Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Закономерности иммунорегулирующего действия естественных супрессорных клеток при разных типах поляризации Т-лимфоцитов

На правах рукописи

ОжМ^

ВЕЛЬСКАЯ НАТАЛИЯ ВИТАЛЬЕВНА

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИММУНОРЕГУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЕСТЕСТВЕННЫХ СУПРЕССОРНЫХ КЛЕТОК ПРИ РАЗНЫХ ТИПАХ ПОЛЯРИЗАЦИИ Т-ЛИМФОЦИТОВ

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Томск 2005

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте фармакологии Томского научного центра СО РАМН.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, доцент

Агафонов Владимир Иванович

Жданов Вадим Вадимович Маслов Леонид Николаевич Карпова Мария Ростиславовна

Ведущая организация:

ГУ НИИ клинической иммунологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Защита состоится 17 февраля 2006 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при НИИ фармакологии Томского Научного центра СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ фармакологии Томского Научного центра СО РАМН (634028, Г. Томск, пр. Ленина, 3).

Автореферат разослан 1 ноября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Амосова Б.Н.

мое-у

/Ш€

ть5 55~

3

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Регуляция иммунного ответа представляет собой важную как с теоретической, так и с практической точки зрения проблему. Центральное место в регуляции иммунологической реакции и определении ее исхода, как известно, принадлежит цитокинам, которые вырабатывают Т-хелперы.

Показано, что после дифференцировки и созревания в тимусе наивные Th прекурсоры мигрируют в периферические органы иммунной системы, где под действием антигена необратимо дифференцируются в два разных типа - ТЫ или Th2 [Seder R.A. et al., 1993], которые различаются по набору секретируемых цито-кинов [Mosmann V.R. et al., 1986]. Для Thl характерны следующие черты: секреция ИФ-у, ИЛ-2, лимфотоксина (TNF-p), индукция продукции В-клетками антител TgG2a, участие в ГЗТ и защите от внутриклеточных патогенов. Th2 клетки вырабатывают ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, преобладают при гельминтозах и аллергиях, способствуют генерации IgE-синтезирующих В клеток, играют важную роль в гуморальном иммунном ответе [Le Gros G. et al., 1990; Sornasse T. et al„ 1996]. Основным фенотипическим признаком Th 1 является высокая продукция ИФ^у, а характерным признаком Th2 - повышенная продукция ИЛ-4 [Romagnani S., 1991; Abbas А.К. et al., 1996;0'GarraA., 1998].

Баланс между дифференцировкой Т-хелперов в Thl или Th2 является определяющим для исхода иммунного ответа [Abbas А.К. et al., 1996]. Аутоиммунные заболевания обусловлены выраженным, но аномальным, Thl ответом, в то время как аллергические заболевания - чрезмерным Th2 ответом. Показана роль Thl в иммунопатологии заболеваний центральной нервной системы, множественного склероза, экспериментального аллергического энцефаломиелита [Issazadeh S. et al., 1995; Lafaille J.J. et al., 1997], колитов [Asseman C. et a!., 2003], аутоиммунного диабета [Mason D. et al., 1998], ревматоидного артрита [Goldberg R., et al., 2004; Latham K.A. et al., 2005], псориаза [Uyemura K. et al., 1993; Nomura I. et al., 2003]. Известна роль Th2 в патогенезе бронхиальной астмы [Krug N. et al., 1997], идиопа-тического пневмофиброза [Smith R.S. et al., 1997], диабета и панкреатита [Pakala S.V. et al., 1997]. Выявлено, что дисбаланс цитокинов Thl и Th2 является важнейшим механизмом атопнческого дерматита [Tsicopoulos A. et al., 1994; Werfel Т. et al., 1996].

Если 1 тип поляризации обеспечивает протективный клеточный иммунитет, то клинические проявления Th2 ответа более разнородны. Это либо реакции гиперчувствительности немедленного типа (анафилактические реакции, бронхиальная астма, гельминтозы), характерными признаками которых, являются, эшинофи-лия и повышенный синтез Ig Е [Finkelman F.D. et al.,

БИБЛИОТЕКА |

■МШВШМJ&

либо состояния толерантности (оральная толерантность, беременность, опухолевый рост), для которых характерна гиперпродукция Т-лимфоцитами ТФР-Р и ИЛ-10 [Khoury S. J., 1992; Maeda Н., 1996].

К числу регуляторов иммунологических реакций относятся и естественные супрессорные клетки (ЕСК). Показано, что ЕСК, представляющие собой не однородную популяцию гемопоэтических клеток разной степени зрелости, участвуют в негативном регулировании ряда иммунологических реакций, неспецифически подавляя пролиферацию иммунокомпетентных клеток [Hoskin D.W. et al., 1989; Subiza J.L. et al„ 1989; Fu Y.X. et al., 1991; Brooks-Kaiser J.C. etal., 1992; Yamamoto H. et al., 1994].

Естественная супрессорная активность обнаруживается в местах нормального гемопоэза, например, в костном мозге взрослого организма [Sugiura К. et al., 1988], печени эмбриона [Чеглякова В.В., 1984], неонатальной селезенке [Schwadron R.B. etal., 1985]. Активность ЕСК возрастает при беременности [Brooks-Kaiser J.C. et al., 1993], опухолевом росте [Subiza J.L. et al., 1989; Young M.R.I, et al., 1992], в результате воздействий, нарушающих гомеостаз в системе крови (гипоксия, кровопотеря [Чеглякова В.В., 1984]), а также под влиянием факторов, повреждающих гемопоэз (облучение, введение фенилгидразина, циклофосфана [Кашла-кова Н.В., 1987; Митасов А.В. с соавт., 1990; Pela'ezB.etal.,2001]).

Участие ЕСК в регуляции иммунного ответа на инфекционные агенты изучено мало. Так, показано, что при введении животным БЦЖ [Kato К. et al., 1985], вируса гриппа [Kusmartsev S.A. et al., 2003], гельминтных олигосахаридов [Тег-razas L.I. et al., 2001], заражении Trypanosoma African [Schleifer K.W. et al., 1993], Salmonella [al-Ramadi B.K. et al., 1991], Schistosoma mansoni [Marshall M.A. et al., 2001], при нематодной инфекции Brugia malayi [Loke P. et al., 2000], после введения суперантигена [Terabe M. et al., 2000] активность ЕСК возрастала.

В основе механизма действия ЕСК лежит секреция ими супрессорных факторов. Оксид азота выступает в роли единственного иммуносупрессорного фактора ЕСК костного мозга интактных животных [Angulo 1. et al., 1995], а также животных, получивших циклофосфан [Angulo I. et al., 2000], у мышей с опухолью [Serafini P. et al., 2004] или с РТПХ [Billiau A.D. et al., 2003], при заражении Trypanosoma African [Schleifer K.W. et al., 1993], при введении гельминтных антигенов [Atochina О. et al., 2001] или суперантигена [Cauley L.S. et al., 2000]. Другим супрессорным фактором ЕСК многие авторы называют ТФР-р и ИЛ-10, который стимулирует продукцию ТФР-р. ЕСК, секретирующие ТФР-Р и ИЛ-10, обнаружены в селезенке мышей во время беременности [Brooks-Kaiser J.C. et al., 1993], при росте опухолей [Terabe М. et al., 2003], после введения гельминтных олигосахаридов [Terrazas L.I. et al., 2001]. ЕСК могут частично осуществлять свое иммуносу-

прессорное действие, вырабатывая простагландины (Е2), что показано при РТПХ [Huchet R. et al., 1993], при канцерогенезе [Fu Y.X. et al., 1991], при заражении мышей Trypanosoma African [Schleifer K.W. et al., 1993]. Обнаружено, что ECK костного мозга и селезенки мышей-опухоленосителей могут оказывать иммуносу-прессорное действие за счет усиленной выработки активных форм кислорода (су-пероксидрадикал и его производные) [Bronte V. et al., 2003; Kusmartsev S. et al., 2003]. Однако в качестве супрессорных факторов ECK чаще других обнаруживают ШиТФР-р.

Активность ЕСК регулируется различными цитокинами, такими как ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-13, ГМ-КСФ, ИФ-у, TNF-a [Holda J.H. et al., 1990; Fu Y.X. et al., 1991; Angulo I. et al., 1995; Billiau A.D. et al., 2003; Terabe M. et al., 2004; Serafini P. et al., 2004]. Вероятно, их набором и определяется, какие факторы будут продуцировать ЕСК в той или иной ситуации.

Имеющиеся в настоящий момент данные позволяют предположить, что активация NO- или ТФР-Р-продуцирующих ЕСК должна происходить в зависимости от типа поляризации лимфоцитов. Такие взаимоотношения показаны между поляризованными Т-лимфоцитами и макрофагами [Munder М. et al., 1998; Mills C.D. et al., 2000]. Активировать макрофаги способны как Thl, так и Th2 клетки, но функциональные свойства при этом будут различны. Макрофаги, индуцированные при Thl-зависимом иммунном ответе («классически активированные»), секретируют оксид азота и др. воспалительные медиаторы (такие как ИЛ-1, ИЛ-б, NO, TNF-a) [Jorens P.G. et al., 1995; MacMicking J. et al., 1997], в то время как макрофаги, индуцированные Th2 цитокинами (ИЛ-4 и ИЛ-10, «альтернативно активированные»), напротив, не синтезируют NO, а при помощи аргиназы 2 метаболизируют аргинин с образованием L-орнитина и мочевины [Corraliza I.M. et al., 1995; Modolell M. et al., 1995; Loke P. et al., 2002].

О наличии связи между поляризацией Т-хелперов и функциональной активностью ЕСК, на наш взгляд, свидетельствуют и данные о генетической предрасположенности развивать определенный тип ответа и выраженностью иммуносупрес-сорной активности у мышей разных линии. Так, максимальная активность ЕСК отмечена у мышей B10.D2 и С57В1/6, а минимальная - у BAlb/c [Maier Т. et al., 1989]. Мыши линии B10.D2 и C57BL/6 склонны развивать Thl-зависимый клеточный ответ, в то время как BAlb/с - ТЪ2-зависимый [Heinzel F.P. et al., 1989; Locks-ley Я.М. et al., 1991; Hsieh C.S. et al., 1995; Shibuya K. et al., 1998]. Именно у Thl линий (B10.D2 и C57BL/6) в отличие от Th2 линии (BAlb/с) макрофаги склонны активироваться по классическому пути и усиленно продуцировать ИФ-у [Buchmul-ler-Rouiller Y. et al., 1986;LiewF.Y. et al., 1991 ¡Oswald l.P. etal., 1992; StengerS. et al., 1994; Dileepan K.N. et al., 1995].

Существующие к настоящему времени работы, в которых показано повышение активности ECK in vivo, можно разделить на две группы. Первая из них включает исследования ECK в условиях стимуляции кроветворения, а другая группа работ проведена с использованием иммунологических моделей, для большинства из которых характерно либо состояние толерантности (опухолевый рост, беременность) либо, вероятнее всего, дифференцировка лимфоцитов в Thl (иммунизация БЦЖ или Salmonella typhimurium). Однако тип поляризации в этих работах не изучался. Совсем не исследованным остался еще один вид иммунных реакций, связанный с поляризацией Th2 - реакции гиперчувствительности немедленного типа. В связи с изложенным выше представляется актуальным исследовать активность ECK при Thl- и ТЬ2-зависимом иммунном ответе, а также оценить влияние ECK на поляризованные Т-лимфоциты.

Цель исследования: изучить влияние естественных супрессорных клеток костного мозга на поляризованные Т-лимфоциты, исследовать влияние поляризации Т хелперов 1 и 2 типов на естественные супрессорные клетки.

Задачи исследования:

1. Изучить изменение активности естественных супрессорных клеток костного мозга при развитии иммунного ответа, вызванного различными антигенными стимулами.

2. Исследовать активность естественных супрессорных клеток костного мозга при развитии Thl - и ТЬ2-зависимого иммунного ответа.

3. Оценить влияние естественных супрессорных клеток костного мозга интактного организма на пролиферацию поляризованных Т-лимфоцитов.

4. Исследовать действие естественных супрессорных клеток костного мозга, полученных от животных с установившейся поляризацией 1 и 2 типа, на пролиферацию поляризованных Т-лимфоцитов.

5. Изучить влияние естественных супрессорных клеток костного мозга на продукцию цитокинов Т-лимфоцитами.

6. Сравнить действие естественных супрессорных клеток костного мозга интактных животных на пролиферацию наивных и поляризованных Т-лимфоцитов.

7. Сравнить действие естественных супрессорных клеток костного мозга, полученных от животных с развившимся Thl-зависимым иммунным ответом на пролиферацию наивных и поляризованных Т-лимфоцитов.

8. Сравнить действие естественных супрессорных клеток, полученных от животных с развившимся ТЬ2-зависимым иммунным ответом (в моделях анафилаксии и толерантности) на пролиферацию наивных и поляризованных Т-лимфоцитов.

9. Оценить влияние естественных супрессорных клеток костного мозга интактных животных на развитие Thl- и ТЬ2-зависимых иммунологических реакций in vivo.

10. Изучить влияние естественных супрессорных клеток животных с Thl-и ТЬ2-зависимым иммунным ответом на развитие Thl - и Т112-зависимых иммунологических реакций in vivo.

11. Оценить участие оксида азота в активности естественных супрессорных клеток интактных и иммунизированных животных в отношении поляризованных Т-лимфоцитов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Иммуносупрессорная и NO-синтезирующая активности естественных супрессорных клеток костного мозга повышаются при любом виде иммунного ответа, протекающего с развитием поляризации как 1 типа, так и сопровождающегося дифференцировкой Т-хелперов в Th2 с развитием анафилаксии или толерантности.

2. Естественные супрессорные клетки костного мозга обладают способностью ингибировать как пролиферацию поляризованных лимфоцитов (1 типа и дифференцированных во 2 тип с развитием анафилаксии или толерантности), так и подавлять продукцию цитокинов наивными и поляризованными Т-клетками. При этом ингибируется продукция лимфоцитами цитокинов как Thl, так и Th2 типа.

3. Т-хелперы 1 типа являются предпочтительной мишенью для антипроли-феративного действия естественных супрессорных клеток костного мозга как ин-тактного организма, так и животных с Thl или Th2 иммунным ответом.

4. Естественные супрессорные клетки костного мозга способствуют протеканию Th2 иммунного ответа in vivo: подавляют Thl-зависимую реакцию (ГЗТ) и, напротив, стимулируют ТЬ2-зависимую (ГЗТ-подобную) реакцию.

Научная новизна. Впервые проведено системное исследование иммуносу-прессорной и NO-синтезирующей активностей ECK костного мозга на большом наборе моделей иммуного ответа. При иммунном ответе, инициированном ксено-антигеном (лошадиная сыворотка, эритроциты барана), аллоантигеном (кожный аллотрансплантат, реакция «трансплантат против хозяина»), а также на фоне иммунологической толерантности, развившейся при опухолевом росте (перевивной солидный и спонтанный канцерогенез) и при полуаллогенной беременности, показано, что иммуносупрессорная и NO-синтезирующая активности ECK костного мозга повышаются при условии изменения (повышение или снижение) продукции цитокинов Т-лимфоцитами селезенки. Впервые показано, что развитие поляризации Т-хелперов сопровождается увеличением активности естественных супрес-

сорных клеток костного мозга, а также усилением синтеза ими оксида азота вне зависимости от типа поляризации.

Впервые изучено влияние ECK костного мозга на пролиферацию поляризованных Т-клеток 1 и 2 типов (как с развитием анафилаксии, так и толерантности) и выявлено, что естественные супрессорные клетки ингибируют ее вне зависимости от функционального состояния лимфоцитов.

Впервые исследовано действие естественных супрессорных клеток костного мозга на продукцию цитокинов наивными и поляризованными Т-лимфоцитами. Обнаружено, что секреция цитокинов Thl и Th2 подавляется.

Впервые проведено сравнение действия ECK костного мозга на поляризованные лимфоциты. Выявлено, что их пролиферация подавляется избирательно. Данная селективность ингибиторного действия естественных супрессорных клеток костного мозга не зависит от того, получены ли они из интактного организма или от животных с установившимся Thl - и ТЬ2-зависимым иммунным ответом.

Впервые исследовано влияние ECK костного мозга на протекание иммунологических реакций in vivo. При этом было обнаружено, что естественные супрессорные клетки костного мозга практически полностью отменяют адоптивную реакцию гиперчувствительности замедленного типа. Разработан уникальный метод оценки действия ECK на развитие локального отека, вызванного Th2 лимфоцитами в системе адоптивного переноса. С помощью данного метода показано, что естественные супрессорные клетки костного мозга не только не ингибируют, а, напротив, стимулируют данную реакцию.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты расширяют представление о физиологической роли естественных супрессорных клеток, в частности, их значение в поддержании гомеостаза иммунной системы, что позволяет глубже понять механизмы взаимодействия иммунной системы и ге-мопоэза и роль кроветворных клеток разной степени зрелости в регуляции иммунологических реакций. Вскрытые в работе закономерности создают теоретическую основу для разработки новых методов клеточной терапии иммунопатологических состояний.

Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертацию, были представлены на конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2002), «Актуальные проблемы фармакологии» (Томск, 2004), на Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2004), на Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2004), на конференции «Иммунология на рубеже веков» (Томск, 2005), на России-

ско-Американской конференции «Биотехнология и онкология» (Санкт-Петербург, 2005), на Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 37 печатных работ, из них 17 в центральных журналах.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 342 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, описание использованных методов и материалов, полученные результаты и их обсуждение), выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 99 таблицами и 24 рисунками. Библиографический указатель включает 477 источников, из которых 34 отечественных и 443 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Животные. Эксперименты проведены на линейных мышах (всего 1503) следующих линий: C57B1/6Y (54), BAlb/cY (1367), AKR/Y (48), а также гибридах FI (СВАхС57В!/6) (16) и Fl(CBAxAKR) (18). Использованы животные обоего пола в возрасте 8-12 недель, полученные из питомника НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (1 категории согласно сертификату). Мыши содержались в неполной барьерной системе, имели постоянный доступ к пище (стерилизованный гранулированный корм) и воде (кипяченая питьевая вода, подкисленная соляной кислотой до рН 4-4,5).

Получение клеточных суспензий. Клетки костного мозга получали перфузией бедренной и большеберцовой костей холодным изотоническим раствором хлорида натрия (ФР), а спленоциты - гомогенизацией селезенок. Суспензии фильтровали через 4-слойный капрон, промывали холодным ФР, ресуспендировали в культуральной среде и оценивали их жизнеспособность. В экспериментах использовали суспензии, содержащие не менее 95% жизнеспособных клеток.

Условия культивирования. Клетки культивировали в среде следующего состава: RPMI 1640 («Sigma») с добавлением 10% ЭТС («ICN», «Serva»), 20 мМ HEPES («Sigma»), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола («Sigma»), 50 мкг/мл гентамицина («Flow Lab») и 2 мМ L-глютамина («Flow Lab»). Культивирование проводили в атмосфер» с 5% СОг и абсолютной влажности.

Удаление адгезируюших клеток осуществляли культивированием миелока-риоцитов 15-17 ч в пластиковых чашках Петри («Costar») в концентрации 3-5х106/мл в культуральных условиях, указанных выше. Затем неприпипшие клетки собирали, отмывали, ресуспендировали в свежей культуральной среде и оценивали жизнеспособность. Для контроля полноты удаления адгезирующих элементов использовали тест с 0,1% раствором нейтрального красного.

Фракционирование клеток по плавучей плотности. Неприлипающие к пластику клетки костного мозга разделяли по плавучей плотности в коммерческом растворе для сепарации клеток «Histopaque-1077» с плотностью 1,077 г/мл («Sigma-Aldrich»). После центрифугирования (15 мин, 400 g) собирали клетки, сформировавшие кольцо. В некоторых экспериментах использовали также клетки, осевшие на дно пробирки. Клетки отмывали, ресуспендировали в среде и оценивали жизнеспособность.

Получение супернатантов Т-лимфоцитов для определения продукции цито-кинов [Williamson Е. et al., 1996]. Спленоциты культивировали 24 ч в концентрации 5х106 клеток/мл в присутствии 4 мкг/мл конканавалина A («Sigma»). Затем клетки удаляли, надосадок разливали на аликвоты и хранили при -20"С.

Определение продукции интерферона-гамма Т-клетками в функциональном тесте осуществляли по способности их супернатанта индуцировать выработку NO миелокариоцитами интактных сингенных животных [Moore S.C. et al., 1992]. Су-пернатант (1/3 и 1/6 от общего объема) Т-лимфоцитов добавляли в 96-луночные круглодонные планшеты («Costar»), содержащие свежевыделенные клетки костного мозга (по 2-3x105 в лунке), культивировали 48 ч, собирали супернатант и измеряли в нем количество NO.

Определение продукции оксида азота осуществляли по содержанию нитритов в супернатантах при помощи реактива Грейса [Green L.C. et al., 1982]. Абсорбцию измеряли при длине волны 550 нм.

Определение продукции интерлейкина-2 Т-лимфоцитами осуществляли в функциональном тесте по способности их супернатанта стимулировать пролиферацию ИЛ-2-зависимых спленоцитов [Moore S.C. et al., 1992]. Для получения ИЛ-2-зависимых спленоцитов клетки селезенки культивировали в концентрации 4х106/мл с Кон А (4 мкг/мл) 36 ч, затем отмывали от митогена и культивировали 48 ч в круглодонных 96-луночных планшетах (5x104 клеток/лунку) с исследуемым супернатантом, после чего оценивали их пролиферативную активность радиоизотопным или колориметрическим методом и выражали соответственно в имп/мии или единицах оптической плотности. При оценке влияния ЕСК на продукцию ци-токинов определяли показатель стимуляции пролиферации (ПСП) ИЛ-2-зависимых спленоцитов для каждого исследуемого супернатанта, который вычисляли по следующей формуле: ПСП = ОП1 - ОП2, где ОП1 - оптическая плотность лунок, содержащих ИЛ-2-зависимые спленоциты с исследуемым супернатантом, ОП2 - оптическая плотность лунок, содержащих ИЛ-2-зависимые спленоциты без какого-либо супернатанта.

Определение ИЛ-4. ИЛ-10. ИФ-v осуществляли иммуноферментным методом при помощи тест-систем («Amersham Biosciences»).

и

Оценка пролиферации радиоизотопным методом. За 16 ч до окончания культивирования клеток в круглодонных 96-луночных планшетах вносили по 0,5 мкКю/лунку 3Н-тимидина. Затем содержимое лунок переносили на стекловолок-нистые фильтры («Titertek») и оценивали включение изотопа на ß-счетчике.

Оценка пролиферации колориметрическим методом [Mosmann Т., 1983]. Клетки культивировали 4 суток в круглодонных 96-луночных планшетах (2-5х104 клеток/лунку). За 4 ч до окончания культивирования в лунки вносили МТТ (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, «Serva»), концентрация которого в лунках составляла 200 мкг/мл. Затем надосадок удаляли, а осадок растворяли диметилсульфоксидом (димексид, «Татхимфармпрепараты»). Абсорбцию растворов замеряли при 550 нм.

Оценка иммуносупрессорной активности миелокариоцитов in vitro проводилась по способности подавлять пролиферацию клеток-мишеней - сингенных спле-ноцитов, активированных митогеном. Для этого клетки-эффекторы культивировали 60-64 ч в 96-луночных планшетах с мишенями (2х105/лунку) в присутствии 4 мкг/мл Кон А. Пролиферацию клеток оценивали радиоизотопным методом (дальнейшие манипуляции описаны выше). Супрессорную активность выражали в % по формуле: супрессия (%) = 100х( 1 - МиЭ/М), где МиЭ - количество имп/мин в лунках (клетки-эффекторы + клетки-мишени), М - количество имп/мин в лунках с клетками-мишенями.

Определение влияния ECK на продукцию цитокинов Т-лимфоцитами. Клетки-эффекторы (миелокариоциты с плотностью менее 1,077 г/л, 2х105/лунку) культивировали 60-64 ч (ИФ-у и ИЛ-4) или 36 ч (ИЛ-2) в 96-луночных планшетах с клетками-мишенями (сингенные спленоциты, 2х105/лунку) в присутствии 4 мкг/мл Кон А, затем надосадок собирали и определяли в нем содержание цитокинов. Контрольные супернатанты получали от культур, не содержавших клеток-эффекторов. Количество ИЛ-4 оценивали иммуноферментным методом, а ИФ-у и ИЛ-2 - в биотестах. В супернатантах, предназначенных для определения ИФ-у, определяли количество нитритов до их использования в биотесте, которое считали нулевым уровнем. Об изменении продукции ИФ-у судили по разнице в количестве нитритов между нулевым уровнем и полученным в биотесте.

Модель полуаллогенной беременности. Самок линии ВА1Ь/с скрещивали с самцами линии С57В1/6. День обнаружения влагалищной пробки считали нулевыми сутками беременности. Забор материала осуществляли на 17-19 сутки гестации. В качестве контроля выступали фертильные самки той же линии.

Иммунизация эритроцитами барана. Суспензию эритроцитов (0,2 мл) вводили внутрибрюшинно мышам линии ВА1Ь/с (2x108 эритроцитов/мышь), а кон-

трольным животным - по 0,2 мл ФР. Материал для исследований забирали на 7 день после инъекции.

Модели опухолевого роста. Клетки карциномы Эрлиха (по ЗхЮ'/мышь) вводили под кожу бедра самцам С57В1/6. Материал для исследования забирали на 21 сутки роста опухоли. Спонтанный опухолевый рост изучали с использованием мышей линии AKR, у которых развивается лимфома тимуса [Бландова З.К. с со-авт., 1983]. Забор материала осуществляли у мышей в возрасте 2, 4 и 7 мес. В качестве группы сравнения были взяты гибриды F1 (CBA/CaLac х AKR) в возрасте 4 мес.

Иммунизация овапьбумином (OBAt [Oshiba A. et а!., 1997]. Мышам линии BAIb/с, которые, в ответ на антиген развивают преимущественно второй тип ответа [Hsieh C.S. et al., 1995], вводили под кожу бедра овальбумин (100 мкг/мышь, «Sigma») с гидроокисью алюминия (5 мг/мышь, «Sigma») в качестве адъюванта в объеме 0,1 мл 1, 2 или 3 раза. Животным контрольной группы вводили по 0,1 мл ФР.

Реакцию гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ) моделировали, используя иммунизированных ОВА мышей. В ответ на введение разрешающей дозы ОВА (10 мкг в 0,1 мл ФР в ретроорбитальный синус) развивалась анафилактическая реакция. Выделяли следующие степени ее выраженности: слабая (угнетенное состояние, взъерошенность шерстного покрова), средняя (угнетенное состояние, взъерошенность, цианоз конечностей, дыхание поверхностное и учащенное, клонические судороги, парезы, параличи), тяжелая (угнетенное состояние, взъерошенность шерстного покрова, цианоз конечностей, дыхание поверхностное и учащенное, боковое положение, клонические судороги, парезы, параличи, гибель в течение 2-4 ч).

Иммунизация лошадиной сывороткой [Емельяненко И.Н., Душкин В.А., 1971]. Разведенную лошадиную сыворотку (1:10) вводили мышам BAlb/с подкожно (в бедро) по 0,2 мл с интервалом 4 дня; контрольные животные получали только ФР. Анафилактический шок вызывали, вводя иммунизированным мышам внутривенно по 0,2 мл неразведенной лошадиной сыворотки. Тяжесть реакции оценивали, как описано выше.

Модель реакции трансплантат против хозяина ГРТПХУ Мышам гибридам FI (СВАхС57В1/б) вводили внутривенно (в ретроорбитальный синус) по 5x107 лимфоцитов, полученных из селезенок мышей С57В1/6, контрольным животным (гибридам) вводили лимфоциты селезенок таких же гибридов. Материал для экспериментов получали на 14-15 сутки после введения лимфоцитов.

Трансплантация кожного лоскута [Бландова З.К., 1982]. На предварительно удаленные участки собственной кожи спины каждый реципиент (самки линии

BAlb/c) получал по 3 лоскута кожи хвоста (от самок линии C57BI/6). Повязку, покрывающую операционное поле, удаляли спустя 7 дней.

Иммунизация БШС. Мышам линии ВА1Ь/с внутрикожно (в основании хвоста) вводили по 100 мкг вакцины туберкулезной («Предприятие по производству бакпрепаратов НИИЭМ им. акад. Н.Ф. Гамалеи РАМН», г. Москва) в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда («Difco»),

Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Иммунизированным БЦЖ животным под апоневротическую пластинку одной из задних лап вводили по 20 мкг БЦЖ в 0,03 мл ФР, в противоположную (контрольную) лапу вводили тот же объем ФР. Развившуюся воспалительную реакцию оценивали через 24 ч, для чего мышей забивали, отрезали обе лапки на уровне голеностопного сустава и взвешивали. Индекс реакции определяли по формуле: ИР (%)=100 х (О - К)/К, где О и К - масса соответственно опытной и контрольной лап.

Адоптивную реакцию ГЗТ вызывали у интактных животных, которым вводили под апоневротическую пластинку одной из задних лап 0,03 мл смеси синген-ных спленоцитов (5х! О7), полученных от иммунизированных БЦЖ мышей, и БЦЖ (20 мкг); в противоположную (контрольную) лапу вводили те же количества син-генных спленоцитов, полученных от интактных мышей, в смеси с теми же количествами БЦЖ. Воспалительную реакцию оценивали через 24 ч.

ТЬ2-зависимый отек. Отек вызывали по Muller K.M. (1994) в нашей модификации у интактных животных, которым вводили под апоневротическую пластинку задних лап 0,03 мл смеси сингенных спленоцитов (1x108), полученных от иммунизированных ОВА мышей, с ОВА (20 мкг); в противоположную (контрольную) лапу вводили те же количества сингенных спленоцитов, полученных от интактных мышей, в смеси с теми же количествами ОВА. Воспалительную реакцию оценивали через 24 ч.

Оценка иммуносупрессорной активности in vivo. На основании методов адоптивной реакции ГЗТ и Muller K.M. (1994) нами разработан метод определения иммуносупрессорной активности in vivo, в основе которого лежит оценка уменьшения величины отека, вызванного реакцией лимфоцитов иммунизированных животных на соответствующий антиген (БЦЖ или ОВА). Интактным животным под апоневротическую пластинку задних лап вводили 0,03 мл смеси клеток (1x10* сингенных спленоцитов и 5x107 миелокариоцитов с плавучей плотностью менее 1,077 г/мл) и соответствующего антигена (20 мкг БЦЖ или ОВА). Контрольная и опытная лапы различались только по источнику получения спленоцитов: для контрольной лапы их получали от интактных животных, а для опытной - от иммунизированных БЦЖ или ОВА (на 8 сутки после третьей иммунизации). Контрольной

группе мышей вводили спленоциты с антигеном без миелокариоцитов. Воспалительную реакцию оценивали через 24 ч.

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программного обеспечения Statistica 6.0. Для всех выборок проверена гипотеза нормальности распределения по величине коэффициента асимметрии и коэффициента эксцесса [Гмурман В.Е., 2001]. Для каждой выборки вычисляли среднее значение величины признаками ошибку средней величины т. Проверка гипотезы о равенстве средних проводилась с использованием /-критерия Стьюдента. Вычисленное значение t сравнивали с табличным при заданном уровне значимости р<0,05. Если расчетная t была больше табличной, то гипотеза о равенстве средних отвергалась.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Активность естественных супрессорных клеток мышей в разных моделях иммунного ответа. Известно, что количество ECK, их активность увеличиваются в состояниях, связанных с иммуносупрессией (беременность, опухолевый рост), более того, эти клетки вносят существенный вклад в ее развитие. Так, ECK, продуцирующие ТФР-ß, обнаружены в селезенке беременных мышей [Hoskin D.W. et al., 1992; Brooks-Kaiser J.C. et al., 1993] и в децидуальной ткани человека [Clark D.A. et al., 1990]. Появление ECK выявлено в ткани опухоли, селезенке животных с опухолью, в периферической крови пациентов с онкологическими заболеваниями [Kusmartsev S.A. et al., 1998; Almand В. et al., 2001].

Однако повышение активности ECK было обнаружено и в других ситуациях, в которых иммуносупрессия не развивается: при развитии реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) [Field E.H., Becker G.C., 1992; Huchet R. et al., 1993; Johnson B.D. et al., 1998; Billiau A.D. et al., 2003]; при инфицировании мышей Salmonella [al-Ramadi B.K. et al., 1991], при введении БЦЖ [Klimpel G.R., Henney C.S., 1978; Kato K. et al., 1985] и высокоиммуногенных вакцин [Bronte V. et al., 1998], при заражении вирусом гриппа [Kusmartsev S. et al., 2003]. В связи с этим мы исследовали естественную супрессорную активность костномозговых клеток при иммунном ответе, инициированном различными способами: ксеноантигеном (лошадиная сыворотка, эритроциты барана), аллоантигеном (кожный аллотрансплан-тат, РТПХ), а также на фоне иммунологической толерантности, развившейся при опухолевом росте (перевивном и спонтанном). В использованных моделях иммунного ответа оценивали также уровень активации иммунитета по продукции ИФ-у и ИЛ-2 Т-лимфоцитами селезенки. В некоторых случаях давали оценку иммунного ответа in vivo (по анафилактическому шоку, реакции ГЗТ и др.).

При использовании лошадиной сыворотки (ЛС) в качестве антигена было обнаружено (табл. 1), что на 8 сутки после однократного введения супрессорная и NO-синтезирующая активности неприлипающих клеток костного мозга не отличались от таковой у интактных мышей Иная картина наблюдалась после пяти имму-низаций. На 3 сутки после последней иммунизации иммуносупрессорная активность неприлипающих миелокариоцитов более чем в 1,5-2 раза превышала контрольные значения, при этом усиливался в 1,7-2 раза и синтез N0 костномозговыми клетками. Аналогичные результаты получены нами и на 8 сутки. При введении разрешающей дозы антигена после однократной иммунизации мы наблюдали слабую степень выраженности анафилактической реакции. Результаты анафилактического шока у животных после 5-кратного введения ЛС, были практически одинаковы: у всех мышей наблюдалась средняя или тяжелая степень его выраженности, 50% животных погибли в течение 2-4 ч. После однократного введения ЛС уровень ИФ-у и ИЛ-2, продуцируемых Т-лимфоцитами, не изменялся, на 3 и 8 сутки после пятой иммунизации продукция ИФ^у и ИЛ-2 снижалась в 2-2,8 раза по сравнению с интактными животными.

