Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Супрессоры противоопухолевого и трансплантационного иммунитета

российская академия мвдицинс1шх наук онкологический научный центр

На правах рукописи Уда 616-006-097:612.112.94 4-Й15.373 - 3

АВРОНИНА Инесса Филипповна

СУПРШЮРН ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО И ТРАНСГШАНТАХЩОКНОГО ШтВГГЕТА

14-00-14 - Онкология

Диссертация на соискания ушной ствпв"и доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва, 1992

Работа выполнена в Онкологическом научном центре Российской академии медицинских наук

Научные консультанты: доктор■медицинских наук С.Н.Быковская доктор медицинских наук профессор Б.Д.Брондз

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор З.Г. Кадагидзе доктор медицинских наук профессор Б.В. Нинегин доктор медицинских наук профессор В.Г.Нестеренко

Ведущее учреждение - Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена

Защита диссертации состоится ___Г-Ж г.

в ____ часов на заседании Специализированного совета

Д.001.17.01 Онкологического научного центра РАМН (Москва, П5478, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Онкологического научнох'о центра 1V.M1I

УчсшиП секретарь Специализированного совета кандидат медицинских наук К) Л'.Шишкин

-4 <r : if^ ')

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

)

'JV.' i

'„Актуальность проблемы. Супрессоры противоопухолевого и трансплантационного иммунитета принадлежат к категории регуляторных лимфоцитов, подавляющих действие киллеров, направленных на уничтожение аутологичноЯ опухоли или трансплантата.

Исследование механизма индукции и функционирования супрессо-ров, а также разработка подходов к модифицированию, их активности является одной из актуальных задач противоопухолевого и транс-глантацконного иммунитета, решение которой может привести как к товышению противоопухолевой резистентности организма, так и к тродлению срока жизни трансплантата.

К настоящему времени из этих двух категория лимфоидннх клеток 5аименее изученными являются Т-супрессоры противоопухолевого в.мунитета. Согласно современным представлениям (wigzeii, 1985; ?oMns,i96G), эти клетки образуются в организме опухоленосителеЯ юд действием опухолеассоциировашшх антигенов, представляющих ;о0ой модифицированные антигены главного комплекса гистосовмес-ммости (Major Histocompatibility Complex, МНС ) (Rogers 1904; Stauss, 19S6; Hirorol et al., 1966; Helsfielfl, 198S1. В экспери-шнтах на животных было показано, что по мере прогрессии роста щухоли происходит постепенное снижение уровня противоопухолевых галлоров и нарастание супрессорноЛ активности Т-клоток и моноци-•ов (Fujlmoto et al.,1976; Ye et al.,1984; North, Bursuker, 1904 i др.). Имеются отдельные исследования, где доказано сущвствова-гае супрессоров противоопухолевого иммунитета у онкологических ¡ольных (Yu et al. ,1977; Mukherjl et al.,1986: Eura et al.,1966). I связи с тем, что изучение сугтрессоров, индуцироватш* ростом шухоли, находится на начальном этапе своего развития, требуется шок новых экспериментальных систем для их- обнаружения, а также 1азра0отка новых методов анализа супрессии, позволягап« оцени-;ать супре ссорную активность в аутологичных системах клеток по ■есту подавления цитотокпячности противоопухолевых киллеров.

С появлением метода клеточной пдонтиг-ноП иммунотерапии и :ечения онкологических болнп« .'пиЯокин-вкгир.щювштт тллера-•и ( ЛАК глетклмн п '-очятпнии с интерлеЯкином-2 (ИЛ-2) (Rosenberg, ■г",г. 1 o<v> > t Г7Ч.Т) очевидной !!по<ч?пдимог.ть изучения способности ynpoeeov^R !V).nt-Hiix « рвяктигаши под действием 11Л-2 в ходе pparnra unuivr.nor. ЛМ!. клрткэми и препаратами рекомОинэнтннх лм^окккок. Кидукцин "упрогс^рной активности в популяции культи-

вируемнх ЛАК ¡слеток человека, а также в крови онкологических больных в процессе адоптивной иммунотерапии остается неизученной. По вопросу подавления супрессорами противоопухолевого иммунитета цитотокиической активности введенных в организм больного ЛАК клеток имеются только единичные исследования (Haubeck jt al., 19öö; fura et al., 1988).

В отличие от регуляторных клеток противоопухолевого иммунитета, изучение Г-супрвссоров, индуцированных антшчшами мне, началось полтора десятилетия назад. На моделях трансплантационного иммунитета у животных била показана способность супрессор-них Т-клеток блокировать активацию синтеза ДНК, генерацию киллеров в смешанной культуре лимфоцитов (Holan et al.,1983; Frankel, I9öi) и др.), а также препятствовать отторжению трансплантата, пересаженного мышам (Jlrsch et al.,1974; Wood et аГ.,1964; Gulg-ley et al. и др.). Несмотря на имеющиеся фундаментальные исследования (Damle, 1986; Hutchinson, 1936), до сих пор не была создана экспериментальная система, позволавдая концентрировать Т-супрессоры трансплантационного иммунитета на клеточном иммуно-сороенте за счет рецепторов к антигенам МНС и получать антксуп-рессорные антитела путем иммунизации кивотшх обогащенной суп-рессорами популяцией лимфоцитов. Общность природы опухолеассоциированных и антигенов МНС открывает возможность разработки в трансплантационной системе нового способа получения антисупрес-соршх сывороток, предотвращающих развитие опухоли.

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение механизма действия Т-супрессоров на моделях противоопухолевого и трансплантационного иммунитета in vitro, рестимудяцяи i« активности под действием Ш1-2; получение антисупресс ;рнях антител.

Работа включала проведение исследований на инбредных линиях животных и клиническом материале миологических больных. П±л этом изучение Т-супрессоров трансплантационного иммунитета у мышей являлось отработкой экспериментальной модели для последующего развития методов выявления, .концентрации и оценки функциональной активности еупрессорних лимфоцитов противоопухолевого иммунитета у человека и их реактивации под действием ИЛ-2.

В ходе работы были поставлены следующие задачи:

- разработка метода индукции у мышей специфических Т-супрес-

соров антигенами комплекса H-?. и изучение их функциональней активности;

- создание экспериментальной модели для концентрации специфических Т-супрессоров мышей и получения обогащенных супрессорами популяций лимфоцитов;

- получение аитисупрессоршх сывороток, модифицирующих реакции трансплантационного и противоопухолевого иммунитета у мышей;

- создание экспериментальной системы для обнаружения и концентрации Т-супрессоров человека, индуцированных ростом опухоли;

- разработка метода тестирования аутологичной оупрессорной активности у (Зольных раком;

- изучение способности Т-еупрэссоров противоопухолевого иммунитета к реактивации под действием ИЛ-2 в ходе адоптивной иммунотерапии онкологических больных.

Научная новизна и практическая значимость работа. Результатом настоящей работы явилось создание новой экспериментальной додели для изучения генерации н функциональной активности специфических Т-суггрессоров, индуцированных антнгенаии МНС у шшеа. Впервые на поверхности специфических Т-супрессоров были обнаружены рецепторы V антигенам комплекса Н~2, что позволяло сконцентрировать их на клеточном иммуносорбонте и использовать обогащенную супрессо-рами популяции лимфоцитов для получения антисупрессоршх антител. При иммунизации крыс популяцией концентрированных регуляторят клеток впервые удалось получить антисупрессорные антитела, избирательно инактивирувдие либо стимулирущие активность Т-супрее-сорсв in vivo et in vitro. При этом оказалось, что антисупрессорные антитела, полученные в трансплантационной системе к дпфференцировочнечу маркеру эффекторных Т-супрессоров, предотвращали также развитие сингенной саркомы у мышей, инактивируя супрессоры противоопухолевого иммунитета.

При фракционировании лимфоцитов периферической крови болышх: раком в предаете перколла впервые удалось получить две различны'! популяции лимфоцитов - обогащенную супрессорами и предшественниками цитотоксичсских Т-лимфоцитов. На основании этих данных была создана принципиально новая зутологнчная система лиифоиднш клеток для обнаружения, концентрации и определения функниммль кой активности сунрессорных Т-клеток и моноцитов окколт-и'.ргки*

больных по тесту подавления цитотоксичности противоопухолевых киллеров.

При изучении действия ИЛ-2 на супрессоры противоопухолевого иммунитета человека впервые была показана возможность реактиваций супрессорной активности Т-клеток и моноцитов в популяциях ЛАК клеток больных раком. С другой стороны, была продемонстрирована способность супрессоров онкологических больных и мышей опу-холеносителей препятствовать цитотоксической активности ЛАК клеток на уровне их взаимодействия с опухолевыми клетками-мишенями.

При проведении адоптивной иммунотерапии в ' ОНЦ РАМН I 1987-1988 годах впервые была изучена динамика :супрессорно1 активности в популяциях ЛАК клеток и периферической крови больных раком. Было установлено, что в процессе лечения уровеш супрессии снижался вплоть до полного исчезновения аффекта з некоторых пациентов к концу терапии.

Практическая ценность работы определяется прежде всего там, что в ней разработаны подхода для концентрации супрессоров противоопухолевого я трансплантационного иммунитета, что может Сыт; использовано для удаления сулрессорных клеток больных из популя ций ЛАК клеток при адоптивной иммунотерапии, и напротив - дл: развития методов активации Т-супрессоров на клеточном иммуноеор бенте при трансплантации. Эти методы могут быть применены дл. получения клонов супрессоров и киллеров, а также для создали препаратов монокпоналышх антител к дафференцировочним маркера этих субпопуляций.

Предложена новая система получения антисупрессорных антитял которые способны инактивировать эту популяцию лимфоцитов, н действуя на другие Т-субклассы, в том числе и на цитотоксичсски Т-лимфоциты, что может оказаться перспективным для противоопухо левой иммунотерапии.

Предложен и апробирован новый способ определения супрессорнс активности у человеке, позволяющий оценивать суммарную активное Т-клеток и моноцитов больных раком. Этот метод может быть исшы зовгн в клинической практике для характеристики иммунного стат! са пациентов со злокачественными новообразованиями.

На основании данных по изучению динамики супрессорной актш ности в популяциях ЛАК клеток и в крови онкологических больных ходе адоптивной иммунотерапии возможно ввести в схему лечеш

рекомендации гю использованию химиопрепаратов, нейтрализующих функциональную активность супрессорных клеток в организме.

Апробация райоти." Основные положения диссертации были представлены на научней конференции "Вопросы молекулярно-клеточной иммунологии" (Ереван, 1979), Всесоюзном симпозиуме "Ранние прояв-ния тканевой несовместимости" (Москва, 1979), IX .Международном симпозиуме по сравнительному изучению лейкозов и родственных заболеваний (Сухуми, Пицунда, 1979), IV Международном 'конгрессе по иммунологии (Париж, 1980), Объединенном пленуме советов АМН СССР (йосква', 1980), Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы иммунологии" (Алма-Ата, 1981), Всесоюзном пленуме "Рецепторы лимфоцитов и клиническая иммунология" (Москва, 1982), II Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток (Звенигород, 1983), Советскот-французеком симпозиуме "Иммунология опухолей" (Москва, 19£"~),' IV Международном конгрессе по иммунологии (Торонто, 1986); Симпозиума "Структура, биосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы" (Пущшзо, 1937), Конференции Американской федерации обществ по биологической терапии (Питсбург, 1991), Всесоюзном симпозиуме "Акт-уалышв вопросы иммунотерапии опухолей" (Юрмала, 1988), I Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи,1989), 1 Съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992).

. П) ликации. Результата исследований, рассмотренных в диссертации, изложены в 33 публикациях, приведенных в копце автореферата: в 25 статьях в научных журналах и 8 тезисах докладов.Кроме этого по теме диссертации имеется одно авторское свидетельство, зарегистрированное в Государственном реестре изобретений СССР.

Структура автореферата. Диссертация в форме научного доклада изложена на 63 стр. машинописного текста, содержит 2 табл. и 14 рис. и состоит из общей характеристики работы, списания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, и выводов. В тексте содержится 142 ссылки на зарубежные и зтечественные источники. В каждой главе перед изложением собственных результатов дан критический обзор состояния разрабатываемых вопросов. Краткий обзор проблемы, определяющий постановку ¡адачи иесдедовагшя, дон во введении.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные, онкологические больные, доноры

В работе использовали мышей конгенных и рекомбинантных но комплексу Н-2 линий - В10 (H-2b), D2 (H-2d), BR (H-2k), В10.М (H-2f), BIO.A (H-2kd), 5R (H-2bkd), 2R (H-2kdb), R101 <H-2db), RIOT (H-2bli); неконгв1ШЫХ ЛИНИЙ - BAI,В/с, СБА, В6, DBA/2, В6СР1, А, СЗН; крыс линии Вистар.

Животных получали из питомника Столбовая (Московская область) и ОНЦ РАМН.

Объектами исследования служили лимфоциты периферической крови 57 больных меланомой, раком мочевого пузыря, почки, прямой и толстой кишки; 17 доноров; лимфоциты селезенки и лимфатических узлов милей; крысиные сыворотки.

Семь больных раком были подвергнуты адоптивной иммунотерапии по схеме Розенберга (Rosenberg et al., 1987). 3 первые 2-3 дни недели у больных брали кровь методом лейкофереза с целью культивирования из нее ЛАК клеток. В последующие дни недели пациентам 2-3 раза внутривенно вводили 2,5-13,6x109 аутологичкых ЛАК клето: с 75.000 БД ракомбинантного Ш1-2 (рИЛ-2). В зависимости от клинического состояния больных подвергали одному-пяти курсам ыдопттноЛ иммунотерапии.

