

№ варианта питательной среды Кристалвиолет разведения, г/мл Бацитра- ЦИН, мкг/мл Тилозин, мкг/мл Амфотерицин В, мкг/мл Накопление микробных клеток в расчете на 1 мл питательной среды 1х109м.к./мл

1 1:1200 000 55 1 20 1,72

2 1:1200 000 110 11 5 1,08

3 1:1200 000 165 16 15 0,74

4 1:1200 000 220 6 10 1,1

5 1:1000 000 110 6 20 1,15

6 1:1000 000 55 16 10 0,72

7 1:1000 000 165 11 15 0,83

8 1:1000 000 220 1 5 1,74

9 1:800 000 165 11 10 0,7

10 1:800 000 220 1 15 1,55

11 1:800 000 55 6 5 1,03

12 1:800 000 110 16 20 0,63

13 1:600 000 220 16 5 0,33

14 1:600 000 165 6 20 0,47

15 1:600 000 110 I 10 0,45

16 1:600 000 55 11 15 0,32

17 - - - - 1,75(контр.)

Таблица 9

Влияние различных концентраций селективных факторов плотной питательной среды на накопление общего количества клеток Л. р1еигорпеишошае

Компоненты Содержание компонентов питательных сред

питательных на различных уровнях

сред

I уровень II уровень III уровень IV уровень

Кристалвиолет 1 1200 ООО 1 1000 000 1 800 000 1 600 000

эффект 0,25 0,2 0,07 -0,51

Бацитоацин 55 110 165 220

эффект 0,04 -0,08 -0,23 0,27

Тилозин 1 6 11 16

эффект 0,46 0,03 -0,18 -03

Амфотерицин В 5 10 15 20

эффект 0,14 -0,17 -0,05 0,08

Сравнительная оценка ростовых свойств оптимальной и селективной плотных питательных сред

Учитывали скорость роста A.pleuropneumoniae, выход бактериальных клеток на 1 мл среды, чувствительность питательной среды и ее влияние на биологические свойства возбудителя.

Результаты исследований показали, что на оптимальной плотной среде макроскопически видимый рост возбудителя появляется через 6,5 -7,0 ч, на селективной - через 7,5 - 8,0 ч.

Выход бактериальной массы на оптимальной среде составил 1,8x1с9 м.к./мл, на селективной - 1,75х109 м кУмл. Плотная селективная среда незначительно уступает оптимальной по чувствительности.

С целью изучения возможности сочетанного применения жидкой накопительной и плотной селективной питательных сред провели последовательные пассажи культур А р1еигорпеитошае (3 штамма) на жидкой и плотной селективных средах, а также на аналогичных средах без ингибиторов. На плотной селективной питательной среде через 20 - 24 ч инкубирования определяли в популяции процент колоний с признаками диссоциации и ферментативную активность субкультур, отвитых из 8-колоний.

Результаты опытов показали, что процент колоний с признаками диссоциации составил 4,8 % после пассажей на оптимальных питательных средах, на селективных - 5,1 %. Таким образом, последовательное культивирование А р1еигорпеитошае на селективных средах обоих типов не приводило к существенному увеличению частоты диссоциации.

Ферментативная активность культур в результате последовательного пассажирования через жидкую и плотную селективные питательные среды не изменилась.

Были проведены исследования по приданию плотной селективной среде дифференциально-диагностических свойств в результате добавления в нее мочевины и индикатора фенолрота. Установлено, что включение в состав среды 10 мл 20%-ного раствора мочевины и 0,6 мл 0,2%-ного раствора фенолрота (на 100 мл среды) позволяет выявить колонии A.pleuropneumoniae через 20 ч инкубирования за счет экстрацеллюлярного выделения фермента уреазы (среда вокруг колоний розовеет).

Изучение селективных свойств сконструированных жидкой и плотной питательных сред

На следующем этапе исследовали селективные свойства сконструированных жидкой и плотной питательных сред.

Для изучения селективных свойств жидкой среды сравнивали ее чувствительность с чувствительностью оптимальной жидкой питательной среды без ингибиторов для следующих бактерий: P. multocida; S. typhi-murium; E. coli; В. subtilis; S. aureus. Чувствительность среды определяли посевом одной и той же культуры с вычислением количества КОЕ методом НВЧ. Количество микробных клеток конкретного вида бактерий в исходной культуре, определенное посевом в оптимальную среду, принимали за 100 %. Исходя из данного показателя, выражали в процентах содержание этого же вида бактерий в исходной культуре, установленное посевом в среду с ингибиторами. Культуру C.albicans высевали только на селективные среды.

Анализ полученных данных показал, что жидкая накопительная среда практически полностью ингибирует рост грамположительных бактерий (рис. 3) и дрожжеподобного гриба. В меньшей степени выражены селективные свойства по отношению к грамотрицательным бактериям из семейства энтеробактерий и существенны по отношению к P.multicida.

Рис. 3. Количество клеток S.aшeus в исходной культуре, определенное посевом в жидкую селективную питательную среду

Определяли ингибирующие свойства селективной плотной питательной среды по отношению к грамотрицательным (P.multocida, S.typhimurium, E.coli) и грамположительным (B.subtilis, S.aureus) бактериям. Использовали те же штаммы, что и в предшествующем опыте. Выявлены аналогичные закономерности: полностью ингибирует рост бацилл, стафилококков и C.albicans, значительно угнетает рост P.multocida и в небольшой степени подавляет рост S.typhimurium и E.coli.

На следующем этапе исследовали селективные свойства сконструированной жидкой питательной среды путем культивирования в ней А. pleuropneumoniae в смешанной культуре с другими видами бактерий.