При отторжении кожного аллотрансплантата как на 7, так и на 12 сутки после операции мы не обнаружили достоверных различий между контрольной и опытной группами по изучаемым показателям (табл. 1). При этом вокруг лоскута наблюдалась ярко выраженная местная воспалительная реакция, завершавшаяся к 15 суткам у всех животных полной его элиминацией. Несмотря на это, уровень продуцируемых Т-лимфоцитами цитокинов (ИФ-у и ИЛ-2) не изменялся. Следовательно, ведущую роль при отторжении аллотрансплантата играли локальные механизмы, не приводящие к активации Т-лимфоцитов в центральных органах иммунной системы (селезёнке). Тот факт, что при этом ECK не активировались, позволяет предполагать их вмешательство в работу иммунной системы только при условии значительного отклонения ее функционального состояния от равновесия

После введения эритроцитов барана иммуносупрессорная активность неприлипающих костномозговых клеток возрастала (табл 1) в 2,6-5 раз, при этом в 1,6 раза повышалась и продукция NO миелокариоцитами. У иммунизированных животных была активирована иммунная система, о чем свидетельствовали результаты реакции ГЗТ, а также увеличение почти в 1,5 раза по сравнению с контролем выработки ИФ-у и ИЛ-2 Т-лимфоцитами.

При развитии реакции РТПХ наблюдалось увеличение в 1,4-2,2 раза продукции лимфоцитами ИФ-у ив 1,5 раза ИЛ-2 (табл. 1). На этом фоне

Таблица 1. Естественная супрессорная активность (% супрессии) клеток костного мозга, выработка ими N0 (мкМ), изменение продукции ИФ-у и ИЛ-2 (% от контроля) лимфоцитами селезенки мышей, иммунизированных лошадиной сывороткой (ЛС), БЦЖ, эритроцитами барана (ЭБ), овальбумином (ОВА), а также при РТПХ, отторжении аллотрансплантата (Ал-лоТр), росте перевивной опухоли Эрлиха и при развитии спонтанной Т-лимфомы у мышей линии АКЛ (Х±п)

Модель иммунного ответа, сроки после иммунизации Группа Цитокины (% от контроля) Супрессорная активность при разных соотношениях эффектор/мишень (%) Концентрация нитритов при разных соотношениях эффектор/мишень (мкМ)

ИФ-7 ИЛ-2 0,5/1 1/1 0,5/1 1/1

8 сутки после одного введения контроль опыт 100,0±7,6 109г2±5,1 100,0±5,7 98,4±6г1 10,7±3,8 7,5±6,9 30,0±5,4 27,8+4,9 3,8±0,1 4г1±0Д 6Д±0,5 7,4±0,9

ЛС 3 сутки после 5-го введения 8 сутки после 5-го введения контроль опыт контроль опыт 100,0±б,0 41,8+6,4 ♦ 100,0±4,0 " 35,8±4,2 * 100,0±9,2 39,8+6,3* " ¡00,0±12,1 49,8±2,7 * 30,1±11,6 68,1 ±6,1 • 29,218,1 50,9±7,7 55,5±7,0 81,4±4,8 * 40,0+6,3 63,8±4,7 * 9,4±и 18,7±2,6 * 4,7±0,9 8,6±0,5 * 13,4±1,7 22,8±2,9* .....б,4±0,8 ' 14,0±2,4 *

РТПХ 14 сутки контроль опыт 100,0±16,б 217,9±27,1 » 100,0±5,1 149,1±11,1 * 14,9±6,0 73,6±6,4 * 27,0±9,4 83,2±4,4 * 9,3±1,9 22,7±1,3 * 15,7±4,0 33,4±2,1 *

7 сутки контроль опыт 100,0±6,8 93,2±9,3 100,0±9,0 107,4±10,9 25,2±6,2 29,8±5,1 46,2±5,9 58,2±2,5 6,9±0,2 7,1±1,0 10,8±0,6 11,514,5

12 сутки контроль опыт 100, ¿¿12,7 111,8+11,7 100,0±9,3 113,1±0,1 26,5±6,5 23,3±8,6 49,3±9,9 47,3±3,4 7,2±0,7 8,3±1,2 11,1+2,3 10,1±1,0

ЭБ 7 сутки контроль опыт 100,0±8,3 159,6±4,8 * 100,0±9,6 145,5±6,9 * 6,6±4Д 34,5±7,6 * 16,4±5,1 43,1±6,8 * 9,5±0,4 15,2±2,0* 11,5±и 18,5±1,4 *

Опухоль Эрлиха 21 сутки роста контроль опыт 100,0±17,8 191,7±12,7 * 100,0±5,6 55,4±22,3 * -12,0±ПД 45,5±11,0 * 18,4±9,7 82,8±6,0 * 4,5 ±2,1 26,3 ±6,0* 17,1 ±2,5 42,4 ± 4,7 *

Спонтанная Т-лимфома 4 мес контроль опыт 100,0 ±4,4 92,3 ±4,4 100,0 ±6,9 76,0 ±5,0* 23,6 ±8,1 57,2 ±5,7 * 38,1 ± 8,3 75,6 ± 5,8 * 18,6 ±2,6 32,7 ± 9,9* 27,8 ±4,3 43,4 ± 3,4 *

Примечание: * - достоверные различия с контролем (р < 0,05).

наблюдалось увеличение в 3-4,9 раз иммуносупрессорной активности миелока-риоцитов и повышение в 2,1-2,5 раза количества синтезируемого ими N0. Полученные результаты хорошо согласуются с данными других авторов [Maier T. et al., 1985; Choi K.L. et al., 1988; Huchet R. et al., 1993; Johnson B.D. et al., 1998; Bil-liau A.D. et al., 2003].

Активность ECK костного мозга мышей на 21 сутки опухолевого роста иммуносупрессорная активность превышала в 4,5 раза контрольный уровень, а выработка N0 клетками костного мозга опухоленосителей в 2,5-5,8 раз превышала контрольные значения (табл. 1). В эти же сроки секреция ИФ-у повышалась, превосходя контрольные значения в 1,9 раза, а синтез ИЛ-2 Т-лимфоцитами селезенки опухоленосителей, напротив, снижался в 1,8 раза. Полученные данные относительно увеличения иммуносупрессорной активности клеток костного мозга согласуется с данными, полученными рядом авторов [Subiza J.L. et al., 1989; Vinuela J.E. et al., 1991; Young M.R.I, et al., 1992; Yamamoto H. et al., 1994; Kus-martsev S.A. et al., 2000; Gabrilovich D.I., 2001].

Исследование активности ECK костного мозга при развитии спонтанного онкологического процесса у мышей линии AKR показало (табл. 1), что супрес-сорная активность неприлипающих клеток костного мозга у мышей AKR в возрасте 4 и 7 мес была более чем 1,4-2 раза выше, чем у гибридов и 2-месячных мышей AKR. Продукция N0 миелокариоцитами мышей AKR в возрасте 4 мес была выше в 1,6-1,8 раз, чем у гибридов. Т-лимфоциты селезенки 4-месячных мышей продуцировали те же количества ИФ-у, что и контрольные клетки, но сниженные количества ИЛ-2. Эти данные согласуются с результатами других авторов, полученными при спонтанном опухолевом росте в эксперименте [Кусмар-цев С.А., 1990; Yamamoto H. et al., 1994; Gabrilovich D.I., 2001; Sinha P., Clements V.K., Ostrand-Rosenberg S., 2005].

Увеличение продукции NO естественными супрессорными клетками при росте опухоли Эрлиха и при развитии спонтанной тимомы также согласуется с литературными данными [Kusmartsev S.A., Li Y., Chen S.H., 2000; Mazzoni A. et al., 2002; Serafïni P. et al., 2004]. Следует заметить, что две группы авторов указывают на ТФР-ß как на фактор, ответственный за активность ECK при росте опухоли [Young M.R.I, et al., 1991; Young M.R.I, et al., 1992; Terabe M. et al., 2003; Terabe M., Park J.M., Berzofsky J.A., 2004]. Однако y одной из них имеется более поздняя работа, в которой показано наличие повышенной продукции NO естественными супрессорными клетками при перевивном канцерогенезе [Young M.R. et al., 1996]. Вторая группа авторов [Terabe M. et al., 2003; Terabe M., Park J.M., Berzofsky J.A., 2004] в указанных выше работах не оценивала секрецию NO.

Анализ полученных результатов показывает, что исследованные виды иммунного ответа можно разделить на 3 группы - иммунный ответ, при котором: 1) повышается продукция цитокинов Thl (введение эритроцитов барана и РТПХ); 2) снижается выработка этих цитокинов (введение JTC, перевивной и спонтанный канцерогенез); 3) не изменяется (отторжение кожного аллотрансплантата). Стимуляция иммунной системы, при которой происходит изменение (повышение или снижение) продукции цитокинов Т-лимфоцитами селезенки, приводит к активации ЕС К костного мозга. Во всех моделях повышение активности ЕСК сопровождалось и повышением количества продуцируемого ими оксида азота. Интересно отметить, что увеличение выработки N0 при иммунном ответе происходило независимо от того, увеличивалась или снижалась продукция ИФ-у Т-лимфоцитами - индуктора NO-синтазы. Наши результаты показывают, что повышение активности ЕСК является общей закономерностью иммунного ответа.

Активность ЕСК костного мозга мышей при развитии иммунного ответа 1 и 2 типов. Для дальнейших исследований активности ЕСК при развитии поляризации мы использовали наиболее широко применяемые приемы - иммунизацию овальбумином, БЦЖ, а также в качестве модели толерантности - полуаллоген-ную беременность (толерантность на аллоантигены). Известно, что при введении ОВА у мышей развивается преимущественно ТЬ2-зависимый иммунный ответ, связанный с повышением синтеза IgE [Oshiba A. et al., 1997; Denzler K.L. et al., 2001; Oh S.-W. et al., 2002; Hamada K. et al., 2003; Schramm C. et al., 2003]. Введение БЦЖ, напротив, приводит к предпочтительной дифференцировке лимфоцитов в Thl [Fong Т.А.Т. et al., 1989; Kawamura 1. et al., 1992; Newport M.J. et al., 1996; Ravn P. et al., 1997; Ottenhoff Т.Н. et al., 1998]. Для состояния толерантности (оральная толерантность, беременность, опухолевый рост) характерна гиперпродукция Т-лимфоцитами ТФР-Р и ИЛ-10 [Khoury S. J., Hancock W. W., Weiner H. L., 1992; Maeda H., Shiraishi A., 1996].

Для получения Th 1-зависимого ответа животных было выбрано два режима: одно- или двукратное введение БЦЖ в ФР с интервалом между инъекциями 1 неделя; дву- или трехкратное введение БЦЖ в неполном адъюванте Фрейнда с интервалом 2 недели. Введение БЦЖ в нашей экспериментальной системе приводило к поляризации 1 типа, о чем свидетельствовало изменение продукции Т-лимфоцитами цитокинов. Так, через 7 дней после третьей инъекции уровень цитокинов Thl типа повышался (ИФ-у почти вдвое, ИЛ-2 в 1,6 раза), а количество основного маркерного цитокина Th2 - ИЛ-4 - снижалось почти втрое. Кроме того, Т-лимфоциты селезенки сенсибилизированных мышей вызывали выраженный клеточный ответ, что мы наблюдали в адоптивной реакции ГЗТ.

Через 3, 7, 14 и 28 дней после однократной и через 8 дней после двукратной инъекции БЦЖ без адъюванта Фрейнда мы не обнаружили изменений имму-носупрессорной и NO-синтезирующей активностей клеток костного мозга. При этом не наблюдалось признаков активации иммунной системы - Т-лимфоциты иммунизированных животных не вызывали реакцию ГЗТ и не изменялся профиль цитокинов, продуцируемых Т-лимфоцитами селезенки.

Изменение иммуносупрессорной и NO-синтезирующей активностей клеток костного мозга наблюдалось на 14 день после второй иммунизации без адъюванта Фрейнда (интервал между иммунизациями 1 неделя), на 7 и 14 дни после двукратной и трехкратной иммунизации БЦЖ с адъювантом Фрейнда (интервал между инъекциями 2 недели). Так, например, на 7 сутки после трехкратной иммунизации иммуносупрессорная активность клеток костного мозга иммунизированных мышей была в 2,3-2,8 раза выше контрольного уровня, примерно настолько же больше миелокариоциты синтезировали при этом оксида азота. У этих же животных Т-лимфоциты секретировали в 1,5 раза больше ИФ-у и ИЛ-2 (по сравнению с контрольным уровнем) и проявляли выраженную реакцию ГЗТ, индекс которой составил 35,4±4,7 (в контроле 1,6±1,2).

Анализ результатов, полученных в экспериментах с БЦЖ, показал, что, как и при других способах инициации иммунного ответа, наблюдается та же закономерность: повышение активности ECK происходит только тогда, когда развивается достаточно выраженный иммунный ответ. Только такое введение антигена, которое приводит к активации Т-лимфоцитов селезенки, к изменению их функционального состояния, к увеличению продукции ими цитокинов, способно активировать ECK костного мозга. Повышенная выработка супрессорными клетками N0 в данном случае является вполне закономерной, поскольку увеличивается количество индуктора его синтеза (ИФ--у), секретируемого Т-лимфоцитами.

В литера!уре нет сведений о ECK и вырабатываемых ими факторах при Thl типе иммунного ответа. Однако показано повышение активности ECK и увеличение продукции ими оксида азота при развитии РТПХ [Field E.H. et а!., 1992; Huchet R. et al., 1993; Johnson B.D. et al., 1998; Billiau A.D. et al., 2003], в селезенке мышей, зараженных Salmonella [al-Ramadi B.K. et al., 1991], при введении БЦЖ [Klimpel G.R. et al., 1978; Kato K. et al., 1985] и высокоиммуногенных вакцин [Bronte V. et al., 1998], при заражении вирусом гриппа [Kusmartsev S. et al., 2003]. Следует полагать, что в этих ситуациях вероятнее всего развивался Thl-зависимый иммунный ответ, хотя тип поляризации в этих работах не изучался.

ТЬ2-зависимый иммунный ответ с развитием ГНТ (Th2-rHT) вызывали иммунизацией ОВА с гидроокисью алюминия в качестве адъюванта. Действительно, как явствует из данных о профиле цитокинов, вырабатываемых Т-

лимфоцитами селезенок иммунизированных животных, продукция цитокинов ТЫ типа снижалась, a Th2, напротив, увеличивалась. Так, на 7 день после третьей иммунизации продукция ИФ-у снижалась более чем в 4 раза, ИЛ-2 - в 1,8 раза, а уровень основного цитокина Th2 (ИЛ-4), напротив, повышался в 1,7 раза. Свидетельством развития ТЬ2-зависимого иммунного ответа явились и результаты анафилактической реакции, развивавшейся после введения разрешающей дозы антигена во все изученные сроки.

На 7 и 14 день после однократной иммунизации ОВА иммуносупрессорная и NO-синтезирующая активности костномозговых клеток иммунизированных мышей не отличались от таковых контрольных животных. Не изменялся и набор цитокинов, секретируемых Т-лимфоцитами селезенки иммунизированных животных, а введение им разрешающей дозы антигена вызывало анафилактическую реакцию слабой степени.

На 7 и 14 день после двукратного и трехратного введения ОВА наблюдалось увеличение иммуносупрессорной активности миелокариоцитов (в 1,5-2 раза по сравнению с контрольным уровнем), одновременно с этим было отмечено повышение количества синтезируемого клетками костного мозга N0 (также в 1,5-2 раза). Т-лимфоциты иммунизированных животных секретировали заметно меньше ИФ-у и ИЛ-2. Введение разрешающей дозы антигена вызывало у всех животных анафилактическую реакцию средней и тяжелой степени выраженности (количество погибших составляло 40-60% и 80-100% соответственно среди двукратно и трехкратно иммунизированных).