Получение лимфоидных клеток

Для приготовления суспензий мышиных спленоцитов использовали гомогенизаторы Поттера. Суспензии клеток из лимфатических углов получали продавливанием их ткани сквозь металлические сетки. Мононуклеарн из периферической крови человека получали методом центрифугирования в градиенте фиколл-верографина с плотностью 1,077 г/см3 (Boyum, 1968), а также из лейкомассы больных и доноров путем ее отстаивания в растворе полигльжина в течение 1-/, часов пр» комнатной температуре. Для получения Т-клеток 2x1 с/ мононуклеаров либо клеток селезенки мышей наносили на колонку г, нейлоновой ватой и инкубировали 30 мин. при 37°С, затем lioripim-репившиася клетки алюпровали экспериментальной средой (Julius et al., 1973).

7

Для получения моноцитов 2-ЮхЮ спленоцитов инкубировали 45 мин. при 37^'С на пластиковых чашках Петри, предварительно пора Ооташшх аутологичней плазмой либо шбрионалъиой телячьей сиво регкой. После инкубации удаляла шжрикриш!Iаикрел клетки, добав-

ЛЯЛИ 2% раствор EDTA (etylendiamintetraacetic aoid) и собирали открепившиеся клетки (Kumagai et al., 1979).

Опухоли

In vitro культивировали клетки мышиной саркомы МХ-11 (Н-2Ь) (Bubenik et al.,1978, 1983), МС-14 (Н-2Ъ)(Bubenik et al., 1978), шеломы X63-.Ag8.653 (H-2d)(Karauuyma, Melohers, 1988) и тимомы EL-4 (H-2b) (Gorer, Araos, 1956), а также линии клеток человека: К-562, Molt-4, рака мочевого пузыря Т-24 (Bubenik et al., 1973), рака тела матки Hela (Gey et al.,1952) и рака толстой кишки РТК 1, 8, 9, 10 и 12 (предоставлены Е.С.Ревазовой, Лаборатория экспериментальных моделей ВОВД АМН СССР).

Для роста опухоли in vivo мышам D2 и В6 вводили подкокно 1-5x106 клеток МС-14 либо 103 клеток EL-4, мышам ВАХВ/о инъецировали внутриОршинно Юб клеток X63-Ag6.653 мышам В10 вводили вяутрпкожно ,5-1хЮ6 клеток саркомы МХ-11.

Суспензии клеток из солидных опухолей человека получали путем инкубации кусочков опухолевой ткани в смеси ферментов - трипсина, коллагеназы и дезоксирибонуклеазы (Pretlow т. о., Pretlow т. р., 1934). Для использования в смешанных культурах клеток полученную суспензию обогащали до 90% опухолевыми клетками ni!тем спонтан-пого осаздения в градиенте эмбриональной телячьей сыворотки. Часть выделенных опухолевых клеток замораживали в жидком азоте для последующего использования в циготоксическом тесте в качестве .леток-мишеней.

Цитотоксический тест

Цитотоксические Т-лимфоциты индуцировали внутрибршинной иммунизацией ?"чшей B10.D2 2-2,5x1 о''' клеток тимомы И>4. КилЛернуп активность клеток селезенки определяли через 4 дня в 16-часовом цитотоксическом тесте но выходу 51Сг из меченых иг клеток-мишеней (перитонеальные макрофаги). В лунку помещали по 8x10s спле-ноцитов и 4хЮ5 кле""ж-мишеней (Дризлих Г.И.,Андреев А.В.,Абро-яина И.Ф. и Брондз Б.Д. ,1975).

Для определения цитотоксической активности мононуклеарных и шмфскин-активировагашх клеток человека и мыши использовали опу-юлевыэ клетки К562, Molt-4, Т-24, IteLa, РТК, МС-14, X63-Ag8.653 i EIi-4. 0,5-4x10 клеток-мотеней инкубировали в среде, содержа щей 50-200 мкКи Na,.,51CrO , в течение часа при 37°С. трижды

отмывали и ресуспендаровали в среде ИРМ1 1640. 1С^ меченых клеток-мишеней смешивали с 5x1эффекторных лимфоцитов и инкубировали в среде ЙРМ1 1640 с 102. эмбриональной телячьей сыворотки в 96-луночннх пластинах в объеме 0,2 мл в течение 18 часов при 37°С и 5% СО^. Каждый вариант повторяли трижды. По окончании инкубации пластины центрифугировали 7 мин. при 300 оборотах в мин.'и отбирали половину супернатвнта для определения радиоактивности.

Специфический лизис клеток-мишеней (цитотоксический индекс) определяли по формула 100(0-С)/(М-С), где о - радиоактивность супернатанта в опыте (в ячейки вносили киллерные клетки), ы -максимальный выход изотопа, достигаемый внесением в ячейки с клеткамн-мишенями 1% раствора додецилсульфата натрия, С - спонтанный выход изотопа из клеток-мишеней в ячейках без добавления эффекторов.

Специфические Т-супрессоры шщеЯ

Т-супрессоры у мышей индуцировали внутривенным введением 9x1 С клеток аллогенной селезенки, облученных, в дозе 15 Гр. Активность специфических Т-супрессоров оценивали по подавлению синтеза ДНИ в однонаправленной трехклеточной смешанной культуре лимфоцитов. Для этого Т-супрессоры, обработанные митомицином С, и сингенные, реагирующие в смешанной культуре лимфоцитов клетки нормальны* лимфоузлов в равной концентрации (БхЮ^/мл) смешивали в соотношении 1:1,5 (по объему) и добавляли равный объем стимулирущиз клеток аллогенной селезенки (107/мл), облученных в дозе 15 Гр. I контрольную смесь вместо Т-супрессоров добавляли обработанные митомицином С клетки нормальной селезенки в той же дозе. Послэ < дней инкубации в объеме 0,2 мл при 37°С в атмосфере 5% С02 к ячейки 96-луночной пластины добавляли по 1 мкКи 3Н-тю®дина 1 через 16 час. культуры переносили на стекловолоконные фильтры ( помощью харвестера.

Для оценки супрессии по подавлению генерации киллеров 5x10( реагирующих лимфоцитов смешивали 1:1 с обработанными митомицино! С клетками иммунной (в контроле - нормальной) селезенки и инкубировали смесь с 1x106 облученных в дозе 15 Гр стимулирующие клеток аллогенной селезенки в объеме 2 мл в 25-луночных пласти нах 5 суток при 37°С в атмосфере Ъ% СО,,. После инкубации клетки извлекали, отмывали и определяли цитотоксическую активкост 3x1лимфоцитов против инкубированных двое суток культур пери

тонеальных макрофагов.

Индекс ингибирования реакций в смешанных культурах лимфоцитов определяли по формуле 100(А-В)/А, где А и В - включение 3Н-тими-дина (имп./мин.) или цитотоксчческий индекс соответственно в контрольной и опытной культурах.

Адсорбция-злвдия спецнфпеских Т-супрессоров на клеточном иымуносорбенте

Для приготовления иммуносорбента 30x106 паритонеальных макрофагов от мышей различных линий культивировали в пластиковых флаконах в 30 мл среда 199 с 20$ бычьей сыворотки, 10» . гидроли-. зата л акт альбумина, 0,005 И буфера Hepes и 100 ВД/мл антибиотиков двое суток при 37°С.

Для проведения адсорбции к предварительно промытому монослою макрофагов, инкубироврнних двое суток, добавляли 100-150x106 ажунных лш^цитов (в среде 199 с 10S бычьей сыворотки, 10» ридролизата лактальбумина, 0,002 М буфера Hepes с 500 ЕД/мл энтибиотков) и инкубировали их при 30°С 2 часа. По окончании гакубации флаконы с культурами помещали на 5 мин. на платформу }стряхивателя (80 об./мин.) для удаления иеприкрепившихся к юнослою лимфоцитов. i

Для проведения элюции к клеточному иммуносорбенту добавляли 6 и стерильного раствора прояазы (25 мг/мл) и инкубировали макрофаги с адсорбированными лимфоцитами 30 мин. при 37°С. После »того флаконы помещали на 5 мин. на платформы встряхйвателя (100 ■150 об./мин.), собирали открепившиеся иммунные лимфоциты, нейт->ализовали проназу избытком бычьей сыворотки.

Индекс адсорбции супрессоров определяли по формуле.100(А-В)/А, •дэ А и Р - индексы ингибирования, вызываемого соответственно итактными и неприкрепившимися супрессорами. Для вычисления юэффициэнта элюции в каадом опыте определяли зависимость вели-зшн индекса ингибирования от абсолютного количества супрессоров I культуре и подсчитывали дозу супрессоров, вызывающую блокяро-1ание активации синтеза ДНК на 50% и генерации киллеров на 33%. отношение етих доз для интактных и элюированннх лимфоцитов оставляло коэффициент элюции.

Обработка клеток антителами с комплементом

2-3x10 клеток инкубировали с антителами 30 мин., осаждали и

к осадку добавляли кроличий комплемент (подобранные разведения), инкубировали 1 час при 37°с в водяной бане, отмывали дважды и использовали в функциональном тесте.

Для инактивации Т-клеток мышей использовали мышиные анти-Thyl.2 и анти-l-J сыворотки, моноклональные антиЧуггл антитела (ИКАТ), кроличьи антимозговые и онтитимоцитарные сыворотки и крысиные антисупрессорные антитела; для инактивации В-клеток -мышиную анти-MLs сыворотку и кроличьи анти-lg сыворотки.

Для инактивации Т-клеток человека использовали МКАТ ОКТЗ (к антигену CD3), 0КТ4 ;к антигену CD4) и 0КТ8 (к антигену CD8); для инактивации В-клеток - МКАТ-0КВ7.

Антисупре ссорные сыворотки

Крыс линии Вистар иммунизировали 3 раза интактными (5X107) или концентрированными (3x107 клеток) специфическими Т-супрессо-рами мышей BALB/c анти-Вб.

Концентрированные Т-супрессоры перед их введением крысам очищали от макрофагов с помощью обработки карбонильным железом (Blck, Möller,1977) а также от В-клеток обработкой антисывороткой к продукту локуса MLs (Tonkonogy, Winn, 1977). Через недели после последней инъекции антисупрессорные сыворотки инактивировали и адсорб!фовали эритроцитами и клетками лимфатических узлое ^ нормальных мышей. Титр антител в сыворотках определяли в двухэ-тапной цитотоксической реакции (Брондз Б.Д., 1964).

Дня модификации реакций противоопухолевого и трансплантационного иммунитета нормальным мышам BALB/c и СВА внутрибрпшшш вводили 50 ыкл антисупрессорной сыворотки без комплемента. Черс: 7 дней определяли активность Т-супрессоров по подавлению реакци в смешанной культуре лимфоцитов.

Предварительно иммунизированным опухоль» мышам ВЮ внутрибрю шшшо вводили 50 шел антисупрессорной сыворотки с комплементом без него в течение первых 4 дней, после внутрикожной тест-инъек ции саркомы ЫХ-11, а затем 4 раза через день. Два взаимно пер • пендикулярных диаметра растущей опухоли определяли штангенцир кулем.

Фракционирование лимфоцитов периферической крови в градиенте перколла в определение вутодоппноЯ супрессорной активности у человека

Мононуклеарные клэтки периферической крови онхологичесю

больных и доноров выделяли на фихолл-верографине с плотностью 1,077 г/см3 . 25-50x106 клеток наслаивали на верх ступенчатого градиента плотности (1,056; 1,067; 1,077 г/см3). После центрифугирования 10 мин. при 450g собирали фракции лимфоцитов, сконцентрированные на границе слоев перколла с плотностью 1,056-1,067 г/см3 (1 фракция, обогащенная супрессорами) и с плотностью 1,067 -1,077 г/см3 (фракция 2, обогащенная предшественниками цитоток-сических Т-лимфоцитов).

5x106 нефракционированных лимфоцитов, лимфоциты 1 и 2 фракций, а также их смесь в соотношении 1:1 культивировали 48 час. в 24-луночных пластинах в среде RPMI 1640, содержащей 2% эмбриональной телячьей сыворотки, 2% !М буфера Hepes, 1 % 200 мМ t-глю-тамина, 40 ед/мл гентамицина и 1 мкг/мл ФГА либо 5-Ю ЕЯ/мл активного препарата интерлейкина 2. Лимфоциты 1 фракции до совместного культивирования с клетками 2 фракции обрабатывали митомицшом '. Во всех культивированных фракциях лимфоцитов определяли цитотоксическую активность против опухолевых клеток-шпеней, меченых 51Сг.

Процент супрессии определяли по формуле: 100(А-В)/А, где А и В - соответственно цитотоксический эффект лимфоцитов 2 фракции и змеей смеси клеток 1 и 2 фракций. Шзкая цитотокетшюсть смеси слеток двух .фракций по сравнению со значениями киллерной актив-юсти клеток 2 фракция свидетельствовала о наличии супрессорной активности в исследуемом образце мононуклеарных клеток.

Определение супрессорной активности ыоиояукле арных клеток больных ракоы в смешанной культуре лимфоцитов п опухолевых клеток

s

Для создания смешанных культур 4x10 обработанных мигомицином ! опухолевых клеток (получены из удаленных при операции опухолей 'ольных раком прямой и толстой кишки, либо - смешиванием алло-■енных клеток пяти культуральных штаммов рака этой же локализа-яи) смешивали с 2х*36 клеток 1 либо 2 фракции этих больных, ыделенных в градиенте перколла, либо их смеси в соотношении 1:1 2 мл полной среда (RPMI ¡610, 5% сыворотки человека, 2хЮ~3 М -глзотамина, 5x10-5 М 2-меркаптоэтанола, 5x10-3 М буфера Hepes, 00 ВД/мл антибиотков). Смесь инкубировали 6 дней в 24-луночных ластинах при 37°С в атмосфере 5% С<Х. На третий день в среду □бавляли 10% хро>птографичэскн очищенного интерлейкина-г, пре-

доставленного Н.Н.Войтеьдом (Институт переливания крови, Минск). Процент супрессии определяем по формуле иигибирования цито-' токсической активности лимфоцитов 2 фр^ада против аутологичшх и аллогешшх опухолевых клеток супрессорными клетками, сконцентрированными в 1 фрм<да, как описано выше.

