Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Функциональное состояние В-лимфоцитов и активность супрессоров костного мозга на этапах злокачественного роста

$

'-«О 9 0' /

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОНКОЛОГИИ , ТОМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА

на правах рукописи УДК 612. 017: 616. 006

КУСМАРЦЕВ СЕРГЕЙ АЛЕКСЕЕВИЧ

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ В-ЛШЕОЦИТОВ И АКТИВНОСТЬ СУПРЕССОРОВ КОСТНОГО МОЗГА НА ЭТАПАХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО РОСТА

(14.00.14 - онкология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ТОМЗК - 1990

Работа выполнена в Научно-исследовательском онкологии Томского научного центра АМН СССР.

• научные руководители:

академик АМН СССР, профессор Н. Е Васильев кандидат медицинских наук Е И. Огреба

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор ЕД. Подоплекин кандидат медицинских наук Я Е Богдашин

Ведущее учреждение: Всесоюзный научный онкологический центр АМН СССР

Защита состоится "_"_ 1990 г. в " " час.

на заседании специализированного ученого совета К. 001.17.02. при НИИ онкологии Томского научного центра АМН СССР (634001,г. Томск, пер. Кооперативный, 5)

С диссертацией южно ознакомиться в библиотеке НИИ онкологии Томского научного центра АМН СССР.

Автореферат разослан "._"_1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

ЕЯ Тихонов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. К настоящему времени накоплен огромный экспериментальный и клинический материал, который свидетельствует об активном и разнообразном участии системы иммунитета в механизмах противоопухолевой зашиты организма. Основную роль в противоопухолевом иммунитете выполняют макрофаги,. Т-лимфоциты, естественные киллеры и др. клетки, способные эффективно элиминировать опухолевые клеткм-мишени. Установлено, что В-лимфоциты продуцируют tn vitro цитотоксические антитела, которые также могут осуществлять лизис опухолевых клеток (Witz et al. ,1984). В то же время антитела, связываясь с опухолевыми антигенами, либо с рецепторами зф-фекторных клеток, способны оказывать усиливающий рост опухоли эф-фект(Не11зи-от,1971). Образование комплексов антиген-антитело яв ляется интегральной частью иммунного ответа организма, направленного на удаление чужеродных антигенов, и поддержание гомеостаза.

В общей оценке состояния иммунологической реактивности организма, и в частности, по В-звену, одним из определявших факторов является его способность к иммунному ответу при назначении антигенного стимула. Исследования иммунологических показателей у онкологических больных, а также в эксперименте, выявили, что при большинстве новологических форм злокачественных новообразований преобладает заметное снижение их уровня сравнительно с величиной в здоровом организме (Rowland et al., 1971;Pikowski et al., 1975; Yarashita et al. , 1982; Dean et al. , 1983; Suzuki et al. , 1986; и др.). Это свидетельствует о том, что зачастую потенциальные возможности эйекторных клеток противоопухолевого иммунитета в условиях in vivo не реализуются в полной мере. При опухолевой росте одной из основных причин возникновения такай ситуации является активация супрессорных клеток, как антиген-специфических, так и неспецифических (Nelson et al. ,1987). Суирессорные механизмы, по мнению некоторых авторов, во многом обеспечивают парадоксальный рост имыупогенных типов опухолей (Naor, 1979; North, 1984).

Известно, что супрессоры представлены множеством вариантов, различающихся по условиям возникновения, кинетикой, специфичностью действия генетической рестрикцией функции, разнообразием свойств, степенью'зрелости и антигенными маркерами, природой еек-ретируемнх факторов и да*е механизмам;! еупрееоии (Ерондэ, 1987),

В последнее время внимание исследователей привлекают работы, свя-заннные с выделением и идентификацией так называемых естественных супрессорных клеток из костного мозга и селезенки, регулирующих иммуннный ответ. Так, в костном мозге человека и животных показано' существование антигеннеспецифических супрессорных клеток, подавлявших гуморальный иммунный ответ in vivo и in vitro (Петров и соавт., 1976;1978;, Duve et al., 1978;, Козлов и соавг.,1984), митогенстимулированную пролиферацию лимфоцитов (Holda et al. ,1986; Young- et al. ,1987), ант иге н- стимулированную пролиферацию Т-клеток в СКЛ (Duwe et al., 1978), а также клеток плазшцитомы X -63.Ag 8. 653, мастоцитомы Р815 и гибридных клеток, продуцирующих монок-лональные антитела (Сидорович и др., 1984). Действие этих супрессорных клеток осуществляется посредством выделения растворимого фактора (Duwe et al. ,1978; Сидорович и соавт., 1987), который способен блокировать также продукцию и активность интерлейкина-2 (toes et al., 1988). Активацию естественных супрессорных клеток костного моэга и появление их в селезенке наблюдали при прогрессивном росте карциномы Эрлиха (Хаитов,1984; Subiza et al., 1989), аденокарциномы Льюиса (Young et al., 1987;1988). Однако, биологическая роль этих клеток еще не совсем ясна.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является сравнительная характеристика функцирнального состояния В-звена системы иммунитета, изучение роли естественных супрессорных клеток в механизмах регуляции иммунитета в условиях экспериментального злокачественного роста, а также при воздействии экстремальных экологических факторов.