Данных об активности ЕСК костного и продукции ими NO при развитии ГНТ в литературе крайне мало. Так, показано, что у мышей, инфицированных гельминтом Schistosoma mansoni, было обнаружено появление популяции незрелых клеток, которые подавляли образование цитотоксических лимфоцитов, выделяя растворимый фактор [Marshall М.А. et al., 2001]. При нематодной инфекции Brugia malayi на фоне развития поляризации 2 типа также показано повышение активности незрелых макрофагальных клеток, которые ингибировали продукцию ИФ-у Т-хелперами [Loke P. et al., 2000]. Тип поляризации у животных с Schistosoma mansoni в данной работе не изучался, однако известно, что антигены таких эндопаразитов вызывают дифференцировку Т-хелперов по 2 типу [Coffman R. L .et al 1989; Hesse M. et al., 2001]. При исследовании влияния гельминтных олигосахаридов был установлен тип поляризации (Th2) и в перитонеальной полости выявлено появление незрелых миелоидных клеток, которые оказывали иммуносупрессорное действие как через факторы (такие как ИЛ-10, ТФР-Р, NO), так и через непосредственный контакт клетка-клетка [Terrazas L.I. et al., 2001]. Однако естественную супрессорную активность костного мозга в этом случае не

изучали. Другими авторами в аналогичной экспериментальной системе также показано появление в перитонеальной полости ЕСК, в основе супрессорного механизма которых была повышенная продукция NO [Atochina О. et al., 2001]. Тип поляризации в данном случае не устанавливали. В целом, полученные нами результаты относительно увеличения активности ЕСК костного мозга и продукции ими NO при развитии ГНТ не противоречат литературным данным.

Как было сказано выше, толерантность представляет собой особый Th2 тип поляризации, для которого характерно наличие иммуносупрессии. Во время беременности мать служит хозяином плоду, который является для нее полуалло-генным трансплантатом [Sargent T.L., 1993]. При этом материнские Т-лимфоциты проявляют сниженную активность в отношении антигенов главного комплекса гистосовместимости, более того, против цитотрофобласта цитотоксические Т-лимфоциты не образуются [Norwitz E.R. et al., 2001]. На экспериментальных животных показано, что при полуаллогенной беременности происходит ингибиро-вание выработки цитокинов Thl типа [Wegmann T.G. et al., 1993; Rich K.C. et al., 1995; Stallmach T. et al., 1995].

В результате изучения профиля продуцируемых Т-лимфоцитами беременных мышей цитокинов мы установили, что у животных развился Th2 тип поляризации, связанный с толерантностью - ТЪ2-Тол. Так, продукция Т-лимфоцитами беременных мышей цитокинов Thl была подавлена: ИФ-у почти вдвое, составляя 51,4% и 65,4% от контроля {при разведениях исследуемого супернатанта 1/6 и 1/3), количество ИЛ-2 также снижалось и составляло 65,9% и 75,3% от контроля (при аналогичных разведениях супернатанта). Уровень ИЛ-10 - основного ци-токина, свойственного состоянию иммунологической толерантности [Khoury S. J. et al., 1992; Maeda H. et al., 1996], напротив, был в 1,7 раза выше контрольных значений (174,2% от контроля).

Неприлипающие клетки костного мозга мышей на 12-15 сутки беременности проявляли умеренную иммуносупрессорную активность (супрессия составила 28,8%), в то время как те же клетки интактных самок при соотношении эффектор/мишень 0,5/1 ее практически не проявляли. При соотношении 1/1 клетки беременных мышей обладали в 1,5-1,6 раза большей иммуносупрессорной активностью, чем контрольные. Более высокая супрессия сочеталась с более активным синтезом NO: его количество было в 2,1 раза и 1,5 раза больше контрольных значений (при соотношении эффектор/мишень 0,5/1 и 1/1). При исследовании иммуносупрессорной активности на 17-19 сутки беременности получились аналогичные результаты: при соотношении эффектор/мишень 0,5/1 миело-кариоциты беременных животных проявляли умеренную супрессию (34,5%), а клетки контрольных мышей практически ее не проявляли. При соотношении эф-

фектор/мишень 1/1 данная активность была в 1,5-1,6 раза больше у беременных мышей по сравнению с интактными. При этом повышалось количество синтезируемого миелокариоцитами NO в 1,6 раза (при соотношении эффектор/мишень 0,5/1) и в 1,5 раза (при соотношении 1/1).

Следует заметить, что данных об активности ECK костного мозга при беременности в литературе нет. Сведения о появлении ECK касаются селезенки беременных мышей [Brooks-Kaiser J.C. et al., 1992; Hoskin D.W. et al., 1992; BrooksKaiser J.C. et al, 1993] и децидуальной ткани человека [Li X. et al., 1999]. В качестве супрессорных факторов ECK эти авторы называют ТФР-ßl и ИЛ-10 [BrooksKaiser J.C. et al., 1992; Hoskin D.W. et al., 1992; Brooks-Kaiser J.C. et al., 1993], а также нуклеозиды [Li X. et al., 1999]. Других экспериментальных систем, в которых развивалась иммунологическая толерантность, в литературе описано две -толерантность, развившаяся в результате введения суперантигена, и иммуносу-прессия, появившаяся при росте опухоли. В работах с суперантигеном (стафилококковый энтеротоксин, элементы бактериальной стенки) тип поляризации не изучался, хотя показано наличие Т-клеточной неотвечаемости [Wahl S.M. et al., 1988; Cauley L.S. et al., 2000; Terabe M. et al, 2000]. Вклад NO в иммуносупрес-сию в этих работах не показан, хотя косвенные свидетельства его роли можно найти (имеется в виду установленная авторами зависимость между уровнем ИФ-у и активностью ECK) [Cauley L.S. et al., 2000].

Толерантности, развивающейся при опухолевом росте, посвящено гораздо больше работ. Увеличение активности ECK костного мозга опухоленосителей показано многими авторами [Subiza J.L. et al., 1989; Кусмарцев С.А., 1990; Vinuela J.E. et al., 1991; Young M.R.I, et al., 1992; Yamamoto H. et al., 1994; Garrity Т., 1997; Young M.R. et al., 1997; Almand В., 2000; Kusmartsev S.A. et al., 2000; Almand В., 2001; Gabrilovich D.I., 2001; Sinha P., Clements V.K., OstrandRosenberg S., 2005]. Также далеко не единичны данные об NO как факторе естественных супрессорных клеток [Young M.R. et al., 1996; Kusmartsev S.A., Li Y., Chen S.H., 2000; Mazzoni A. et al., 2002; Serafini P. et al., 2004].

Повышение иммуносупрессорной активности клеток костного мозга животных с развившейся толерантностью согласуется с другими нашими результатами, полученные при ТЬ2-зависимом иммунном ответе, индуцированном ОВА, а также при опухолевом росте.

В многочисленныех клинических и экспериментальных наблюдениях показано увеличение как продукции NO, так и экспрессии NO-синтазы при аллергических состояниях, например, при бронхиальной астме [Nijkamp F.P., Folkerts G., 1994; Barnes P.J., Liew F.Y., 1995; Gustafsson L.E., 1998; Ricciardolo F.L.M. et al., 2003]. Аналогичные данные имеются и при беременности [Riemer R.K. et al.,

1997; Kakui К. et al., 2004]. С другой стороны, также хорошо известно, что синтез N0' стимулируют цитокины, связанные с активацией Thl, такие как ИФ-у, ТНФ-а, ИЛ-2, ИЛ-12 [Oswald I.P.etal., 1992; Yim C.Y. et al., 1995; Wigginton J.M. etal., 1996]. А цитокины, связанные с активацией Th2, такие как ИЛ-4, ИЛ-13 ИЛ-10 и ТФР-р, ингибируют синтез оксида азота [Oswald I.P. et al., 1992; al-Ramadi B.K. et al., 1992; Corraliza I.M. et al., 1995; Munder M. et al., 1998]. Таким образом, мы имеем парадокс: при ТЬ2-зависимом иммунном ответе наблюдается повышение уровня синтеза оксида азота. В литературе механизмы, приводящие к этому, не достаточно освещены. Повышенный синтез NO при бронхиальной астме можно объяснить присоединившейся инфекцией, а также особенностями эпителия бронхов, в которых обнаружена повышенная активация сигнальных путей, ассоциированных с Thl (Statl), и экспрессия ИЛ-12 [Walter M.J. et al., 1998; Koga Т. et al., 1999; Sampath D. et a!., 1999; Holtzman M.J. et al., 2002]. Этот парадокс, вероятно, получили и мы - у ЕСК, побывавших под влиянием цитокинов Th2, экспрессия NO-синтазы в ответ на соответствующий стимул повышается. В данном случае присоединившаяся инфекция исключается, а значит повышение количества синтезируемого ЕСК оксида азота было следствием развития Th2-зависимого иммунного ответа на вводимый антиген. Возможно, это является отражением какой-то закономерности, требующей дальнейшего изучения.

Действие естественных супрессорных клеток интактного организма на пролиферацию поляризованных Т-лимфоцитов. Все полученные выше данные явились результатом экспериментов с использованием в качестве лимфоцитов-мишеней клеток селезенок интактных животных, т.е. наивных лимфоцитов (ThO). Мы не обнаружили в литературе никаких сведений о влиянии ЕСК на поляризованные лимфоциты, а также, естественно, и об участии оксида азота в качестве фактора ЕСК. В связи с этим мы изучили влияние ЕСК костного мозга интактных животных на поляризованные лимфоциты. Лимфоциты, поляризованные по 1 и 2 типам, получали на 8 сутки после третьей иммунизации БЦЖ и ОВА соответственно, а также на 17-19 сутки беременности. Было обнаружено, что непри-литгающие клетки костного мозга интактных мышей оказывали ингибиторное действие на пролиферацию Thl клеток (при соотношении эффектор/мишень 0,5/1 процент супрессии составил 59,3%, при соотношении 1/1 - 87,1%). При этом ЕСК в присутствии лимфоцитов продуцировали значительное количество NO (при соотношении эффектор/мишень 0,5/1 концентрация нитритов составляла 25,7±2,2 мкМ, а при соотношении 1/1 - 39,8±1,0 мкМ). Неприлипающие клетки костного мозга интактных мышей проявляли выраженную антипролифера-тивную активность и в отношении П12-ГНТ клеток (при соотношении эффектор/мишень 0,5/1 процент супрессии составил 31,0%, при соотношении 1/1 -

59,4%). При этом ECK продуцировали значительное количество NO (при соотношении эффектор/мишень 0,5/1 концентрация нитритов составляла 18,5=12,5 мкМ, а при соотношении 1/1 - 30,6±1,0 мкМ). Костномозговые клетки интактных мышей также подавляли пролиферацию ТЬ2-Тол клеток (при соотношении эффектор/мишень 0,5/1 процент супрессии составил 59,0%, при соотношении 1 /I -74,4%). При этом клетки-эффекторы в присутствии лимфоцитов также продуцировали значительное количество NO (при соотношении эффектор/мишень 0 5/1 концентрация нитритов составляла 24,4±1,2 мкМ, а при соотношении 1/1 -37,8±1,1 мкМ).

Таким образом, ECK костного мозга интактных животных способны оказывать ингибиторное влияние на пролиферацию поляризованных по 1 и 2 типу (как при ГНТ, так и при толерантности) лимфоцитов и продуцировать при этом N0. Следует заметить, что, как было уже сказано выше, основным индуктором синтеза оксида азота является ИФ-у, который продуцируется ТЫ. Поэтому выявление NO и, как следствие этого, подавление пролиферации ТЫ клеток впопне объяснимо. Обнаружение N0 в присутствии ТЬ2-ГНТ и ТЬ2-Тол клеток, вероятнее всего, связано с тем, что среди спленоцитов, использованных в качестве клеток-мишеней, присутствовали не только Th2 клетки, но и наивные лимфоциты, которые в ответ на Т-клеточный митоген секретировали ИФ-у, чем и вызывали появление N0. В присутствии чистой популяции Th2 клеток количества оксида азота должны были бы быть крайне малыми, либо вообще не обнаруживаться.

Действие естественных супрессорных клеток костного мозга при ТК1-и ТЬ2-зависимом иммунном ответе на поляризованные Т-лимфоциты. Для того, чтобы выяснить, как изменяются свойства самих ECK при развитии иммунного ответа, вызывающего различную по направлению дифференцировку Т-хелперов, в отношении поляризованных лимфоцитов, мы сравнили активность ECK костного мозга интактных, иммунизированных (БЦЖ, ОВА) и беременных животных в отношении поляризованных Т-лимфоцитов.

Неприлипающие клетки костного мозга иммунизированных БЦЖ мышей (7 сутки после третьей инъекции) подавляли пролиферацию ТЫ клеток сильнее, • чем миелокариоциты интактных животных: в 1,9 раза (при соотношении эффектор/мишень 0,5/1) и в 1,6 раза (при соотношении 1/1), что сопровождалось и увеличением в 1,5 раза синтеза ими N0. Клетки костного мозга иммунизированных ОВА мышей (7 сутки после третьей инъекции) подавляли пролиферацию Th2-ГНТ клеток сильнее, чем клетки интактных животных: при соотношении эффектор/мишень 0,5/1 контрольные миелокариоциты вообще не проявляли иммуно-супрессорной активности, в то время как клетки костного мозга иммунизированных ОВА мышей ее проявляли (супрессия составила 25,7%); при соотношении

1/1 клетки костного мозга иммунизированных OB А мышей подавляли пролиферацию ТЬ2-ГНТ в 1,7 раза сильнее, чем клетки контрольных (интактных) животных. ECK, полученные от животных с ТЬ2-зависимым иммунным ответом, вызванным OB А, продуцировали в 1,4-1,5 раза больше N0, чем ECK интактных мышей. Неприлипающие клетки костного мозга беременных мышей подавляли пролиферацию ТЪ2-Тол клеток сильнее, чем костномозговые клетки интактных животных: при соотношении эффектор/мишень 0,5/1 в контроле супрессорной активности практически не было выявлено, в то время как у ECK беременных мышей она составила 23,4 %; при соотношении 1/1 активность ECK беременных мышей в 1,4 раза превышала аналогичные показатели интактных мышей. Более высокая иммуносупрессорная активность сопровождалась и более активным синтезом NO - в 4 раза выше, чем в контроле, при соотношении эффектор/мишень 0,5/1 и в 1,4 раза выше при соотношении эффектор/мишень 1/1.

Таким образом, ECK костного мозга животных с Thl- и ТЬ2-зависимым (ГНТ и толерантность) иммунным ответом, так же как и костного мозга интактных мышей, подавляли пролиферацию поляризованных по 1 и 2 типу лимфоцитов и продуцировали при этом NO. Кроме того, в отношении всех протестированных поляризованных лимфоцитов иммуносупрессорная активность ECK костного мозга иммунизированных БЦЖ, ОВА и беременных животных увеличивалась, что сопровождалось и повышенной продукцией NO.

Влияние естественных супоессорных клеток на продукцию цитокинов Т-лимфоцитами. В литературе нет информации о влиянии ECK на продукцию цитокинов Т-лимфоцитами, за исключением данных о действии на продукцию ИЛ-2. В этих сведениях есть противоречивые данные. Так, показано, что супернатант клеток костного мозга вызывал снижение уровня продукции ИЛ-2, при этом сами ECK не утилизировали ИЛ-2 и не блокировали его связь с рецептором на Т-лимфоцитах [Saffran D.C., Singhai S.K., 1991; Hoskin D.W. et al., 1992]. Другие авторы показали, что ECK подавляли не продукцию ИЛ-2, а экспрессию рецептора к нему на лимфоцитах [Field E.H. et al., 1992]. Имеются сообщения о том, что ECK нарушали утилизацию ИЛ-2, при этом экспрессия рецептора ИЛ-2 Т-лимфоцитами сохранялась [Brooks-Kaiser J.C., Hoskin D.W., 1993; Brooks J.C., Hoskin D.W., 1994]. Недавно было показано, что ECK не нарушают продукцию ИЛ-2, а при помощи NO блокируют сигнальный путь от рецептора ИЛ-2 - через Янус-киназу-3/STATS [Mazzoni А. et al., 2002]. Имеются сообщения о том, что ECK нарушали утилизацию ИЛ-4, однако данные об их действии на продукции этого цитокина отсутствуют [Brooks-Kaiser J.C., Hoskin D.W., 1993; Brooks J.C., Hoskin D.W., 1994].

Мы изучили влияние ECK, полученных от иммунизированных БЦЖ и ОВА, а также беременных мышей, на продукцию ИФ-у, ИЛ-2 и ИЛ-4 как наивными, так и поляризованными Т-лимфоцитами. Миелокариоциты фракционировали по адгезирующим свойствам и по плавучей плотности.

Продукция ИЛ-2 наивными Т-лимфоцитами снижалась почти втрое, составляя от контрольного уровня 39,9% (в присутствии ECK интактных мышей), 20,0% (в присутствии ECK иммунизированных БЦЖ животных), 38,9% (в присутствии ECK иммунизированных ОВА мышей) и 27,5% (в присутствии ECK беременных животных). Продукция ИЛ-2 Т-лимфоцитами, поляризованными по 1 типу, снижалась еще больше, составив от контрольного уровня 30,2% (в присутствии ECK интактных мышей), 10,7% (в присутствии ECK иммунизированных БЦЖ животных), 15,3% (в присутствии ECK иммунизированных ОВА мышей) и 22,8% (в присутствии ECK беременных животных). Продукция ИЛ-2 ТЬ2-ГНТ клетками также снижалась, составив от контрольного уровня 44,6% (в присутствии ECK интактных мышей), 26,5% (в присутствии ECK иммунизированных БЦЖ животных), 17,9% (в присутствии иммунизированных ОВА) и 32,6% (в присутствии ECK беременных мышей). Продукция ИЛ-2 ТЬ2-Тол клетками снижалась до 40,0% (в присутствии ECK интактных мышей), 21,6% (в присутствии ECK иммунизированных БЦЖ животных), 28,7% (в присутствии ECK иммунизированных ОВА мышей) и 29,6% (в присутствии ECK беременных животных) от контрольного уровня. Таким образом, ECK костного мозга подавляли продукцию ИЛ-2 Т-лимфоцитами вне зависимости от того, наивные лимфоциты или поляризованные. Данное свойство ECK не изменялось в случае получения их от мышей с ТЫ- и ТЬ2-зависимым (ГНТ и толерантность) иммунным ответом.

