Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Естественные супрессорные клетки, их свойства и функции в норме и при злокачественном росте в эксперименте

на правах рукописи

? Г Б ОД

ri.il IV

ВЕЛЬСКИЙ ХРИЙ ПАВЛОВИЧ

ЕСТЕСТВЕННЫЕ СУПРЕССОРНЬЕ КЛЕТКИ, ИХ СВОЙСТВА И ФУНКЯШГ В НОРМЕ И ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОМ РОСТЕ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ -диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

ТОМСК - 1С99

Работа Бнполяепз в Нгу^э-^-лггцоватетской лаборатории экспериментального бкомедкдакского моделирования Iомского научного центра СО РАМН и Научно-исследовательском институте онкологии Томского научного центра СО РАМН.

Научныэ руководители:

академик РАКИ, профессор Н.В.Васильев

каидидат медицинских наук С.А.Кускарцев

Офкдаадьные оппоненты: •

доктор медицинских наук Ю.А.Козлов

канд55дат биологических наук Н.В.Чердынцева

Егдудзе учреждение:

1шстктут клинической кгл.7Водогка СО РАМН (НоккжСирск).

Зеэдта состоится "_"_1925 г. в "_" час. на ва-

садгяш диссертационного Совета Д 031.34.01 в Научно-исследова-тед>скоу институте онкологии Томского научного центра СО РАМН (ез',001, Томск, пор. Кооперативный, Б).

А21-ор2ферат рааослан "_"_1986 г.

УчЗай секретарь

спсц-.1гип:-а;:рованппго совета, /

иаад'ди&' мсйищшиож наук -/Я ' Н.Д.Кис&яйза

обшдя характеристика fabotu

Актуальность теш. Опухолевый рост, как известно, сопровожден значительными нарушениями р системе иммунитета и естест-;ной резистентности, которые занимают ваякое место а патогене онкологического процесса. Установлено, что активность ес-твенных супрессорных клеток (ЕСК) многократно увеличивается : росте опухоли (Nicoletti. 1985; Young et al., 1988; Subiza al., 1989). Полученные от животных-опухоленосителей ЕСК сб-агат широким спектром неспецифического иммуносупрессорного ствия. Показана их способность подавлять функции Т-лимфош!-(Ycung et al., 1S88; Subiza et al., 1989), в частности, об-ование цитотоксических лимфоцитов (Nicoletti et al., 1985), иыфоцитоз (Nicoletti et al., 1985; Subl2a et al., 1989; Kyc-цев 1990), а также клеток естественной противоопухолевой ре-тентности: активность натуральных киллеров (Nicoletti et , 1985; Young et al., 1990), и продукцию опухоленекротичес-э фактора макрофагами (Young et al., 1992). С другой стороны, кроме многообразного иммуносупрессорного зтаия интактные костномозговые ЕСК способны in vitro подав-ь рост различных опухолевых клеток (Seledtsov et al. i 1995; luraetal., 1G90). Причём, стимуляция иммукосупрессорной щки ЕСК in vitro интерлейкином-3 (ИЛ-З).и граяулоцкт-макро-альным колониестимулирукишм фактором (ГМ-КОФ) (рекоыбинант-i или опухолевого происхождения) также приводит к усилению и гивоопухолевой активности. Подобный механизм стимулянта? ЕСК гт место и при опухолевом росте in vivo (Young et al., 1988, L; Suglura et al:, 1992).

В литературе имеются неоднозначные данные о роли ЕСК в опусом росте. Так, на модели перевивной лёгочной карциномы Ль-1 убедительно показано, что подавление противоопухолевого 'нитета (через ингибицию образования CD4~8+-лимфоцитов) ес-?веняыми супрессорными клетками, имеюетми фенотип граиугоцн-(акрсфагаяьных предшественников, является основным механиэ-в патогенезе данного опухолевого-процесса. Активация ЕСК з i случае происходит за счет выработки опухольа ГМ-КС-3 (Young il., 1992, 1994). В тоже время, несмотря ка усивеняэ гкгив-■и ЕСК и появление их з селезенке яиеотеых с опухольа Зр.";;-естественнь'в супресссры не играет роли в имеющей кесто з :ой ситуации ингкбиции синтеза противоопухолевых igM (Vinue-t al., 1991; Subiza et al., 1992). Крсмо того, при развитии ского лейкоза у мншей линии ЛКН описано появление кедролкх ск эритрсздной природы с выраяеиноЗ сстестзенмссупрс-сссрнс;": Бностью, причем ст;п-гуллшя зритропоэз?. на сгадил "пселзон-

коза" снижала выход лейкозов (Лксуко^ к др., 1ÖS5; Казакова i др., 1988). Так ко показано антилейкоэное действие ECK индуцированных в РТПХ (PalathuTipat et al.. 1992).

Таким образом, ECK, проявляя иммуносупрзсссрное и/иди противоопухолевое действие, ыогут двояко влиять на опухолевый процесс: с одной - стороны, благодаря своему противоопухолевому действию они могут тормозить рост опухоли, а с другой, ингиби-руя системы иммунитета и неспецифической резистентности. ECK могут нарушать механизмы противоопухолевой защиты и, следовательно, способствовать бластомогенезу.

Известно, что ECK являются гетерогенной популяцией, состоящей из субпопуляций, принадлежащих к различным росткам кроветворения (гранулоцитарно-макрофагальному, эритроидному, лимфоид-нсму), и, возможно, различающихся по степени зрелости. Эти субпопуляции могут различаться и по функциям: действовать на разные мкоеки, продуцировать различные факторы и др., и, следовательно, по разному влиять на опухолевый рост In vivo.

Учитывая вышесказанное, представляется актуальным исследовать свойства естественных супрессорных клеток, принадлежащих к разным субпопуляциям, а также изучить прямое влияние факторов, вырайатызаемых .опухолью, ка некоторые субпопуляции ECK.