46 и 72 часов инкубации в ройллерных ишшишшь. клеток/мл в

среде ВРШ 1640, содержащей 22 эмбриональной телячьей сыворотка 22 0,1 M буфера Hepes, i% 200 Ш I глютамина, 40 мю/мл гентамн-цана vi ООО ЕД/мл рИЛ-2 производства Института органической химии Латвийской республики) и последующей обработки митомищшом С смешивали с 10x1 о6 свекевыделенных аутологичных мононуклеарных клеток втих ка людей и культивировали 48 час. в стеклянных флаконах фирмы "Залу Claas" в среде такого хе состава. В контроле культивировали смесь необработанных и обработанных митомицином С мононуклеарных клеток от одного и тою же больного или донора. Во всех культурах ЛАК клеток стандартным методом определяли цито-токсическую активность генерированных в них киллеро-;.

В ряд^ экспериментов ЛАК клетки перед добавлением в свежие культуры адсорбировали ва пластиковых чашках 45 мин. при 37°С для удаления прилипаниях клеток, либо обрабатывали моноклсналь-шши антителами ОКТ 8 в разведении 1:20 при комнатной температуре в затем комплементом кролика в р заедании 1:10 s течение 60 мкы. при 37аС.

Для генерации ЛАК клеток животных 60x136 лимфоцитов селезенки нормальных шше. BIO, C57BL/6 и BALB/c культивировали ? 30 ередд RPMI 1640, содержащей 5-7S эмбриональной сывоторкн, 2Z 20G 1Й L-rJnrïaMHHa, 50 ЕДАлл антибиотиков, 1<ГЬ M меркаптоэтансла а 1СЮО ед/мл рЯЛ-2 фирыл "Setus".

Dpa определении супрессии п^ тесту иигибирования щкотоксич-ности ЛАК клеток в эффекторной стадии 4-8x1 Cr, 8-16x105 и 16-32x106 зефракционированных, вэпршсрепившихся к нейлоновой вате, либо прикрепляющихся к пластику лимфоцитов мыаейг-опухоленоси-телей и моиоыуклеар1.лх клеток больных раком добавляли к смеси 4-8x106 лак клеток мышей либо человека и 1-2x104 опухолевых клеток-швевей. Трехклетечные культуры инкубировали в 0,2 мл среды rpmi 1640 с IOS ембриоаадьнсй телячьей сыворотки в 96-луночных плас-

Определеша супрессоршй активности в популяциях ЛАК клеток большх, допоров и мшей

10x106 ЛпК клеток онкологических п

после 24

танах 18 час., после чего в пробах определяли сл. цифическуп цтотоксичность по выходу Б1Сг (см. цитотоксический тест).

Эффект супрессии оценивали по формуле ингибирования цитотон-сичвской ектиыости ЛАК клеток: 1J0(A-B)/A, где А и В - показатели цитотокпгености соответственно в контрольных и олытпнх культурах.

Ав-юрадзгагрвфяя

■rj

Для авторадиографического исследования 10 лимфоцитов iЛшуби-роввли 1 чао при 37°С в 1 мл среда RPMI 1640, содержащей 107 эмбриональной телячьей сыворотки и 1 мкКи Н-тпмидина» периодически встряхивая. После фиксации, обработки эмульсией и окрашивания мьгиловым зеленым пиронином в каждом мазке Подсчитывали □коло 600 лимфоцитов, различая меченные и не меченные изотопом клетки.

1аыун ©флюоресценция

Состав лимфоцитов периферической крови больных раком и доноров исследовали методом непрямой поверхностной икму^офлюоресцен-рш. 20 мкл суспензии клеток, содержащей 2-4x106 мононуклеаров, юмещали в лунки предметного стекла, покрлтае поли-L-лизином (100 (ССГ/1ЛЛ). Образовавшейся мояослой клеток обрабатывала сначала моноклоналы "ми антителами ОКТ 3, ОКТ 4, ОКТ 8 и OHM 1 в эазведешш 1:20 30 мин. при ¿>С. В прямом метода ишунофлгорес-{бнции.монослой клеток обрабатывали антителами В ceil sly Marker } разведении 1:20. Реакцию оценивали путем подсчета количества :ветящихся клеток н^ 300 клеток монослоя.

Статистический анализ

При обработке результатов вычисляли значение средней величины [ стандартную-)оотбку показателя средней. Достоверность разницы юаду значениями определяли по методу' Стыщента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Индукция супрессорных Т-клеток антигенами комплекса Н-2 у мышей

При иммунизации- антигенами МНС особый интерес представляет изучение супрессорных Т-клеток ввиду высокой иммуногенности продуктов этого комплекса по сравнению с другими "нетрансплантационными" антигенами (Wagner et al.,1981; Lechler et al.,1990).

Индуцированные аллоантигенами супрессорные Т-клетки впервые были обнаружены Jlrsch et al. (1974) в лимфатических узлах летально облученных мышей с аллотрансплантатами ткани сердца.

В дальнейшем присутствие антиген-специфических супрессорных Т-клеток было продемонстрировано в различных аллогенных системах:

- на модели неонатальной толерантности у взрослых мышей (Strelleln, 1979; Strelleln. Gruchalla,1901 ; Okada, Strober.1982 айв, Strelleln, 1905; Wood, Strelleln, 1987);

- на модели супрессии гиперчувствительности замедленного типа у мышей (Vanderkwast et al., 1981; Perry et al., 1982) и крыс (Prop et al.. 19Ô6);

- на моделях удлинения срока жизни аллотрансплантатов у мышей (KllsTww et al.,1975; KUshaw, Brent, 1977; Hilgert, 1979; Hors-burgh et al.,1961 ; Wood, Monako.1964), крыс (Hall,1961; Hall et al. ,1985; Hltchlnson, 19Ö6; Yamaguchl et al., 1989; Gulgley et al., 1989) и карликовых свиней (Rosengard et al., 1990);

- в смешанной культуре лимфоцитов мышей (Schwartz et al., 1982; Holán, Mltchlnson, 1963; Salomon et al., 1983) и человека (Damle, Englemn,1963; Damle, 1986; Frankel et al., 1989; Sayegh et al., 1989).

В настоящем исследовании была разработана модель для изучения антиген-специфическиой супрессии в системе антигенов комплекса Н-2 по тестам подавления ранних иммунологических реакций - пролиферации лимфоцитов и генерации киллеров (рис. 1). В отличие от ранее известных экспериментальных систем для создания этой модели был использован комплекс различных факторов (инбреднне линии мышей, массивная доза антигена, облучение), приводящих к усилению специфического компонента супрессии.

Спустя 4 суток после однократной внутривенной инъекции мышам 02 или BALB/c массивной дозы облученных аллогенных лимфоиднкх клеток мышей Bio в селезенке реципиента выявлялись супрессоры d анти-ь, которые при добавлении к сингенным лимфоцитам мышей

Oamm д*

ив Щч

9 •lD'jomoff

tooojw«

J1 ЮТ» Л

190

говори

Cmspnrop Огамрипор

MIC

ОООООООООС

оооооооооа ОООООООООО

оооосооооо

ОООООООООО ОООООООООО

- Остебожаетае •1 Сг иэ клетох-мишмгеА В

Ряс. i. йодель функционирования Т-супрессоров, специфичных к

антигенам кокплекса Н-2 Специфические Т-супрессоры (СТО индуцированы ln vivo <sl внутривенной инъекцией реципиенту аллогенных клеток селезенки лоно-ров в большой дозе. Активность СТС Л знти-В тестирована через 4 дня после иммунизации ln vivo в трехклеточноя однонаправленной сиешнноя культуре лимфоцитов (С/W)! клетки иммунной селезенки А анти-t), обработанные жтотшио» С, смешани с нормальными синген-шми реагирующими лимфоцитами 1РЛ) и облученным! аллогенншм гтнмулятораии линии В. С коятрольнуо группу i О) СКЛ ев едена клетки нормальной селезенки иышей тол ж линии А, обработанные мтотиинпм С, После 5 днея инкубации определена активность РЛ А анти-В'- пролифератиокыя тест и тест на генерацию ЦТЛ.

>2 угнетали их рзвкцше» в сметанной культуре лимфоцитов на стиму-мторы мыши вю. ^специфический компонент супрессии составлял ю отношению к специфической супрессии 16 и 5®, судя по угнетена) соответственно синтеза синтеза ДНК и цитотоксической реакции I присутствии "посторонних" стимуляторов (СВА/2 я СВА).

На рис.2 виг видно, что супрессорная активность в селезенке ыявлялась на 2 сутки, достигала максимума на 4-6 сутки и снизилась к 20 суткам. Во всех случаях блокировка синтеза ДНК по воей интенсивности в I,5-2 раза превышала блокировку генерации

ванных клетками мнтактной (а, 6 1 «ли облученной (в, г) селезенки аллогешшх BIO (сплошная линия) или сингенн их (прерывистая

линия) 02 минея

По горизонтали - сроки иммунизации (дни). По вертикали - ИИ включения 3Н-тимидина (а и в1 и генерации киллеров (б и г) в СКЛ Супрессоры селезенки I черные крухки> или тимуса (треугольники) при реакции в СКЛ на стимуляторы В. Супрессорь селезенки '.белые кружи) при реакции в СКЛ на стимуляторы ЕВА/2 (в) и СБА (г).

киллеров.

Введение мышам различных доз облученных клеток показало, что доза 9x107 - оптимальна для индухцки вллогенних специфических супрэссоров: меньшая доза вызывала меньшую супрессию, а большая - приводила к увеличению неспецифического компонента и супрессии индуцированной сингенными клетками.

Зведение мышам D2 массивной дозы интактных клеток аллогенноЯ селезенки мышей ВЮ приводило . к не специфической супрессии ш третий-четвертый дни после иммунизации (рис. 2 а и б). В более поздние. сроки различия между специфической и неспецифическо! супрессией сглаживалось за счет роста неспецифического компонента супрессии.

Изучение природы клеток супрессоров показало, что облученные аллогенные селезеночные метки индуцировали только Т-супрессоры: их активность полностью отменялась обработкой сыворотками анти-Thy-l.2, антитимоцитарной и антимозговой, но не отменялась обработкой антителами к В-клеткам. Действие анти-Thy-l.2 антител было пропорционально их концентрации.

Результаты фракционирования клеток селезенки в линейном градиенте фиколла показали, что наиболее активные Т-супрессоры концентрируются в 1 фракции клеток с низкой плотностью фиколла, обогащенной до 60% большими лимфоцитами.

Сходство кинетики образования супрессоров, блокирующих активацию синтеза ДНК а генерацию киллеров в смешанных культурах лимфоцитов, так же как идентичность природа этих супрессоров и их биологических свойств указывало на то, что обе реакции блокировались одними и теми же супрессорами, угнетающими .пролиферацию клеток (Webb, Jamíeson, 19Т6). В э^ом случав подавление генерации киллеров являлось лишь следствием угнетения пролиферации, что по-видимому, объясняет меньшую супрессию генерации киллеров по сравнению с супрессией синтеза ДНК. Эти данные, однако, не исключают, что супрессоры могут, хотя и з меньшей степени, тормозить танзке образование гуморального фактора, способствующего дифференцировке киллеров, или сак процесс такой дифференцировки (Rode et al. ,1978).

ГСтзавнительное изучение кинетики образования супрессорных Т-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов показало, что цитотокси-ческий эффект иммунных лимфоцитов D2 анти вю в сроки тестирования супрессии (от 2 до 20 дней) оказался слабым ( около 20%) и неспецифическим. Кроме этого оказалось, что облучение в дозе 2,25 Гр рчачительно снижало активность супрессоров, в то время как цитотоксический эффект иммунных лимфоцитов инактивировался дозой 20,2 Гр. Предшественники Т-супреесоров по т°стам ингибиции сингезаДНК'п генерации киллеров били нечувствительны к циклофос-фану в дозе 50 мг/чг массы и полностью инактивировались этим иммуномодулятором в дозе 100 и 200 мг/кг, а также гидрокортизоном. Напротив, предшественники цитотоксических Т - лимфоцитов только частично угнетались циклофэсфаном в дозе 200 мг/кг и били резистентны к действию гидрокортизона.

Различия свойств Т-супрессоров и цитотоксических Т-лимфоцитоп, а также их предшественников указывали на то, что супрессорный аффект был связан не с цитотоксическим действием киллеров на

клетки-стимуляторы в смешанной культуре лимфоцитов, элиминация которых могла бы привести к угнетению реакции, а с прямой инактивацией реагирующих Т-супрессоров.

Обогащение специфических Т-супрессоров при фракционировании на клеточном имиуносорбенте

По современным представлениям (Green et al., 1963; Germain, Benacerraf, 1964; Batchelor et al.,1969; Batchelor et al.,1990), специфичность действия Т-супрессоров означает, что на их поверхности присутствуют рецепторы, специфически реагирующие с антигеном.

Наличие рецепторов к антигену было продемонстрировано с помощью адсорбции супрессорных клеток на полистироле, сефадексе или пластике, конъюгированных с чистым белковым антигеном или Гептаном (Okumura et al., 1977; Tanlguchl et al., 1977; Weinberg et al.,1979; Sunshine et al.,1983; Eddy et al., 1967). Последующая элюция прикрепившихся клеток приводила к 20-1оо-кратному возрастанию концентрации специфических Т-гулрессоров.

Способность Т-супрессоров связываться с чистым антигеном была подтверждена при использовании клонов Т-гибридом (Whitaker, Ruddle, 1980; Lonal etal.,1981), стабильных линий или клонов Т-супрессоров (fresho et al..1961; Heuer et al.,1986; Degwert et al., 1988).

Один из вариантов рецептора специфических Т-супрессоров, связывающегося с гаптеном без ассоциации с продуктом МНС, был синтезирован m vitro на полисомах из супрессорных Т-гибридом мыши (Веаюап et al., 1984 ).