С указанной целью штаммы A. pleuropneumoniae засевали в виде чистой культуры и в сочетании с В. subtilis, S. aureus, P. multocida, E. coli, S.typhimurium в жидкую оптимальную и накопительную питательные среды. В процессе культивирования, через 6, 8, 10, 12, 24 и 48 ч производили подсчет КОЕ A. pleuropneumoniae в чистых и смешанных культурах. Результаты некоторых опытов представлены на рис. 4 и 5.

КОЕ/мл A.pleuropneumoniae (1x10®)

1-1 ^

0,9 (=3 |Ч

0,8 fi

0,7

0,6

0,5 I

0,4 I

0,3 hj 4 <=Я В

0,2 ? 3 9

0,1 i :: i. 9

0 И к-М *'М М М И-

6 8 10 12 24

Время культивирования, ч

Рис. 4. Влияние S.aureus на рост A.pleuropneumoniae в жидкой оптимальной питательной среде

Результаты опытов показали, что испытанные гетерологичные виды бактерий в смешанных культурах на оптимальных жидких питательных средах тормозят рост A.pleuropneumoniae.

КОЕ/мл А pleuropneumoniae (1x10')

6 8 10 12 24 48

Время культивирования, ч

Рис. 5. Влияние S.aureus на рост A.pleuropneumoniae в жидкой накопительной питательной среде

Использование жидкой накопительной питательной среды позволяет практически полностью избежать антагонистического влияния грамполо-жительных бактерий. Для минимизации отрицательного влияния на рост A pleuropneumoniae грамотрицательных бактерий (Е coli, S.typhimurium, P.multocida), высев из жидкой накопительной среды на плотную, по нашему мнению, целесообразно проводить через 7 - 8 ч инкубирования, т.е. в конце фазы логарифмического роста

Результаты испытания сконструированных селективных питательных сред для выделения A.pleuropneumoniae из животных тканей

С целью изучения влияния на рост A. pleuropneumoniae бактерий, наиболее часто обнаруживаемых в верхних дыхательных путях, мы подвергли бактериологическому исследованию миндалины 19 клинически здоровых убойных свиней По одной схеме исследования тканевый го-могенат инкубировали в течениие 8-9 ч в жидкой питательной среде без ингибиторов и затем рассевали на аналогичную плотную питательную среду. По второй схеме материал последовательно культивировали на жидкой и плотной селективных питательных средах. Результаты исследований представлены в табл. 10

Как видно, в миндалинах убойных свиней обнаруживаются с различной частотой представители 14 родов бактерий. При использовании жидкой накопительной и плотной селективной питательных сред полностью подавляется рост грамположительной микрофлоры, увеличивается частота изоляции актинобацилл

Таблица 10

Результаты бактериологического исследования миндалин убойных

свиней (п= 19)

Схема посева материала и количество выделенных

культур бактерий

Род или Сывороточно-дрожжевой Накопительная жидкая пита-

вид бактерии бульон, высев на плотную тельная среда, высев на

оптимальную с реду плотную селективную среду

Абс. % Абс. %

Micrococcus sp. 3 15,7 - -

Staphylococcus sp. 19 100 - -

Streptococcus sp. 16 84,2 - -

а- и р-гемолитич.

Bacillus sp. 3 15,7 - -

Corynebacterium sp. 6 31,6 - -

E.rbusiopathiae 1 5,3 - -

E.coli б 31,6 6 31,6

Actinobacillus sp. 3 15,7 5 26,3

Haemophilus sp. 1 5,3 0 -

Bordetella sp. 1 5,3 2 10,5

Klebsiella sp. 2 10,5 2 10,5

Enterobacter sp. 1 5,3 1 5,3

Neisseria sp. 2 10,5 2 10,5

Pasteurella sp. 2 10,5 1 5,3

Для исследования характера действия микрофлоры естественных микробиоцинозов миндалин на рост A.pleuropneumoniae тканевый гомоге-нат миндалин от пяти животных с наиболее типичной микрофлорой (Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Corynebacterium sp., Actinobacillus sp., Pasteurella sp., E.coli) искусственно контаминировали A.pleuropneumoniae. Затем такой материал вносили в жидкие селективную и неселективную питательные среды, инкубировали 7 ч и высевали из накопительной среды на плотную селективную, а из обычной жидкой среды на плотную среду без ингибиторов. Из 5 проб, посеянных на оптимальные среды без ингибиторов, A.pleuropneumoniae выделили в 20 % случаев, из тех же проб на селективных питательных средах A.pleuropneumoniae выделили в 100 % случаев.

Как видно, бактериальная микрофлора миндалин при культивировании на оптимальных питательных средах без селективных факторов, существенно подавляет рост возбудителя, и при заведомом наличии в материале A.pleuropneumoniae реизолировать культуру удается не всегда. Таким образом, применение селективных питательных сред значительно увеличивает вероятность выделения A. pleuropneumoniae из материала, контамини-рованного сопутствующей микрофлорой.

На следующем этапе испытывали разработанные селективные питательные среды для выделения А. р1ешгорпештошае из материала от свиней, больных пневмонией (п=23). Результаты этих исследований приведены в табл.11. Как видно, максимальное количество культур А. р1ешгорпештошае было изолировано из различных материалов по схеме исследования с посевом в накопительную жидкую питательную среду и последующим высевом через 7-8 ч инкубирования на плотную селективную среду. При исследовании миндалин и бронхиальной слизи частота изоляции А.р1ешгорпештошае в этом случае увеличивается в 1,8 раза.