В рамках этой цели решались следующие задачи:

1. Провести сравнительное изучение функционального состояния В-эвена и естественных супрессорных механизмов у инбредных мышей, оппозитных по спонтанному бластомогенезу.

2. Изучить влияние экстремального воздействия на гуморальный иммунитет и активность неспецифических супрессоров у экспериментальных животных. Используя препараты природного происхождения -тимоптин и экстракт родиолы розовой, провести иммунокоррекцию выявленных сдвигов.

3. Охарактеризовать функциональное состояние В-лимфоцитов у животных со спонтанными злокачественными опухолями молочной ив-

лезы,.а такда в динамике химического канцерогенеза.

4. Оценить супрессорную активность клеток костного мозга и селезенки, продукцию костномозгового супрессорного фактора на ука-заннных вше моделях экспериментального злокачественного роста.

5. Изучить влияние Кон А-активированного супернатанта, гидрокортизона и липополисахарида на продукцию супрессорного фактора клетками костного мозга

6. Провести сравнительный анализ изучаемых показателей в возрастном аспекте у мшаей высокораковой линии.

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые, комплексно охарактеризовано гуморальное звено иммунитета у мышей, оппозигных по предрасположенности к спонтанному опухолевому росту, а также на различных моделях экспериментального злокачественного роста

Впервые показано, что в костном мозге мышей высокораковой линии в возрасте 11-15 месяцев происходит активация естественных супрессорных клеток, а в селезенке появляется клеточные элементы, обладавшие способностью неспецифически ингибировать генерацию ан-тителообразувдих клеток у нормальных еингенных реципиентов, иммунизированных эритроцитами барана.

Впервые установлено, что в латентном периоде канцерогенеза, индуцированного 7,12-ДМВА, происходит выраженное угнетение имуноре-гуляторной функции костного мозга.

Впервые показано, что тимоптин и экстракт золотого корня эффективно предупреждают развитие стресс-индуцированных нарушений в гуморальном иммунном ответе.

Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое значение полученных результатов заключается в расширении представлений оо иммуяорегуляции и межклеточного взаимодействия в условиях возникновения и роста злокачественных новообразований. Проведенные исследования позволяют оценить вклад антигеннеспецифичес-ких супрессорных механизмов в развитие сдвигов, происходящих в системе иммунитета при старении, неопластическом процессе, а также при воздействии экстремальных факторов.

Полученные данные могут служить основой для создания новых методов иммунокоррекции. Дальнейшее выделение и очистка иммуносуп-рессорного фактора, продуцируемого естественными супрессорнычи

клетками, может привести к созданию эффективных иммунотерапевти-ческих препаратов, перспективными для клинического применения.

Экспериментальные данные, полученные в работе, были включены в материалы экспозиции "Служба экспериментального Сиомедицинского моделирования в решении задач медицинской науки и практического здравоохранения в Сибири", представленной на ВДНХ СССР. Экспозиция была удостоена медали.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на отчетных конференциях НИИ онкологии Томского научного центра АМН СССР (1984-1988 гг. );на областной конференции "Молодые ученые - народному хозяйству" (Томск; 1086);на Международном аим-• позиуме "Научные и прикладные аспекты биотехнологии лабороторных животных" (Лущито, 1989)¡на заседании Томского научного общества иммунологов (ШО).

Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 16 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 135 страницах машинописного текста, иллюстрируется 19 рисунками, 12 таблицами и состоит из введения, б глав, заключения и выводов, списка литературы из 204 наименований.

Основные положения, представляемые к защите.

1. Характеристики состояния В-лимфоцитов различны у животных инбредных линий с разной генетически.обусловленной предрасположенностью к спонтанному опухолевому росту. Реакция В-эвена на экстремальный раэдрожитель также неодинакова у мышей высокораковой и низкораковой линий.

2. Развитие злокачественных новообразований у экспериментальных животных сопровождается активацией неспецифических супрессор-ных клеток и появлением их в селезенке.

3. фи росте спонтанных опухолей молочной железы и в процессе ДМБА-индуцированного канцерогенеза происходит угнетение функциональной активности В-лимфоцитов, нарушается их способность к гу-моральнфму иммунному ответу.

4. Иммунорегуляторная активность клеток костного мозга при злокачественном росте изменяется.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы н методы работы. В работе использовали мышей линий A/Sn, С57В1/6, СВА, DBA/2 обоего пола массой 14-20г. разводки опытно-племенного питомника НИЛ экспериментальных биологических моделей АМН СССР ( г. Шсква) и отдела биомедицинского моделирования НИИ онкологии Томского научного центра АМН СССР. Всего использовано 1135 животных.