В настоящем исследовании получены прямые данные о наличии у Т-супрессоров рецепторов, специфически реагирующих с антигенами Н-2, что позволило сконцентрировать эти суггрессоры, отделив их от большей части остальных клеток. Для этого были исполъзоьаны методы адсорбции иммунных лимфоцитов на густом монослое макрофагов, растущих на стекле или пластике, и их последующей элюции с помощью проназы.

После адсорбции супрессоров D2 анти-ВЮ (вызывающих более 803 угнетете синтеза ДНК и подавление генерации киллеров на 44%) i течение 24 час. на монослое макрофагов ВЮ способность этю клеток специфически блокировать активацию синтеза ДНК и генерацию киллеров уменьшалась на 68-70%, в то время как после адсорбции на монослое сингенных макрофагов 1)2 - лишь на 17-20%. Напро-

тив, слабая неспецифическая супрессия тех же реакций, стимулированных в смешанных культурах лим$оцитов "посторонними" клетками мышей линий DBA/2 и СБА не уменьшалась после адсорбции супрессо-ров ни на одном из использованных монослоев.

Для получения концентрированной популяции специфических кле-ток-супрессоров лимфоциты анти-Н-2ь, прикрепившиеся к монослоям, были элгаровэны и после отмывания от проназы смешаны с синген-ными нормальными реагирующими лимфоцитами в различных соотношениях. Из рис. 3 следует, что супрессивная активность в смешанной культуре лимфоцитов анти-Н-20, элюированных с монослоя клеток Bio, выявлялась уже при их добавлении к реагирующим лимфоцитам менее чем в 1% (при блокировании пролиферации) или в 52 (при блокировании генерации киллеров) концентрации, т.е. существенно возрастала по сравнению с активностью нефракционированных суп-рессоров. Зто увеличение супрессорного эффекта было иммунологи-чески специфично, поскольку тот те эффект лимфоцитов, элшрсван-ннх с монослоя сингенных клеток D2, не приводил к возрастанию супрессии. Судя по снижению количества супрессорных клеток, внзнва-дих 50S ингибкрование синтеза ДНК в смешанных культурах лимфоцитов либо 33% подавление генераши киллеров они концентрировались в среднем в 30 раз, а угнетающих генерацию¡киллеров - в 2,6 раза по сравнению с концентрацией сулрессоров в нефракциони-ровалией суспензии иммунных лимфоцитов.

В элшров&нной популяции сулрессоров доля Т-клеток в 2,5 раза превышала количество этих клеток в интактной суспензии, достигая 80S при использовании наиболее активной анти-Т-сыворотки, доля больших и средних лимфоцитов возрастала до 40 и 27%, а уровень клеток, синтезирующих ДНК, увеличивался в 3 раза по сравнению с исходным.

По данным настоящей работы эффективность фракционирования Т-супрессоров на монослоэ клеток-мишеней значительно выше, чем Т-киллеров: однократной адсорбции в течение 2 часов было достаточно для почти полого удаления специфических Т-супрессоров, а их количественное обогащение в элшрованной популяции достигало 30-крзтного. Можно думать, что рецепторы Т-супрессоров были доступнее для антигенов, чем рецепторы- киллеров, и отличаются простотой своей структуры. Основаниями для последнего предположения явились, в частности, данные о том, что Т-супрессоры, индуциро--ванные антигеном Н-2, представляли собой набор моноспецифических субпопуляций, каждая из которых реагировала подобно антителам

Рис. 3. Обогащение элюировашшх лммфоиитов BIO.02 антм-ВЮ клетками-супрессораии.

По оси абсцисс - доля иммунных лимфоцитов 1*1 в смеси с реагирующими лимфоцитами B10.D2. Стимуляторы - клетки BIO. По оси ординат - индекс ингиОирования (% ) активации синтеза МИК II, У, 5) , генерации киллеров (2, 1, 61 в СКЛ. Иммунные лимфоциты не ?>рак ииоиированы (1, 2). элсировани с монослоя клеток i/o [3,1 или B10.D2 (5. fi).

, только с одной из детерминант молекулы Н-2. Это указывало на тс что рецепторы Т-супрессоров по иммунологической структуре ом чались от рецепторов Т-кшцаров и приближались к иммуноглоб: липам.

Антисупрессорные антитела к дифференцировочныи ыаркерга специфических т-супрессоров, индуцированных антигенами комплекса Н-2

На мембране различных типов Т-супрессорных клеток и их рас воримых факторов был выявлен маркер I-J-продукт субрайона ко! лекса Н-2 (Murpfiy et al. ,1976; Tada et al.,1976; Green et a 1963 a и 6; Dorf, Benacerraf, 19Ö4; Nakayama et al.,1989).

Аллогенные моноклональные антитела к селективному маркеру избирательно элиминировали специфические Т-супрессоры, привод стимуляции антителообразования (Pierres et al., 1977), о те генетической нереактивности к полипептидам (Pierres et al.,19 и усилению противоопухолевого иммунитета (Pierres et al.,H DreMn et el. ,1983 ).

Недавно было показано, что введение моноклональннх антител к другому селективному маркеру Т-сулрессоров - KJ23a - приводило к торможению роста саркомы у мышей (Katz et al.,1989), в то время как использование моноклональннх антител к белковой детерминанте 2Н4 способствовало усилению активации индукторов супрессоров в аутологичной смешанной культуре лимфоцитов (TaVeuchl, 1989). Инъекция телятам моноклональннх антител к ВоТ2 и ВоТ8 антигенным детерминантам усиливала гуморальный ответ, вызванный интактива-цией супрессоров, подавляющих антителообразование (Howard et al.. 1989). Напротив, введение моноклональннх* антител к маркеру В166, экспрессированному на Т-супрессорном факторе, неспецифически уменьшало индуцированную ультрафиолетом супрессию контактной гиперчувствительности (Yee et al.,1990).

Значительно более универсальным для избирательной элиминации Т-супрессоров и направленного усиления иммунного ответа у животных разных видов явилось бы получение ксеногенных антител против дифферэшцфоБОчного антигена Т-супрессоров, отличаидего их от Т-клеток других субклассов. Антитела такого типа ранее были получены г'гтем иммунизации кроликов лимфоцитами мышей, иммунизированных V1 -антигенами (Красгаша Н.А., Лопатина Т.К., Мокренко А.И. я др.,1980), тимомой HL-4, являющейся, по-видимому; злокачественной линией Т-супрессоров мышей (Al-Sakkaf et al., 1979; Groo-ten et al., 1987), а также гаптешм (Cone et al., 1931), Однако в этих случаях антисупрессорная сыворотка оказывала влияние на Функцию T-суцрессоров, которые подавляли образование антител или пролиферативную реакцию Т-клеток на конканавалин А.

В настоящей работе были получены две антисупрессоряые сыворотки против элшрованных специфических Т-сутгрессоров-(антисыво-рогка 1 и 2) и одна - против интактных супрессоров (аятисыворот-ка 3). При реакции истощенных антисупрессорних сывороток со специфическими Т-супрессорами мышей линии BALB/c ан^и-Вб, сконцентрированных с помощью элюции с монослоя клеток-мшеней В6, анти-снворотка i убивалр 30%, антисыворотна 2 - 26%, а антисыворотка 3 - только 13% клеток.

На рис. 4 представлены данные по инактивации специфических Г-супрессоров, киллеров и Т-клеток, продуцирующих MIF (фактор ингибирования миграции макрофагов, Migration Inhibiting Factor) после их обра ботки адсорбированными ангисупрессорными сыворотками в присутствии комплемента и без него. Антисыворотки 1 и 2 инактивироваля 95- ¡00S Т-супрессоров d энти-ь и 64-100% т-супрес-

t

!0S

tú

SO

rb

Vú -

20

I

jél

j

i ¡

¡8 t

i г з

игл

!

чЛ

1

i

\\

Рис.

W ЦТЛ МГ - продуцента

4. Влияние антисупрессорных сывороток I АСС ) крыс на функцию

клеток Т-суОклассов, специфичных к аллоантигенаи А - индекс ингибирования синтеза ДНК. Б - цитотоксическия индекс. В - индекс подавления миграции макрофагов. Шиунные ммфотты не обработаны в контроле 11 I или обработаны в присутствии комплемента нормальной сывороткой крыс 12). АСС 1, индуцированной СТС 4 анти-Ь, абогашннини элвдиеи с аллогенного чонослоя 13), ингакт-нон АСС , индуи.ированноя интактныт СТС М). Сыворотки адсорбированы эритроцитами и клетками лимфоузлой нормальных мышея ВА1В/ АСС 1, но не интактной АСС. избирательно шйктивирует СТС, не влияя на активность ЦТЛ и М1Р-продуцентов <3 анти-Ь.

copos В6 (а анти-Ь). ИнактивируюцЕе действие антиснворотки 3 Сылс значительно ниже (не превышало Б!% в отсутствие и 61 % в присутствии комплемента).

Напротив, те же антисыворотки 1 и 2 не иаактивировали (в присутствии комплемента) ни киллеры, ни MIF-продуценты; вместе < тем антисыворотка 3, менее активная против специфических Т-суп рессоров, частично инактивировала киллеры и почти полносты уничтожала активность MlF-продуцеятов. Инактиаирующее действи антисывороток 1 и 2 почти полностью исчезало после истощеки антисывороток концентрированными т-супрессорами, но не клеткам нормальной селезенки мышей balb/c.

Для изучения влияния энтксупресеорных антител m vivo антисы

воротки I и 2 были введены мышам ВАЬВ/с, иммунизированным клетками селезенки Вб для индукции специфических Т-супрессоров. Введение антисупрессорных сывороток через 4 дня после иммунизации без комплемента приводило к 60%, а в сочетании с комплементом -к 85-100% угнетению генерации Т-супрессоров. При введении мышам ВАЬВ/с или СВА антисупрессорных сывороток за два дня до иммунизации или даже неиммунизированным мышам происходила резкая инактивация неспецифических супрессоров в селезенке, поскольку они в сходной степени угнетали синтез ДНК в смешанной культуре лимфоцитов, индуцированной стимуляторам различного происхождения -не только Вб, но и Шк/2 (рис. 5).

Рис. 5. Влияние АСС на генерацию Т-суарес-

соров 1п VIУО По оси ординат - ИИ синтеза ДНК при добавлении в СКЛ клеток селезенки мышея ВАШ/с или СВА, получивших инъекцию ИКС (белые столбики) или АСС Iзаштрихованные) за 2 дня до иммунизации, одновременно с нея и через 4 лня или без иммунизации (+7!. а - сыворотка без комплемента, б - с комплементом.

60 ¥0 го о

-2

4»

Введение антисыворотки 1 вместе с комплементом приводило к полному подавлению роста саркомы МХ-И у иммунных к ней мышей линии BIO, тогда как такая же инъекция нормальной сыворотки с комплементом не влияла на рост опухоли. При введении антисывороток 1 и 2 вместе о комплементом или без него двум категориям

мышей ВП - нормальным и иммунизированным клетками саркомы МХ-11 оказалось, что ни одна из сывороток не влияла на рост саркомы у нормальных мышей линии BIO, т.е. антисупрессорные антитела не оказывали прямого эффекта на опухолевые клетки. Предварительная иммунизации клетками саркомы MX-i 1 приводив к замедлению роста тест-опухоли, дополнительное введение иммунизированным мышам антисыворотки 2 еще более угнетало этот.рост, а введение той же антисыворотки вместе с комплементом было особенно эффективным (рис. 6).

: го г

16

12

12 3U 5

1 3

i

12 3 US

Рис. 6. Усиление противоопухолевого иммунитета с помощью ЛСС

10® клеток саркомы МХ-11 введены внутрикожно нормальным мышам BIO la, bi или предварительно иммунизированным клеткамии саркомы МХ-11 (б, г). Мири не инъецированы (1) или инъецированы нормальной сывороткой 150 мкл) 12, 3), антисывороткоя 2 (50 мкл > 14, 5) без комплемента 12, 4) и с ним (3, 5>. По оси ординат - средний диаметр опухоли 1мм) через 7 la, б) и 15 Iв, г) дней после ее

введения

Было показано, что на поверхности элюированных с аллогенногс иммуносорбента супрессорных клеток присутствовали антигенные маркеры Thy-1.2, Lyt-2.1 и I-J, поскольку антитела к ним в присутствии комплемента угнетали функцию этих клеток m vitro. Кро ме этого было установлено, что помимо вышеназванных маркеров ш Т-супрессорах экспрессируется детерминанта 1-е- комплекса Н-2 Анти-I-C сыворотки (полученные иммунизацией мышей рекомбинантны;

i

линий, различающихся между собой аллелями этой детерминанты) также частично инактивировали действие супрессоров в присутствии и без комплемента.

Для изучения вопроса о том, к какому маркеру специфических Т-супрессоров направлены антитела антисывороток 1 и 2, было проведено истощение, этих сывороток клетками, покрытыми антителами к Thy-1.2, Lyt-2.1 и I-J-детерминантам. Результаты адсорбции показали, что эффект антисутгрессорних сывороток in vitro отменялся адсорбцией этих сывороток иммунными Т-супрессорами и тимо-цитами, незначительно снижался . после экранирования маркеров антителами Lyt-ги, тогда как при экранировании антителами

Рис. 7. Истоцеше антител, инактивирувдих СТС, тимоцитами н иммунными Т-клетка им, покрытия антителами

По оси ординст - ИИ синтеза ДИК в СЮ! при обработке СТС ати-Вб АСС 1:4 (а), ИКС 1:4 (0), стш-Щ-1.2 1:20 (в), amu-Lyt-2.l 1:500 (г) и ант-1-J^ 1:4 (д). 1 - штатные сыворшси или антитела; 2 - сыворотка, адсорбированные шшиаЯньии клсткахи,. Л,а -сыворстн ., адсорбированные' мешкали, обрабсякснныли ИКС (1:4); 3, в~д - сЬворстки, адсорбированные клеткали, обработанными. ННС (1:10); 4 - АСС (1:4); 5 - анш-ТПу-1.2 (1:10); _ - awiu-Iyt-2.1 (U100); 7 - comu-Lyt-1.1 (1:100); 8 - aHmu-I-Jk (1:4).