Дедь и 8адачи исследования. Целью настоящей работы является характеристика естественных супрессорных клеток разного происхождения и влияния на них опухолевых факторов in vitro. В ранках этой цели решались следушие задачи:

1. Охарактеризовать ECK иктактного костного мозга, селезенки, печени эмбриона разных сроков внутриутробного развития и костного мозга бестиыусных мышей "nude" с использованием различных мишеней: митогенстимулированкых Т- и В-лимфоцитов и опухолевых клеток, а также механизм этого ингибиторного действия.

2. Сравнить- уровень супрессорной активности ECK интакткого костного иозга, селезенки, печени эмбриона разных сроков внутриутробного развития и костного мозга бестимусных мазей "nude" а отнозениа ка!тогенстимулироваккых лимфоцитов и опухолевых клеток.

3. Оценить прямое воздействие на 1состноыозгоьые ECK опухолевых супернатгнгов в зависимости от наличия в них ¡содокнгсп'му-лйрущих факторов.

4. Определить относительное содержание клеток, несутах антиген зр;'.трс0лас?ов, в клеточных, популяциях с разлинуй уровней естественной супрессорной активности (костный ыозг, тимус, селезенка иатаетных я опуходекбсудах гавотшх. г*с-р::сиа). |

5. Охарактеризовать роль клеток, несущих антиген эритроблготов. в естественной супрессорной активности кнтактного костного мозга. '

6. Сравнить влияние опухолевых факторов на активность ECK клеточных популяций с различным содержанием клеток, несущих антиген эритробластов (костный мозг взрослых животных к печень эмбриона разных сроков внутриутробного развития).

Научная новизна. В результате проведенных исследований дана характеристика и проведено сравнение естественной супрессорной и противоопухолевой активности ECK разного происхождения. Показано, что противоопухолевым и иммуносупрессорншс действием обладают как клетки костного мозга, так и печени эмбриона мыши разного возраста. Определено, что уровень естественной супрессорной активности костного мозга бестимусных мышей выше, чем у эутимусных. Впервые показано, что ECK, происходящие из эмбриональной печени, обладают кроме иммунссупрессорной, также и противоопухолевой активностью.

Установлено наличие ингибирующего функцию ECK действия опухолевых факторов In vitro, а также отсутствие корреляции между супрессориндуцирующим эффектом и колониестимулирующей активностью у опухолевых супернатантсв.

Впервые показано, что удаление клеток, несущих антиген эритробластов, или связывание моноклональных антител с этим антигеном приводит к снижению или отмене естественной супрессорной активности костного мозга.

Установлено, что воздействие опухолевых факторов, обладающих колониестимулирующей активностью, приводит к усиленна естественной супрессорной активности печени эмбриона 14 и 19 дней внутриутробного развития как в отнозенки опухолевых мишеней, так и митогенстимулированных лимфоцитов.

Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое значение полученных результатов заключается в расширении представлений о свойствах естественных супрессорнкх клеток разного происхождения и их роли в опухолевом процессе. Проведенные исследования позволяют заключить, что наблядаемзя in vivo активация естественных супрессорнкх клеток мсиет рэаяизовываться, очевидно, через различные механизмы,з зависимости от сзойств опухоли. Полученные в работе результаты могут служить основой для дальнениего изучения механизмов опуходеиндуцированной клму-носупрессии и создания подходов для усиления противоопухолевого иммунитета путем элиминации или регуляции активнее?/ супрессср-ных клеток, индуцированных опухолью.

Основные положения. т-у^с; •. заг-т.гу: 1. Неадгезивнные клетки геыопоэтичеоких органов (костного мозга и эмбриональной печени) интактньи хашотных обладают выра-кэнной способностью инг- пировать in vitro пролиферацию мито-генстимулированньк-%имфоцитов, а также опухолевых клеток.

2. В феномене естественной супрессорной активности участвуют клетки несудае антиген эритрэоластов.

3. Естественносупрессорная .и противоопухолевая активности кеадгезивнных клеток костного ыоага и эмбриональной печени чувствительны к прямому воздействию факторов выделяемых опухолевыми клетками.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и об-сукдены на Всероссийской конференции "Лабораторные животные и их использование в медико-биологических исследованиях" с международным участием (г.Москва, 1992 г), на 8-м Международном конгрессе по иммунологии (Будапешт, 1992), на расширенном засе-^ дакии Томского общества иммунологов (Томск, 1993), на 12 Европейской иммунологической конференции (Барселона, 1994).

Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 4 статьи в центральной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 137 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 рисунками, 31 таблицами и состоит из введения, 6 глав, заключена к выводов, списка литературы из 175 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В работе использовано 300 мышей, полученных из коллекционного Фонда НИЛ ЗБМ ТНЦ РАМН, сбоего кола в возрасте 8-14 недель линий BALB/c (H-2d),. C57B1/CJ (К-2Ь), CBA/CaLac (H-2k), DBA/2J (H-2d). CC57W/Mv (K-?.0), C3H/HeSn (H-2k), а так ке бестимуснке мкпи BALB/c, несущи стацию "nude".

выделения ï: отмывки клеток костного мозга, селезенки, с:-йр'лонадьной печени и различных опухолей использовали среду 12Э (НПО "Вектор", Новосибирск). Культивирование клеток проводили с "сподьговакиэь; среды RFM! 1640 (НПО "Вектор", Новосибирск) со следу:оаи>.ш добавками: 101 инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ИЗМ та. Гамалеи PA.VH. Москва), 2 rrij Ь-гдатгника ("FIov/ Lab.", Великобритания), Б*1(Г6 и 2-меркапто-зхгшода ("Fluka", Ввейцария). 40 ют/ил гекгалална i"Pnar

- б -

hi г.", Болгария), 20 inM HEPES ("Flos Lab.", Великобритания). Культивироование клеток- проводили в атмосфере, содержащей 5% СОг и 95Х воздуха при 3?°С и lOOZ-ой влажности.