В качестве модели экспериментального химического канцерогенеза использовали саркому, индуцированную 7,12-диметилбез(а)антраценом (ДЫБА, Serva). Для индукции опухоли мышам 2-3 месячного возраста . однократно подкожно вводили канцероген в правое бедро в дозе О,4мг. в 0,1 мл оливкового масла. Контролем служили мыши, которым вводили оливковое масло без ДМБА. По истечении индуктивного периода (3-4 мес. ) у животных в области введения канцерогена появлялись опухоли, идентифицированные при гистологическом исследовании как фибросаркомы.

Для изучения спонтанных злокачественных но&ообразований использовали самок мышей линии A/Sn, имеющих высокую частоту развития рака молочной железы ( Бландова и соавт., 1979). Опухоли молочной железы возникали у половозрелых размножавшихся самок в возрасте старше 8 месяцев. Гистоморфологическое исследование показало, что в большинстве своем новообразования молочных желез у самок мышей линии A/Sn представляют собой инфильтрирующий рак с выраженным клеточным полиморфизмом.

При исследовании влияния старения на изучаемые показатели использовали самок мышей A/Sn и С57В1/6 в следующих возрастных группах: 2-3 мес., 6-7 мес., 11-15 мес. (именно в этом возрасте у самок A/Sn выход спонтанных опухолей молочной железы был наибольшим).

В качестве модели экстремального воздействия на животных, оп-позитных по спонтанному бластомогенезу, использовали трансмеридиональный перелет ив г.Москвы в г.Томск. При этом происходит смена климато-географических условий и сдвиг часового пояса на 4 часа, что можно рассматривать как субэкстремальный фактор, оказывающий влияние на организм в целом, и вызывающий комплекс специфических и неспецифических реакций адаптационного синдрома, которые опосредуются через нейро-эндокринное звено регуляции гомеостаза (lia-

твхин и соавт., 1986). Для коррекции отрицательного влияния трансмеридионального перемещения на противоопухолевую резистентность , использовали растительный адалтоген - экстракт родиолы розовой (золотой корень) и препарат тимуса - тимоптин.

Объектом исследования служили клетки селезенки, костный мозг, и сыворотка крови, полученные при декапитации животных. Для характеристики гуморального иммунитета и состояния антигеннеспецифических иммунорегуляторных механизмов применяли, следующие показатели.

Определение числа антителообраэующих клеток в селезенке проводили на 5-е сутки после введения эритроцитов барана (в/б, 2x1О8) методом локального гемолиза в геле (lerne, Nordin, 1963).

В сыворотке крови иммунизированных животных определяли титр гетерогемагглютининов с дифференцированием их на Ig М и Ig 6 с помощью 0,1 М раствора 2-меркаптоэтанола (Scott, Qershon, 1970).

Уровень циркулирующих иммунных комплексов измеряли, используя 4,166% р-р полиэтиленгликоля-6000 (Rodrick et al., 1982).

Супрессорную активность клеток костного мозга и селезенки in vivo изучали в системе адоптивного сингенного переноса. Для этого сингенным интактным реципиентам вводили в/в по 10 ' клеток костного мозга или по 5x107 спленоцитов qt доноров. Затем реципиентов не позднее, чем через час иммунизировали эритроцитами барана (в/б, 2x10® ). На 5-е сутки животных декапитировали, извлекали селезенку и определяли число антителообразуюиих клеток. Во всех экспериментах в качестве реципиентов использовали мышей одного воэраста(5-б месяцев).

При выполнении экспериментов in vitro применяли следующие среды: среда А - для отмывания клеток (среда 199 с добавлением 10% инакгивированной бычьей сыворотки и гентамицина(40 мкг/мл)); среда Б - для культивирования (среда RPMI 1640, забуференная 20 мМ HEPES, дополненная 2 мМ L-глутамшом,' 10% телячьей эмбриональной сывороткой и 3x10 М 2-меркаптоэтанолом).

Культивирование клеток осуществляли в планшетах для иму но логических реакций (завод мед. полимеров, Ленинград) при 37 С с 5Z COg и 1007. влажности.

По окончании культивирования клетки с помощью харвестера переносили на стекловолокнистые фильтры (Flow Labs или Scatron). Под

счет интенсивности радиоизотопной метки в ДНК проводили на сцин-тилляционном счетчике "Mark III" (Tracor Analytic).

фи изучении активности естественных супрессорных клеток in vitro клетки костного мозга опытных животных (4 х 10^) культивировали совместно с клетками нормальной сингенной селезенки в присутствии 2,5 мкг/мл конканавалина А. В качестве контроля использовали монокультуру епленоцитов, стимулированную Кон А. За 18 часов до завершения 3-х суточного культивирования влунки добавляли по 1 мкКи 3н-тимидина (уд. активность 5 Ки).

При тестировании цитостатического действия клеток костного мозга в качестве клеток-мишеней импользоваои маетоцитому Р815, поддерживаемую в асцитной форме на мышах ДВА/2. Свежевыделенные клетки-мишени инкубировали с клетками-эффекторами 14 часов. Затем в каждую лунку добавляли ^Н-тимидин (1 мкКи/лунку, уд. акт.5 Ки). Через 4 часа инкубации клетки с помоиью харвестера переносили на фильтры.