Таблица 11

Результаты бактериологического исследования материалов

от свиней с поражениями легких

Характер исследуемого материала Кол-во проб Схема бактериологического исследования и количество выделенных культур А ркигорпеитошае

Кровяной агар с "кормилкой" Плотная селективная среда Жидкая накопительная питательная среда с последующим высевом на плотную селективную среду

Схема I Схема II Схема III

Абс. % Абс. % Абс. %

Пораженная легочная ткань 23 8 34,8 8 34,8 10 43,5

Бронхиальная слизь 23 5 21,7 6 26,1 9 39,1

Миндалины 11 4 36,4 5 45,5 8 72,7

Всего 57 17 29,8 19 33,3 27 47,4

Полученные результаты позволяют рекомендовать для выделения А.р1ешгорпештошае из контаминированного посторонней микрофлорой материала сконструированные нами жидкую накопительную и плотную селективную питательные среды по схеме, приведенной ниже.

Исследуемый Посев в жидкую Инкубиро- Высев на плотную

материал => накопительную => вание 7-8 ч => селективную => питательную среду при 37-38 °С среду

Изучение

Инкубирование Отбор колоний Микроскопи- Определение прочих фер-20-24 ч при => уреазопозитивных ческое иссле- => НАД -зависи- =>ментативных 37-38 "С бактерий дование мости характеристик

Рис. 6. Схема бактериологического исследования контаминированного материала для выделения А.р1еигорпеигаошае с применением селективных питательных сред

выводы

1. Наиболее пригодны в качестве основы при конструировании селективных питательных сред для культивирования A. pleuгopneumoniae, из числа испытанных отечественных коммерческих сред, питательный бульон на основе панкреатического гидролизата кильки и питательный агар на основе панкреатического гидролизата панциря криля производства НПО «Питательные среды», г. Махачкала.

2. Результаты исследования показали, что оптимальное содержание добавочных ростовых компонентов в базовом питательном бульоне следующее: дрожжевой экстракт и сыворотка крови крупного рогатого скота - 3,5 % (объем/объем), глюкоза - 0,2 % (вес/объем); в питательном агаре дрожжевой экстракт и сыворотка крови крупного рогатого скота - 5,5 % (объем/объем), глюкоза- 0,1 % (вес/объем).

3. В качестве ингибиторов посторонней микрофлоры в жидкие и плотные селективные питательные среды для A. pleuгopneumoniae следует добавлять бацитрацин (220 мкг/мл), тилозин (1 мкг/мл), амфотерицин В (5 мкг/мл), кристалвиолет (1:1 000 000).

4. Для придания плотной селективной среде дифференциально-диагностических свойств в нее целесообразно вносить мочевину (10 мл 20 %-ного раствора) и фенолрот (0,6 мл 0,2 %-ного раствора), что позволяет дифференцировать колонии A.pleuгopneumoniae от уреазонегативных бактерий.

5. Разработанные селективные питательные среды целесообразно использовать для выделения A.pleuгopneumoniae по следующей схеме: посев исследуемого материала в накопительную питательную среду, инкубирование 7-8 ч при 37-38 °С, высев смешанной культуры на плотную селективную среду, инкубирование 20-24 ч, отбор колоний уреазопозитивных бактерий с последующим изучением свойств отвитых культур по стереотипной схеме.

6. Сконструированные селективные питательные среды при исследовании контаминированного посторонней микрофлорой материала (миндалины, бронхиальная слизь) позволяют увеличить частоту изоляции A.pleuгopneumoniae в 1,8 раза.

СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработаны и используются в учебном процессе:

1. Методы лабораторной диагностики пастереллеза и актинобацил-лезной пневмонии свиней: Методические указания к лабораторным занятиям для студентов специальности 310800 - Ветеринария. М.: МГУПБ, 2003.

2. Бактериологическая диагностика актинобациллезной пневмонии свиней с применением селективных питательных сред: Методические указания к самостоятельной работе для студентов специальности 310800 -Ветеринария. (Рассмотрены и одобрены на заседании Ученого совета ве-теринарно-санитарного факультета МГУПБ от 24 декабря 2003 г., протокол № 3).

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

Для выделения A.pleuropneumoniae из контаминированного посторонней микрофлорой материала рекомендуем применять разработанные накопительную и плотную селективные питательные среды.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ИССЕРТАЦИИ

1. Карабанова О.В. Оптимизация состава питательных сред для культивирования Actinobacillus pleuropneumoniae // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Материалы международной научно-практической конференции. - Щелково, 2003. С. 88 -89.

2. Карабанова О.В. Разработка жидкой и плотной питательных сред с селективными свойствами для культивирования Actinobacillus pleuropneumoniae // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Материалы международной научно-практической конференции. - Щелково, 2003. С.90 - 92.

3. Скородумов Д.И., Карабанова О.В., Родионова К.П., Костенко Т.С. Дифференциация культур Actinobacillus pleuropneumoniae второго биовара и сходных видов бактерий, выделяемых от убойных свиней // Все о мясе.2003,№2.С.37-39.

4. Скородумов Д.И., Родионова К.П., Карабанова О.В. Методы лабораторной диагностики пастереллеза и актинобациллезной пневмонии свиней // Методические указания к лабораторным занятиям для студентов специальности 310800-Ветеринария. -М.: МГУПБ, 2003.

Подписано в печать 12.01 2004. Печать лазерная.

Объем 1,5 пл. Тираж 100 экз Заказ /3 .

ГУПП «Печатник» 109316, Москва, ул. Талалихина, 33.