В работе использовались клетки асцитного варианта карциномы Эрлиха и мастоцитомы Р815, поддерживаемые in vivo на самцах линии BALB/c и DBA/2 соответственно методом внутрибрхимнной трансплантации. Так же использовальсь миеломоноцитарная линия WEHI-3, клетки зритролеикоза К-2 и гибридомная линия МАЕ-15 поддерживаемые in vitro. Все клеточные линии получены из ОНЦ РАМН (г.Москва).

Для удаления прилипающих к пластику костномозговых клеток суспензию в концентрации 4-6 х юб клеток/мл помещали в пластиковые чашки Петри и инкубировали в культуральной среде 10-12 ч.

В работе использовали следующие методы клеточного фракционирования: а) в ступенчатом градиенте плотности перколла (Holda J.H. et al, 1986); б) по наличию рецептора к АГ-ЭБ с помощью моноклонадьных антител МАЕ-15 (пэннинг) (Чеглякова В.В. и др, 1989); по наличия рецептора к агглютинину зародышей пшеницы (WGA -"Sigma", США) (Sugiura К. et al, 1988). Диссоциацию клеточных агрегатов осуществляли с помощью N-ацетил-D-глюкозамина (Sigma, США).

Моноклональные антитела к антигену зритробласта выделяли из супернатанта гибридомы МАЕ-15 Еысаливанием с помощью сульфата аммония с последующим диализом (Мечетнер Е.Б., 1985). Определение содержания клеток несущих антиген эритробласта проводили методом непрямой иммукофлюоресцс-нции на микроскопе "Лгмам".

Кодониеста^улирующую активность супернатантов опухолей тестировали по способности стимулировать рост колоний клеток костного мозга а металцеллюлозе (Гольдберг Е.Д. и др., 1992) совместно с В.В. 'Едачовым (КИИ фармакологии ТНЦ РАМН).

Для получения опухолевых супернатантов опухолевые клетки инкубировались з культуральной среде" 48 часов в концентрации 2>--10б кл./!<л. Затем, надосадок собирали, освобождались от клеток центоифугированием 1500 об./мин. (30-40 «яга. ) и хранили при -20°С.

Для обработки клеток-эффекторов супернатанта»«! опухолей. Свекевыделенные метки инкубировали 2 суток с различными разведениями опухолевых супернатантов, затем отмывачи н тестировали способность их неадгезизкой фракции к проявлению естествекно-супресссрной активности няи к выработке супрессорного фактора. Клетки-эффекторы контрольной группы инкубировались то же время 5 отсутствие опухолевого супернатанта.

Определение активности естественных супрессорных • клеток. Активность естественных супрессорных клеток определяли по подавлению пролиферации спленоцитов, индуцированную конканавали-ном А (Кон А) в качестве Т-клеточного или липополисахаридом (ЛПС) в качестве B-клеточного митогена. Свежевыделенные сплено-циты культивировались совместно с эффекторами в присутствии митогена (Кон А в конечной концентрации 4 мкг/мл или ЛПС, 50 мкг/мл) в 96-ти луночных круглодонных планшентах в общем объеме 200 мкл., в указанных выше условиях 60-72 ч. Все образцы помещали в триплетах. В контрольных лунках мишени культивировали в отсутствии эффекторов. За 16-18 ч. до окончания культивирования вносили 3Н-тишдин по 0,5-1,0 мкКю (1,85-3,7 х 104 Бк) в каждую лунку. Затем содержимое лунок переносили на стекловолокнистые фильтры ("Titertek"), промывали изотоническим раствором хлорида натрия, 5% раствором ТХУ и этанолом. Фильтры высушивали и переносили в сцинтилляционную жидкость ЖС-8, включение изотопа (импульсы/минуту) оценизаы на 0-счетчике "Mark-III". Супрессорную активность выражали в виде индекса ингибиции (%), который вычисляли по следующей формуле: ИИ » (1 - О/К ) хЮО, где 0 - количество имп./мин. в лунках с клетками-мишенями культивируемыми совместно с клетками-эффекторами, К - количество имп./мин. в лунках с клетками-мишенями без клеткок-эффекторов.

Противоопухолевую активность супрессорных клеток и супрес-сорного фактора оценивали в цитостатическом тесте (Богдашин И.В.. 1986) по подавлению пролиферации клеток-мишеней, в качестве которых использовались клетки асцитной Формы карциномы Эрлиха либо мастоцитомы Р815. Для этого в 96-луночные кругло-донные планшеты помещали по 2х104 опухолевых клеток/лунку и добавляли клетки-эффекторы (неадгезивная фракция костного мозга или селезенки, по 2xio5 или 4*105 клеток/лунку). В случае тестирования супрессорного фактора к мишеням добавляли изучаемый супернатант в различных разведениях. Контрольные лунки содержали только клетки-мишени без эффекторов или супернатанта. Клетки инкубировали в указанных выше условиях i6 часов. За 4 часа до окончании культивирования в каждую лунку добавляли по 0,5-1,0 мкКю 3Н-тимидина и по стандартной методике определяли включение метки на з-счетчике "Mark-III".

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью критерия Стъюдента с использованием прикладных программ "Statgrafics". Везде з таблицах и в тексте приведены значения средней и стнадартной ошибки (Х±ш), на рисунках указаны доверительные интервалы.

- ? -

РЕЗУЛЬТАТЫ исследования и ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. »

ГЛАВА 3. Характеристика естественной супрессорной активности клеток костного мозга, селезёнки н печени эмбриона.