Отмена действия антйсупрессорннх сывороток только после их адсорбции необработанные дополнительными антителами специфичес ■ кими Т-супрессорами, а не после экранирования маркеров ТИу-кг и 1-<1, свидетельствовала о том, что инактивируншй аф>}«?кт оипоро-ток обусловлен ггрисутстпиом п них янтител, мялряплггапл с ронциров очному маркеру Т-супрессоров, эпгнреггигу^м.-.му хол1.

реакции на антигены Н-2 и расположенному рядом с маркером Lyt-2.1.

Поскольку антисупрессорные сыворотки против специфических Т-супрессоров мышей BALB/c инактивировали эти клетки независимо от их линейной принадлежности (не только.BALB/c, но и В6 и B1Q.A), очевидно, что эти антитела являлись антителами к дофферонцирово-чному маркеру универсального типа. Эти антитела не реагировали с продуктом субрайона 1-0, специфичного для каждого комплекса Н-2, хотя не исключена реакция этих антител с антигенной детерминантов , сцепленной с продуктом субрайона 1-е, но не несущей линейной специфичности.

В отличие от инактавируюцего эффекта антисупрессорных сывороток стимулирующий эффект отменялся после адсорбции клетками тимом EL-4 и BW5147 (на поверхности которых экспрессировани маркеры незрелых кортикальных тимоцитов), но не иммунными элюиро-ванными специфическими Т-супроссорами. По-видимому, в антисупрессорных сыворотках помимо антител к дифференцировочному маркеру Т-супрессоров присутствовали также антитела к тимоцитарнкм маркерам предшественников супрессоров, контакт с которыми при введении сывороток нормальным животным приводил к образованию неспецифических супрессорных клеток.

Концентрация Т-супрессоров больных раком при фракционировании в ступенчатом градиенте перколла

При росте опухоли происходит ослабление иммунной защиты организма и образованиесупрессорных клеток, препятствующих реализации цитотоксической активности, индуцированной опухолеоссоциигю-ванными антигенами.

Присутствие Т-супрессоров, специфически подавляющи противоопухолевый иммунитет, било продемонстрировано в ряде экспериментальных сингсгашх систем мышей:

- на модели угнетения отторжения опухоли у иммунных животных (Fujimoto et al.,1976; Groen. 1980; Schatten et al.,1984);

- на модели подавления адоптивного иммунитета (North, 1982; North and Buroukei4, 1984);

- на моделях иммунологической толерантности к опухоли, инду цированной in vivo (Mengert:en f;t al.",1975; Mo Bridn, llow.it:,1986) И in vi tro (Haubf.-cli.,'Koif.ch, -1982; Haubcftk i;t al. ,1988; .1989);

- на модели роста опухолей, индуцированных ультрафиолетом (Spelman and Daynes, 1978; Roberts et al.,1983; Roberts, 1986);

- в смешанных культурах лимфоцитов и опухолевых клеток (СКЛО) (Bear, 1986; Kaymakealan et al.,1987).

У (Зольных раком Г-супрессоры, препятствувдие генерации противоопухолевых киллеров, были выявлена в следующих аутологичных системах клеток:

- ггри фракционировании лимфоцитов периферической крови в градиенте бычьего сывороточного альбумина (Vu et al., ¡977);

- в смешанной культуре лимфоцитов и опухолевых клеток (Muk-herji et al., 1936 а и 6; Eura et al., 1988).

В настоящем исследовании Т-супрессоры противоопухолевого им-мугастета были обнаружены при фракционировании лимфоцитов периферической крови больных раком в ступенчатом градиенте перколла.

У 37 больных раком прямой и толстой кишки после фракционирования в ступенчатом градиенте получали фракцию 1 с низкой (1,056-1,087 г/см3) и фракцию 2-е высокой плотностью перколла (1,067-1,077 г/см3). Лимфоцита 1 и 2 фракций, а также их смесь в соотношении l :1 использовали в качестве реагирующих клеток в СКЛО, и определяли их цитотоксическую активность против клеток аутологичной и аллогенной опухолей.

При культивировании кефракционированьых лимфоцитов в СКЛО образования цитотоксических клеток не происходило. Цитотоксичес-кая активность против клеток аутологичной опухоли наблюдалась после использования для культивирования в СКЛО клеток 2 фракции лимфоцитов (табл. 1 ). В аутологичной СКЛО, стимулированной опухолевым! клетками Солышх, в 15 случаях из лимфоцитов 2 фракции образовывались цктотсгссические клетки, разрушающие аутологичные, но не алгогеннне опухолевые клетки. При культивировании лимфоцитов 1 фракции образования цитотоксических клеток не происходило. В 10 из 15 случаев лимфоциты 1 фракции, добавленные к клеткам 2 фракции f. начале культивирования, подавляли цитотоксический эффект последних.

Генерация цитотоксических клеток происходила также при культивировании лимфоцитов 2 фракции больных в СКЛО, стимулированной смесью 5 штаммов рака толстого кишечника. Цитотоксический эффект против клеток аутологичной и аллогенной опухоли наблюдался во всех 10 случаях. В 8 из 10 случаев цитотоксическую активность лимфоцитов 2 фракции подавляли лимфоциты 1 фракции, как было описано выше. При-культивировании лимфоцитов 1 фракции, как в

Табл. 1. Цитотоксическая активность противоопухолевых киллеров (X), генерированных в СКЛО из лимфоцитов периферической крови больных РПТК, фракционированных в градиенте перколла

1- •■; АУТОЛОГХЧШШ ОПУХОЛЬ АЛЛОГЕННАЯ

8' 1 - -........— ОПУХОЛЬ

'ФРАКЦИЯ

I 2 ' 1+2 г

2 2,3±1,2 11,5 ±3,3* 0,6±0,8 0,0+0.8

4 0.7±0,1 15,3±! ,5* 0,0±1,8 1,3±0.2

5 3,0+0,5 17,9±2,3* ),8±0,3 0.1±0.<

6 4.3±2,3 32,2±0,8* 14,8±2,8 0,5±3.4

8 1,1±..,4 15,2 ±0,9* 2 7±1,1 7.7±2.3

А 10 2.9±1.5 30,8±7,3 32.1 ±5,8 6.5+1,7

14 1,1 ±0.5 26,3±2,2 28,3 ±1,3 2,9 ¿1,4

24 1,04-0,8 24,4 ±1,9 29,1 ±8,2 3.94:1.3

26 0.5 ±1.2 31,0±2,1 25,6±3,9 3.2 ±1.3

27 0.9±0.4 18,9±1,0* 0,0±2,1 3,2+0.9

28 0,6+1,4 П,3±?,8 9;5±i.l 0.64:0.2

29 0,6+0.4 16,9 ±0.4* 0,3±0,1 2,2 ±0.2

33 1.0+0,3 20,6±4,8* 6,1 ±1,4 0,9±0.3

34 4,5+0.4 17,0±2,6* 1.4±1,0 1.3+0.5

-37 0,7±0,2 17,4±0,9* 0,5±0,1 0.0±0.8

~27 4.5+0,5 44,2±4,1* 1.5±0,7 52.7+4.9

28 0,3±1.1 46,2 ±2,6* 29,4±1,1 38,0+3,4

29 4,7±1.6 42,8±4,7* 1,8±0.6 45,5+4,3

30 2,3+1.2 50,5±3.3** 35,2 ±5.8 аз,о±1,э

В 31 0.1 ±0,2 41,8±12,9 32,9 ±5,6 31.5 ±2.3

в 32 1,9+J.! 44,9±2.1* 1).5±0.1 4!.4±0.3

33 0.6±0.4 48,2 ±5,0* 0.4+0.2 67.9±2.б

34 (1.4 ±0,1 45.3 + 1,9* 9.0 ±2.0 51.9±7.4

3(1 1.9+0.1 39,4^2.0 46.9±1,5 39.б±2.4

37 O.o + l.C 42.0±1.9* 2,0 + 1.3 35.3 ±2.7

Примечания: А - СКЛО, сгимулиоованная опухолевыми клетками больного; Б - СКЛО, стимулированная смесью клеток 5 штаммов РТК. Одна звездочка - р<0,01, две - р<0,03 по сравнению со смесью лимфоцитов 1 и 2 фракция в соотношении 1:1. Лимфоциты добавляли к опухолевым клеткам з соотношении 30:1.

иутологичной СКЛО, образования цитотоксических клеток не происходило.

Нгдогл'нае образования цитотоксических клеток в СЮЮ свиде-

тельствопало о присутствии супрессоров в 1 фракции клеток, выделенных в градиенте плотности. Этот вывод подтверждался зависимостью подавления образования цитотоксических клеток из лимфоцитов 2 фракции от дозы клеток 1 фракции и резистентностью клеток 1 Фракции 1С митомицину С. При 50% содержании клеток 1 фракции в смеси с лимфоцитами 2 фракции наблюдался максимальный эффект подавления образования цитотоксических клеток в двух типах СКЛО, который снижался с уменьшением дозы клеток 1 фракции до 25-12Ж. При обработке лимфоцитов 1 фракции митомицином С и добавлении их [i различных долах к лимфоцитам 2 фракции в начале культивирования такжн на происходило отмены эффекта ингибировштия.

Результаты обработки клеток 1. и 2 фракций градиента плотности моноклпкяльннми антителами ¡i комплементом свидетельствовали о Т-клоточноЯ природе цитотоксических и супрессоршх клеток и их принадлежности к общей супроспорно-цитотоксичсской популяции лимфоцитов человека CiitV. отмена эффекта супрессии ¡гроисходила После обработки клоток 1 фракции антителами ОКТЗ, ОКТЗ, но не 0НТ4 и 0KR7. Подавление образования цитотоксических клеток в двух типах СКЛО наблюдали после обработки клоток 2 фракции теми ке типами антител, что и при обработке клеток 1 фракции градиента плотности..

Образование цитотоксических Т лимфоцитов против клеток ауто логичной опухоли в СКЛО, стимулированной опухолевыми клетками болышх раком прямой и толстой кишки,' но видимому, связало с использованием для культивирования 2 фракции лимфоцитов, обога ценной до 9ГХ Т-клетками поело фракционирования в градиенте пер-колла (Kut-niok rii al., 1079). Подобный результат был получен ранее у больных раком легкого при использовании для культивиро-пания в CICJÍ0 популяции малых Т лимфоцитов с высокой плотностью (Uuhida, Mooit!, 1 ví.'-"' 1; Vanky «t al., 1901)- Образование цитотоксических T -лимфоцитов против клоток аутологичной и аллогенной опухолей в СКЛО, стимулированной смесью 5 штаммов рака толстого кишечника, можно объяснить использованием для культивирования стимуляторов опухолевых ¡слеток больных раком толстого кишечника, несущих различные индивидуальные антигены HLA. В 1 фракции лимфоцитов, выделенных и градиенте перколла, были обнаружены .Т-супрессоры, подавляющие образование цитотоксических Т-лимфоцитов в СКЛО из лимфоцитов 2 фракции, содержащей Т-клетки. Сходным образом, по фракции лимфоцитов с низкой плотностью, выделенных в градиенте бычьего сывороточного альбумина, были обнаружены Т-

супрессоры естественных киллеров, выделенных из фракции градиента С ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТЬЮ (YU et al., 1977).

Определение аутологичной супрессорной активности лимфоцитов периферической крови онкологических больных и доноров

Для оценки супрессии в крови онкологически больных используются количественные и функциональные методы тестирования. Они позволяют оценивать активность яеспецифических Т-супрессоров либо моноцитов, накапливающихся в организме опухоленосителей в процессе роста опухоли.

Для количественной оценки Т-клеточной супрессии применяются:

- методы учета розеток с Т-лимфоцитами (Goblelgh et al.,1950; Otsuku et al.,I981; Rosenblum ey al.,1982; Кадагидзе З.Г., Maxo-нова Л.А.,Табагари rt.3. и др., 1982; HagarM et al.,1984; Gangal, 1996);

- анализ соотношения CD4/CD8 Т-клеток с помощью моноклональ-ных антител (Seligmnn et al.,1964);

- подсчет Т-клеток, тсущх-рецепторы к феррятину (Moroz et al.,1901; Navak et al.,I9S6), к гиствшшу (Khan et al.,1969; Inage et al. ,1990) и к теофшину (Пантелеева Е.С.,Неприн8 Г.С., Ярилин А.А. и др.,1982).

Функциональную активность супре зорных Т-клеток и моноцитов определяют:

- по подавлению "спонтанными" ели активированными Кон-А Т-супрессорами реакции бласттраноформации гетерологичных лимфоцит-тов (Toge et al-,1983; Kural et al., 1988; Попова E. P., Бори-сенко E.B.,1989);

- по индометацян-нндуцированному усилению лимфопролифера тв-ного ответа (Goodwin et al.,1977; Mue, Panje, I960; Me CoroicK, Panje, 1986).

В настоящем исследовании разработан метод определения функциональной супрессорной активности у человека на основе фракционирования лимфоцитов периферической крови в ступенчатом градиенте (рис. 8). Этот способ позволяет оценивать суммарную активносп Т-клеток и моноцитов у больных раком и доноров по подавлению го® образования аутологичных противоопухолевых киллеров, генерируемых под действием фитогемагглютюшнв или ИЛ-2 из предшественников цитотоксических т-лимфоцитов.