«-213 t

РНБ Русский фонд

2004-4 27456

Актуальность темы. Среди респираторных инфекций свиней широко распространены болезни, вызываемые представителями семейства Pasteurellaceae. В пределах данного семейства, наряду с P.multocida, значительную роль в инфекционной патологии свиней играет Actinobacillus pleuropneumoniae - возбудитель актинобациллезной пневмонии свиней (М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, 1986; Л.Я. Романова, В.Ф. Финенко, 1987; М.А. Сидоров, Ш.М. Мицаев Д.И. Скородумов, 1989; F. Touil, R. Higgins, 1988; J. Hommer, E.M. Kamp, W.L.A. Lioeffen et.al., 1999).

В основе борьбы с любой инфекционной болезнью лежит эффективная диагностика. Методы серодиагностики актинобациллезной пневмонии свиней (РСК, РА, иммуноферментный метод) большинство авторов рассматривают как групповые, полезные преимущественно при оценке эпизоотической ситуации в хозяйстве. Основным методом лабораторной диагностики актинобациллезной пневмонии свиней остается бактериологическое исследование (М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, Н.И. Лаврентьев, 1981; Л.Я. Романова, В.Ф. Финенко, 1987; A. Gunnarson, 1979; K.R. Mittal, R. Higgins, 1984; R. Nielsen, 1988).

При острых вспышках болезни и исследовании свежих легочных поражений изоляция культуры возбудителя не представляет особой сложности. Труднее выделить A. pleuropneumoniae из старых пневмонических очагов и особенно из миндалин, носовой и трахеобронхиальной слизи из-за сильного загрязнения материала сопутствующей микрофлорой. Многие аспекты экологии А. pleuropneumoniae недостаточно ясны, их изучение требует исследования материалов, содержащих значительное количество бактериальных контаминантов (М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, 1978; М.Ф. Мильков 1987; F. Castryck, 1984; Т. Gram, 1996; U. Hinrichs, V.F. Ohlinder, S. Pesh et. al., 1999). Таким образом, для повышения эффективности бактериологической диагностики актинобациллезной пневмонии свиней и изучения экологии возбудителя необходимо применение питательных сред с селективными свойствами. В зарубежной литературе имеются единичные сообщения о попытках конструирования и использования питательных сред подобного типа (К.A. Gilbride, 1983; M.J. Jacobsen, 1995).

Отечественные бактериологи целенаправленных исследований в данном направлении не проводили. В связи с изложенным, мы поставили перед собой задачу по конструированию и испытанию селективных питательных сред для культивирования A.pleuropneumoniae.

Цель и задачи исследовании. Разработать жидкую среду обогащения (накопительную) и плотную селективную среду для диагностического культивирования A. pleuropneumoniae.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

- оптимизировать состав жидкой и плотной питательных сред для диагностического культивирования A. pleuropneumoniae, с использованием в качестве основы доступных отечественных коммерческих питательных сред;

- определить качественный состав и оптимальное количественное соотношение противомикробных веществ в селективных питательных средах для культивирования A. pleuropneumoniae;

- провести оценку разработанных селективных питательных сред по основным параметрам, характеризующим рост A. pleuropneumoniae, и селективным свойствам;

- испытать сконструированные селективные питательные среды для выявления A. pleuropneumoniae в животных тканях.

Научная новизна. Научно обоснованы:

- оптимальный состав жидкой и плотной питательных сред для диагностического культивирования A. pleuropneumoniae с использованием в качестве основы доступных отечественных коммерческих микробиологических сред;

- качественный состав и оптимальное количественное соотношение противомикробных веществ в селективных жидких и плотных питательных средах для A. pleuropneumoniae;

- использование жидкой накопительной и плотной селективной питательных сред в схеме бактериологического исследования на актинобациллезную пневмонию свиней.

Практическая ценность работы. Разработаны жидкая накопительная и плотная селективная питательные среды для культивирования А. pleuropneumoniae.

Определена целесообразность использования сконструированных селективных питательных сред для выделения A. pleuropneumoniae из материала, контаминированного сопутствующей микрофлорой.

Предложена схема бактериологического исследования на актинобациллезную пневмонию свиней, предусматривающая применение жидкой и плотной селективных питательных сред.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: межкафедральном заседании сотрудников ветеринарно-санитарного факультета МГУПБ (2003) и Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, (2003).

Публикации. Материалы диссертации отражены в четырех опубликованных печатных работах.

Основные положения, выносимые на защиту:

Состав оптимизированных жидкой и плотной питательных сред для диагностического культивирования A. pleuropneumoniae.

Состав жидкой накопительной и плотной селективной питательных сред для A. pleuropneumoniae.

Схема бактериологического исследования на актинобациллезную пневмонию свиней с использованием жидкой и плотной селективных питательных сред.

ВЫВОДОВ

Для выделения A.pleuropneumoniae из контаминированного посторонней микрофлорой материала рекомендуем применять разработанные накопительную и плотную селективные питательные среды.

Заключение

При остром и сверхостром течении актинобациллезиой пневмонии ifr свиней выделение возбудителя не представляет особой сложности.

Типичные клинические симптомы могут служить диагностическим ориентиром, патологоанатомические и гистологические изменения достаточно специфичны и также могут служить основанием для постановки предварительного диагноза на актинобациллезную пневмонию свиней. Окончательный диагноз ставится на основании результатов бактериологического исследования.

Затруднения возможны при диагностике подострых, и особенно хронических случаев, а также при изучении бактерионосительства.

В случае хронического течения типичные признаки болезни ^ практически отсутствуют. Исследуемый материал, направляемый в лабораторию, может быть контаминирован сопутствующей микрофлорой, а количество возбудителя в нем может быть невелико.