При исследовании влияния ECK на продукцию ИФ-у как наивными, так и поляризованными лимфоцитами, было обнаружено следующее. Продукция ИФ-у наивными лимфоцитами почти вдвое снижалась и составила от контрольного уровня 55,3% (в присутствии ECK интактных мышей), 54,6% (в присутствии ECK иммунизированных БЦЖ животных), 58,9% (в присутствии ECK иммунизированных ОВА мышей) и 46,5% (в присутствии ECK беременных животных). Продукция ИФ-у ТЫ клетками также снижалась более, чем вдвое, составив: 43,4% (в присутстсвии ECK интактных мышей), 36,3% (в присутстсвии ECK иммунизированных БЦЖ животных), 40,1% (в присутстсвии ECK иммунизированных ОВА мышей) и 34,9% (в присутстсвии ECK беременных животных) от контрольного уровня. Продукция ИФ-у ТЬ2-ГНТ клетками также снижалась почти в 2 раза и составила от контрольного уровня: 54,9% (в присутстсвии ECK интактных мышей), 63,5% (в присутстсвии ECK иммунизированных БЦЖ животных), 56,5% (в присутстсвии ECK иммунизированных ОВА мышей) и 50,0% (в присут-

стсвии ECK беременных животных). Продукция ИФ-у ТЬ2-Тол клетками также снижалась почти вдвое и составила от контрольного уровня: 59,9% (в присут стсвии ECK интактных мышей), 44,2% (в присутстсвии ECK иммунизированных БЦЖ животных), 53,7% (в присутстсвии ECK иммунизированных ОБА мышей) и 48,3% (в присутстсвии ECK беременных животных). Таким образом, естественные супрессорные клетки как интактных животных, так и мышей с Thl- и Th2-зависимым (ГНТ и толерантность) иммунным ответом ингибировали секрецию ИФ-у Т-лимфоцитами, причем это не зависело от состояния Т-лимфоцитов (наивные они или поляризованные).

ECK костного мозга влияли также на продукцию ИЛ-4 Т-лимфоцитами интактных животных, подавляя его почти вдвое. В присутствии ECK, полученных от интактных мышей, его секреция составляла 42,2% от контрольного уровня; в присутствии ECK, выделенных от иммунизированных БЦЖ или ОВА животных - 51,5% и 33,4% соответственно. Таким образом, ECK как интактных, так и животных с Thl - или ТЪ2-зависимым иммунным ответом оказывали ингибирующее действие на продукцию ИЛ-4 Т-лимфоцитами интактных животных. Учитывая литературные данные и свои результаты, можно предположить, что ответственным за подавление продукции цитокинов является оксид азота.

Сравнение действия естественных супрессорных клеток на наивные и поляризованные Т-лимфоциты. В следующих сериях экспериментов мы сравнили действие ECK костного мозга интактных животных на пролиферацию наивных и поляризованных лимфоцитов. Было обнаружено (табл. 2), что ECK интактного организма подавляют пролиферацию Thl сильнее, чем наивных. При этом ECK продуцировали больше NO в присутствии поляризованных лимфоцитов Пролиферацию Th2-FHT те же ECK подавляли в 1,6-2,9 раза слабее, чем наивных. Од-нонаправленно изменялся и уровень продукции N0: в присутствии Th2-rHT клеток концентрация нитритов была в 1,5-2,6 раза ниже, чем в присутствии наивны I. Так же как в случае ТЬ2-ГНТ клеток, активность ECK интактных мышей в отношении ТЪ2-Тол была 1,5-2,2 раза ниже, чем в отношении наивных лимфоци-тон. В присутствии ТЬ2-Тол клеток миелокариоциты интактных животных синтезировали меньше N0.

В следующих сериях экспериментов мы сравнили действие ECK костного мо-ira не интактных мышей, а животных с Thl-зависимым иммунным ответом на поляризованные лимфоциты (табл. 2). Было выявлено, что ECK, полученные от жизотных с 1 типом иммунного ответа, обладали высокой активностью как в отношении наивных, так и поляризованных лимфоцитов, однако пролиферацию Th I они подавляли достоверно сильнее, продуцируя при этом больше N0. Те же ECK (от мышей с Th-1-зависимым иммунным ответом) подавляли пролифера-

цию ТЬ2-ГНТ в 1,2-1,7 раза слабее, чем лимфоцитов интактных животных, сек-ретируя при этом в 1,5-1,9 раза меньше NO. Аналогичные результаты получены и в отношении ТЪ2-Тол: супрессорная активность была в 1,3-1,8 раза ниже, чем в отношении контрольных лимфоцитов, N0 продуцировалось при этом в 1,4-1,8 раза меньше.

Сравнение активности ECK костного мозга интактных мышей и животных с Th-2-зависимым иммунным ответом (ГНТ) в отношении поляризованных лимфоцитов показало следующее (табл. 2). При использовании Thl в качестве мишеней иммуносупрессорная активность была практически максимальной, превышая в 1,2-1,3 раза процент супрессии в отношении наивных (контрольных) лимфоцитов. В присутствии Thl клеток ECK костного мозга животных с Th-2-зависимым иммунным ответом (ГНТ) синтезировали в 1,7 раза больше N0, чем в присутствии наивных лимфоцитов. При использовании в качестве клеток-мишеней ТЬ2-ГНТ получились иные результаты. Клетки костного мозга мышей с Th-2-зависимым иммунным ответом (ГНТ) подавляли пролиферацию ТЬ2-ГНТ клеток в 1,6-2,3 раза слабее, чем наивных, кроме того, продуцировали в 1,3-1,4 раза меньше N0. Пролиферация ТЬ2-Тол также подавлялась в 1,3-1,6 раза слабее, чем наивных лимфоцитов. При этом продукция NO также была в 1,5-1,7 раза меньше, чем в присутствии наивных клеток.

В следующих сериях экспериментов мы сравнили действие ECK костного мозга мышей со 2 типом иммунного ответа (толерантность) на поляризованные Т-лимфоциты (табл. 2). Иммуносупрессорная активность, проявляемая в отношении Thl, была в 1,2-1,4 раза выше, чем в отношении наивных лимфоцитов, что сопровождалось повышенной продукцией N0. Те же ECK в 1,5-1,7 раза слабее подавляли пролиферацию ТЪ2-ГНТ, при этом синтезировали в 1,5 раза меньше N0. В отношении ТТ|2-Тол получились аналогичные результаты: иммуносупрессорная активность была в 1,4-2,1 раза ниже, чем в отношении наивных лимфоцитов. Продукция NO была в 1,6 раза ниже в присутствии ТЬ2-Тол по сравнению с контрольным уровнем.

Как показывает анализ полученных результатов, не зависимо от того, получены ли ECK из интактного организма или от животных с развившимся иммунным ответом, они проявляли более выраженную иммуносупрессорную активность против лимфоцитов, поляризованных по 1 типу, чем против ТТгё-лимфоцитов. Мы не обнаружили какой-либо селективности действия ECK в отношении цитокииов: продукция как Thl, так и Th2 цитокинов подавлялась. Избирательность действия ECK в отношении поляризованных Т-лимфоцитов 1 типа, на наш взгляд, связана не с преимущественным подавлением Th 1 цитокинов, а с преимущественной активацией самих ECK этими цитокинами. Поскольку лимфоциты, полученные от

животных с Thl-зависимым иммунным ответом, продуцируют больше ИФ-у, то и стимулировать продукцию оксида азота такие лимфоциты будут лучше. Таким образом, избирательность действия в отношении пролиферации лимфоцитов-мишеней связана с более высоким стимуляторным потенциалом Thl клеток, чем Th2 по отношению к ECK. Другими словами, ECK активируются параллельно с системой иммунитета под влиянием цитокинов Т-лимфоцитов и действуют преимущественно в отношении Thl, что способствует сдригу поляризации во 2 тип.

Таблица 2. Сравнение иммуносупрессорной (% супрессии) и NO-синтезирующей (концентрация нитритов, мкМ) активностей костномозговых клеток в отношении пролиферации лимфоцитов, полученных от интактных, беременных и иммунизированных ОВА и БЦЖ животных (Х±ш)

Источник ECK Источник лимфоцитов Иммуносупрессорная активность NO-синтезирующая активность

Соотношение э( )фектор/мишень

0,5/1 1/1 0,5/1 1/1

Интактные мыши Интактные (контроль) БЦЖ (опыт) 50,7±1,1 64,8±3,6* 67,7±3,4 84,2±2,3* 20,9±0,8 26,0±0,8* 27,1±0,7 34,6±2,1*

Интактные (контроль) ОВА (опыт) 49,1±7,1 16,8±5,3* 68,5±5,8 43,8±0,3* 16,9±1,0 6,6±2,0* 34,2±0,4 22,6±2,1*

Интактные (контроль) Беременные (опыт) 47,9±8,9 21,3±3,0* 67,5±4,2 46,4±3,8* 23,8±1,6 10,5±2,4* 30,7±2,9 19,7±2,7*

БЦЖ Интактные (контроль) БЦЖ (опыт) 54,3±1,2 73,8±3,7* 75,2±3,1 91,3±2,4* 26,7±0,5 32,8±0,7* 35,5±1,8 43,4±0,9*

Интактные (контроль) ОВА (опыт) 80,4±3,6 48,5±5,5* 92,0±2,6 74,4±4,5* 37,4±3,5 20,9±4,1* 44,9±1,6 29,6±3,3*

Интактные (контроль) Беременные (опыт) 64,8±8,1 35,9±5,0* 79,7±4,4 61,0±2,0* 37,7±1,5 20,4±1Д* 49,4±3,7 34,1±2,5*

ОВА Интактные (контроль) БЦЖ (опыт) 69,7±5,9 92,5±2,7» 83,1 ±2,3 97,1±0,9* 31,5±2,1 52,9±2,3* 38,0±3,8 63,6±2,8*

Интактные (контроль) ОВА (опыт) 54,4±3,6 24,1±1,1* 72,2±3,2 45,7±6,0* 20,1 ±0,7 13,9±1,0* 40,2±1,8 30,0±04*

Интактные (контроль) Беременные (опыт) 72,0±6,9 43,9±3,8* 86,5±2,0 64,1±5,3* 38,6±1,7 23Д±1,0* 49,8±2,1 33,4±2,3*

Беременные Интактные (контроль) БЦЖ (опыт) 52,8±1,7 71,9±5,6* 70,4±3,9 85,3±3,0* 26,9±1,7 45,0±1,9* 42,б±3,1 5б,8±1,9*

Интактные (контроль) ОВА (опыт) 54,1±4,4 31,6±4,5* 73,3 ±3,8 45,б±4,2* 32,7±1,7 21,7±0,5* 44,5±1,4 30,4±1,7*

Интактные (контроль) Беременные (опыт) 62,6±7,6 29,9±7,3* 81,3±5,3 58,2±3,7* 29,0±2,8 18,7±1,7* 40Д±2,4 25,7±4,4*

Примечание: * - различия с контролем достоверны (р<0,05).

Действие естественных супрессорных клеток на Thl- и ТЬ2-зависимые иммунологические реакции in vivo. Непосредственное влияние ECK на функции Т-лимфоцитов in vivo ранее совсем не исследовалось, тем более не изучалось их действие на поляризованные Т-клетки. Для оценки действия ECK на функцию Thl мы использовали адоптивный вариант реакции ГЗТ. Для того, чтобы иметь возможно корректно сравнить влияние ECK на Thl и Th2, действие ECK на поляризованные по 2 типу лимфоциты мы оценивали в модели, аналогичной адоптивному варианту реакции ГЗТ, но вызываемой введением Th2 и, соответственно, зависимой от ИЛ-4 [Muller K.M. et al., 1993; Muller K.M., et al., 1994; Terui T. et al., 2001]. Для исследования действия ECK животным опытной группы кроме спленоцитов в обе лапы вводили также миелокариоциты с плотностью менее 1,077 г/л. По изменению величины отека судили о влиянии ECK.

Для изучения влияния на ТЫ-зависимый отек ECK костного мозга интакт-ных животных вводили вместе с лимфоцитами иммунизированных БЦЖ мышей и антигеном (БЦЖ). ECK снижали величину отека почти в 4 раза (рис. 1, В): с 27,5±4,0 до 7,1±1,5. Контрольные клетки (с плотностью более 1,077 г/л) не влияли на величину отека (рис. 1, А). ECK костного мозга животных с Thl-зависимым иммунным ответом также практически полностью подавляли реакцию: с 25,2±2,5 до 4,7±1,9 (рис. 1, С). ECK костного мозга животных с "Независимым иммунным ответом также снижали ее индекс в 3,4 раза, с 33,3±5,6 до 10,1±2,1 (рис. 1, D).

Как известно, в сенсибилизированном организме на начальной стадии ГЗТ происходит активация эндотелиальных клеток сосудов, привлечение и активирование антиген-специфических Т-лимфоцитов. Затем наступает следующая стадия, в которую антиген-специфические Т-лимфоциты начинают продуцировать хемотаксические и активирующие цитокины, что приводит к привлечению и активированию таких эффекторных клеток, как гранулоциты и макрофаги, которые секретируют соответствующие цитокины и производные активных форм кислорода, что усиливает проницаемость сосудов и выход из них жидкости [Askerase P.W., 1992]. При адоптивном варианте ГЗТ начальная стадия отсутствует, а в месте введения у интактного животного развивается только последняя стадия реакции [Bianchi A.T.J., 1981; Scovern H., 1982]. Установлено, что Thl лимфоциты могут индуцировать реакцию ГЗТ при их введении в подушечку лапы, ключевым цитокином, регулирующим эту реакцию, является ИФ-у [Cher D.J., 1987; Fong T.А., 1989; Muller K.M., 1993]. Полагаясь на данные литературы и собственные результаты, полученные in vitro, можно представить один из вероятных вариантов развития событий. Введенные в подушечку лапы антиген-специфические лимфоциты под действием антигена (БЦЖ) продуцируют повышенные количе-

ства ИФ-у, что вызывает увеличение синтеза NO естественными супрессорными клетками, который подавляет продукцию хемотаксических и активирующих ци-токинов, предотвращая появление отека. Возможно, что такой механизм имму-носупрессорного действия ECK не единственный, однако ответить на этот вопрос могут только дальнейшие исследования.

Рисунок 1. Влияние миелокариоцитов с высокой плотностью, полученных из интактного организма (А), а также ECK интактного костного мозга (В), ECK животных, иммунизированных БЦЖ (С) или ОВА (D), на Thl- и Независимый отек in vivo.

ДЦ - контроль (без миелокариоцитов), |—| - опыт (с миелокариоцитами).

Для изучения действия на ТЬ2-зависимый отек ECK интактных животных вводили вместе с лимфоцитами иммунизированных ОВА мышей в смеси с ОВА. Мы обнаружили увеличение индекса реакции в 1,8 раза: с 17,5±3,1 до 31,3±3,8 (рис. 1, В). То, что данный эффект связан с ECK, подтвердили эксперименты, в

который использовали неприлипающие костномозговые клетки с плотностью более 1,077 г/л (рис. 1, А). Такие миелокариоциты не влияли на реакцию. Когда использовали ECK костного мозга иммунизированных БЦЖ мышей, также наблюдали увеличение реакции в 1,9 раза: с 11,5±2,1 до 21,8±2,6 (рис. 1, С). ECK костного мозга иммунизированных ОВА животных также повышали степень выраженности отека в 1,7 раза: с 14,3±1,7 до 24,2±2,8 (рис. 1, D).

Известно, что за реакцию ГЗТ ответственны Thl лимфоциты [Cher D.J., 1987; Fong T.А., 1989; Muller K.M., 1993]. Однако Th2 лимфоциты способны индуцировать ГЗТ-подобную реакцию, которую можно оценивать, как и ГЗТ, по локальному отеку [Muller K.M. et al., 1993; Muller K.M., et al., 1994; Terui T. et al., 2001; Woodfolk J.A. et al., 2001]. Механизм развития ГЗТ-подобной реакции, которую вызывают антиген-специфические Th2 клетки, до конца не понятен. Известно, что инфильтрат, образующийся в месте введения лимфоцитов с антигеном, состоит в основном из эозинофильных лейкоцитов с относительно небольшой примесью нейтрофильных лейкоцитов, в то время как инфильтрат, вызванный Thl клетками состоит из нейтрофильных лейкоцитов с незначительной примесью эозинофилов [Terui T. et al., 2001]. Локальный отек, индуцированный Thl или Th2 лимфоцитами, различается по кинетике: реакция, вызванная Thl, возникает через 12 ч и достигает максимума к 48 ч; реакция, вызванная Th2, обнаруживается уже через 6 ч, достигая пика к 24 ч, а к 48 ч исчезает [Terui T. et al., 2001]. Отек, вызванный Th2 клетками, отменялся при блокировании ИЛ-4 в ранние сроки после введения в подушечку лапы антиген-специфических Th2 лимфоцитов с антигеном, хотя сам ИЛ-4 не был способен вызвать ГЗТ-подобную реакцию [Muller K.M., 1993].