Fmiee било показано (см. главу 4), что при фракционировани лам{ощт>в периферической крови онкологических больных в града

1,077 г/смэ

D

МОКОНУКЛЕАРНЫЕ КЛЕСТ! ОКТ 3 - 59-66 ОКТ 4 - 38-46* ОКТ 8- 21%

от I- 20-27%

В-кл. - 1Ы6#

Градиент фиколл-верографина

Градиент перколла

СУ11РЕСС0РЫ ОКМ I - 43-69% I фракция ОКТ 3 - Э5-4&»

пре-ЦТЛ-СНГ 3 - 76-92*

Г

2 фракция

ТЕС'МГСЬ.ДИ";: СУПРЕССИИ Б СКЛО И СИЛ

Рис. 8. Фракционирование лимфоцитов периферической крови человека в градиенте перколла

Монснуклеарные клетки крови онкологических больных и доноров выделяли на <риколл-верогра<рине с пдотцостьр 1,077 г/си3 и наслаивали на верх ступенчатого градиента перколла < 1,056; 1 .067; 1,077 г/ см3). После центрифугирования градиента собирали фракции лим-фоцитое, сконцентрированные на границе слоев перколла с плотность» 1,056-1,067 г/см3 (фракция 1, обогащенная супрессорачи) и с плотностью 1,067-1,077 г/см3 (фракция 2, обогащенная предшественниками цито гоксических Г-лимфоцитов ).

онте плотности в 1 фракции клеток с низкой плотностью перколла (1,056-1,067 г/см3) концентрируются супрессоры, в то время как в градиенте о высокой плотностью (1,067-1,077 г/см3) - предшественники цитотоксических Т-лимфоцитов.

йммунофлюоресцена.^й анализ показал, что нефракционированные лимфоциты периферической крови больных раком прямой кишки и раком мочевого пузыря содержали незначительно отличающиеся друг от друга количества Т-, В-клеуок и моноцитов. У больных была выявлена тенденция к уменьшению содержания Т-клеток и к снижению индекса 0КТ4/0КТ8. Во 2 фракции градиента наблюдалось увеличение доли Т-клеток с 66 до SZ% и снижение содержания моноцитов с 27 до 75t. Был^ также отмечена тенденция к увеличению индекса 0КТ4/ 0КТ8, особенно сильно выраженная у доноров. Напротив, в 1 фракции градиента наблюдалось снижение доли Т-клеток до 36% и повышение уровня моноцитов до 69%, отмечена тенденция к снижению индекса 0КТ4/0КТ8. Результаты ишунофлгооресцентного анализа согласовывались с датами известных исследований распределения Т- у В-клеток крови человека по фракциям градиента перколла и дополняли их сведениями о содержании у доноров и онкологическая''больных субпопуляций 0КТ4 и 0КТ8, а таг я ¡лононукле арных клеток с маркером 0КЫ1 (Kumiek et al., 1979).

Культивирование мононуклеаров 2 фракции 13 больных раком и 10 доноров в присутствии ФГЛ либо ШГ-2 л всех случаях приводило к повышению цитотоксической активности против аутологичвдх и алло-генных опухолевых клеток (в среднем в 1,7 раза у доноров и в 2 раза у больных) по сравнению с нвфракционированными лимфоцитами. Культивирование лимфоцитов 1 фракции но приводило к образованию цитотоксических лимфоцитов. Добавление к лю>ф>цитам 2 фракции клеток 1 фракции в соотношении 1:1 подавляло индукцию цитотокьи-ческой активности (*) у всех оолышх и у 4 из 10 доноров (табл.2).

У онкологичес. лх больных сутгрессорами цитотоксических Т-лимфоцитов являлись Т-клетки и моноциты, выделенные из 1 фракции градиента плотности. Подавлрчие образования противоопухолевых киллеров из лимфоцитов 2 фракции в присутствии ИЛ-2 или ФГА наблюдалось после добавления к ной в начале культивирования Т-клеток или моноцитов из 1 фракдаи градиента плотности, обрэбо-гяшш ттотиу.ном С. У доноров отдельные случаи супрессии были-:ья.ч'--|!ш с действием суггрессоров-моноцитов, поскольку подавлст е ••"»рп.тоиигоя цитотоксических клетск из лимфоцитов 2 фракции ••'.'.''•глп /•! дг.итод'яцю К U'."l Фрякиии МОМоцитор, а'не обра-

Табл. 2. Цитотоксическая активность I*) стимулированных ИЛ-2С А) и ФГА (Б) лимфоцитов периферической крози доноров и онкологических вольных до и после фракционирования в градинте плотности

перколла (М - а)

§ Нефракцио- Фракция градиента перколла

а нированные лимфоциты I 2 I + 2

1

1а

2

2а

3

4

4а

5

6

6а

Доноры \

28,9±1,5 4,5±!,0 51,9±5,7*** 35,3±1.1

7,3±2,2 0,7±0,4 40.8±0,3 37,01:2,0

40.2±4,4 0,3±0.2 65,4±3,4* 22,9±2,8

22.3±1,5 3,0±2,7 36,8±2,4 31,5±3,7

36,6± 11,1 3,7±0,5 П 56,0±7,1 68,3+5.3

2М±2,1 и 4.9±1.3 57,«±5.8 45,6±53

14,9±4,9 5,0±2.2 А6,3±3,0** 20,1±5.7

41.0±3,8 6,7±1.6 47,6±3,2 46,5+1.6

25.6±2.4 2,6±2,5 34.0±3.2 36.3+2.8

33,3±2,8 0,9±0.3 50.5±3,7" 26.9±2.Э

Онкологические больные л

40.3+3,1 5,8±1,3 78,6±3,7* 25,5 ±2,5

37,7±5,1 6.3±2,2 75,5±6,4* 26,2±1.1

37,9±1,0 6,9±1,8 70,7±2,5* 7,9±2,2

32.7±2.5 1,5±2.4 69,8±8,6* 0,7±2.7

13,2±0,2 1,1 ±0,5 26,4±4,4** 10,1 + 1.1

40,5+5,8 2,2±2,0 53,4±5,8** 24,4 + 1.3

25.1 ±'.-.0 0,1±0,1 39,4±0,1* 3.6±-1,()

12.7.14,0 2,1 ±1,0 32,2±2,7* 0,6+1,6

7.4 ±1.4 2,8±0,9 20,0±2,4* 0.1 + 1,1

11.3 ±2,0 0,1 ±0.1 34,0±3,5* 4,3±г 1,4

? 0.3+0,3 0,1 + 0,1 35,8±0,8* 0,1+0.1

7а 0,6+0,7 0,3±0 12,0±2,1** 0,2±0.3

8 25,7±5,4 3,6±0,3 49,8±2,9» б,7гЫ.9

6а 27.3±2,5 5,9+ 1,7 58,0±8,3** 9,2±1.б

9 44.0-1 1,0 3,8±3.0 56.2±3,0* 6,3±2.7

9а 32.5±2.7 0,9+0,7 56,0±2,0* 3,8^1.7

10 Ю.8+1,1 0,2+0 32.2+0,4 * 0.2±О,4

II Ю.3+1.3 2.2+1.2 30.1 ±5.5" 0.6+03

12 13 10.9^1.1 2.5±0,1 34 .б-ЬЗ.4* 3.3+0.5

6.410.2 3.0^0.6 12.4±0,8*- о.а£а 8

ботанных митомицином С Т-клеток из 1 фракции градиента плотности.

Было показано, что условия фракционирования лимфоцитов периферической крови в ступенчатом градиенте перколла с плотностями слоев I,056; 1,067 " 1,077 г/см3 являлись оптимальными для определения супрессии по тесту подавления ци тотоксической активности лимфоцитов 2 фракции клетками 1 фракции градиента (рис. 9).

1 ,067 1,065 1,069 1,062 1,071

1,056 1,053 1,058 1,051 1,060

Плотность перколла. г/ог

Рис. 9. Определение сузрессии при фракционировании лимфоцитов

периферической крови больных РЛК в градиентах перколла

Процент супрессии вычисляли по формуле ингиЛфования ичтотокси-

ческоя активности лимфоцитов вторах фракция против КМ РТК1 суп-

рессорными клетками 1 фракция градиентов 1-5. Для градиентов 1-3

р<0,05-0,002, а для градиентов 4 и 5 - р>0,01. Лимфоциты первых

и вторых фракций культивировали в присутствии ФГЛ (А) и ЯЛ-2 >Б)

Выход за гранищ эмпирически определенных интервалов плотности градиента для получения фракций лимфоцитов, обогащенных супрес-сорами и предшественниками датотоксических -Т-лимфоцитов, как в сторону снижения плотности верхней и средней, так и увеличения плотности нижней и средней границ градиентов приводил к постепенному снижению уровня супрессии за счет уменьшения цитотокси-ческой активности лимфоцитов 2 фракции ступенчатого градиента плотности.

Увеличение цитотоксического эффекта на опухолевые клетки-ми-ийни после использования для культивирования с Ш1-2> или ФГА лимфоцитов 2 фракции можно объяснить, во-первых, обогащением этой

фракции градиента перколла клетками хелперно-индукторной популяции лимфоцитов 0КТ4+, способствующих более интенсивной пролиферации цитотоксичезких Т-лимфоцитов из клеток-предшественников субпопуляции лимфоцитов 0КТ8+ (Kabelltz et al.,l9S9), во-вторых, удалением из 2 фракции градиента супрессорных Г-клеток и моноцитов, концентрирующихся после фракционирования в 1 фракции градиента.

Полученные результаты согласуются с данными о том, что обогащение популяции лимфоцитов периферической крови Т-клетками приводит к повышению активности образования противоопухолевых цито-токсических Т-лимфоцитов, э супрессорами киллеров, индуцированных ростом опухоли, являются Т-клетки и моноциты.

Индукция супрессии у онкологических больных в ходе адоптивной иммунотерапии

Культивирование лимфоцитов периферической крови человека с ИЛ-2 приводит к образованию ЛЛК клеток с неспецифической противоопухолевой активностью (Lotce Pt ai.,1981; Grimm et al., 1981, 1982, 1986), использующихся в клинике для адоптивной иммунотерапии онкологических болышх в сочетании с ИЛ-2 (Rosenberg, 1985, 1986, Rosenberg et al.. 1987, 1989; Urba et al., 1989).

В экспериментах на мышах Сило показано, что под действием ИЛ-2 наряду с ЛАК клетками происходит образование неспецифических Т-супрессоров, подавляющих пролифератившй ответ, генерацию киллеров и чнтителообразование в свежих культурах лимфоцитов, стимулированных ФГА и аллоантигенами (Soport et al., 1984, 1985, 1986, 1У89; Ung et al.,1986; Ttwmin, Welgle, 1984; Bucy, 1986; Torro-Amiorv? ..t al., 1'JO'i j.

Куль^йвироьэниг лимфоцитов периферической крови больных раком v. присутствии йЛ-2 приводило к активированию Т-супрессоров с фенотипов СйЗ'он;" (Коуаш et .il.,i9S5; Eblhara et al., 1989) и клеток монгцитарно-макрофагального происхождения, секретирующих растворимые гупроссорнш факторы (Sone et al.,1987,1989; Natnan, 1987; N11 et Al., 1988; Munekata et al., 1990).

Недавно било показано, что ИЛ-2 усиливает способность Т-кле-точных гибридо;. синтезировать растворимые супрессорные факторы (Frelre-Moak et al.,1989), я использование моноклональшх антител к рецептору для ИЛ-2 приводит к образованию антиген-специфических Т-супрессоров (Turk's et al., 1939).

В настоящем исследовании была изучена индукция суирессорной

,y¿f///rt-

ЯЗЕЭИЗ

Mel-1 K-562 Mel-1 K-562 Mel-1 K-562

24 4.

48 4.

72 4.

Mel-1 K-562 Mel-1 K-562 Mel-1 K-562

24 ч.

48 4.

72 4.

r0 rTo r20 Г30 Г40 río reo '70 "l80 r90 'toa Нитотоксичность (Q контроль, В ошт), Супрессия Щ, %

Рис. 10. Индукция супрессии в популяции ЛАК клеток

10x1ЛАК клеток больного меланоыоя (получены из кроеи до начала. после 1, 2 И 3 курсов АИТ) смешивали с 10x10й свежевыде-ленних аутологичных иононуклеарных клеток (МНЮ и культивировал» -1" час. Б контроле культивировали смесь необработанных и обработанных митоншином С МИК того хе больного. Супрессию определяю в тесте ингиОирования цитотоксичности ЛАК клеток в свежи, культурах против Мс1-1 и К-562 (р-О.02-0,0011,

акдудза

Ел

Ме1-1 К-562 Ме1-1 К-562 Ме1-1 К-562

24 Ч.

'48 ч.

72 Ч.

а

Е

ЕБ

ииаышааяз

МеХ-1 к-562 ~Ме1-1 к-562 _Ме1-1 к-562

г^ ч.

48 Ч.

72 Ч.

го то ^ 130 чо '"бо г60 7о г80 "эо 1100 Ц'гготоксичюсть {0 контроль, 0 опыт), Супрессия 0. Ж

Е

Рис. 10, продолжение

активности в популяции ЛАК клеток и периферической крови больных мелакомой и раком почки в ходе адоптивной иммунотерапии, проводимой В ВОНЦ АМН СССР в 1987-1988 годах.

В популяциях ЛАК клеток, полученных из крови больных до начале адоптивной иммунотерапии, супрессорная активность выявлялась у 2 из 7 больных через 48, но не через 24 часа культивирования моноуклеарных клеток с интерлёйкином-2.Через 72 часа суп-рессорную активность можно было выявить уже у 6 больных (1,2, , 4-7) при тестировании ингибирования цитотоксической активности ЛАК меток из свежих аутологичннх культур на клетки-мишени Мел-1 и у'5 больных (1,2, 4, 6, 7) - при использовании клеток-мишеней К 562. Показатель супрессии колебался от 33 до 99% (р< 0,02-0,001 ),'рис'Л0.

Напротив, в пощ.иции аутологкчных ЛАК клеток семи доноров супрессорная активность после 24, 48, и 72 часов культивирования не была обнаружена.