Фактор, продуцируемый костномозговыми естественными супрессор-ньш клетками, получали путем инкубации б млн. клеток в 24-луночных планшетах (Costar) в объеме 1,5 мл. культуралыюй среды. Активность супрессорного фактора оценивали по степени подавления пролиферации мастоцитомы Р81Б in у!Ьго(Сидорович и соавт., 19В7).

Для оценки митоген-стимулированной пролиферации В-лимфоцитов 2 X 105спленоцитов на лунку помещали в планшеты для иммунологических реакций и добавляли по 25 мкг/лунку ЛГЕ. В контрольные лунки вместо митогена добавляли такой же объем среды.

В некоторых экспериментах в качестве источника интерлейкина 2 и гамма-интерферона использовали Кон A-активированный супернатант епленоцитов крыс Wistar, освобожденный от лектина (Mater et al., 1985).

, Все полученные нами результаты подвергались статистической обработке с использованием критериев Стьюдента и Вилкоксон-Манна-Уитни. В таблицах приведена средняя квадратичная ошибка, а на графиках- величины доверительных интервалов.

Результаты исследования■ 1. Функциональная характеристика гуморального иммунитета и ее-

тественных супрессоров у мышей высокораковой и низкораковой линий.

Опыты проведены на мынах линии А/5'п с высоким выходом рака молочной железы и мышах низкораковой лияш С57В1/6 (Бландова и со-авт., 1983; Харьковская и соавт., 1985). Исследования выполнены на'животных, полученных из опытно-племенного питомника НИЛ экспериментальных биологических моделей АМН СССР и отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ онкологии ТНЦ АМН СССР.

Число антителообразующих клеток в селезенке мышей А/Бп на 5-е сутки после иммунизации их эритроцитами барана (2х1сРв/б) было достоверно выше, чем у мышей линии С57В1/6 (Р< 0,05). В характере изменения титра сывороточных гетерогемагглютининов на 3, 7 и 14-е сутки после назначения антигенного стимула, однако, достоверных различий не наблюдали. На 3-й сутки иммунного ответа все определяемые антитела были представлены М, а к 7-м суткам у мышей обеих линий большую часть сывороточных гемагглютининов составляли меркаптозтанол-резистентные антитела (1е в). К 14-м суткам иммунного ответа уровень в-антител продолжал нарастать, хотя титр общих гемагглютининов к этому сроку снижался.

При изучении ЛПС-стимулированной пролиферации В-лимфоцитов селезенки было показано, что индекс стимуляции у животных высокораковой линии существенно превышал аналогичный показатель у мышей линии С57В1/6 (3,8 и 2,48 соответственно).

Адоптивный перенос клеток костного мозга интактных мьшей линии А/5'п сингенным реципиентам, иммунизированных ЭВ, приводил к снижению числа АОК в селезенке последних с 50 280 + 3 400 до 12 600 + 3 450 (т. е. на 782). Перенос клеток селезенки практически не изменял иммунного ответа реципиентов. Клетки костного мозга мышей С57В1/6 в меньшей степени ингибировали генерацию АОК реципиентов, чем костномозговые клетки высокораковой линии. При этом число АОК в селезенке снижалось с 21 620 + 3 460 до И 460 + 3 510, т. е. на 4.7%. Клетки селезенки также не оказывали влияния на иммунный ответ к тимусззвясимому антигену, что свидетельствует об отсутствии в этом органе антиген-неспецифических супрессорных клеток у молодых половозрелых животных. Таким образом, у мышей высокораковой линии А/Зп имеют место различия состояния В-звена системы иммунитета, и естественной супрессор-

ной активнсти по сравнению с животными резистентной линии С57В1/6, что выражается в образовании значительно большего числа АОК в ответ на антигенный стимул, большей интенсивности пролиферации спленоцитов in vitro в ответ на стимуляцию ЛПС, а также в более высокой активности естественных супрессоров, определяемой in vivo.

2. Влияние экстремального воздействия на функциональное состояние В-звена системы иммунитета и активность антигеннеспеци-фических супрессоров.

В работе использованы мыши линии A/Sn и С57В1/6, полученные из опытно-племенного питомника НИЛ ЗБМ СССР; доставка из г. Москвы в г. Томск осуществлялась самолетом, исследования проводились на 1-е, 3-й, 7-е и 14-е сутки после перевозки. Достоверное снижение количества АОК зафиксировано у мышей обеих линий при иммунизации их ЭВ на 3-й сутки после транспортировки (Р< 0,05). Причем у мышей высокораковой линии угнетение иммунного ответа было более глубоким. Результаты изучения титра сывороточных гемагглютининов на 3, 7 и 14-е сутки после их иммунизации в 1-й день адаптации такие свидетельствуют о снижении уровня сывороточных антител в продуктивный период иммунного ответа (Р< 0,05 для обеих линий). Использование 2-меркаптозтанола для дифференцирования гемагглюти-нинов на íg М и Ig Q показало, что ослабление гуморального иммунного ответа происходит ва счет снижения Ig G. Наблюдаемые фазовые изменения в иммунном ответе на тимусзавиеимый антиген тесно связаны с активацией эндокринной системы в условиях "транспортного ■ стресса" и адаптации к новым климато-географическим условиям. Показано также, что на 1-е сутки после перевозга животных достоверно снижался индекс стимуляции пролиферации спленоцитов в присутствии ЛПС (Р< 0,01). В эти же сроки в селезенке обнаружены клетки, способные подавлять генерацию АОК у иммунизированных реципиентов (на 40%). После 3-их суток адаптации супрессорная активность спленоцитов исчезала.