Как уже говорилось ранее, при развитии ГЗТ, вызванной Thl клетками, главную роль играет ИФ-у [Cher D.J., 1987; Fong T. А., 1989], который, вероятно, через стимуляцию синтеза NO и обеспечивает наблюдаемый иммуносупрессор-ный эффект ECK. При реакции, вызванной Th2 клетками, влияние ИФ-у на ECK исключается, а появление отека обеспечивается цитокинами Th2, следовательно, NO-зависимый механизм активности ECK не возможен. Это объясняет отсутствие иммуносупрессии при ГЗТ-подобной реакции, индуцированной Th2 лимфоцитами. Интересно другое: при этой реакции мы наблюдали не просто отсутствие действия со стороны ECK, а, напротив, ее стимуляцию.

Хорошо известно, что Т-хелперы (как Thl, так и Th2) индуцируют продукцию медиаторов, избирательно благоприятствующих собственному функционированию. Например, Т-хелперы активируют макрофаги по соответствующему пути (классическому или альтернативному), которые секретируют цитокины, поддерживающие данный тип поляризации [Abbas A.K. et al., 1996; Munder M. et

al., 1998; Mills C.D. et al., 2000; Loke P. et al., 2002]. Вполне вероятно, что введенные в подушечку лапы ECK в условиях гиперпродукции цитокинов Th2 начинают секретировать вещества, способствующие функционированию Th2. Одним из кандидатов на роль такого цитокина является ИЛ-Ю [Mosmann T.R. et al., 1989], о секреции которого естественными супрессорными клетками имеются данные в литературе [Brooks-Kaiser J.C. et al., 1993; Terrazas L.I. et al., 2001].

Анализ всех полученных нами результатов показывает, что повышение активности ECK является закономерностью иммунного ответа, что при поляризации Th изменяются (увеличиваются) количественные характеристики естественной супрессорной активности, а ее качество остается одним и тем же не зависимо от направления поляризации - активность ECK всегда зависима от интерферона^. Механизм активности ECK определяют клетки-мишени, от которых собственно и зависит конечный результат их взаимодействия с ECK. ECK обладают избирательностью действия, подавляя Thl поляризацию и тем самым способствуя сдвигу поляризации во 2 тип.

На основании полученных результатов мы схематично представили взаимодействие ECK и поляризованных лимфоцитов следующим образом (рис. 2, 3 и 4) В интактном организме существует некоторый фоновый обмен сигналами между лимфоцитами селезенки и ECK, находящихся в костном мозге (рис. 2, А). При появлении антигена, вызывающего Thl-зависимый иммунный ответ (рис. 2, Б), формируется очаг воспаления, в который мигрируют наивные лимфоциты где и происходит их дифференцировка. Поляризованные лимфоциты попадают также из очага воспаления в селезенку. Активированные лимфоциты стимулируют ECK костного мозга, которые перемещяются в очаг воспаления и в селезенку. Поскольку ТЫ вырабатывают повышенное количество ИФ-у, то у активированных таким образом естественных супрессорных клеток значительно возрастает уровень синтезируемого оксида азота, что приводит к сдерживанию иммунной реакции, а также способствует ее угасанию. Если же по какой-либо причине развивается гиперактивация иммунитета, например, при увеличении антигенной стимуляции (рис. 3, А), то происходит еще большая активация ECK, что ведет к еще большему увеличению уровня синтезируемого ими NO и к развитию NO-зависимой иммуносупрессии (рис. 3, Б). Клиническими проявлениями такой ситуации может быть установление толерантности на данный антиген (например, приживление аллотрансплантата) либо хронизация воспаления (например, персистирование инфекции).

Рис. 2. Схема взаимодействия Т-лимфоцитов и ECK при развитии Thl-зависимого иммунного ответа.

Антиген

Селезенка

Костный мозг

Очаг воспаления

Селезенка

ЕСК-^О*

Костный мозг

. Антиген

V ЕСК

Очаг воспаления

Рис. 3. Схема развития иммуносупрессии, вызываемой ЕСК.

Костный мозг

Антиген

Селезенка

Костный мозг

Антиген

Рис. 4. Схема взаимодействия Т-лимфоцитов и ECK при развитии Независимого иммунного ответа.

Рассмотрим ситуацию иммунного ответа 2 типа (рис. 4). В результате появления антигена происходит формирование очага воспаления, в который мигрируют лимфоциты (рис. 4, А). Затем происходит их поляризация в Th2 и миграция в селезенку. Поляризованные клетки через цитокины своего профиля (в том числе через ИЛ-4) активируют ECK костного мозга, которые также мигрируют и в очаг воспаления, и в селезенку. Но активированные Th2 цито-кинами естественные супрессорные клетки не только не подавляют иммунный ответ, а напротив, стимулируют его (рис. 4, Б). Клиническим примером такой ситуации может быть развитие и поддержание ТЪ2-зависимого ответа на гельминтные антигены.

Вероятно, обнаруженные нами свойства ECK в отношении поляризации являются отражением их физиологической роли в организме, которая заключается в поддержании гомеостаза иммунной системы и создании условий для развития толерантности.

ВЫВОДЫ

1. Стимуляция иммунной системы, при которой происходит изменение (повышение или снижение) продукции цитокинов Т-лимфоцитами селезенки, приводит к активации естественных супрессорных клеток костного мозга и увеличению продукции ими оксида азота. Повышение активности естественных супрессорных клеток является общей закономерностью иммунного ответа.

2. Активность естественных супрессорных клеток в отношении наивных Т-лимфоцитов повышается при развитии как ТЫ-, так и "Независимого, связанного с анафилаксией и толерантностью, иммунного ответа. При этом продукция оксида азота естественными супрессорными клетками увеличивается.

3. Естественные супрессорные клетки интактных животных и мышей с развившимся первым и вторым типом иммунного ответа (гиперчувствительность немедленного типа и толерантность) подавляют пролиферацию поляризованных Т-лимфоцитов как первого, так и второго типов, включающего анафилаксию и толерантность. Активность естественных супрессорных клеток костного мозга животных с развившимся первым или вторым типом иммунного ответа в отношении поляризованных лимфоцитов выше, чем активность естественных супрессорных клеток интактного организма.

4. Естественные супрессорные клетки костного мозга, как интакт-ных, так и мышей с развившимся Thl- и ТЬ2-зависимым иммунным ответом, ингибируют выработку основных цитокинов Thl (интерферона-гамма и ин-терлейкина-2).

5. Естественные супрессорные клетки костного мозга интактных животных подавляют продукцию основного цитокина Т хелперных клеток 2 типа (интерлейкина-4).

6. Антипролиферативная активность естественных супрессорных клеток костного мозга интактных животных в отношении пролиферации Thl клеток выше, чем в отношении наивных Т-лимфоцитов.

7. Активность естественных супрессорных клеток, полученных от животных с Thl-зависимым иммунным ответом, в отношении пролиферации Thl клеток выше, чем в отношении наивных Т-лимфоцитов, но в отношении Th2 клеток (связанных с развитием как анафилаксии, так и толерантеости) ниже, чем в отношении наивных Т-лимфоцитов.

8. Активность естественных супрессорных клеток, полученных от животных с ТЪ2-зависимым иммунным ответом, связанным с развитием как анафилаксии, так и толерантности, в отношении пролиферации Thl клеток выше, чем в отношении наивных Т-лимфоцитов, но в отношении Th2 клеток (связанных с развитием как анафилаксии, так и толерантеости) ниже, чем в отношении наивных Т-лимфоцитов.

9. Активность естественных супрессорных клеток, полученных от животных с Т112-зависимым иммунным ответом (при развитии анафилаксии), в отношении пролиферации Thl клеток выше, чем в отношении наивных Т-лимфоцитов, а в отношении Th2 клеток (связанных с развитием анафилаксии и толерантности) ниже, чем в отношении наивных Т-лимфоцитов.

10. Естественные супрессорные клетки вне зависимости от источника получения (костный мозг интактных животных, а также мышей с развившимся Thl - или ТЬ2-зависимым иммунным ответом) оказывают протипоположное действие на развитие Thl- и ТЬ2-зависимых иммунологических реакций in vivo', подавляют Th 1-зависимый отек и увеличивают ТЬ2-зависимый отек.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Влияние рекомбинантного ГМ-КСФ на активность естественных супрессорных клеток // Сб. тр. молодых ученых СО РАМН, Новосибирск.-1993.-С.125-128 (соавторы Бельский Ю.П., Кусмарцев С.А.).

2. Increasing activity of natural supressor cells and production suppressor factor by bone marrow cells in aging of mice of high-tumor strain // II Internet. Congress IS-N14, Paestum, Italy, 1993.-P. 284 (соавторы Вельский Ю.П., Кусмарцев СЛ.).

3. An increase of natural suppressor cell activity in mice following the injection of GM-CSF in vivo И XII Europ. Immunol. Conf., Barcelona, Spain, 1994.-P. 294 (соавторы Кусмарцев C.A., Вельский Ю.П., Агранович И.М.).

4. Естественные супрессорные клетки (обзор) И Успехи совр. биологии. -

1994. - Т. 114, вып (№) 6. - С.705-714 (соавторы Кусмарцев С.А., Вельский Ю.П , Агранович И.М.).

5. Дифференциальная индукция естественной супрессорной активности клеток костного мозга in vitro различными типами опухолей // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1995. - № 8. - С. 184-187 (соавторы Вельский Ю.П., Кусмарцев С.А., Агранович И.М.).

6. Влияние экзогенного эритропоэтина на супрессорную активность клеток костного мозга и селезенки мышей II Экспериментальная иммунология. - Томск,

1995. - С. 31-38 (соавтор Кусмарцев С.А.).

7. Индукция супрессорного фактора, обладающего выраженными антипро-лиферативными свойствами in vitro // Клинич. и эксперим. исследования молодых ученых СО РАМН. - Новосибирск, 1996. - С. 44 (соавтор Кусмарцев С.А.).

8. Роль простагландинов в индукции неспецифических супрессоров костного мозга супернатантом опухоли Эрлиха // Медико-биологические аспекты ней-ро-гуморальной регуляции. - Томск, 1997. - С. 309-311 (соавторы Кусмарцев С.А., Вельский Ю.П., Данилец М.Г.).

9. Супрессорная и противоопухолевая активность клеток костного мозга и селезенки мышей AKR при старении // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1999. - Т. 127, № 4. - С. 452-454 (соавторы Вельский Ю.П., Данилец М.Г., Стальбовская Е.С., Кусмарцев С. А.).

10. Characteristics of suppressor factor produced by bone marrow cells after DT treatment // Immunology. - 1995. - V. 86. - Suppl. 1. -P. 126 (соавторы Кусмарцев С.А., Вельский Ю.П.).

11. Регуляция антипролиферативной активности неприлипающих клеток костного мозга. Роль интерферона-гамма // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1999. -Т. 128, № 12. - С. 677-680 (соавторы Вельский Ю.П., Данилец М.Г., Стальбовская Е.С., Кусмарцев С.А.).

12. Характеристика естественной супрессорной активности при росте опухоли Эрлиха // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2000. - Т. 129. - Прилож. 1. - С. 6063 (соавторы Данилец М.Г., Вельский Ю.П., Стальбовская Е.С., Кусмарцев С. А., Агафонов В.И.).

13. Механизм усиления иммуносупрессорных свойств клеток костного мозга при росте карциномы Эрлиха // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2001. - Прилож. 1. - С. 75-77 (соавторы Трофимова Е.С., Вельский Ю.П., Агафонов В.И.).

14. Разнонаправленное действие дексаметазона на противоопухолевую и естественную супрессорную активность клеток костного мозга // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2000. - Т. 129, № 4. - С. 386-388 (соавторы Стальбовская Е.С., Вельский Ю.П., Агафонов В.И.).

15. Характеристика противоопухолевых свойств гемопоэтических клеток // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. — Томск, 2001. - С. 14-17 (соавтор Трофимова Е.С.).

16. Иммуносупрессорная активность клеток костного мозга с разной плавучей плотностью у мышей линии AKR // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. - Томск, 2002. - С. 114-117 (соавтор Трофимова Е.С.).

17. Влияние спонтанной Т-лимфомы на иммуносупрессорную и противоопухолевую активности клеток костного мозга in vitro II Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. - Томск, 2002. - С. 117-120 (соавтор Трофимова Е.С.).

18. Состояние кроветворных и лимфоидных органов у мышей линии AKR/JY с лимфомой тимуса // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2002. - № 7. - С. 79-82 (соавторы Карпова Г.В., Фомина Т.И., Абрамова Е.В., Трофимова Е.С., Пе-рельмутер В.М.).

19. Характеристика старых мышей линии AKR/JY // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. - Томск, 2002. - Т. 2. - С. 76-80 (соавторы Карпова Г.В., Фомина Т.И., Абрамова Е.В., Трофимова Е.С.).

20. Активность протеолитических ферментов и их ингибиторов в процессе пролиферации клеток мастоцитомы Р-815 in vitro 11 Вопросы онкологии. - 2001. -Т. 47, № 5. - С. 619-622 (соавторы Акбашева O.E., Вельский Ю.П., Панова Т.И).

21. Влияние цитокинов и их комбинаций на экспрессию сиалоадгезина макрофагами костного мозга // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2003. - Т. 136, № 8. -С. 160-162 (соавторы Кусмарцев С.А., Данилец М.Г., Агафонов В.И., Дыгай A.M., Гольдберг Е.Д.).

22. Естественная супрессорная активность и опухолевый рост // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2003. - Прилож. № 2. - С. 68-75 (соавторы Бельский Ю.П., Данилец М.Г., Трофимова Е.С., Патрушев В.К., Агафонов В.И.).

23. Роль естественных супрессорных клеток во взаимодействии гемопозти-ческой и иммунной систем // Експериментальна i клнична медицина (Харьков). -

2003. - № 2. - С. 36-43 (соавторы Вельский Ю.П., Данилец М.Г., Патрушев В.К., Агафонов В.И.).

24. Изучение активности естественных супрессорных клеток при опухолевом росте // Актуальные проблемы фармакологии. - Томск, 2004. - С. 34-36 (соавторы Вельский Ю.П., Данилец М.Г., Трофимова Е.С., Патрушев В.К., Агафонов В.И.).

25. Иммуносупрессорная активность естественных супрессорных клеток при гиперчувствительности немедленного типа, вызванной овальбумином // Актуальные проблемы фармакологии. - Томск, 2004. - С. 99-101 (соавторы Патрушев

B.К., Данилец М.Г., Трофимова Е.С., Вельский Ю.П., Агафонов В.И.).

26. Роль клеточных взаимодействий в индукции противоопухолевой активности естественных супрессорных клеток // Сб. статей по материалам Y Конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке», Томск, 2004. - С. 314-315 (соавторы Патрушев В.К., Вельский Ю.П., Данилец М.Г., Трофимова Е.С., Агафонов В.И.).

27. Иммуносупрессорная и противоопухолевая активности различных популяций костномозговых клеток Н Сибирский онкологический журнал (Томск). -

2004. - № 2-3 (10-11). - С.118-123 (соавторы Вельский Ю.П., Данилец М.Г., Патрушев В.К., Трофимова Е.С., Агафонов В.И.).

28. Роль оксида азота в иммуносупрессорной активности клеток костного мозга при экспериментальном опухолевом росте // Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии. - Томск, 2004. - С. 63-64 (соавторы Вельский Ю.П., Данилец М.Г., Трофимова Е.С., Патрушев В.К., Агафонов В.И.).

29. Иммуносупрессорная и противоопухолевая активности клеток костного мозга у животных с разным генотипом. Роль оксида азота II Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии. -Томск, 2004. - С. 61-62 (соавторы Вельский Ю.П., Данилец М.Г., Трофимова Е.С., Патрушев В.К., Агафонов В.И.).

30. Продукция оксида азота клетками опухолевых линий // Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии. -Томск, 2004. - С. 180-181 (соавторы Патрушев В.К., Вельский Ю.П., Данилец М.Г., Трофимова Е.С., Агафонов В.И.).

31. Иммуносупрессорная активность костномозговых клеток мышей при гиперчувствительности немедленного типа // Иммунология. - 2004. - Т. 25, № 4. -

C. 213-215 (соавторы Вельский Ю.П., Патрушев В.К., Данилец М.Г., Трофимова Е.С., Агафонов В.И.).

32. Клетки опухоли Эрлиха стимулируют продукцию интерферона-у Т-

клетками и не чувствительны к аутокринному оксиду азота // Вопросы онкологии. - 2004. - Т. 50, № 6. - С. 689-692 (соавторы Вельский Ю.П., Данилец М.Г., Трофимова Е.С., Патрушев В.К., Агафонов В.И.).