Обработай ЛАК клеток больных моноклональными антителами 0К-'8 с комплементом либо адсорбция их на пластике перед добавлением в свекио культура приводила к сниже^чю эффекта супрессии в популяции ЛАК клеток "шести' больных (1, 2,4 - 7 ) при 'тестировании ингибирования цитотоксической активности против клеток-мишепей Мел-1 и у двух Сольных (4, 7) - против клеток-мишеней К 563, р<0,02-0,001 (рис. 11).

Полученные результаты свидетельствовали об активации супрес-сорной' функции Т-клеток и моноцитов в популяции ЛАК ¡меток интерлейкином-2.

Высокий уровень супрессии в популяциях ЛАК клеток больных моемо объяснить реактивацией под действием рИЛ-2 циркулирующих в кс-'-ои супрессорнкх Т-клеток, индуцировамых ростом опухоли. Еоз-г-юхность этого продемонстрирована ранее рядом авторов (Ко-, уата е* а1., 19»5; ЕМЪага ег аХ., 1989). Таи, при длительном культивировании лимфоцитов периферической крови больных раком желудка в среде, содержаще,! Т-клеточный ростовой фактор и.,-к ИЛ-2 - происходила активация т-супрессоров, подавляющих пролифе-¿-ивный ответ на аллоантигеш и ФГА, а также цитотоксическую активность ЛАК клеток на • стадии взаимодействия с опухолевыми клетками-мишенями. Имеются также и противоположные результаты, полученные в экспериментах на мышах. Недавно было показано, что ^"пьл'чг/" к свежим культурам активированных в течение 2 часов с о«ух.>лесп-па{»п*ских Т-супрессоров не приводило к подавло-

12 4 6 6 7

Рис. И. Характеристика супрессорных клеток в популяции ЛАК ¿леток онкологических болытх

Цитотоксьческая активность смеси 10х10ь обработанных и 10x100 .'.?обработ.- :ны.х мити>.:чцинои С мононуклеарних клеток (МНКИог одного и того же человека) больных 1,2,4-7 после 4а час. культивирован ия с юао ЕД/мл рИЛ-2 (контроль); смеси 10x1 сЯ МНК больных 1,2,4-? с 10-1 Оьаутологичл'нх ЛАК клеток (получена через 72 часа культивирования а рояллерных .рлакпнах) после 4в час.

инкубации с !ООО ЕЛ/мл сИЛ-2 ¡опыт). £33 контроль, ЕЩ опыт, СИЗ ЛАК клетки после адсорбции на пластике, ££3 Л.4К клетки пчеле обработки ионеклональш/ми антитела:, ы л ко мич-ментом

torn цитотоксической активности ЛАК клеток, генерированных в этих культурах (HaubecX et al.,1968). Различие результатов этих авторов с нашими данными может быть связано с тем, что для реализации действия супрессоров человека требуется не менее 2-3 суток культивирования этих клеток в среде с рШ1-2, за время которого ироис/^дит их активация и дифференцировка.

Индукция супрессии в популяции ЛАК клеток онкологических вольных может быть также связана с активацией супрессорной функции моноцитов рекомбинантным ИЛ-2. В пользу этого свидетельствовали полученные ранее данные, о том, что добавление стимулирован-* ■ ых липополисахаридеми ют* аутологичной сывороткой моноцитов онкологических больных к свежим культурвм лимфоците®, крови тех же больных в присутствии ИЛ-2, приводило к подавлению дифферея-цировки ЛЯС клеток на ранних стадиях культивирования (Soné et al., 1987; Iton et al., 1989).

В ходе адоптивной иммунотерапии, т.е. при генерации ЛАК клеток из крови больных, уже по. учавших многократные инъекции противоопухолевых киллеров с рИЛ-2, происходило снижение супрессии, индуцируемой ИЛ-2. Гак, посла лече; ля больного 1 тремя курсами введения аутологичных ЛАК клеток с рИЛ-2 и больного 2 - двумя, уровень супрессорной активности в популяции культивируемых ноно-нукл^чрных клеток In vitro падал с 86-63% до 39-20%.

Подобные данные были получены при изучении супрессорной активности в крови больных раком.

До начал: адоптивной иммунотерапии.уровень аутологичной супрессорной активности определенной методом градиентного центрифугирования, колебался от 36 до 56%.

Через сутки после проведения первого курса адог. литой иммунотерапии супрессорная активность в крови больных 2 и 3 имела тенденцию к уменывениг вплоть до плного исчезновения эффекта супрессия у больных 1,4-7.У больных 1 и.2, получавших.соответственно 5 и 3 курсов леченил, супрессорная активность ыоноуклеарных клеток чер-з пут:.¿i после окончания адоптивно; иммунотерапии не быяр ььивАвна (рис. 12).

Снижение уровня супрессии р ходе адоптивной •. иммунотерапии коррелировало с нарастанием в сроки тег ирссания супрессии у всех пациентов цитотоксической активности и нонуклеарных клеток противаклеток-мишеней Mel-i и К-562. У больных 1 и ¿, получавших несколько курсов теракта, к концу лечения сохранялся высокий уро! нь ujmvroKcjíwjrowí мояоижледркиа kjíutok, достигаадкЁ ь6%.

Эффекты падения уровня супрессии в популяциях ЛАК клеток и лимфоцитов периферической крови в хода адоптивной иммунотерапии свидетельствовали о сдвига иммунного балланса клеток крови больных в сторону образования новых киллеров из их предшественников за счет введения пациентам аутагогичных ЛАК клеток в сочетании п рЯЯ-2.

В пользу такого предположения свидетельствовали также резуль тата измерения цитотоксичности мононуклеаров при оценке супрессии изтодом градиентного центрифугирования. Цитотоксический эф!>ек11 нефракциокированных мононуклеаров крови больных до проведения адоптивной иммуоотерапии колебался от 18,1 до 32,61, в то время как цитогокслческая активность клеток 2 фракции градиента пер колла превышала °ф5ект нефракционированных мононуклеарных клеток во всех случаях в 1,7-3,5 раза. Увеличение цитотоксичности кле ток 2 фракции можно Объяснить концентрацией в ней предшествен ников цитотоксичоских Т-лю«фоцитов после фракционирования в гра диенте перколла. В ходе адоптивной иммунотерапии у больных 1,2, и 4, получавших несколько курсов лечения, отмечена тенденция к дальнейшему уволичешш цитотоксичности нефракционированных мононуклеаров и клеток 2 фракции градиента перколла после 48 час. культивирована.. с ФГА.

Отмена супрессии после адсорбции 1 фракции клеток, обогащенной супре ссора?«, на пластике или обработка их моноклональными антителами OKTö и комплементом свидетельствовала о том, что у большинства исследованных больных супрессорами являлись 'Г-метки и моноциты. Полученные результаты подтвердили наш более ранние предположения о том, что во фракции градиента перколла с плотно стью 1,056-1,067 г/см3 у онкологических больных концентрирова и.г.ъ супрэсссркые Т-клетки и моноциты (см. главу 4).

Для рэшегия Ео:ггсса о том, препятствуют ли супрессоры проти ■ .щг/холеьсю KMMïL!TiiT9Ta цатотоксической активности ЛАК клеток •«a ypoEwS их с::.-'.;модействия с опухолевыми клетками-мишенями, поставит д-.полнительные эксперименты по изучении влияния -•ynpJccopoB опухо/опоентелей на эффе к торную стадию действия ЛАК шпак.

В экспериментах на животных было показано, что добавление меси эффекторов и клеток-мишеней при постановке цитотоксичш; toro теста нефракционировакных лимфоцитов, не прикрепившихся ,, шйлоноеой ьате Т-клеток и прикреплявшихся к пластику макрофаго» шшей BIO с опухолью МС-1 4 на 10 день ее роста в 1/4 экаш

риментов приводило к ингибирования цитотоксической активности сингенных ЛАК клеток против МС-14 на 33-40% (р<о,01). При добавлении этих типов клеток, полученных от мышей C57BL/G и balb/c о опухолями KL-4 и X63-Ag.8.653 на более поздних стадиях их развития (на 30, 40, 45, 114 и 120 дни роста) в 5/5 экспериментов наблюдалось усиление ингибирования цитотоксичности ЛАК клеток против el-4 и X63-Ag.8.653. Степень ингибирования зависела от дозы и при самой высокой (супрессоры:эффекторы:клетки-мишени -160:40:1 ) достигала 44-10026 (р<0,01-0,001).

Подобные результаты были получены при изучении действия суп-рессоров противоопухолевого иммунитета у больных раком мочевого пузыря (рис 13). При добавлении к смеси эффекторов и клеток-мишеней в качестве супрессоров неприкрепившихся к нейлоновой вате и прикрепляющихся к пластику клеток* от больных 1-И стадий подавление цитотокси еской активности аутологичных ЛАК клеток против клеток , Г-24 на 34-46% наблюдалось у 2/6 пациентов (р<0,01). При добавлении к смеси эффекторов и клеток- -шпеней не-фракодошрованных мононуклеаров, не. прикрепившихся к нейлоновое вате Т-клеток и .прикрепляющихся к пластику моноцитов больных I1I-IV стадий - происходило усиление аффекта ингибирования цитотоксической активности аутологичньл ЛАК клеток пробив Т-24, поскольку этот эффект наблюдался уже у 4/4 пациентов. Как и в выше описанных экспериментах на мыша- ингибирукщий эффект зависел от дозы супрессоров и при соотношении супрессоры:эффекторы: клетки-мишени - 160:40:1 достигал 40- 98% (р<0,02-0,001).

Рис. 12. Сравнение супрессорной и цитотоксической активности ыононуклеарных клеток крови онкологических больных в ходе адоптивной иммунотерапии

За дР>а дня до начала, и через утки после окончания 1, 2 ,3,4 и 5 курсов ЛИТ в щюбч больного лелстолой 1 летодол центрифугирования б градиенте перколла (1,056; 1,067; 1,077 г/сл3) была опреде-лет супряасорюя активность ИНК, I - не/фршщиокированние лилфо->!*'лы, 2,- 1 фракция (обогпшрк ая супрсссорали), 3-2 фракция (обогсщенндя предшественникали цитотокепчеекш: Т-лилфоцчтов), 4 с.хссь клеток 1 и 2 фракций в соотношении 1:1. Супрессию опре-домии в тесте; ингибиро&акия итотоксической активности лилфоци -топ р ¡фракции сущюссораии илетхии, скокцетрировст>шли В V гцхИи^апа (р<0,05-0,001). Цитотоксичноапъ МНК определяли против клеток-лтюней Хе1-1.

Цит о токсичность,* ' Супрессия,*«

и цитотоксичность,* KM: Mel-1(D), К 562 IN

Ранее било установлено, что при фракционировании мононуклеар-ных клеток человека на колонке с Нейлоновой ватой в неприкрепив-шейся популяции клеток содержится 32-95Ж ОКТЗ* клеток (.ТиНив е(. а1.,1973). а при фракционировании на чашках Петри среди прикрепляющихся к пластику члеток концентрация 0КМ1+ составляла 71-851 (Китаеа1 еЬ а1.,1979). В связи с этим можно предположить, что в крови больных раком мочевого пузыря, а также в селезенке мышей с опухолями МС-14, Х.63-А£.8.653 присутствовали т-супрессоры и супрессорные клетки моноцитарно-макрофагального происхождения, которые подавляли цитотоксичность ЛАК клеток в вффекторной стадии.

Наиболее сильная супрессоривя активность наблюдалась у больных Ш-ХУ стадий и у мышей с поздними сроками роста опухолей (30-120 дней) по сравнешш с уровнем супрессии на более ранних стадиях развития зле ;ачественных, новообразований.

Способность Т-супрессоров нищей с опухолями подавлять цито-токсичность опухолеспецифических киллеров была прс.;емонстриро-вана ранее (Ри;[1люго а1., 1976).. Недавно было показано, чт^ супрессоры и моноциты Сольных раком головы и шей ^подавляли иито-токсичность 0КТЗ+4+ клеток в смененных культурах лимфоцитов и опухолевых клеток человека (Бита а1>.а1., 1908).

. Получышыэ результаты свидетельствовали о необходимости оценки супрессии в ходе адоптивной имм-чотерапии, являющейся одним из критериев эффективности лечения.

Рис. 13. Влияние супрессоров больных раком и мышей с опухолями на цитотоксическую активность ЛАК клеток в эффекторной стадии

А ■■ эксперимент на лапах В10 а MC-i4 на 10 день роста (I) и Ü57BL/6 с EL-4 на 45 день росла (TIJ;© - цтотоксический эффект ЛАК клеток нормальных ятей с з внесения супрессороб 6 цшотокси-ческий тест; 1 и 2 - при добавлении к эффектора* нефращиониро-ваюшх селезеночных лилфоцитов норлалъных лшей или лшей с опу-. холь»; 3 и 4 - при. добавлении Т-клеток либо лилфоцитов из селезенки лшей с опухолью.

Б - эксперименты с клетками больных ракол мочевого пузыря I-П (I) и III-IV (IT) стадий болезни. Цитотоксический эффект аутологичных МАК клеток боа добавления супрессоров в цитотокси-чпекий пест; 1 и 2 - при добавлении жфракциышрованных лонанрк-леаркых клеток донора либо больного; 3 и 4 - при добавлении Т-КЛРШОК 4U0O *0НЛ)#вП0б болЫШ.

100

80

60

ж

к о

40

20

Чг

у /

г /

V" 3 /

А I

160

—Г"

80

40

К"

4

Ж

■Ы

з

Y'

f" "Г

к II

160

—i— 80

—i 40

100

w

о

н 80"

о

н

60

40

20

f —-

Б I

-1—

160 80 40 160

Количество супрессоров на 40 эффекторов и I клетку-иксекь

+-7a

/

Г7/1

/ /

/

/ /

i-4

У

/

Б II

—i— 80

40

ВЫВОДЫ

1. Внутривенное введение мышам массивной дозы облученных клеток аллогенной селезенки индуцировало образование специфических Т-супрессоров, блощ^юцих синтез'ДНК и генерацию киллеров в смешанной культуре лимфоцитов. Их активность была максимальной в селезенке реципиента на 3-6 сутки после иммунизации.