ЕСА клеток интактного костного мозга. Супрессорная активность костномозговых клеток по отношению к спленоцитам, стимулированным Кон А. наблюдалась у всех тестируемых линю! (BALB/c, CC57W/MV, С57В1/6). В соотношении эффектор/мишень 2:1 индекс ингибищщ пролиферации мишеней в отдельных экспериментах составлял от 83,9±4,4 до 23,9*9,3%; в соотношении 1:1 в большинстве экспериментов также наблюдалась выраженная супрессия (от 5б,б±б,3 до 22,5±5,6%). Пролиферация спленоцитов, стимулированных ЖС, также дозозависимо подавлялась костномозговыми клетками.

При использовании в качестве мишеней опухолевых клеток мас-тецитомы г815 и асцитного рака Эрлиха также наблюдалась ингиби-рование их пролиферации костномозговыми эффекторами. Пролиферация клеток Р815 выраженно подавлялась как сингенными (BALB/c), так и аллогенными (CC57W/mv и СВА) клетками неадгевивной фракции костного мозга. В соотношении зффектор/мишень 20:1 величина супрессии составляла от 92,4±0,27. до 66,4±1,6Z в разных экспериментах, в соотношении 10:1 - 30- 40% , в большинстве экспериментов.

Также зарегистрирована антипролкферативная активность неп-рилипающих клеток костного мозга по отношению к клеткам асцитного рака Эрлиха (58,5±1,4Х и 30,8±1б,3% соответственно для соотношений 20: Ьи 10:1). Супрессорной активностью обладал так-сз супернатант костномзговых клеток, который дозозависимо подавлял пролиферацию как ЛПС или Кен А-сткмулирозанных спленоцитов, так и опухолевых клеток Р-815. Активность была выраженной в разведении 1/4 (42,6±4,2 и 30,0±13,1%) и сохранялась в разведении 1/8 (11,2±3,1 и 11,8±0,92) в отношении лимфоцитов, сталированных как Кон А, так и ЛПС соответственно. Противооопухолевая активность супернатанта клеток костного мозга в разведении 1/4 была 79,б±1,б2 и сохранялась вплоть до разведения 1/16 (17,8±5,8Х). Следовательно можно заключить, что неприлкпающие клетки костного мозга конституитивно продуцируют 'раствсришй фактор(н), который и опосредует их супресссрное действие.

Естёственяссупрессорная и противоопухолевая активности ке-адгезивной костномозговой фракции проявлялась и з присутствии

10_5м индометацина (ингибитора синтеза простат лачдинов). Пролиферация Кон А - сиаг/дировгЕШс сллеяоцктов икгибировалась на 48,1±4,0Z и 44,4± 0,7% (в соотношении эффектор/мишень 2:1 и 1:1 соответственно), а пролиферация клеток Р815 - на 94,б±2,2% и 64,5±3,3Z (в соотношении эффектор/мишень 2:1 и 1:1 соответственно) .

Таким образом, интактные клетки костного мозга мышей различных линий показали вцракенную антипролиферативную активность в отношении как спленоцитов, стимулированных Т- или В-клеточными митогенами, так и опухолевых клеток. Ингибирующее влияние костномозговых клеток не обусловлено действием зрелых макрофа-галькых элементов, т.к. использовалась неприлипающая к пластику фракция. Антипролиферативный эффект обусловлен констуитивной продукцией растворимого супрессорного фактора. Кроме того, супрессия не зависит от синтеза простатландинов, поскольку проявляется в присутствии иядометацина, блокирующего синтез простат-, лачдинов. Причём эти характеристики присущи клеткам, подавляющим пролиферацию как митогенстимулированных спленоцитов. так и опухолевых клеток, что хорошо согласуется с результатами ряда работ (Suglura К. et al., 1990; Seledtsov V.I. et al., 1995), в которых показано, что супрессорное действие ЕСК проявляется не только по отношению к нормальным пролиферирующим, но также и к опухолевым клеткам.

ЕСА клеток селезёнки. Клетки селезенки в наших экспериментах не подавляли митогениндуцировакнуа пролиферацию сингенных спленоцитов стимулированным Кон А, ни в сотношении эффектор/мишень 1:1, ни даде 2:1, что согласуется с данными об отсутствии естественной супрессорной активности у спленоцитов, полученных от интактных мышей в отношениишении ыитоген (Young M.R.I.- et al., 1963, 1989; lUkcevlch D.A. et al., 1987) или антигенстиму-лировакпой (Saffran D.C. et al., 1991; Brooks-kaiser J.C. et al., 1593) пролиферации лимфоцитов.

С другой стороны, пролиферация опухолевых клеток-мишеней вырачекно икгибировалась спленоцнтами. Индекс ингибиции пролиферации мастоцитомы Р815 составил 61,1±12,9Z и 28,7±20,1Z (в соотношении эффектор/мишень 20:1 и 10:1 соответственно), а опухоли Зрлиха - 40,9± 5.6S и 17,8± 5,5% (в соотношении эффектор/мишень 20:1 и 10:1 соответственно). Эти селезёночные эффекторы не ЯЕЛяатся зрелыми макрофагами, т.к. прилипающие к пластику клетки удалялись. Они также отличны и от натуральных киллеров. поскольку подавляли пролиферация не только клеток асцит-нок карциномы Эрлиха, но и мастоцитомы Р-815. которая не чувс-

- а -

твительна к действия НК. Возможно, что полученный противоопухолевый ■ эффект спленоштов связач с цитостатическими эффекторами Т-клеточного происхождения, оказывающими свое действие на опухолевые клетки при непосредственном клеточном контакте (Богда-шин И.В., 1986).

ЕСД клеток эмбриональной печени (КЗП). Кроме костного мозга и селезенки в' качестве источника эффекторов испояьзовааиь клетки эмбриональной печени, которая, как известно, в период внутриутробного развития является гемопоэтическим органом. Кроветворение в печени эмбриона происходит с большей интенсивностью, чем в костном мозге взрослых животных. При этом 65-707. клеток эмбриональной печени мыши морфологически определяются как незрелые эритроидные элементы (Rencricca N. et al., 1976;.Чегляко-ва B.B., 1984).