При исследовании иммунокорректирующего влияния препаратов ти-моптина и экстракта золотого корня на стресс-индуцированные изменения в В-звене системы выявлено, что тимоптии оказывает выраженное нормализующее влияние на угнетение иммунного ответа к ЗВ, а также т снижение пролиферативного ответа к В-клеточному миноге-

иу. Экстракт золотого корня менее эффективно повышал сниженные уровень антителообразования и митоген-стимулированный пролифера-тивный ответ спленоцитов у животных, перенесших трансмеридиональный перелег. Следует также отметить, что используемые нами имму-номодуляторы отменяли снижение клеточности в селезенке, а также увеличение количества ядросодержащих клеток в костном мозге, вызванных стресс-воздействием.

3. ДМБА-индуцированный канцерогенез.

. В опытах на мышах линии C57BL/6, введение 7,12- диметилбензСа]-антрацена подкожно приводило к возникновению сарком (идентифицированных при гистологическом исследовании как фибросаркома). Контрольным животным вместо ДМБА вводили его растворитель. Для исследований использовали животных через 40-50 дней после введения канцерогена ("ранний латентный период"), после появления пальпируемых опухолей, и животных у которых к этому времени ешэ не появились опухоли ("поздний латентный период").

При иммунизации 2x10 ЭВ у контрольных животных число АОК на селезенку составило 43 600 + 4 560, у животных группы "поздний латентный период" этот показатель снижался более чем в 2 раза; а минимальные результаты были получены у животных-опухоленосителей: 18 ООО + 9 320 АОК на орган (Р< 0,05). Сходные по направленности, однако менее выраженные результаты были получены при определении титра гемагглютининов.

Уровень циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови в процессе химического канцерогенеза возрастал. Так, в контрольной группе уровень ЦИК составил 0,29 + 0,04, а у животных-опухоленосителей увеличивался до 0,73 + 0,1 усл. ед. (Р< 0,01). Полученные нами результаты согласуются с литературными данными (Steele et al., 1983; Ravikumr et al., 1984), в которых указывается, что при прогрессировали! опухолевого процесса средний уровень и частота выявления положительных результатов обнаружения ЦИК значительно увеличивается.

Как следует из представленных выше данных, гуморальный иммунный ответ на тимусэависимый антиген у животных после введения ДМБА прогрессивно снижался, однако, пролиферативный ответ спленоцитов на &-клеточный митоген не был изменен. Одной из вероятных причин угнетения антителообразования может быть прямое токсическое влия-

ние ДМБА на клетки селезенки. По данным Ward et al. (1084) и Erlich et al. (1986) этот канцероген имеет высокую токсичность прежде всего для клеток костного мозга и селезенки. Другой возможной причиной снижения иммунореактивности при развитии фибро-сарком, индуцированных ДМБА, может быть появление (или активация) супрессорных клеток.

Клетки селезенки контрольных животных при переносе их реципиентам с последующей иммунизацией последних эритроцитами барана практически не оказывали влияния на иммунный ответ (рие.1). В то же время перенос спленоцитов животных-опухоленосителей сопровождался снижением числа АОК у реципиентов с 26 ОБО + 3 010 до 12 720 + 1 930 (т.е. на 61%).

Рис. 1 Супрессорная активность клеток костного мозга (А) и селезенки (В) при ДМБА-индуцированном канцерогенезе 1-контроль, II- ранний латентный период, Ш-поздний латентный период, 1У-опухоленосители

Кинетика естественной супрессорной активности клеток костного мозга в процессе химического канцерогенеза, индуцированного ДЫБА, также представлена на рис.1. Из представленных данных следует, что в латентный период канцерогенеза естественная супрессорная активность клеток костного мозга существенно снижается. При переносе клеток костного мозга опухоленесущих мышей количество АОК в селезенке реципиента достоверно понижалось (Р< 0,05), однако их супрессорная активность была ниже, чем у интактных мышей. Исследование активности костномозгового супрессорного фактора in vitro показало, что ее достоверное повышение у животных-опухоленосите-лей наблюдалось лишь при разведении супернатанта 1/16 (Р< 0,05). При более высоких концентрациях супрессорного фактора, достоверных различий в подавлении синтеза ДНК клеток-мишеней наш не было зарегистрировано.

Цитостатическое действие клеток костного мозга достоверно усиливалось в поздний латентный период, в то время как их супрессорная активность была минимальной; это указывает на различную природу костномозговых цитостатических эффекторов и естественных супрессоров. Известно, что для осуществления цитостатических взаимодействий необходим контакт клетки-эффектора с клеткой-мишенью (Богдашин, 1986), в то время как реализация супрессорного влияния осуществляется дистантно, через выработку соответствующих факторов.