Как следует из данных литературы, сведения о носительстве возбудителя, биологических свойствах A.pleuropneumoniae, выделенных от свиней из благополучных стад, крайне скудны. Исследование указанных

32 вопросов безусловно требует использования селективных питательных сред.

Поэтому одним из существенных направлений совершенствования бактериологической диагностики актинобациллезной пневмонии свиней, по нашему мнению, является разработка соответствующих жидкой накопительной и плотной селективной питательных сред для культивирования возбудителя.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследования

Работа выполнена в период с 2000 по 2003 гг. на кафедре микробиологии и иммунологии Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

Материал для бактериологического исследования брали от убойных свиней на Таганском мясокомбинате и ЗАО «Кузнецовский свинокомплекс», а также от павших и убитых с диагностической целью животных из хозяйств, неблагополучных по респираторным болезням свиней (АОЗТ «Комплекс» Череповецкого района Вологодской области; СПК «Кущевский» Краснодарского края). Всего бактериологическому исследованию подвергнут материал от 42 свиней, в том числе от 19 клинически здоровых и 23 с явлениями пневмонии.

В опытах использовали референтные штаммы Actinobacillus pleuropneumoniae ССМ 5869, ССМ 5870, ССМ 5871, М62, К 17, К 98; штаммы из музеев бактериальных культур кафедр микробиопогии и иммунологии МГУПБ и МГАВМиБ: B.subtilis, S. aureus NCTC 8530, S. epidermidis AFCC 14990, S. typhimurium № 415, E. coli 02, P. multocida P19 (серовар D), а также С. albicans.

Перед использованием культуры типовых штаммов A.pleuropneumoniae подвергали селекции по признаку диссоциации. С этой целью лиофильно высушенные культуры A. pleuropneumoniae после регидратации высевали на сывороточно-дрожжевой бульон с добавлением 5 % сыворотки крови крупного рогатого скота и 5 % стерильного дрожжевого экстракта.

После 18-20 ч культивирования при 37 °С культуры рассевали на чашки Петри с сывороточно-дрожжевым агаром. Через 20 ч культивирования колонии изучали при помощи стереоскопического микроскопа МБС-10 в косопроходящем пучке света (Н.С. Акатова, 1966) и отбирали для последующей работы колонии S-формы, характеризующиеся следующими признаками: 6-18-часовые культуры в пучке косопроходящего света флуоресцируют, имеют зеленоватый цвет с красным отливом, мелкозернистую структуру, иногда легкую концентрическую исчерченность.

При конструировании питательных сред применяли: питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой (НПО «Питательные среды», г. Махачкала); агар для культивирования микроорганизмов, сухой (ГРМ-агар, МНПЦ ГИП, г. Оболенск); питательный агар сухой АСД (Ставропольский НИИ вакцин и сывороток, г. Ставрополь); МПА; «шоколадный агар»; питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), бульон на переваре Хоттингера с содержанием 120 мг/% аминного азота; МПБ.

В качестве добавочных ростовых и антитоксических компонентов питательных сред использовали дрожжевой экстракт, глюкозу в виде 40%-ного стерильного раствора, стерильную сыворотку крови крупного рогатого скота (ООО «Биолот», Санкт-Петербург).

Дрожжевой экстракт готовили из прессованных хлебных дрожжей по следующей методике: в 1 л дистиллированной воды суспендировали 250 г дрожжей, кипятили 4-5 мин; суспензию центрифугировали при 5000 об/мин 15-20 мин; надосадочную жидкость стерилизовали путем фильтрации через стерилизующие пластины фильтра Зейтца. Стерильный дрожжевой экстракт хранили при температуре 4-8 °С - не более 7 суток.

В качестве селективных факторов при разработке питательных сред использовали следующие антибиотики и красители: кристалвиолет (Фабрика химреактивов, г. Львов); раствор бриллиантовой зелени 1%-й (ОАО «Московская фармацевтическая фабрика»); Амфотерицин В (АКО «Синтез», г. Курган); Bacitracin, В - 5150; Tylosin, РА 9503; Cloxacillin sodium 106Н0826; Nistatin, - (Sigma chemical CO). Для определения чувствительности A. pleuropneumoniae к антибиотикам использовали стандартные бумажные диски (объединение «Мосмедпром» им. Л.Я. Карпова) с оксациллином, бензилпенициллином, ристомицином, линкомицином, эритромицином, олеандомицином, фузидином, тетрациклином, метациклином, левомицетином, неомицином, мономицином, канамицином, гентамицином, ампициллином, полимиксином, рифампицином, стрептомицином, карбенициллином, амфотерицином, нистатином, доксациклином, ципрофлоксацином, клотримазолом, бацитрацином, тилозином, клоксациллином.

Чувствительность A. pleuropneumoniae к антибиотикам определяли методом диффузии в агар с применением стандартных бумажных дисков и методом серийных разведений в жидких питательных средах (М.Д. Биргер, 1973). Ингибирующее действие красителей устанавливали методом предельных разведений.

Общее количество бактериальных клеток устанавливали при помощи стандарта мутности ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича и нефелометрически, используя калибровочную кривую. Количество жизнеспособных бактериальных клеток определяли методом посева серийных десятикратных разведений исследуемой взвеси бактерий на поверхность плотной питательной среды, а также методом предельных разведений в жидкой питательной среде с вычислением концентрации микробных клеток методом наиболее вероятных чисел с использованием таблицы Мак-Креди (Н.С. Егоров, 1986).

Выбор оптимального соотношения исследуемых компонентов в составе базовых и селективных питательных сред осуществляли согласно методу ортогональных латинских прямоугольников (В.В. Бирюков, 1968).