Клетки печени эмбриона мыши 19-ти дней внутриутробного развития выраженно подавляли рост как спленоцитов, стимулированных Кен А (от 61,5*1,2 до 77,3±0,4Х) или ЛПС (32,8±3,U) - в соотношении мишень/ эффектор 1:1, так и опухолевых клеток Р835 (от 47.915,3 до 70,2* 0.7Z) - в соотношении мишень/эффектор 10:1. Аналогичные данные получены и в случае клеток печени эмбриона 14-дневного возраста. Для проявления супресссрного эффекта не требовалось контактного взаимодействия с мишенями: супернатамт клеток печени 19-тидневных эмбрионов в разведении 1/3 подавлял пролиферацию спленоцитов, индуцированную Кон А (индекс ингиби-цки составил 69.4il.0Z).

В присутствии Ю-5м индометацина неадгезивные КЭП (19-ти дней внутриутробного развития). проявляли как кммуносупрессор-пую (индекс ингибииии пролиферации Кон А-стимулированных спленоцитов в соотношении мишень/эффектор 2:1 составил 74,6±1,4% и 78,2±2,7£ в двух независимых экспериментах), так и противоопухолевую (индекс ингибиции пролиферации мастоцитсма Р815 в соотношение эффектор/мишень 20:1

состазил 80,9±2,5% и 78,1±0,5Х з двух независимых экспериментах) активности. Тактам образом клетки печени эмбриона, как и костномозговые, проявляют свое антилролкферативноэ действие на-зазисимо от синтеза яростаглаидиноз.

ECK костного ?-;озга бестимусных мызей. Как видно из таблицы 1, дефицит Т-звена у мкпей "nude" существенным образом злкяет на активность ECK. Клетки костного мозга мышей (неприлипаоцая фракция), гетерозиготных по данному гену, ¿кбо не проявляли (нр;: соотнесении 0,5:1 для 1-ой и 1:1 для 2-ой серии), либо проявляли низкую (з соотношении 1:1 для 1-сЛ п 2:1 для 2-ой се-

Таблица l.

Супрессорная активность клеток костного мозга мышей с мутацией "nude" по отношению к митогенстимулированным спленоцитам

Серия эксперимента Соотношение эффектор /мишень Митоген, используемый ю Конканавалин А 1я стимуляции мишеней Липополисахарид

nu/+ nu/nu (контроль) (опыт) nu/+ nu/nu (контроль) (опыт)

1) 1:1 0,5:1 75,0± 5,5* 7,6± 2,8Г (22*) (92) 101,2±11,5 77,8±17,1 (-5) (20) 53,2±0,0 7,4±1,9Г (5) (87) 47,1±1,2 47,8±1,9 (15) (14)

2) 2:1 1:1 9,0± 1,1 2,5± 0,4В (24) (79) 15,8± 1,6 6,1± 1,4® (-34) (48) 5,2±0,8 2,1±0,4б (37) (75) 7,6±0,8 3,6±0.5а (8) (57)

Примечания: - уровень включения [3Н]-тимидина (имп/минх103) Х+Л1; включение [3Н]-тимидина в культуре спленоцитов без эффекторов: в случае стимуляции Кон А - 9б,8±7,6 (1 эксперимент), 11,8+0,7 (2 эксперимент); в случае стимуляции ЛПС - 55,8±5,8 в 1-м эксперименте и 8,3±0,4 во 2-м;

- в скобках указан индекс ингибицки (X);

- а)р<0,02; б)р<0,01; в)р<0,002; г)р<0,001. "

рии) супрессорную активность по отношению к митогенстимулированным спленоцитам. Напротив, клетки костного мозга бестимусных мышей проявляли значительную супрессорную активность в обеих сериях в отношении как Т-, так и В-митогенстимулированных лимфоцитов , которая была максимальной при больших соотношениях эффекторов и мишеней.

Аналогичные разультаты получены при сравнении противоопухолевой активности костномозговых эффекторов, полученных от гетерозиготных и гомозиготных мышей. Клетки костного мозга бестимусных животных обладали большей, чем эутимускых антипролифера-тивной активностью по отношению к опухолевым клеткам Р815 (соответственно 48.3il.7Z и 37.5± 0.6%, р<0,01 в соотношении 10:1; 18,9Ш,6£ и 5,5±3,1%, р<0,05 в соотношении 5:1).

ГЛАВА 4. Влияние опухоли на активность естественных суп-

рессорных клеток костного мозга in vitro. «

Для изучения влияния опухоли in vitro на супрессорную активность костного мозга использовали супернатанты мышиных опухолевых клеток различного происхождения (ыастоцитома Р815, мие-ломоноцитарная линия WEHI-3 конституитивно продуцирующая ЙЛ-З (Lee J.С. et al., 1982), зритролейкоз К-2 и асцитный вариант карциномы Эрлиха). Костномозговые клетки интактных .тавотных инкубировали 2 суток в культураяьной среде с добавлением 507. различных опухолевых супернатантов, затем отмывали и тестировали супрессорную активность их неадгезивной фракции,

Антипролиферативное действие костного мозга в отношении клеток мастоцитомы Р-815 достоверно повышалось после обработки супернатантами опухолевых клеток WEHI-3 и Р-815 несмотря на высокий уровень супрессорной активности в контроле. В противоположность этому, супернатанты асцитной карциномы Эрлиха и эрит-ролейкоза К-2 в разведении 1/2 достоверно снижали супрессорное действие неприлипаодих клеток костного мозга (рис. 1)

Используемые опухолевые супернатанты были исследованы на наличие в них колониестимулирувзэй активности. ■Кшгсккестимули-руюцую способность тестировали по способности стимулировать рост колоний костного мозга в метилцеллюлозе. Из представленных данных (Рис. 2) видно, что супернатанты мастоцитомы Р81Б, мие-ломоноцитарнсй линии WEHI-3 и эритролейкоза К-2 достоверно стимулируют рост колоний. Супернатанты же асцитной карциномы Зрли-ха такой способностью не обладали.