•' к

2. На поверхности Т-супрессоров, индуцированных антигенами комплекса Н-2. обнаружены антиген-специфические рецепторы, позволяющие концентрировать супрессоры', ингибируксдае синтез ДНК в 30 раз и генерацию киллеров - в 2,6 раза.

•г' Ч

' ' 1 '

3. Обогащение супрессорами фракций вотированных лимфоцитов коррелировало с возрастанием в 3 раза доли Т-клетон, увеличением пропорции больших лимфоцитов и бластов, а также клеток, синтезирующих ДНК.

4. Антисупрессорные сыворотки избир гельно инвктивировали Т-суп-рессоры мышей, не оказывая влияния на функцию других популяций

л

эф$екторшх Т-лимфоцитов - киллеров и М1Р-продуцентов.

!-. а антисупрессорных сыворотках присутствовало два типа антител к новому ди4ференцировочно»'у маркеру эффекторных Т-супрессоров и к маркерам их предшественников, акспрессированных также в тимусе нн незрелых кортикальных тимоцитах.

К. Антнсупрессорные сыворотки инактивировали различные категории оф|шсторов - Т-супроссоры трансплантационного и противоопухолевого иммунитета, что свидетельствовало об экспрессии на поверх-: ности этих рогуляторных клеток дифферонцировочвдх маркеров од..о{! ¿1 той жи лнтигенной природы.

7. Из кропи больных раком при фракционировании лимфоцитов периферической крови в 1'радиентв перколла были получены две различные- популяцшш клеток - обогащенная Т-супрессорами и моноцитами либо - предшественниками цитотоксических Т-лимфрцитов. Полученные результата явились предпосылкой для создания новой аутологичной системы лимфоидных клеток для обнаружения и концентрации оупрессорсв 1фотивоопухолевого иммунитета, а также оценки га функциональной активности по тесту подавления цито-токсичности киллеров.

8. Разработан новый способ определения аутологичной супрессорной активности у больных раним.

9. В популяции лимфокин-активированных киллеров (ЛАК клеток) некоторых онкологических Сольных уже на вторые сутки культивирования происходила активация супрессорных Т-клеток и монацитов. ¡Га третьи сутки суиросс-орная активность выявлялась в популяции ЛАК клеток большинства больных. В ходе адоптивной иммунотерапии а популяция.? клеток некоторых пациентов к концу терапии проясход.и.з они»; п!.> уровня супрессии, индуцируемой ИЛ-2-.

10. при ¡(ровед&ьп: адоптивной иммунотерапии у онкологических оольны'. лц-т опрьдолнна 'аутологичная су)фзссорная активность м.»ионуклозр1шх плиток периферической крови. Через сутки после окснч&шы каждого курсу терапии происходило ее снижение вплоть до полного исчезновения у некоторых .больных, получавших повтор ние курой лечении.

н. Т- суар^ееори 1! мглюцмти препятствовали иитотоксичи о»и актиыккт) ЛАК кл«т(>к ни урэык« их изпикодкЯствии о с/иухолс.или! клетками-мишенями. Наиболее значительный эффект кпгийнр.и-.у.пш

оказвшали супрессорные, клетки,' полученные от больных раком

Illriv стадий и'мйтей с опухолями на поздних сроках развития. '.

• <

СПИСОК РАБ01 ОПУБЛИКОВАННЫХ JlO ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Индукция Т-супрессоров при иммуиизащр аллогенной селезенкой в системе Н-2 мышей. - Билл, зкспер. биол.' мед., 1979, No Ю, с. 429-431 (в соавторстве с А.В.Карауловым и Б.Д.Брондзом)

2. Изучение специфических Т-супрессоров, блокирующих первичный ответ в'смешанийх культурах лимфоцитов мышей. - Материалы научной конфгченции "Вопросы молекулярко-клеточцой биологии", Ереван, 1979, с. 1,2-14 (в соавторстве с Б.Д.Брондзом и А.В.Карауло-вым) . '.'.'.

3. Обнаружение рецопторов специфически Т'-клеток-супрессоров, иммунных к антигенам Н-2, и их обогащение с помощью фракционирования на монослое'клеток-мишеней. - Молекулярная биология, 197Я, т. 13, вып.6, с.1287-1295 (в соавторстве с Б.Д. Брондзом и А.В. ' Карауловым) , ;

4. Генетические условия индукции ^ реализация действия специфи-ческих Т-супрессоров, иммуных к антигенам Н-2. - Генетика, 1979, т.15, No 12, с. 2119-2133 ( в соавторстве с Б.Д. Брондзом и А.В. Карауловым) . ,

5. Specific T-suppresr>or Immune ,to H-2 antigens: methods Of enrichment, clonal structure, receptors, and genetic constraints - Proceedings of the IXth International Symposium on Comparative Research on leukemia and Related ■ Diseases, held in Pitsunda, 1979, p. 63 (with Bronds B.D., Karaulov A.V., and Blandova Z >

6. Узкая специфичность рецепторов Т-супрессоров, иммунных к антигенам комплекса Н-2. - Генетика, 1980, т. 16, No 12, с. 2152 -2163 (в соавторстве с Б.Д. Брондзом, А.В. Карауловым и З.К. Блавдовой)

7. Специфические и неспецифическиэ супрессорц, иммунные к антигенам Н-2 мышей. - Физиологический журнал, 1930, т. 26, No 3, с. 308-3!6 (в соавторство с А.В.Карауловым и Б.Д.Брондзом)

а. Иммунологическая специфичность и кинетика индукции Т-супрс-соров при иммунизации мышей аллогенной селезенкой. - Цитология, К'вп, т. 22, No Ь, с. 583-590 (в соавторстве с Б.Д. Брондзом и A.it. Кароулошм 1

9. Характеристика т-супросооров, концентрированных с даедью элюции с монослоя аллогешшх клеток-мишеней. - Бюлл.экспер.биол. мед., 1980, Но 2, с. 202-205 (в соавторстве с А.В. Карауловым и Б.Д. Брондзом)

10. Различия cboiu Гц специфических Т-суцрессоров и цитотоксичео-ких Т-лимфоцитов, иммушшх к антигенам комплекса Н-2. - Бюлл. экспер. биол. мед., 1980, ко 12, с. 703-705 (в соавторстве с

A.В.Карауловым и Б.Д.Нрондзом)

11. Biological, Immunological and genetic characterization or specific suppressor T ct-lls and their receptors Immune to antl- . gens of the H-2 complex. - Molecular lmmunlogy, 1980, Vol. 17, p. ЙЗЗ-849 (with Brands B.I)., Karaulov A.V., and Blandova Z.K. )

12. Requirement for Induction of specific suppressor T cells and detection of their H-2 antigen-blndirig receptors by fractionation on target ceil monolayer. - Scand. J. Immunol., 19B1, vol.

13. p. 517-534 (with Br о rids U.D., Karaulov A.V., Blandova Z.K.)

13. Избирательная инактивация специфических Т-супрессоров, иммунных к антигенам комплекса ii-2, и предотвращение их генерации in vivo антисупрессорними ксеногенными антителами. - Молекулярная биология, 1981, т. 15, вып. 5, с. 1131-1143 (в соавторстве с Б.Д. Брондзом, А.11. Сусловым, М.Б. Зайцевой, А.В. Карауловим)

14. Получение аитисупрессорных антител и использование их для предотвращения генерация T-cyitpaccopos In vivo. - Иммунология,

1981, No 4, с. 30-35 (в соавторстве с В.Д. Брондзом, А.II. Сусловым, М.Б.Зайцевой и А.В.Карауловым)

15. Получение аллогенных, ксеногенных и моноклоналышх антител к Т-суирессорам к 'Г-киллерам мышей. - Тезисы докладов Всесоюзной конференции, Алма-Ата, 1981, с. 5 (в соавторстве с С.Г.Егоровой,

B.Д. Ь'рон.-'.зом, А.П. Сусловым, М.Б. Зайцевой, А.В. Червонским и А.Ь. Кари/ловим)

1Й. The differences in receptor cross reactivity and clonal structure between cytotoxic Г lymphocytes, specific suppressor T cells and memory T cells immune to antigens of-the H-2 complex.-

1982, in Mechanism of all-mediated cytotoxicity, eds . Clare W.R. and GoistelnH., p. 171-189 (with Bronds B.D., Blandova Z.K., Karaulov A.V., Plmenov A.A.)

i7. la- антигенные маркеры специфиеских Т-супрзссоров, иммунных к антигенам комплекса Н-2. - Гавела, 1982, т. 18, No 4, о.639-651 (в соавторстве с Б.Д.Брондзом, М.Б Зайцевой и З.К.Блавдовой)

18- Inactivación of speciric anti-H-2 supressor T cells by antisera io I-J and 1--C subregion products of the H-2 complex. - J. lmnsunogenetlcs, 1983, vol. 10,' p. 425-438 (with Bronds B.D. and Zalceva Ы.В) "'.'''.'

19. Генетическая рестрикция и условия взаимодействия в культуре специфичных к антигенам Н-2 Т-супрессоров с подавляемыми реагирующими лимфоцитами. - Материалы II Всесоюзной конференции по генетике соматических.клеток. - Звенигород, 1983, о. 52 (в соавторстве с Б.Д.Брондзом, М.Б.Зайцевой и А.В.Червонским)

20. Specific suppressor Т cells ii&nune. to antigen of H-2 complex: receptors, clonal structure. Genetic restriction and antigenic narkers. - Immunol.Rev. (Ed.G.Moller, Stockholm), 1984, No CO, p. 29-76 (with B.D.Bronds, M.B. Zaltceva, A.V. Filatov, and A. V. Chervonsky) . ^

21. Сравнительное изучение условий выявления рецепторов Т-клеток памяти и других субпопуляцай Т-лимфоц тов,. иммунных к антигенам комплекса Н-2. - Билл.экспвр.биол.мед., 1984, т. XCYII, No 1, с. 66-68 (в соавторстве с А.А.Пименовым и Б.Д.Брондзом)

22. Обнаружение la-антигенов на Т-супрессорах, специфичных it антигенам Н-2, и их возможная функциональная роль - Сб. "Иммунологические аспекты биологии развития", М, Наука,;.1984, с. SP 85 (в соавторстве с М.Б.Зайцевой и Б.Д.БровдЕом)

23. Разделение внтиоупрвссорнш антител сыворотки крысы, "элиминирующих Т-супрессоры и стимулирующие их образование. - Бюлл. экспер.бдал.мед., 1985, No 8, < 215-218 (в соавторстве с М.Б. Зайцевой и Б.Д. Бронцзом)

24. Selective inactiva!.Ion and enchancement of the suppressor 'Г cells function by polyclonal and monoclonal antlsuppressor antibodies. - Abstracts Sixth International Congress of Immunology, roronto, Canada, 1986, p. 296 (with B.D. Bronds, M.B. Zaltceva, and A.V. Chervonskyt

г5. Цитотоксическая и суггрессорная активность стимулированию ¡гп'ррлэйкином-2 и фитогемагглюткншюм лимфоцитов периферической

г iv.bh человека до и после разделения в градиенте иёрко.гша. •■

Билл.экстар.биол.мод., 1988, No 9, о. 327-329 {в соавторстве с Н.В.Малаховой, К.М.<.лгуритч и 8.С.Ананьевым)

26. Условия образования противоопухолевых цитотокеических Т-лим-фоцитов и подавление их активно^-и Т-супрессорами в смешенной культуре лимфоцитов и клеток ■ опухоли. - Вшл.экспер.биол.мед., 1980, No 10, с. 473-476 (в соавторстве с B.C.Ананьевым)

27. Получение обогащенной цитотоксическими противоопухолевыми Т~ клетками популяции лейкоцитов из крови онкологических больных. -Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума, Юр.чапа, 1988, с. 5-6 (в соавторстве с Н.В.МалзховоЙ, К.М.&гургошм и В.С.Ананьевым)

28. Клеточные механизмы противоопухолевого иммунитета. - Цитология, 1388, т. ххх, No 1, с. 1125 (в оавторстве с С.Н.Быковской, Т.А. Куприяновой л A.A. Быковым)

29. Определение аутологичной супроссорной активности в кро^я онкологических больных. - Тезисы доюшдов I Всесоюзного иммунологического съезда, Сочи, 1889, с. 5 (в, соавторстве с Н.В. Малаховой)

30. Treatment with interleukln-2 In an liamunodepressed state. -Blometl.Pharmacot.her., 19Я0, vol. 44, p. 263-268 (with Bykovskaya 3.M., Kupriyanova T.A., and Kalachova M.V.I

31. Down-regulation or LAK cell-mediated cytotoxicity: cancer ind ageing. - BloMad. Pharmacother., 1990, vol. 44, p. 333-330 «Ith Bykovskaya 2.N., Kuprlyanova T.A., a,nd Bubenlk J. I

12. Сравнение су»рессорной и цитотоксичес: эй активности мононук-ювршгх клеток крови при адоптивной иммунотерапии онкологических !олышх лши^окин-яктийировааиши киллерами с низке ' дозой реком-'чдаапке-го ичтяряейши 1-2. Иалл.&кспер. биол. мед., 1991, No 11, . 5;9-5:?l (в авторстве с Куприяновой Т.А., Болвачевой A.B., иконкой С.Л1., кроновой О.М. и Руачидзе Л.И.)

ч. tbvy «Ч!"лл генерации лгаафокин-активированних киллеров супрес-орами я;.'ЛИ/ 'оолухолевого иммунитета онкологических больных. -ззисы докладов I Съезда иммунологов России, Новосибирск, 1992, . б. (без соавторов) .

Авторское свидетельство по теме диссертации

юсоб определения супрессорной активности лимфоцитов крови молигичсских больных. No 15)9368, зарегистрировано в Гог'дарс-юшюм радстро изобротнний СССР 1.7.19S9 (боа ооавгоров)