Тагам образом, 'анализируя полученные результаты, можно закл*>-чить, что развитие фибросарком, индуцированных 7,12-диметилбенэ-антраценом у мышей линии C57BL/6 сопровождается снижением гуморального иммунного ответа на тимусзависимый антиген, повышением уровня циркулирующих иммунных комплексов, появлением в селезенке неспецифических клеток-супрессоров, а также снижением активности костномозговых еупрессорных клеток.

4. Спонтанный рак молочной железы у мышей линии A/Sn. Возрастные изменения изучаемых показателей у мышей высокораковой и низкораковой линий мьдаей.

Одной из наиболее близких по отношению к человеческой ситуации злокачественного роста являются спонтанные опухоли у етвотных. В опыте использованы мыши линии A/Sn, самки с раком молочной железы

(подтвержденным гистологически). Помимо животных с опухолями, в работе также использовали самок мышей высокораковой линии А/5п и низкораковой линии С57В1/6 разного возраста: 2-2,5 мес.; 6-7, мес.; 12-15 мес.

Рис. 2 ЛШ-стимулированная пролиферация спленоцитов

мышей A/Sn в процессе старения и при росте спонтанного РМЖ.

I - возраст 2-2,5 мес., И -6-7 мес., III - 11-16 мес., IY - опухоленесущие мши;

1 - пролиферация спленоцитов в присутствии митогена;

2 - спонтанная пролиферация.

На рис. 2 представлены результаты изучения пролиферации In vitro В-лимфоцитов селезенки шин Я A/Sn при старений и возникновении спонтанных злокачественных новообразований. Спонтанная пролиферация спленоцитов в процессе старения практически не изменялась. При развитии опухоли уровень пролиферации клеток селезенки

в отсутствии митогена резко возрастал. Однако, при добавлении ЛПО индекс стимуляции пролиферации ул.,.. еных этой группы был самым низким - 1,26 в то время как у живогних в соответствии с увеличением возраста данный показатель изменялся следующим образом: 3.8; 4,05; 2,3.

Нами было проведено исследование активности неспецифических сулрессорных клеток костного мозга и селезенки в процессе старения мышей высокораковой линии и при появлении у них опухолей молочной железы (табл.1). В системе in vitro клетки селезенки молодых животных практически не влияют на уровень иммунного ответа сингенных. реципиентов, тогда как спленоцигы стареювдх и опухоле-несущих животных подавляли накопление антителообраэующих клеток на 63X и 75% соответственно. Перенос клеток костного мозга от 2-2,5-месячных мышей с последующим введением антигена сопровождался снижением иммунного ответа с 63 240 + 4 S30 в контроле, до 10 ООО + 2 680 АОК на селезенку. Трансплантация костного мозга старых и опухоленесущих доноров сопровождалась подавлением генерации АОК. соответственно на 93,71 и 94%.

Сходные по направленности результаты были получены при изучении активности естественных костномозговых супрессоров in vitro е тесте подавления Кон А-стимулированной пролиферации нормальных сингенных спленоцитов. При добавлении клеток костного мозга в соотношении 2:1 интенсивность митоген-стимулированной пролиферации снижалась на 70,2; 75,5 и 85,5% при использовании, соответственно, молодых, стареющих и опухоленесущих мышей.

Оупернатанты, полученные после 48 часов культивирования in vitro клеток костного мозга исследуемых животных обладали выраженным ингибируюндем действием на пролиферацию клеток мастоцитомы Р 816 в культуре (Рис. 3).

У мыией линии. A/Sn в возрасте 2-2,5 месяцев активность супрес сорного фактора составляла 70,4%. 1Ь мере старения этот показатель постепенно увеличивался и достигал максимального значения у животных, имеющих злокачественную опухоль (92,7%). У мышей низко раковой линии динамика продукции и активность костномозгового супрессорного фактора при старении была близка к выше описанной.

Недавно было показано (Fu et al., 1989), что при росте злокачественных опухолей молочной железы в сыворотке крови, а татле i

Таблица 1

Влияние трансплантации клеток костного мозга и клеток селезенки самок мышей линии А/5п на иммунный ответ сингенных реципиентов

вводимые клетки, возраст донора Число АОК/сел. % супрессии

ЭБ 63 240 + 4 930

ЭБ+к. к. м., 2-3 мес. 10 ООО + 2 680 * 84,2

ЭБ+к. к. м. ,11-14 мес.,

без опухоли 4 010 + 2 680 * . 93,7

ЭБ+к. к. м. ,11-14 мес.,

с опухолью 3 750 + 2 280 * 94,1

ЭБ+к. с., 2-3 мес. 60 Й20 + 8 835 3,9

ЭБ+к. с. ,11-14 мес.