Обработка неадгезивной фракции костного мозга супернатантсм опухоли Эрлиха приводила к сникениэ выработки СФ костномозговыми клетками. Супернатант костного мозга контрольной группы (клетки костного мозга инкубировались со средой з отсутстзки опухолевого супернатантз) оказывал ингибирущее действие на пролиферацию кямунокомпетентных, так и опухолевых клеток. Индекс ингибиции пролиферации спленоцитоз стимулированных Кон А составил 56.1 ±11,07. (в разведенки костномозгового супернатантз 1/2). Пролиферация опухолевых клеток ингибировалась (в разведении костномозгового супернатанта 1/4) на 53,7±10,1% (в отношении клеток Р815) и на 71,4±4,9S (в отношении опухоли -Эрлиха). Обработка костного мозга супернатантсм опухоли Эрлиха приводила к достоверному снгасен'.га ингибируюдего эффекта (з отношении опухоли Эрлиха - 40,4±6,0а, р<0,01; мастоцитомы Р815 - 6,5± 8,6%,

соотношение ьффектор/мишень Экспгряхеит 1 Эксперимент 2

Рлс. 1. Влияние супернатантов различных опухолей на супргссорную активность (1шдекс ынгабишш, %) костного мозга по отношению е клеткам ыастоцнтомы Р-815. ,::р<0,05,-**р<0,02;***р<0,01.

Парад тестнровгннек супрессорнои активности клетки костигго г.:озга 2 суток инкубировалась: 1 • без опухолевых супорнятантсз (контроль); 2 - с супернатантоц карцнкоыы Зилцха; 3-е супернатантов клеточной ляшш \VEHI-3; 4 - с сулериатаитом эрктролейкозг К-2; 5 - с супернатгитом мгзс-тоцнтсьш Р-815.

LM

КЭ K-2 PS 15 WHH1-3 тестируем я опухоль

Рнс. 2. Колониеобразугощая активность супернатантов опухолевых клеток, тестированная in vitro в метилцеллюлозе.

В контроле (К) тест проводился з культуральной среде, а в опыте з культуральной среде с добавлением 50% различных опухолевых супернатантов. *р<0,02;**р<0,С01; п=5.

ПК . культуральная среда в отсутствие супернатантов опухолей

□КЭ - асцитный вариант карциномы Эрлиха

ГЗК-2 - эрнтролейкоз К-2

□Р315* wacTooHToria Р815

"-WEK1-3 ' мисломсноцитарная линия WEHI-3

р<0,01) или полной его отмене (в отношении митогенстимулировак-ных спленоцигов 0,7±8,2, р<0,05).

Обобщая приведённые данные о влиянии супернатантов на коло-ниеобразухлцую, пролиферативную и супрессорную активность костного мозга, можно заключить, что опухолевые клетки WEH1-3 и Р815 активируют ECK костного мозга через продуцируемые ими ге-мопоэтические факторы. Известно, что естественные супрессорные клетки имеют рецепторы к JUI-3 (Suglura К. et al., 1992) и прямое воздействие мульти-КСФ (или ГМКСФ) приводит к значительной активации ECK (Holda J.H. et al., 1990; Sugiura K. et al., 1992). Как свидетельствуют полученные нами данные, супрессорная активность клеток костного мозга возрастала после обработки су-пернатантом опухоли WEHI-3, конституитивно продуцирующей ИЛ-3. Такой же эффект был получен и при обработке костного мозга су-пернатантом мастоцитомы Р-815, также обладающей колониестимули-рующей активностью. В то же время клетки К--2, вырабатывающие фактор(ы), стимулирующий образование колоний клетками костного мозга, напротив, несколько снижал активность ECK костного мозга. Таким образом, поскольку супернатант К-2 не стимулировал активность ECK, но имел колониестимулирующую активность, то, очевидно, эта активность отлична от ИЛ-3 или ГМ-КСФ и связана, возможно, со стимуляцией более коммитированных кроветворных клеток. Снижение активности ECK в этом случае может быть обусловлено дифференцировкой незрелых темопоэтических предшественников с потерей ими естественносупрессорной активности. Известно, что при росте опухоли Эрлиха. in vivo наблюдается усиление естественной супрессорной активности (Subiza J.L. et al., 1989). В наших экспериментах супернатант карциному Эрлиха in vitro не имел колсниестимулирующей активности, что согласуется с имеющимися в литературе данными (Maler T. et al., 1987), кроме того, обработка этим опухолевым супернатантом клеток костного мозга снижала Их естественную супрессорную активность.

ГЛАВА 5. Изучение содержания клеток, несущих антиген эритробластов, в разных клеточных популяциях и их вклад в естественносупрессорную активность интактного костного мозга.

ECK эритровдной природы изучались преимущественно в моделях стимулированного эритропоэза в ситуациях, острой и хронической анемии, гемолитической.анемии, индуцированной фенилгидразином, при введении тестостерона (Чеглякова В.В., 1984; Цырлова И.Г. и

др.. 1986; сенников C.B. и др.. 1987; Кашакова Н.В., 1987; Ми-тасов A.B. и др.. 1990). Нами изучались супрессоры зритроидной природы интактного костного мозга с использованием моноклинальных антител МАЕ-15 к антигену выявляющемуся исключительно на эритробластах (названному антигеном зритробластов - АГ-ЗБ) (Ievleva E.S. et al., 1976; Мечетнер E.B. и др.. 1979).