Оценку качества сконструированных питательных сред проводили по следующим показателям:

- чувствительность питательной среды;

- скорость роста, период генерации;

- выход бактериальных клеток на 1 мл среды;

- селективные свойства среды;

- сохранение стабильности биологических свойств культивируемого микроорганизма (Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям 1980; Г. Шлегель 1987; Э. Джавец 1982).

Длительность лаг-фазы — Ti определяли как промежуток времени между моментом tr, в который культура достигла определенной плотности хг и моментом времени tj , в который она могла бы достичь такой же плотности, если бы сразу же после инокуляции начался экспоненциальный рост

Ti = tr-ti = tr- 'е*г-'8*о.

Скорость экспоненциального роста вычисляют из начальной и конечной плотности бактерий х0 и xt в моменты времени t0 и t по формуле: м lgxt-lgxQ Ц lge(t-t0)

Время генерации вычисляли по формуле

Явление диссоциации изучали по методу Н.С. Акатовой (1966), с использованием стереоскопического микроскопа МБС-10. При этом определяли наличие в популяции и процентное содержание колоний с измененными морфологическими и оптическими характеристиками.

Материалом для бактериологического исследования служили миндалины, пораженные ткани легких, бронхиальная слизь. Всего исследовано 76 материалов от 19 клинически здоровых и 23 больных пневмонией свиней. Выделено и идентифицировано на уровне рода или вида 156 культур бактерий.

При бактериологическом исследовании материал высевали на сывороточно-дрожжевой агар и бульон, сывороточный и кровяной агар с «баккормилкой», а также на сконструированные питательные среды. У выделенных культур бактерий определяли форму клеток, отношение к окраске по Граму. Окраску бактерий по методу Грама проводили в модификации Хукера (P. Gerhard et al, 1983). В сомнительных случаях результаты окраски по Граму контролировали в тесте с гидроксидом калия (Т. Gregesen, 1978). Капсулы выявляли окраской по методу Гинса (М.О. Биргер, 1973); жгутики - посевом в 0,3%-й ПЖА и микроскопией препарата «раздавленная капля». На первоначальном этапе идентификации, после установления формы клетки и окраски по Граму, использовали идентификационные схемы P.J. Quinn и соавт. (1994). У грамположительных палочковидных бактерий и кокков в этом случае определяли в тесте Хью-Ляйфсона тип метаболизма углеводов (глюкоза, сахароза, мальтоза, маннит); каталазную и оксидазную активность. У выделенных грамотрицательных палочковидных бактерий и кокков исследовали способность к росту на агаре Мак-Конки, тип метаболизма углеводов, каталазную и оксидазную активность. В случае необходимости у бактерий, отнесенных к определенному роду или группе родов, изучали дополнительные ферментативные характеристики с использованием рутинных тестов, а также пластин биохимических для дифференциации энтеробактерий (ПБДЭ) производства Нижегородского НИИЭМ.

Ферментативную активность бактерий по отношению к углеводам исследовали в полужидких средах Гисса, при изучении НАД-зависимых бактерий в среды добавляли НАД (10 мкг/мл).

Оксидационно-ферментативный тест Хью-Ляйфсона проводили на одноименной питательной среде с глюкозой, сахарозой, мальтозой и маннитом. Для этого исследуемую культуру засевали в пробирки со средой Хью-Ляйфсона. Перед посевом для удаления кислорода пробирки со средой, углеводом и индикатором кипятили 15-20 мин, охлаждали и

38 засевали уколом испытуемой культурой. В одну из пробирок после посева наливали стерильное вазелиновое масло слоем толщиной 1 см (анаэробная пробирка). Результаты учитывали после инкубирования по следующей схеме: если кислота не образуется в обеих пробирках — микроорганизм не утилизирует данный углевод. Образование кислоты только в аэробной пробирке (без вазелинового масла) указывает на расщепление углеводов путем окисления. Если кислота образовалась в обеих пробирках, то микроорганизм способен расщеплять углевод также путем брожения.

Образование каталазы тестировали с применением 3%-й перекиси водорода: бактериальную массу снимали с поверхности агаровой среды бактериологической петлей или тонким стеклянным шпателем и суспендировали в капле 3%-й перекиси водорода на предметном стекле. Результат учитывали невооруженным глазом или под малым увеличением микроскопа сразу или через 5 мин. Оценивали по наличию пузырьков газа ^ (положительный результат) или по их отсутствию (отрицательный результат).

Образование оксидазы определяли по методу Ковач с использованием в качестве субстрата 1%-го диметилпарафенилендиамина. Испытуемую культуру выращивали 18-20 ч на агаровой среде в чашке Петри. Поверхность среды заливали приготовленным перед употреблением 1%-ным раствором диметилпарафенилендиамина. Чашку наклоняли, чтобы раствор стек, и через 20-30 с учитывали результат. Колонии бактерий, образующих оксидазу, приобретали пурпурный цвет.

Редукцию нитратов определяли, используя жидкую питательную ^ среду с добавлением 0,1% KNO3 (С.A. Neyra et. al. 1977). Посевы инкубировали при 37 °С, результаты учитывали через 1, 2, 4 и 7 дней. В указанные сроки в пробирку отбирали 0,1 мл культуры, добавляли 2 мл реактива, затем дистиллированную воду до 4 мл. Через 15 мин учитывали результат: положительный результат - среда окрашена в красный цвет.