без опухоли 23 320 + 1 470* 63,1

ЭБ+к. с. ,11-14 мес. 1

с опухолью 16 040 + 5 230 * 74,6

Тримечания: к. к. м. - клетки костного мозга; к. с. -клетки селеэенки; ; - различия с контролем статистически достоверны (Р < 0,05).

опухолевой тканевой жидкости происходит увеличение содержания фактора, подобного гранулоцитарно-макрофагальному колониестимули-рувдому фактору. Клетки костного мозга, культивируемые 3 дня Ш vitro с супернатантами опухолевых клеток сильно ингибировали про-лиферативный ответ спленодатов на штогены. Таким образом, результаты полученные этими.авторами, полностью согласуются с данными, полученными наш.

Рис. 3 Продукция супрессорного фактора клетками костного мозга мышей С57В1/6 в процессе старения. I - возраст 2-2,5 мес., II -6-7 мес.,111 - 11-15 мес., IY - опухоленесукие мыши;

Анализируя полученные нами данные на модели спонтанного роста рака молочной железы, можно выявить следующие основные моменты: появление при старении, а также при росте опухоли клеток-суп-

рессоров в селезенке, их активацию в костном мозге, увеличение уровня спонтанной пролиферации спленоцитов и ослабление их ответа на В-клеточный митоген, а также активация костномозговых цитоста-тических эффекторов и усиление продукции клетками костного мозга супрессорного фактора

ВЫВОДЫ

1. Мыши высокораковой линии А/2п и низкораковой линии С57В1/6 различаются по уровню гуморального иммунного ответа к тимусзави-симому антигену, пролиферативкого ответа к В-клеточному митогену, а такие по активности естественных супрессорных клеток костного мозга

2. Неспецифические супрессорные клетки в селезенке мышей высокораковой линии А/Еп обнаруживается при старении животных и возникновении спонтанных опухолей молочной железы.

3. Активность цитостатических эффекторов и супрессорных клеток костного мозга, продукция костномозгового супрессорного фактора увеличиваются при росте спонтанных опухолей молочной железы.

А. При развитии фибросарком, индуцированнных 7,12-диметилбенз-I а) антраценом возрастает уровень циркулирующих иммунных комплексов в крови и снижаются показатели гуморального иммунитета

5. Снижение активности естественных супрессорных клеток костного мозга происходит в латентный период химического канцерогенеза. При развитии опухолей неспецифические супрессорные клетки обнаруживаются в селезенке.

6. Продукция костномозгового супрессорного фактора при совместной инкубации клеток костного мозга с Кон А-активированным супернатантом, свободным от лекгина, а также с гидрокортизоном или липополисахаридом, не изменяется.

7. Тимоптин и экстракт золотого корня могут эффективно предупреждать стресс-индуцированные сдвиги в гуморальном иммунитете у мышей высокораковой линии А/Бп.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Иммунологическая реактивность по В-эвену иммунитета мышей

СВА/ Ca в динамике роста перививной злокачественной опухоли // В кн. Иммунология экстремальных состояний.- Томск. - 1985,- С.65-70 (соавторы В.И. Огреба, С. А.Станкевич)

2. О возможности использования препаратов растительного происхождения для профилактики и коррекции врожденных и приобретенных иммунодефицитов // Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока: Тез. докл. Всесоюзн. конф. - Томск, 1986.-С. 112- 113. (соавторы В. ИОгреба, А. Р. Коробейникова, А. П. Лихачева, 0.3. Кабанова, С. А. Станкевич, Г. Ф. Фролов).

3. Некоторые показатели В-авена иммунитета в динамике химического канцерогенеза, индуцированного 9,10-ДМБА // Мэлодые ученые и специалисты - ускорению ЯТИ Тез. областной конф.- Томск, 1986.-С. £6

4. Гормональные механизмы иммунорегуляиии и состояние системы иммунитета у животных с различной предрасположенностью к спонтанному бластоыогенеэу в норме и в условиях экстремального воздействия // Регуляция иммунного гомеостаза: Тез. Всесозн. конф. - Ленинград, 1986. - С. 54-56 (соавт. В. И. Огреба, С. А. Станкевич,

Е В. Чердынцева, Г. Ф. Сролов). "Регуляция иммунного гомеостаза". Лэнинград, 1986, С.64-65.

5. О единой направленности изменений в системе иммунитета при состояниях врожденного и приобретенного иммунодефицита с позиций противоопухолевой резистентности // Иммунодефициту и аллергия: Тез. Всесоюзн. симпозиума с международный участием. - М., 1986. -

С. 66-67 (соавт. В. И.Огреба, Н. Е Чердынцева, С. А. Станкевич),

6. Противоопухолевая ревистентность организма на фоне адаптации к климаго -географическим условиям Сибири // Проблемы создания и совершенствования автоматиз. информ. систем охраны труда, окреуж. среды и здоровья населения: Тез, Всесоюзн. конф. - Ангарск. 1986.- С. 182-183.(соавт. С.А.Станкевич, R И.Огреба, Е А.Иванов).

7. Роль генотипа в реализации ответных реакций в системе иммунитета на фоне сочетанного действия факторов окружавшей среды // Там же, - С. 193-194 (соавт. Е И. Огреба, С. А.Станкевич, Г.Ф.Фролов).