Было определено содержание клеток, несущих антиген зритроблаотов, в различных органах интактных мышей. МАЕ-15+-клетки отсутствовали в тимусе, присутствовали в относительно небольшом количестве в костном мозге (10Z) и селезенке (6Х) и приблизительно на половине клеток печени 19-тидневного и 14-дневного эмбрионов мыши (482 и 58% соотвесвенно), где, как известно, идет интенсивный гемо- и, особенно, эритропоэз. Эти результаты соответствуют литературным данным о наличии АГ-ЗБ в различных клеточных популяциях (Ievleva E.S. et al., 1976; Иевлева E.C. и др.. 1979) и свидетельствуют о высоком уровне зритропозза з эмбриональной печени.

Для оценки роли супрессоров зритроидной природы в противоопухолевом иммунитете изучали влияние МАЕ-15+-клеток костного мозга на пролиферацию митогенстимулировашшх Т-лимфоцитов. Для этого определяли супрессорную активность неадгезивной фракции костного мозга после удаления клеток, несущих АГ-ЗБ.

Супрессия клетками костного мозга Кся А-стимулированных спленоцитов практически полностью отменялась после удаления МАЕ15-позитивных клеток в соотношении эффектор/мишень 1:1 (с 74,3*6,32 до 7.2± 13,7%, р<0,01) и достоверно снижалась в соотношении 2:1 (с 74.5*2,0* до 43,8±4,32, р<0,001).

Продукция супрессорного фактора неприлипающей фракцией костного мезга тагае достоверно снижалась после удаления из неё клеток, несущих АГ-ЗБ (супрессия пролиферации Кон А-стимулированных спленоцитов снижалась с 79,6*1,61 до 27,1*9,1%; р<0,002).

Взаимодействие антител МАЕ-15 с неприлипающей фракцией костного мозга (в случае предварительной совместной инкубации) даже без удаления клеток, несущих АГ-сЕ, дозозазисиуо снижает супрессорную активность, полностью блокируя ей при концентрации антител 150 и 200 мкг/мл (рис. 3). Дальнейшие исследования показали. что предварительная инкубация нонсклснальиыи антителами влияет на супрессорную активность только з случае использования МАЕ-15, но не Н417.3. что говорит о специфичности полученного эффекта.

Таким образом, полученные нэа результаты позволяю? заклю-

зоссо.еэ

25000,00 -

§ 20000,00 -

CS X

к

«3

S 15000,00 --

g 10000,00 -

9.

5000,00 --

0,00

иншени

ыншеии+эффекторы

0 10 75 150 300 концентрация uAT МАЕ-15 (ыкг/ил)

Piic. 3. Влияние предварительной ¡зпгубгцки клето:; костного мозга мышей лкшш СЗН с «AT МАЕ-15 на активность ECK (в .соотношении!: пкшень/эффектор - 1:1).

*р<0,05; **р<0,002; все сравнения проводились относительно контроля; п=6.

Мглагн;: - сглевопзгш, сталулйросаикйе Кон А.

чить, что, во-первых, удаление клеток, взаимодействующих с мАТ МАЕ-15, приводит к значительному снижению естественной супрес-сорной активности интактного костного мозга вследствие ум^ньсе-ни? выработки супрессорного фактора. Нужно отметить, что по* . лекие пролиферации Кон А-стимулированных спленоиитов редуциоэ-валссь после обработки клеток костного мозга антителами МАЕ-15 без фракционирования. Это показывает, что антиген, распознаваемый мАТ МАЕ-15, не только присутствует на клетках интактного костного мозга, играющих существенную роль в естественной суп-рессорной активности, но и участвует в ее реализации, так как связывание мАТ с этим антигеном блокирует естественную супрес-сорную активность.

ГЛАВА б. Влияние опухоли на активность естественных суп-рессорных клетск эритроидной природы.

Изучали влияние m vitro супернатанта опухоли Р815 на активность ECK эритроидной природы на модели эмбриональной печени мыши. Была использована неприлипаю!дая к пластику фракция клеток печени эмбрионов 14 и 19 суток внутриутробного развития.

ECK печени 14-тидневного эмбриона. Обработка супернатантом опухоли Р315 достоверно увеличивала естественносупрессорную активность клеток эмбриональной печени по отношению к сингенкым спленоцитам, стимулированным ЛПС, с 54,2±2,9Z до 69,2.+3,<7. (р<0,02) и с 14.9±0,5Х до 41,5+9,37. (р<0,05) в соотношении эффектор/мишень 2:1 и 1:1 соответственно. Противоопухолевое действие КЗП (мишени - Р315) также увеличивалось после предобработки эмбриональных эффекторов с тем же опухолевым супернатантом. Яндекс ингибкции пролиферации повышался с 43,9±4,2% до 75, 1ï4 ,2% и (р<0,01) с 17.7t0.77. до 49,0±11,17. (р<0,05) 3 соотношении эффектор/мишень 2:1 и 1:1 соответственно.

При использовании в качестве мишеней Кон А-стимулированных спленоиитов наблюдалась лишь тенденция к увеличению супрессор-ной активности КЭП после обработки последних супернатантом опухолевых клетск PS15.

ECK печени 19-тидневного эмбриона. Супрессорная активность КЗП после обработки супернатачтом опухоли Р815 достоверно уве-ли-пгЕалась з отношении обеих используемых мишеней, несмотря на высокий исходный уровень супрессии. В случае Коп А-сткмулнро-валньд спленоиитов супрессия увеличивалась с 81,6±1,1Х до 89,4±0,6Ï (р<0,С02), в случае опухолевых клеток Р815 - с ЗЗ.ОМ.ЗХ до S2,9±C,2Z (р<0,05). Причем это увеличение проявля-

лось и в присутствии индометацина (Ю-5 Ш как в отношении опухолевых клеток Р-815 - с 81,7±2,ЗХ до 93,1±0,3£ (р< 0.01), так и в отношении Кон А-стимулированных спленоцитов - с 77,7±1,7Z до 87,7±0,6Z (р<0,001).

Обработка неприлипающей фракции КЭП супернатантоы опухоли Р815 достоверно увеличивала продукцию супрессорного фактора: супрессия пролиферации Кон А-стимулированных спленоцитов увеличивалась с 69,4± 1,0% до 80,3±1,6Х (р<0,05).