Щелочную фосфатазу выявляли с помощью раствора динатрий-п-нитрофенилфосфата на глициновом буфере (Burger, 1967). Испытуемую культуру выращивали на питательном агаре, смывали бактериальную массу небольшим количеством изотонического раствора натрия хлорида с таким расчетом, чтобы бактериальная суспензия по оптической плотности приближалась к молоку. Затем в стерильную пробирку наливали 0,3 мл суспензии бактерий и 0,3 мл 0,1 М глицинового буфера (рН 4,8), с растворенным 0,01 М динатрий-п-нитрофенилфосфатом. Компоненты перемешивали и выдерживали при 37 °С 6 ч. При наличии щелочной фосфатазы суспензия окрашивалась в желтый цвет. Контролем служила пробирка с физиологическим раствором и остальными компонентами, но без бактерий.

Утилизация натрия цитрата. Для данной цели использовали цитратный агар Кристенсена (Christensen, 1949).

Выявление уреазы. Бактериальную массу испытуемой культуры в количестве одной бактериологической петли вносили в пробирку с 1 мл среды Заксе. Результаты учитывали после 30-40 мин инкубирования при температуре 37-38 °С. За положительную реакцию принимали малиново-красное окрашивание среды.

Определение индола. Испытуемую культуру выращивали сутки в бульоне Хоттингера. Экстракцию образовавшегося индола из культуры производили эфиром, пробирку тщательно встряхивали, оставляли в покое до отстаивания на поверхности среды слоя эфира и затем осторожно добавляли 0,5 мл реактива Эрлиха. Реактив Эрлиха: пара-диметиламинобензоальдегид - 0,5 г, этанол 96% - 95 мл, НС1 - 20 мл.

Желатиназную активность определяли посевом чистой культуры бактерий уколом в столбик желатины. Засеянные пробирки, а также пробирки с незасеянной желатиной инкубировали при температуре 37 °С в течение 10 суток. Опытные и контрольные пробирки охлаждали в холодной воде (10-15° С), после чего учитывали результат по текучести столбика желатины.

Способность утилизировать аминокислоты (аргинин, орнитин, фенилаланин, лизин) и образовывать Р-галактозидазу тестировали на пластинах ПБДЭ. Пластины биохимические для идентификации энтеробактерий (ПБДЭ) использовали согласно прилагаемой инструкции.

Зависимость бактерий от НАД определяли в тесте "сателлитного" роста на сывороточном питательном агаре (5 % сыворотки крови крупного рогатого скота) с питающей культурой S. epidermidis.

Полученный цифровой материал обрабатывали, используя общепринятые методы математической статистики (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962, Ростова Н.С., 1977).

2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Сравнительная оценка ростовых свойств общеупотребительных коммерческих жидких и плотных питательных сред

На первом этапе исследований провели сравнительную оценку доступных для диагностических лабораторий коммерческих общеупотребительных плотных и жидких питательных сред с целью выбора наиболее оптимальных, как основы для конструирования жидкой накопительной и плотной селективной питательных сред.

Общепринятые питательные среды не обеспечивают рост A.pleuropneumoniae, поэтому в каждую из тестируемых сред вносили равные объемы стерильного дрожжевого экстракта как источника НАД и стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота в количестве 5%.

Испытывали следующие жидкие питательные среды:

• Питательный бульон сухой для культивирования микроорганизмов (ННПЦ ГИП, г. Оболенск). Состав в г на 1 л воды: панкреатический гидролизат рыбной муки - 18,0; натрия хлорид — 2,0.

• Питательный бульон сухой для культивирования микроорганизмов (НПО «Питательные среды», г. Махачкала). Состав в г на 1 л воды: панкреатический гидролизат кильки - 10,05 г.; натрия хлорид-4,95 г.

• Питательный бульон на переваре Хоттингера с содержанием 20 мг/% аминного азота.

• Мясо-пептонный бульон.

Жидкие питательные среды после уравнивания рН (7,4-7,5) разливали в одинаковых объемах по однотипным культуральным сосудам (пробирки, колбы). После внесения дрожжевого экстракта и сыворотки крови, для контроля стерильности, среды выдерживали 20 ч при 37-38 °С, затем инокулировали равными посевными дозами бактериальных культур, выращенных в течение 20 ч на 5%-ном сывороточно-дрожжевом МПА. Посевная доза составляла 0,1 мл культуры концентрацией 0,5 х 109 микробных клеток в 1 мл. Производили параллельный посев трех штаммов A. pleuropneumoniae (ССМ 5869, ССМ 5870, М 62). Посевы инкубировали в термостате при 37 °С в стационарных условиях в течение 20 ч.

Затем нефелометрически, используя калибровочную кривую, устанавливали общее количество бактериальных клеток в 1 мл питательной среды. Полученные результаты в виде средних показателей по группе штаммов представлены в табл. 1. Как видно из приведенных данных, наибольшие и близкие показатели накопления бактериальных клеток в 1 мл среды получены в бульоне Хоттингера и питательном бульоне НПО «Питательные среды» (г. Махачкала). Поскольку различия выхода бактериальных клеток на этих средах были несущественными, для дальнейших исследований мы выбрали, как наиболее доступный, питательный бульон производства НПО «Питательные среды» (г. Махачкала).

Сравнительная оценка ростовых свойств различных общеупотребительных жидких питательных сред (Р> 0,01)

Питательная среда Общее количество бактериальных клеток (log)

Питательный бульон сухой для культивирования микроорганизмов (НПО «Питательные среды», г. Махачкала) 8,99 ± 0,08

Питательный бульон сухой для культивирования микроорганизмов (ННПЦ ГИП, г. Оболенск) 8,89 ± 0,27

Бульон Хоттингера с содержанием 120 мг/% аминного азота 9,0 ±0,16

МПБ 8,86 ± 0,27

Из плотных общеупотребительных коммерческих питательных сред испытывали:

• Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ - агар), производство ННПЦ ГИП, г. Оболенск. Состав в г на 1 л воды: панкреатический гидролизат рыбной муки — 24,0; натрий хлористый - 4,0; агар микробиологический — 12,0 ± 2,0.