33. Средство, обладающее противоаллергическим действием // Патент № 2240801 РФ от 27.11.2004 г. (соавторы Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Агафонов

B.И., Бельский Ю.П., Данилец М.Г., Трофимова Е.С.).

34. Механизм противоопухолевой активности естественных супрессорных клеток костного мозга Н Бюлл. эксперим. биол. и медиц. - 2005. - Т. 139, № 2. -

C.208-210 (соавторы Бельский Ю.П., Патрушев В.К., Данилец М.Г., Трофимова Е.С., Агафонов В.И.).

35. Роль оксида азота в иммуносупрессорной и противоопухолевой активностях клеток эмбриональной печени // Бюлл. Сибирского отделения Российск. Академии медиц. наук. - 2005. - № 2 (116). - С. 74-77 (соавторы Бельский Ю П., Данилец М.Г., Патрушев В.К., Трофимова Е.С., Агафонов В.И.).

36. Естественная супрессорная активность клеток костного мозга при иммунном ответе // Бюлл. эксперим, биол. и медиц. - 2005. - Прилож. 1. - С. 61-64 (соавторы Бельский Ю.П., Данилец М.Г., Борсук О.С., Трофимова Е.С., Патрушев В.К., Агафонов В.И.).

37. Влияние естественных супрессорных клеток костного мозга на поляризованные Т-лимфоциты // Бюлл. эксперим. биол. и медиц. - 2005. - Прилож. 1,-С. 65-68 (соавторы Бельский Ю.П., Данилец М.Г., Трофимова Е.С., Патрушев В.К., Шерстобоев Е.Ю., Агафонов В.И.).

»21 2 44

РНБ Русский фонд

2006-4 18736

Заказ 952. Тираж 100. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники Пр. Ленина, 40

Актуальность проблемы. Регуляция иммунного ответа представляет собой важную как с теоретической, так и с практической точки зрения проблему. Центральное место в регуляции иммуннологической реакции и определении ее исхода, как известно, принадлежит цитокинам, которые вырабатывают Т-хелперами.

Показано, что после дифференцировки и созревания в тимусе наивные Th прекурсоры мигрируют в периферические органы иммунной системы, где под действием антигена необратимо дифференцируются в два разных типа - Thl или Th2 [Seder R.A. et al., 1993], которые различаются по набору секретируемых цитокинов JMosmann V.R. et al., 1986]. Для Thl характерны следующие черты: секреция ИФ-у, ИЛ-2, лимфотоксина (TNF-P), индукция продукции В-клетками антител IgG2a, участие в ГЗТ и защите от внутриклеточных патогенов. Th2 клетки вырабатывают ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, преобладают при гельминтозах и аллергиях, способствуют генерации IgE-синтезирующих В клеток, играют важную роль в гуморальном иммунном ответе [Le Gros G. et al., 1990; Sornasse T. et al., 1996]. В настоящее время не вызывает сомнений, что основным фенотипическим признаком Thl является высокая продукция ИФ-у, а характерным признаком Th2 - повышенная продукция ИЛ-4 [Romagnani S., 1991; Abbas А.К. et al., 1996; O'Gaira A., 1998].

Баланс между дифференцировкой Т-хелперов в Thl или Th2 является определяющим для исхода иммунного ответа, связанного с инфекцией, аутоиммунитетом или аллергическими заболеваниями [Abbas А.К. et al., 1996]. Аутоиммунные заболевания обусловлены выраженным, но аномальным, Thl ответом, в то время как аллергические заболевания - чрезмерным Th2 ответом. Показана роль Thl в иммунопатологии заболеваний центральной нервной системы, множественного склероза, экспериментального аллергического энцефаломиелита [Fssazadeh S. et al., 1995; Lafaille J.J. et al., 1997], колитов [Asseman С. et al., 2003], аутоиммунного диабета [Mason D. et al., 1998], ревматоидного артрита [Goldberg R. et al., 2004; Latham К.A. et al., 2005], псориаза [Uyemura К. et al., 1993; Nomura I. et al., 2003]. Известна роль Th2 в патогенезе бронхиальной астмы [Krug N. et al., 1997], идиопатического пневмофиброза [Smith R.S. et al., 1997], диабета и панкреатита [Pakala S.V. et al., 1997]. Выявлено, что дисбаланс цитокинов Thl и Th2 является важнейшим механизмом атопического дерматита как у человека, так и в экспериментальных моделях [Tsicopoulos А. et al., 1994; Werfel Т. et al., 1996].

Показано, что большое значение для направления поляризации имеет сам антиген, его структура и доза, а также способ его попадания в oprami3M [Constant-S. etai., 1997; Тао X. et.al., 1997; Q'Garra А., 1998]. Некоторые патогены (Leishmania, Listeria, Mycobacteria) или гельминты вызывают развитие четкой поляризации ThO либо в Thl либо в Tli2 [Hoebe К. et al., 2004]; однако наблюдаются и ситуации, когда Т-лимфоциты в ответ на антиген продуцируют смешанный тип цитокинов [Kelso А., 1995]. Антиген-презентирующие клетки, прежде всего дендритные клетки, могут направлять дифференцировку ThO [Steinman R.M., 1983; Banchereau J. et al., 1998]. Продуцируя ИЛ-12 [Macatonia S.E. et al., 1995; Koch F. et al., 1996], дендритные клетки могут создавать условия для предпочтительного развития Thl in vitro и in vivo [Langenkamp A. et al., 2000; Tanaka H. et al., 2000]. В то же время другие антиген-презентирующие клетки (B-лимфоциты) [Stockinger В. et al., 1996; Macaulay А. Е. et al., 1997] и клетки NK-T [Bendelac А. et al., 1997] могут способствовать развитию Tli2.

Если 1 тип поляризации обеспечивает протективный клеточный иммунитет, то клинические проявления Th2 ответа более разнородны: во-первых, реакции гиперчувствительности немедленного типа (анафилактические реакции, бронхиальная астма, гельминтозы) [Finkelman F.D. et al., 1988; Clutterbuck E.J. et al., 1989], во-вторых, ситуации толерантности иммунной системы (оральная толерантность, беременность, опухолевый рост), когда наряду с секрецией ИЛ-4 начинает преобладать выработка ТФР-ß и ИЛ-10 [Klioury S. J. et al., 1992; Maeda H. et al., 1996].

К числу регуляторов иммунологических реакций относятся и естественные супрессорные клетки (ECK). Показано, что ECK, представляющие собой крайне не однородную популяцию гемопоэтических клеток разной степени зрелости, участвуют в негативномрегулированиирядаиммунологическихреакций,. неспецифически подавляя пролиферацию иммунокомпетентных клеток [Hoskin D.W. et al., 1989а; Subiza J.L. et al., 1989; Fu Y.X. et al., 1991; Brooks-Kaiser 1С. et al., 1992; Yamamoto H. et al., 1994].

Естественная супрессорная активность обнаруживается в местах нормального гемопоэза, например, в костном мозге взрослого организма [Sugiura К. et al., 1988], печени эмбриона [Чеглякова В.В., 1984], неонатальной селезенке [Schwadron R.B. et al., 1985]. Активность ECK возрастает в ситуациях усиленного кроветворения при беременности [Brooks-Kaiser .Т.С. et al., 1993а], опухолевом росте [Subiza J.L. et al., 1989; Young M.R.I, et al., 1992b], в результате воздействий, нарушающих гомеостаз в системе крови (гипоксия, кровопотеря [Чеглякова В.В., 1984]), а также под влиянием физических (облучение) и химических факторов, повреждающих гемопоэз (введение фенилгидразина [Кашлакова Н.В., 1987; Митасов А.В. с соавт., 1990], циклофосфана [Pela'ez В. et al., 2001]).

Участие ЕСК в регуляции иммунного ответа на инфекционные агенты изучено мало. Так, показано, что при введении животным БЦЖ [Kato К. et al., 1985], вируса гриппа [Kusmartsev S.A. et al., 2003а], гельминтных олигосахаридов [Terrazas L.I. et al., 2001], заражении Trypanosoma African [Schleifer K.W. et al., 1993], Salmonella [al-Ramadi B.K. et al., 1991], Schistosoma mansoni [Marshall M.A. et al., 2001], при нематодной инфекции Brugia malayi [Loke P. et al., 2000], после введения суперантигена [Terabe M. et al., 2000] активность ЕСК значительно возрастала.

В основе механизма действия ЕСК лежит секреция ими супрессорных факторов. Оксид азота выступает в роли единственного иммуносупрессорного—фактора—ЕСК—костного—мозга—интактных животных [Angnlo I. et al., 1995], а также животных, получивших циклофосфан [Angulo I. et al., 2000], у мышей с опухолью [Serafini P. et al., 2004] или с РТПХ [Billiau A.D. et al., 2003], при заражении Trypanosoma African [Schleifer K.W. et al., 1993], при введении гельминтных антигенов [Atochina О. et al., 2001] или суперантигена [Cauley L.S. et al., 2000]. Другими супрессорными факторами ЕСК многие авторы называют ТФР-р и ИЛ-10, который стимулирует продукцию ТФР-р. ЕСК, секретирующие ТФР-Р и ИЛ-10, обнаружены в селезенке мышей во время беременности [Brooks-Kaiser J.С. et al., 1993а], при росте ряда опухолей [Terabe М. et al., 2003], после введения гельминтных олигосахаридов [Terrazas L.I. et al., 2001]. ECK могут частично осуществлять свое иммуносупрессорное действие, вырабатывая простагландины (простагландин Е2), что показано при РТПХ [Huchet R. et al., 1993], при канцерогенезе [Fu Y.X. et al., 1991], при заражении мышей Trypanosoma African [Schleifer K.W. et al., 1993]. Обнаружено, что ECK костного мозга и селезенки мышей-опухоленосителей могут оказывать иммуносупрессорное действие за счет усиленной выработки активных форм кислорода (супероксидрадикал и его производные) [Bronte V. et al., 2003; Kusmartsev S. et al., 2003b], Однако в качестве супрессорных факторов ECK чаще других обнаруживают NO и ТФР-ß.

Активность ECK регулируется различными цитокинами, такими как ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6, ШИЗ, ГМ-КСФ, ИФ-у, TNF-a [Holda J.H. et al., 1990; Fu Y.X. et al., 1991; Angulo I. et al., 1995; Billiau A.D. et al., 2003; Terabe M. et al., 2004; Serafini P. et al., 2004]. Вероятно, их набором и определяется, какие факторы будут продуцировать ECK в той или иной ситуации^---------------

Имеющиеся в настоящий момент данные позволяют предположить, что активация NO- или ТФР-Р-продуцирующих ECK должна происходить в зависимости от типа поляризации лимфоцитов в конкретной ситуации. Такого типа взаимоотношения показаны между поляризованными Т-лимфоцитами и зрелыми макрофагами [Munder М. et al., 1998; Mills C.D. et al., 2000]. Активировать макрофаги способны как Thl, так и Th2 лимфоциты, но функциональные свойства при этом будут различны. Макрофаги, индуцированные при Thl-зависимом иммунном ответе, называют «классически активированными» (М-1), а индуцированные Т1т2 цитокинами (ИЛ-4 и ИЛ-10) - «альтернативно активированные» (М-2). М-1 секретируют оксид азота и другие воспалительные медиаторы (такие как ИЛ-1, ИЛ-6, TNF-a) [Jorens P.G. et al., 1995; MacMicking J. et al., 1997]. Напротив, М-2 не синтезируют оксид азота, а при помощи аргиназы 2 метаболизируют аргинин с образованием L-орнитина и мочевины [Corraliza I.M. et al., 1995; Modolell M. et al., 1995; Loke P. et al., 2002].

О наличии связи между поляризацией Т-хелперов и функциональной активностью ЕСК, на наш взгляд, свидетельствуют и данные о генетической предрасположенности развивать определенный тип ответа и выраженностью иммуносупрессорной активности у мышей разных линий. Так, максимальная активность ЕСК отмечена у мышей B10.D2 и C57BI/6, а минимальная - у BAlb/c [Maíer Т. et al., 1989]. Мыши линии B10.D2 и C57BL/6 склонны развивать Thl-зависимый клеточный ответ, в то время как BAlb/c — Th2-зависимый [Heinzel F.P. et al., 1989; Locksley R.M. et al., 1991; Hsieh C.S. et al., 1995; Shibuya K. et al., 1998]. Именно y Thl линий (B10.D2 и C57BL/6) макрофаги склонны развивать М-1 ответ и усиленно продуцировать ИФ-у по сравнению с макрофагами Th2 линии (BAlb/c) [Buchmuller-Rouiller Y. et al., 1986; Liew F.Y. et al., 1991; Oswald I.P. et al., 1992a; Stenger S. et al., 1994; Dileepan K.N. et al., 1995].

Существующие к настоящему времени работы, в которых показано повышение активности ЕСК ш vivo, можно разделить на две группы. Первая из них включает исследования ЕСК в условиях стимуляции кроветворения, а другая группа работ проведена с использованием иммунологических моделей, для большинства из которых характерно либо состояние толерантности (опухолевый рост, беременность) либо, вероятнее всего, дифференцировка лимфоцитов в Thl (иммунизация

БЦЖ или Salmonella typhimurium). Однако тип поляризации в этих работах не изучался. Совсем не исследованным остался еще один вид иммунных реакций, связанный с поляризацией Th2 - реакции гиперчувствительности немедленного типа. В связи с изложенным выше представляется актуальным исследовать активность ECK при ТЫ- и ТЪ2-зависимом иммунном ответе, а также оценить влияние ECK на поляризованные Т-лимфоциты.

Цель исследования: изучить влияние естественных супрессорных клеток костного мозга на поляризованные Т-лимфоциты, исследовать влияние поляризации Т хелперов 1 и 2 типов на естественные супрессорные клетки.

Задачи исследования:

1. Изучить изменение активности естественных супрессорных клеток костного мозга при развитии иммунного ответа, вызванного различными антигенными стимулами.

2. Исследовать активность естественных супрессорных клеток костного мозга при развитии Thl- иТЬ2-зависимого иммунного ответа.

3. Оценить влияние естественных супрессорных клеток костного мозга интактного организма на пролиферацию поляризованных Т-лимфоцитов.

4. Исследовать действие естественных супрессорных клеток костного мозга, полученных от животных с установившейся поляризацией 1 и 2 типа, на пролиферацию поляризованных Т-лимфоцитов.

5. Изучить влияние естественных супрессорных клеток костного мозга на продукцию цитокинов Т-лимфоцитами.

6. Сравнить действие естественных супрессорных клеток костного мозга интактных животных на пролиферацию наивных и поляризованных Т-лимфоцитов.

7. Сравнить действие естественных супрессорных клеток костного мозга, полученных от животных с развившимся Thl-зависимым иммунным ответом на пролиферацию наивных и поляризованных Т-лимфоцитов.

8. Сравнить действие естественных супрессорных клеток, полученных от животных с развившимся Независимым иммунным ответом (в моделях анафилаксии и толерантности) на пролиферацию наивных и поляризованных Т-лимфоцитов.

9. Оценить влияние естественных супрессорных клеток костного мозга интактных животных на развитие Till- и ТЬ2-зависимых иммунологических реакций in vivo.

10. Изучить влияние естественных супрессорных клеток животных с Thl- и ТЬ2-зависимым иммунным ответом на развитие Till- и Независимых иммунологических реакций ш v¿va

11. Оценить участие оксида азота в активности естественных супрессорных клеток интактных и иммунизированных животных в отношении поляризованных Т-лимфоцитов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Иммуносупрессорная и NO-синтезирующая активности естественных супрессорных клеток костного мозга повышаются при любом виде иммунного ответа, как протекающего с развитием поляризации 1 типа, так и сопровождающегося дифференцировкой Т-хелперов в Th2 с развитием анафилаксии или толерантности.

2. Естественные супрессорные клетки костного мозга обладают способностью ингибировать как пролиферацию поляризованных лимфоцитов (1 типа и дифференцированных во 2 тип с развитием анафилаксии или толерантности), так и подавлять продукцию цитокинов наивными и поляризованными Т-клетками. При этом ингибируется продукция лимфоцитами цитокинов как ТЫ, так и Th2 типа.

3. Т-хелперы 1 типа являются предпочтительной мишенью для антипролиферативного действия естественных супрессорных клеток костного мозга как интактного организма, так и животных с Thl или Th2 иммунным ответом.

4. Естественные супрессорные клетки костного мозга способствуют протеканию Th2 иммунного ответа in vivo: подавляют Thl-зависимую реакцию (ГЗТ) и, напротив, стимулируют Tli2-зависимую (ГЗТ-подобную) реакцию.