8. Неспецифические супрессоры селезенки и костного мовга у мышей высокораковой линии в онтогенезе // Актуальные проблемы в иммунологии: иммунодефициты и иммунокоррекция: Тез. региональ. конф. -

Владивосток, 1987,- С. 151 (соавт. а Е Огреба, ЕЕ Васильев).

9. Activity, of bone marrow and spleen suppressor cells in mices with spontaneuos tumour // Eight European Immunology Mseting.

'Zagreb, Yugoslavia, 1987.- N 10-49,- P. 195 (Ogreba V. I. , Vasilyev N. V.).

10. Depedence reactions of imrfiunity factors to extremal influence from genetic predisposition and typology of nervous system // Eigth European Immunology Meeting. - Zagreb, Yugoslavia, 1987,-N 10-49. -P.65 (Vasilyev N. V., Ogreba V. I., Erschov A. F., Colyda Т. I. , Ryabchuk V. A. , Khoreva S. A. , Abzaeva I.N,, Stankevich S. A. , Frolov Q. F.).

11. Сравнительная характеристика системы иммунитета у мышей с различной предрасположенностью к злокачественному росту в норме и в условиях стресса // Актуальные вопросы стандартизации лаб. животных для мед-биол. исследований: Тез. Всесоюэн. конф. - М, 1988.4.2. - С. 143-145 (соавт. ЕЕ Огреба, С.А.Станкевич, ЕЕЧердынце-ва, Ю, П. Вельский).

12. Non-specific bone marrow and splenic supressor cells in mice with DMBA Induced carcinogenesis // Ninth European Immunology Meeting.- Roma, Italy, 1S88.- W 28-20.- P. 363 (Ogreba V. I., Vasilyev N. V.).

13. The cytostatic effect of immunocompetent cells in dynamic of chemical induced tumor growth // Ninth European Immunology Meeting. - Roma, Italy, 198Э. - W 1117 -47.- P. 109 (Ogreba V. I. , Stankevich S. A.. Bel sky Y. P. , Polushina 0. A. , Vasilyev N. V.).

14. Активность неспецифических супрессоров костного мозга и селезенки в латентный период опухолевого роста // Вопросы онкологии. - 1988.- N 8.- С. 952- 955 (соавт. Е Е Огреба, ЕЕ Васильев).

15. Супрессорная активность клеток костного мозга и селезенки мышей линии С57В1/6 при канцерогенезе, индуцированном 7,12-диме-тилбенз( а)антраценом // Экспериментальная онкология. - 1989,- N 5. - С. 23-25 (соавт. ЕЕ Огреба).

16. Сравнительная характеристика функционального состояния Ти в-клеточного звеньев иммунитета у линий животных, оппозитнь/х по спонтанному бластомогенезу // Деп. ВИНИТЕ - 20.01.89,- N 481 -В89: Опубл. Билл.зкспер.Сиол. и мед. - 1989.- N 5,- С. 41.-N 470 (соавт.

В. Е Огреба, С. А. Станкевич., Е А. Терновой., Г. Ф. Фролов).

УТВЕРЖДАЮ ДИРЕКТОР НШ ОНКОЛОГИИ ТЩ АМН СССР ЧЛЕН-КОРР. АМН СССР

__/е а зыряшв

"_"__19_ Г.

ЭКСПЕРТНОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ О ВОЕЙШЮОТИ ОПУБЛИКОВАНИЯ

ЭКСПЕРТНАЯ КОМИССИЯ (РУКОВОДИТЕЛЬ-ЭКСПЕРТ) _ НИИ онкологии

Томского научного центра АМН СССР, зам. директора по НИР_

(организации с указанием ведомственной принадлежности) академик АМН СССР Е В. Васильев

РАССШГРЕВ автореферат диссертации Кусмарцева С. А. на соис-(ф.и.о. автора, ьид, название материала) какие степени кандидата медицинских наук "функциональное состояние В-лимфоцитов и активность еупресеоров костного мозга на

этапах злокачественного роста"_:_

ГОДТВЕРДДАЕТ, ЧТО В МАТЕРИАЛЕ не содержатся_сведения,пре-(содержатся ли сведения,

дусмотреннае разделом 3 положения -88_

предусмотренные разделом 3 положения - 88) НА ПУБЛИКАЦИЮ МАТЕРИАЛА _не следует_

(следует ли)

ПОЛУЧИТЬ РАЗРЕШЕНИЕ _МЭ СССР__

(министерства, ведомства или другой организации) 8АКЖЯЕНИ£_автореферат диссертации__Кусмарцева С. А. "Функциональное состояние Вт-лимфоцитов и активность супрессоров костного мозга на этапах злокачественного роста"__

ПРНдагДАТЕАЬ ЮИИССДО (РУКОВОДИТ ЕЛЬ- ЭКСПЕРТ) Заместитель директора по НИР НИИ онкологии ТНЦ АШ СССР, академик АМН СССР / / Н. а Васильев