• Питательный агар сухой для культивирования микроорганизмов (АСД), производство Ставропольского НИИ вакцин и сывороток. Состав в г на 1 л воды: очищенный гидролизат кормовых дрожжей — 16,0-18,0; агар в/с - 8,0-13,0; натрий хлорид - 6,0.

• Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой производства НПО «Питательные среды», г. Махачкала. Состав в г на 1 л воды: панкреатический гидролизат панциря криля мороженого - 23,1; агар микробиологический - 11,2±1,2; натрия хлорид — 7,7±0,3.

• Мясо-пептонный агар (НИИЭМ им. Гамалеи Н.Ф.)

Питательные среды готовили согласно рекомендациям производителя. Устанавливали рН 7,4-7,5. После автоклавирования среды охлаждали до 45 °С и добавляли по 5 % (объем/объем) стерильного дрожжевого экстракта и стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота. Среды разливали в стандартные чашки Петри строго по 20 мл в каждую чашку. Для посева применяли 20-часовые агаровые культуры А. pleuropneumoniae, выращенные на сывороточно-дрожжевом МПА. Посевная доза составляла 0,2 мл взвеси бактерий концентрацией 0,5 х 109 м.к./мл на одну чашку Петри. Культуру каждого штамма A.pleuropneumoniae (ССМ 5869, ССМ 5870, М 62) засевали на три параллельные чашки Петри.

Через 20 ч инкубирования при 37-38 °С бактериальную массу смывали изотоническим раствором натрия хлорида, измеряли объем бактериальной взвеси, устанавливали количество микробных клеток в 1 мл при помощи калибровочной кривой, затем умножали этот показатель на объем бактериальной взвеси. Таким образом, получали урожай бактериальной культуры для каждого штамма A.pleuropneumoniae. Общее количество выросших микробных клеток (урожай) делили на объем среды в мл в чашках Петри и получали выход бактериальных клеток на 1 мл испытуемой плотной питательной среды.

Средние показатели выхода бактериальных клеток по группе штаммов A. pleuropneumoniae на разных плотных питательных средах представлены в табл. 2. Из этих данных видно, что накопление бактериальных клеток A. pleuropneumoniae на всех испытанных образцах питательных сред близки. Исходя из полученных результатов, в качестве базовой среды для конструирования селективного агара мы выбрали питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой производства НПО «Питательные среды», г. Махачкала, как достаточно доступный и широко используемый.

Сравнительная оценка ростовых свойств коммерческих плотных питательных сред (Р > 0,01)

Питательная среда Общее количество бактериальных клеток (log)

Питательный агар сухой для культивирования микроорганизмов (ННПЦ ГИП, г.Оболеиск) 9,23 ± 0,08

Питательный агар сухой для культивирования микроорганизмов (Ставропольский НИИ вакцин и сывороток) 9,27 ±0,08

Питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой (НПО «Питательные среды», г. Махачкала) 9,25 ± 0,28

МПА 9,17 ±0,31

2.2.2. Конструирование оптимальной жидкой питательной среды для A. pleuropneumoniae

Определяя оптимальный состав питательной среды для культивирования A. pleuropneumoniae, экспериментально устанавливали оптимальное соотношение добавочных компонентов, при которых урожай бактериальных клеток достигал максимального значения в стационарном режиме культивирования.

Исследовали влияние на рост A.pleuropneumoniae дрожжевого экстракта, сыворотки крови крупного рогатого скота, глюкозы и рН среды. В качестве показателя выхода процесса использовали накопление общего количества бактериальных клеток в 1 мл питательной среды через 20 ч инкубирования при 37-38 °С. Для каждого единичного перечисленного фактора определяли «лимитирующую», «стационарную» и «ингибирующую» области, путем варьирования его содержания в среде на фоне постоянного уровня остальных факторов.

2.2.2.1. Влияние дрожжевого экстракта на рост ~ A.pleuropneumoniae в жидкой питательной среде

Питательный бульон разливали по 5 мл в стандартные пробирки с ватно-марлевыми пробками, устанавливали рН 7,6-7,7, стерилизовали (рН среды после стерилизации составлял 7,4-7,5). Затем вносили 5% (объем/объем) стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота, 0,2% глюкозы в виде 40%-ного стерильного раствора и варьирующее количество дрожжевого экстракта (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5; 10,0 %).

Посевная доза A. pleuropneumoniae составляла 0,1 мл бактериальной взвеси 20-часовой культуры, выращенной на сывороточно-дрожжевом МПА, концентрацей 0,5 х 109 м.к. Культивирование проводили в стационарных условиях при 37-38 °С в течение 20 ч. В опыте использовали 6 штаммов A. pleuropneumoniae (ССМ 5869, ССМ 5870, ССМ 5871, М 62, К 17, К 98).

Полученные результаты представлены в табл.3 и на рис. 1. Как видно, концентрации дрожжевого экстракта в диапазоне 0,5 - 3,5 % можно оценить как «лимитирующие», а в диапазоне 5,5-9,5 % - как «ингибирующие». По нашему мнению, при использовании данного питательного бульона (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), предметом дальнейших исследований при оптимизации питательной среды могут быть концентрации дрожжевого экстракта в интервале, близком к «стационарной» области.

Влияние содержания дрожжевого экстракта в питательной среде на рост Actinobacillus pleuropneumoniae ( n = 6 ; Р > 0,05)