Научная новизна. Впервые проведено систем гное исследование иммуносупрессорной и NO-синтезирующей активностей ECK костного мозга да большом наборе моделей иммуного ответа. При иммунном ответе, инициированном ксеноантигеном (лошадиная сыворотка, эритроциты барана), аллоантигеном (кожный аллотрансплантат, реакция «трансплантат против хозяина»), а также на фоне иммунологической толерантности, развившейся при опухолевом росте (перевивной солидный и спонтанный канцерогенез) и при полуаллогенной беременности, показано, что иммуносупрессорная и NO-синтезирующая активности ECK костного мозга повышаются при условии изменения (повышение или снижение) продукции цитокинов Т-лимфоцитами селезенки. Впервые показано, что развитие поляризации Т-хелперов сопровождается увеличением активности естественных супрессорных клеток костного мозга, а также усилением синтеза ими оксида азота вне зависимости от типа поляризации.

Впервые изучено влияние ECK костного мозга на пролиферацию поляризованных Т-клеток 1 и 2 типов (как с развитием анафилаксии, так и толерантности), и выявлено, что естественные супрессорные клетки ее иигибируют вне зависимости от функционального состояния лимфоцитов.

В первые исследовано действие естественных супрессорных клеток костного мозга на продукцию цитокинов наивными и поляризованными Т-лимфоцитами. Обнаружено,, что секреция цитокинов ТЫ и ТЬ2 подавляется.

Впервые проведено сравнение действия ECK костного мозга на поляризованные лимфоциты. Выявлено, что их пролиферация подавляется избирательно. Данная селективность ингибиторного действия естественных супрессорных клеток костного мозга не зависит от того, получены ли они из шггаюгного организма или от животных с установившимся Till- и Независимым иммунным ответом.

Впервые исследовано влияние ECK костного мозга на протекание иммунологических реакций in vivo. При этом было обнаружено, что естественные супрессорные клетки костного мозга практически полностью отменяют адоптивную реакцию гиперчувствительности замедленного типа. Разработан уникальный метод оценки действия ECK на развитие локального отека, вызванного Th2 лимфоцитами в системе адоптивного переноса. С помощью данного метода показано, что естественные супрессорные клетки костного мозга не только не ингибируют, а, напротив, стимулируют данную реакцию.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты расширяют представление о физиологической роли естественных супрессорных клеток, в частности, их значение в поддержании гомеостаза иммунной системы, что позволяет глубже понять механизмы взаимодействия иммунной системы и гемопоэза и роль кроветворных клеток разной степени зрелости в регуляции иммунологических реакций. Вскрытые в работе закономерности создают теоретическую основу для разработки новых методов клеточной терапии иммунопатологических состояний.

Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертацию, были представлены на конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2002), «Актуальные проблемы фармакологии» (Томск, 2004), на Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2004), на Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развитая жсперштенталъной и клиническом онкология» (Томск, 2004), на конференции «Иммунология на рубеже веков» (Томск, 2005), на Российско-Американской конференции «Биотехнология и онкология» (Санкт-Петербург, 2005).

Публикации, По теме диссертации опубликовано 37 печатных-работ, из них 17 в центральных журналах.

ВЫВОДЫ

1. Стимуляция иммунной системы, при которой происходит изменение (повышение или снижение) продукции цитокинов Т-лимфоцитами селезенки, приводит к активации естественных супрессорных клеток костного мозга и увеличению продукции ими оксида азота. Повышение активности естественных супрессорных клеток является общей закономерностью иммунного ответа.

2. Активность естественных супрессорных клеток в отношении наивных Т-лимфоцитов повышается при развитии как ТЫ-, так и ТЬ2-зависимого, связанного с анафилаксией и толерантностью, иммунного ответа. При этом продукция оксида азота естественными супрессорными клетками увеличивается.

3. Естественные супрессорные клетки интактных животных и мышей с развившимся первым и вторым типом иммунного ответа (гиперчувствительность немедленного типа и толерантность) подавляют пролиферацию поляризованных Т-лимфоцитов как первого, так и второго типов, включающего анафилаксию и толерантность. Активность естественных супрессорных клеток костного мозга животных с развившимся первым или вторым типом иммунного ответа в отношении поляризованных лимфоцитов выше, чем активность естественных супрессорных клеток интактного организма.

4. Естественные супрессорные клетки костного мозга, как интактных, так и мышей с развившимся ТЫ- и Т112-зависимым иммунным ответом, ингибируют выработку основных цитокинов ТЫ (интерферона-гамма и интерлейкина-2).

5. Естественные супрессорные клетки костного мозга интактных животных подавляют продукцию основного цитокина Т хелперных клеток 2 типа (интерлейкина-4).

6. Антипролиферативная активность естественных супрессорных клеток костного мозга интактных животных в отношении Thl клеток выше, чем в отношении наивных Т-лимфоцитов.

7. Активность естественных супрессорных клеток, полученных от животных с Thl-зависимым иммунным ответом, в отношении пролиферации Thl клеток выше, чем в отношении наивных Т/ лимфоцитов, но в отношении Th2 клеток (связанных с развитием как анафилаксии, так и толерантеости) ниже, чем в отношении наивных Т-лимфоцитов.

8. Активность естественных супрессорных клеток, полученных от животных с Т112-зависимым иммунным ответом, связанным с развитием как анафилаксии, так и толерантности, в отношении пролиферации Thl клеток выше, чем в отношении наивных Т-лимфоцитов, но в отношении Th2 клеток (связанных с развитием как анафилаксии, так и толерантеости) ниже, чем в отношении наивных Т-лимфоцитов.

9. Активность естественных супрессорных клеток, полученных от животных с Т112-зависимым иммунным ответом (при развитии анафилаксии), в отношении пролиферации Thl клеток выше, чем в отношении наивных Т-лимфоцитов, а в отношении Tli2 клеток (связанных с развитием анафилаксии и толерантности) ниже, чем в отношении наивных Т-лимфоцитов.

10. Естественные супрессорные клетки вне зависимости от источника получения (костный мозг интактных животных, а также мышей с развившимся Thl- или ТЬ2-зависимым иммунным ответом) оказывают протипоположное действие на развитие Thl- и Th2-зависимых иммунологических реакций in vivo: подавляют Thl-зависимый отек и увеличивают Th2-зависимый отек.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Регуляция иммунного ответа представляет собой важную как с теоретической, так и с практической точки зрения проблему. Показано, что ЕСК, представляющие собой крайне не однородную популяцию гемопоэтических клеток разной степени зрелости, участвуют в негативном регулировании ряда иммунологических реакций, неспецифически подавляя пролиферацию иммунокомпетентных клеток при помощи супрессорных факторов. Естественная супрессорная активность обнаруживается в местах нормального гемопоэза, например, в костном мозге взрослого организма, печени эмбриона, неонатальной селезенке. Активность ECK возрастает в ситуациях усиленного кроветворения при беременности, опухолевом росте, в результате воздействий, нарушающих гомеостаз в системе крови (гипоксия, кровопотеря), а также под влиянием физических (облучение) и химических факторов (фенилгидразин, циклофосфан), повреждающих гемопоэз.

Наибольшее количество работ, посвященных ЕСК, выполнено на моделях опухолевого роста. При химически индуцированных, спонтанных и перевивных опухолях ЕСК обнаружены в костном мозге, селезенке и опухолевом узле. Показано, что ЕСК в значительной степени ответственны за метастазирование опухоли н иммуносупрессию. При создании условий, приводящих к созреванию ЕСК, восстанавливалась активность НК, возрастало число цитотоксичеысих Т-лимфоцитов, что приводило к увеличению продолжительности жизни опухоленосителей.

Участие ЕСК в подавлении иммунного ответа на инфекционные агенты изучено мало. Так, показано, что при введении животным БЦЖ, вируса гриппа, гельминтных олигосахаридов, заражении Trypanosoma African, Salmonella, Schistosoma mansoni, при нематодной инфекции Brugia malayi, после введения суперантигена (стафилококковый энтеротоксин, элементы бактериальной стенки) активность ЕСК значительно возрастала.

Во время сикгешгой беременности в селезенке у мышеи появлялись незрелые клетки с иммуносупрессорными свойствами, которые ингибировали синтез ШГ-2. Из децидуальной ткани человека удалось получить клеточную линию ЕСК, оказывающих свое противоопухолевое действие при помощи факторов, которые являются нуклеозидами.

В основе механизма действия ЕСК лежит секреция ими супрессорных факторов. Оксид азота выступает в роли единственного иммуносупрессорного фактора ЕСК интактного костного мозга. ЕСК его вырабатывают в ответ на ИФ-у, для чего необходим костимуляторный сигнал с молекулы CD40 и увеличение уровня эндогенных TNF-a и ИЛ-1(3. Оксид азота являлся таюке основным фактором ЕСК у животных, получивших циклофосфан, у мышей с опухолью или с РТПХ, а также при заражении мышей Trypanosoma African, при введении гельминтных антигенов.

Другими супрессорными факторами ЕСК многие авторы называют ТФР-р и ИЛ-10, который стимулирует продукцию ТФР-р. ЕСК, обнаруженные в селезенке мышей во время сингенной беременности, вырабаты вали ТФР-р 1 и ИЛ-10. ЕСК продуцировали ТФР-р и ИЛ-10 при росте ряда опухолей, после введения гельминтных олигосахаридов.

ЕСК могут осуществлять свое иммуносупрессорное действие частично, вырабатывая простагландины (простагландин Ег), что показано при РТПХ, при химически индуцированном канцерогенезе, при заражении мышей Trypanosoma African.

Обнаружено, что ЕСК костного мозга и селезенки мышей-опухол вносите лей могут оказывать иммуносупрессорное действие за счет усиленной выработки активных форм кислорода (супероксидрадикал и его производные). Показано, что в условиях дефицита аргинина NO-синтаза начинает продуцировать супероксидрадикал. Дефицит аргинина появлялся в результате резкого увеличения экспрессии аргиназы печеночного типа (Argl) естественными супрессорными клетками.

Активность ЕСК регулируется различными цитокинами, такими как ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ЙЛ-6, ИЛ-13, ГМ-КСФ, ИФ-у, TNF-a. Вероятно, их набором и определяется, какие факторы будут продуцировать ЕСК в той или иной ситуации. Во многих работах показано также, что факторы активированных лимфоцитов повышают активность ЕСК, что широко используется как стандартный методический прием для увеличения активности ЕСК.

Как известно, по набору продуцируемых цитокинов Т-лимфоциты разделяются (поляризуются) на две функционально различные популяции Thl и Th2. Основными, маркерными цитокинами Thl являются ИФ-у, ИЛ-2, а Th2 - ИЛ-4, ИЛ-10.

Показано, что для Thl-зависимого иммунного ответа характерны следующие черты: секреция ИФ-у, ИЛ-2, лимфотоксина (TNF-P), индукция продукции В-клетками антител IgG2a, участие в ГЗТ и защите от внутриклеточных патогенов. Этот тип поляризации обеспечивает протективный клеточный иммунитет против вирусов, грибов и бактерий. Th2 клетки вырабатывают ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, способствуют генерации IgE-синтезирующих В-лимфоцитов. Клинические проявления 2 типа поляризации Т-лимфоцитов более разнородны: с одной стороны, это реакции гуморального иммунитета, протекающие как гиперчувствительность немедленного типа (анафилактические реакции, бронхиальная астма, гельминтозы), где именно цитокины Th2 вызывают эозинофилию (ИЛ-5) и продукцию IgE (ИЛ-4). С другой стороны, отмечено, что в ситуациях толерантности иммунной системы (оральная толерантность, беременность, опухолевый рост) наряду с секрецией ИЛ-4, начинает преобладать выработка Т-лимфоцитами ТФР-Р и ИЛ-10. Такие поляризованные Т-клетки разные авторы обозначают по-разному: Th2, Th3 или регуляторные Т-клетки 1 типа (Тг-1). Тг-1 клетки выделяют по способности вырабатывать большое количество ИЛ-10 и малое -ТФР-Р, в то время как Th3 лимфоциты продуцируют преимущественно ТФР-р. Гиперпродукция этих цитокинов и обеспечивает состояние толерантности.

Оба типа Т-клеток (Till и Tli2) происходят из общего предшественника, получившего название нулевых Т-хелперов (ThO). Для их активирования и дифференцировал требуется 3 независимых сигнала: первый сигнал поступает через комплекс TKP/CD3, который взаимодействует с антигеном в комплексе с молекулами ГКГ на поверхности антиген-презентирующей клетки. Второй сигнал поступает в результате взаимодействия рецепторов и лигандов, представленных на CD4 ' Т-клетках и антиген-презентирующих клетках (CD28+/B7+, ОХ4(3+ и LFА-1+ЯСАМ+). Третий сигнал представляет собой фон цитокинов, присутствующих в данный момент. Природа этих сигналов и является определяющим моментом для дифференцировки ThO в Thl или Tli2. Дифференцировка из ThO регулируется цитокинами: ИЛ-12 стимулирует образование ТЫ, а ИЛ-4 определяет дифференцировку в Th2. Эти цитокины появляются в раннюю фазу инфекции, ИЛ-12 секретируют макрофаги и дендритные клетки после встречи с микробным антигеном, а источником ИЛ-4 являются базофилы, тучные клетки и Т-лимфоциты с фенотипом CD4+NK1.1+, Показано, что большое значение для направления поляризации имеет сам антиген, его структура и доза, а также способ его попадания в организм. Известно, что ИЛ-12 и ИЛ-4 не только усиливают образование Thl и Tli2 соответственно, но и одновременно подавляют генерацию противоположных Т-хелперов. Более того, процесс дифференцировки ThO в Thl или Th2 является необратимым.

Возможно, активация N0- или ТФР-ß-продуцирующих ECK должна происходить в зависимости от типа поляризации лимфоцитов в конкретной сигуации. Такого типа взаимоотношения показаны между поляризованными Т-лимфоцитами и зрелыми макрофагами. Активировать макрофаги способны как ТЫ, так и Th2 лимфоциты, но функциональные свойства при этом будут различны. Макрофаги, индуцированные при Thl-завиеимом иммунном огвете, называют «классически активированными», они секретируют оксид азота и другие воспалительные медиаторы (такие как ИЛ-1, Ш1-6, TNF-a). Макрофаги, индуцированные ТЬ2 цитокинами (ИЛ-4 и ИЛ-10) - «альтернативно активированные» - не синтезируют оксид азота, обладают противовоспалительными свойствами.

О наличии связи между поляризацией Т-хелперов и функциональной активностью ECK, на наш взгляд, свидетельствуют и данные о генетической предрасположенности развивать определенный тип ответа и выраженностью иммуносупрессорной активности у мышей разных линий. Так, максимальная активность ECK отмечена у мышей B10.D2 и С57В1/6, а минимальная - у ВА1Ъ/с. Мыши линии B10.D2 и C57BL/6 склонны развивать ТЫ-зависимый клеточный ответ, в то время как BAlb/с - Т1\2-зависимый. Именно у Thl линий (B1Q.D2 и C57BL/6) макрофаги склонны развиваться по классическому пути и усиленно продуцировать ИФ-у по сравнению с макрофагами Tli2 линии (ВА1Ь/'с).

Существующие к настоящему времени работы, в которых показано повышение активности ECK in vivoy можно разделить на две группы. Первая из них включает исследования ECK в условиях стимуляции кроветворения, а другая группа работ проведена с использованием иммунологических моделей, для большинства из которых характерно либо состояние толерантности (опухолевый рост, беременность) либо, вероятнее всего, дифференцировка лимфоцитов в Thl (иммунизация БЦЖ или Salmonella typhimurium). Однако следует отметить, что тип поляризации в этих работах не изучался. Совсем не исследованным остался еще один вид иммунных реакций, связанный с поляризацией Th2 - реакции гиперчувствительности немедленного типа. Имеющиеся в литературе данные позволяют предполагать участие ECK в развитии и поддержании поляризации Т-хелперов, как при помощи прямого влияния, так и опосредованно, изменяя функциональные свойства анти ген-презентирующих клеток.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Животные. Эксперименты проведены на линейных мышах (всего 1503) следующих линий: С57В1/оУ (54 головы), ВА1Ь/сУ (1367 головы), АКЮТ (48 голов), а также гибридах Б1(СВАхС57В1/6) (16 голов) и И(СВАхАКК) (18 голов). Распределение животных по сериям экспериментов представлено в таблице 1. Использованы животные обоего пола в возрасте 8-12 недель, полученные из питомника НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (1 категории согласно сертификату). Мыши содержались в неполной барьерной системе (воздухообмен составлял 10-12 крат/ч, температура 22±2°С, влажность 55±10 %, световой режим 10:14 ч). Мыши размещались в клетках (УЕЬА2Г) со стерилизованной мелкой стружкой в качестве подстила, имели постоянный доступ пище (стерилизованный гранулированный корм) и воде (кипяченая питьевая вода, подкисленная соляной кислотой до рН 44,5).

Получение клеточных-—суспензий.Животных— забивали дислокацией шейного отдела позвоночника, клетки костного мозга получали перфузией бедренной и болынеберцовой костей холодным изотоническим раствором хлорида натрия в асептических условиях, спленоциты получали гомогенизацией селезенок в стеклянном гомогенизаторе. Полученные суспензии фильтровали через 4-слойный капрон, трижды промывали холодным изотоническим раствором хлорида натрия, ресуспенднровали в культур альной среде и экспериментах использовали суспензии, содержащие не менее 95% жизнеспособных клеток.