Таким образом, опухолевый супернатант Р815 стимулировал супрессорную активность печеночных клеток в отношении опухолевых клеток, а также спленоцитов, стимулированных как ЛПС, так и Кон А. Это действие реализовывадось через увеличение выработки супрессорного фактора не простагландшовой природы.

ВЫВОДЫ

1. Клетки интактного костного мозга и эмбриональной печени мышей различных линий, а также костного мозга бестимусных мышей (несущих мутацию "nude"), обладают выраженной естественносуп-рессорной и противоопухолевой активностью. Антипролиферативный эффект обусловлен конституитивной продукцией растворимого супрессорного фактора. Естественносупрессорная и противоопухолевая активность костного мозга бестимусных животных значительно выше. чем эутимусных.

2. Клетки интактной селезенки не проявляли естественяосуп-рессорной активности. ' но выраженно ингибировали пролиферацию опухолевых клеток.. Противоопухолевый эффект обусловлен действием клеток, не являющимися зрелыми макрофагами . и натуральными киллерами.

3. Супернатанты миеломоноцитарной линии WEHI-3 и мастоцито-мы Р81Б повышают антипролиферативное действие клеток костного мозга, а супернатант эритролейкоза К-2 снижает его; при этом, все названные опухолевые линии обладает колониестимулирующей активностью.

Супернатант клеток карциномы Эрлиха, не, обладая колони-ecTKi,аудирующей активностью/ сникает антипролиферативную активность клеток костного мозга за счет уменьшения продукции супрессорного фактора.

4. Содержание клеток, несущих антиген эритробластов, в печени 19-дневного эмбриона мыши выше, чем в костном мозге взрослых мышей, но ниже, чем в печени 14-дневнкх эмбрионов. Антиген эритробластов отсутствует у тймоцитов. В селезёнке количество

клеток, несуща антиген эритрсбластов, увеличивается при опухолевом росте.

5. Удаление иг костного мозга клеток, несущих антиген эрит-робластов, приводит к снижении естественносупрессорной активности за счет снижения выработки супрессорного фактора. Блокирование антигена эритроблзстов монсклональными антителами без удаления меток так*.е ингибирует естествеккосупрессорную активность костного мозга.

6. Сакторы, вырабатываемые клетками мастоцитомы F815, обладают способностью усиливать пролиферативкую, естественнссупрес-сорную, а также противоопухолевую активности клеток печени 14-тидневного эмбриона мыши.

7. Факторы, вырабатываемые клетками мастоцитомы Р315, не влияют на пролиферативную, но стимулируют естественносупрессор-ную и противоопухолевую активность клеток печени 19-тидневного эмбриона мыши. Это действие реализовывалось через увеличение выработки супрессорного фактора не простагландиновой природу.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. ОгребаБ.И., Станкевич С.А., Кусмарцез С.Д., Чердыниева

H.В., Вельский Ю.П. Сравнительная характеристика системы иммунитета у мьшей с различной предрасположенностью к злокачественному росту в норме и в условиях стресса/.-¿¿^.¿-^ Всессваной конференции "Актуальные вопросы стандартизации лабораторных животных для медико-биологических исследований", Москва.-1968.-4.2.-С.143-145.

2. Kusrcartsev S.A., Belsky Y.Р., i^lotnikov Y.M., Agranovitch

I.M. The influence of monoclonal antibodies to antigen of erythroblasts on natural suppressor cells of tone marrow suppressor cells in vitro // Abstr. Sth Irraunol. Congr., Budapest, Hungary.-1992.-P.294.

3. Вельский Ю.П., Кусмзрцев С.А. Влияние факторов, вырабатываемых клетками опухоли Эрлиха на опухолецидную и супрессор-ную активность клеток костного мозга in vitro // Ланимало-гкя.-1393.-Н.1.-С.41.-

4. Kusrrartsev S.A., Belsky. Y. P., Zernlyanskaya N.V. Increasing activity of natural supressor cells and production suppressor factor by bone narrow cells in aging of mice cf high-tinrcr strain // Abstr. 2-nd Int. Congr. ISNIM, Paestun (Salerno), Italy.-lS93.-P.234.

5. Кусмаг.П'ЗЗ С. А., Агранович И.M., Вельский Ю.П., Гончарская

М.А. Клетки, несущие антиген аритробластов, определяют естественную супрессорную активность неадгезквных клеток костного мозга // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-1993.-N.6.-С.652-655.

6. Еелъский Ю.П., Агранович И.М., Кусмарцев С.А. Противоопухолевая и супрессорная активность клеток костного мозга уменьшается после инкубации с супернатантом опухоли Эрлиха // Бюллетень экспериментальной биологии и медицтш.-1994. -К.5.-С.514-517.

7. Kusrnartsev S.A., Belsky Y.P., Zemlyanskaya N. V., Agrano-vltch I.M. An increase of natural suppressor cell activity in mice following the injection of GM-CSF in vivo // Abstr. 12 Europ.' Ircmunol. Conpv, Barcelona, Spain.-1994.-P. 520.

8. Кусмарцев С.A., Вельский Ю.П., Агранович И. M., Землянская К.в. Естественные супрессорные клетки (обзор) // Успехи современной биологии. -1994.-Т. 114.-N.б.-С.705-714.

9. Вельский Ю.П., ■ Кусмарцев С.А. Изучение взаимодействия естественных супрессоров с некоторыми популяциями иммуноком-петентных клеток// Сборник трудов "Экспериментальная и клиническая иммунология", Томск.-1995.-С.25-31.

10. Вельский Ю.П., Землянская Н.В., Кусмарцев С.А., Агранович И.М. Дифференциальная индукция естественной супрессорной активности клеток костного мозга in vitro.различными типами опухолей // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1695.-N.8.-С.184-187;