Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Влияние цитостатиков и ростовых факторов на противоопухолевые и иммуносупрессорные свойства клеток костного мозга

РГ6 од На правах рукописи

ЗЕМЛЯНСКАЯ НАТАЛИЯ ВИТАЛЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ ЦИТОСТАТИКОВ И РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ НА ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ И ИММУНОСУПРЕССОРНЫЕ СВОЙСТВА КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск - 1996 г.

Работа выполнена в Научно-исследовательской лаборатории экспериментального биомедицинского моделирования Томского научного центра СО РАМН и Научно-исследовательском институте онкологии Томского научного центра СО

Научные руководители:

академик РАМН, профессор Н.В. Васильев,

кандидат медицинских наук С.А. Кусмарцев.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.Е. Гольдберг, кандидат биологических наук Н.В. Чердынцева.

Ведущая организация: Институт клинической иммунологии СО РАМН.

Защита состоится "_"_ 1996 г. в "_" час.

на заседании диссертационного совета Д 001.34.01 в Научно-исследовательском институте онкологии Томского научного центра СО РАМН (634001, Томск, пер. Кооперативный, 5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (пер. Кооперативный, 5).

Автореферат разослан "_"_ 1996 г.

Ученый секретарь

РАМН.

диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Актуальность темы.

Известно, что прогрессирующий характер роста большинства опухолей тесно связан с наличием первичных и приобретенных иммунодефицитов, которые проявляются в относительной неэффективности механизмов противоопухолевой защиты и в избыточной активации механизмов иммуносупрессии [Кароог Q.S., 1982; North R.J. et al., 1984]. При росте химически индуцированной, спонтанной и перевивной опухоли показана активация иммуносупрессоров костного мозга и их экспансия в селезенку [Subiza J.L. et al., 1989; Кусмарцев С.А., 1990; Young.M.R.I. et al., 1992; Young M.R.I. et al., 1994]. Эти иммуносупрессоры (так называемые естественные супрессорные клетки, ECK) имеют нулевой фенотип, способны действовать дистантно через растворимые факторы, неспецифически, без предварительного контакта, не рестриктированно по антигенам гистосовместимости. Кроме ингибиции ответа Т-, B-клеток [Maes L.Y. et al., 1988; Subiza J.L. et. al., 1989], натуральных киллеров [Fu Y.X., 1991; Young M.R., 1992], ECK участвуют в регуляции гемопоэза, подавляя колониеобразование стволовых кроветворных клеток (СКК) и выработку стромальными элементами ростовых факторов [Young M.R., 1988; Moore S.C., 1992]. В ряде работ показано наличие цитостатического действия ECK на опухолевые клетки in vitro [Sugiura К. et al., 1990; Seledtsov V.l. et al., 1995].

С другой стороны, опухолевые клетки обладают независимостью от контролирующих пролиферацию сигналов и способностью к постоянному автономному росту, в частности, за счет способности продуцировать факторы роста [Блинов М.Н., 1990]. Одной из возможных причин иммунодефицита является активация ростовыми факторами ECK костного мозга. Показано, что продуцируемые опухолевой тканью ростовые факторы, такие как, интерлейкин-3 (ИЛ-3), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, активируют ECK [Sotomayor Е.М. et al., 1991, Young M.R. et al., 1992, Young M.R. et al., 1994].

Еще одно обстоятельство привлекает внимание к ECK: применение химиопрепаратов и гемопоэтических ростовых факторов для лечения больных со злокачественными новообразованиями приводит к глубокому вмешательству в гемопоэз, а соответственно, и к вмешательству в систему, регулирующую пролиферацию кроветворных клеток. Данные о результатах

г

применения в клинике рекомбинантного человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (рчГМ-КСФ) для устранения миелосупрессии, развившейся после лечения высокими дозами цитостатиков, неоднозначны: однй авторы показывают неэффективность и даже токсичность препарата [Hoekman К. et al., 1991; Bajorin D.F. et al., 1995], другие, напротив, рекомендуют его для ускорения восстановления количества нейтрофилов и снижения частоты связанных с нейтропенией инфекционных осложнений [Büchner Т. et al., 1991]. Использование ИЛ-3 и рчГМ-КСФ или - рчГ-КСФ (гранулоцитарного) в качестве индуцирующих дифференцировку факторов при миелоидных лейкемиях до химиотерапии не было успешным IDexter М., 1992]. Показана эффективность применения рчГМ-КСФ при подготовке больных к аутологической трансплантации костного мозга, препарат значительно увеличивает количество СКК в пери и больных после

успешное лечение анемии, развивающейся после аллогенной трансплантации костного мозга, а также у больных со злокачественными новообразованиями разной локализации при помощи эритропоэтина (ЭП) [Platanias L.C. et al., 1991, Symann M., 1992].

Таким образом, в ситуации экспериментального бласто-могенеза и в клинике показано, что сама опухоль индуцирует нарушения гомеостаза кроветворной ткани, ведущие к актива-ции естественных супрессоров, которые, в свою очередь, способны подавлять как противоопухолевый ответ, так и ингибировать гемопоэз. Применение цитостатических пре-паратов и ростовых факторов может также усиливать генерацию естественных супрессоров, приводя к снижению эффективности лечения. В связи с вышеизложенным приобретают актуальность вопросы, касающиеся механизмов регуляции активности ECK при использовании химиотерапевтических и гемопоэз-стимулирующих препаратов.

Цель и задачи исследования:

Целью данной работы является изучение регуляции активности естественных супрессорных клеток ростовыми факторами in vivo и in vitro, внутриклеточных механизмов их активации, а также влияния цитостатиков на костномозговую

высокодозовой химиотерапии

1991]. Описано

популяцию супрессорных клеток. В рамках этой цели решались следующие задачи:

1. Изучить влияние на ECK колониестимулирующего фактора ГМ-КСФ и эритропоэтина in vivo и in vitro.

2. Исследовать взаимосвязь клеточного метаболизма, синтеза ДНК, РНК и активности ECK. Оценить роль ионов водорода в регуляции активности естественных супрессорных клеток in vitro.

3. Охарактеризовать влияние актиномицина Д на супрес-сорную активность костного мозга, её зависимость от дозы препарата и генотипа животных.

4. Изучить механизм действия индуцированных актиноми-цином Д супрессоров на клетки-мишени, охарактеризовать растворимую супрессорную активность (зависимость от цикло-оксигеназы, видоспецифичность, чувствительность к нагреванию, кипячению, заморозке и оттаиванию).

5. Охарактеризовать клетки-продуценты растворимой су-прессорной активности, реагирующие на актиномицин Д.

6. Сравнить действие актиномицина Д, оливомицина и вин-кристина на естественные супрессорные клетки костного мозга.

Положения, выносимые на защиту:

1. Стимуляция гемопоэза in vivo на уровне гранулоцитарно-макрофагальных и эритроидных предшественников ростовыми факторами (ГМ-КСФ и ЭП) сопровождается усилением как иммуносупрессорной, так и противоопухолевой активности естественных супрессорных клеток.

2. Противоопухолевые цитостатические препараты с разным механизмом действия (актиномицин Д оливомицин и вин-кристин) способны in vitro усиливать естественную супрессорную активность через усиление продукции супрессорного фактора (ов), который имеет небелковую природу, не принадлежит к простагландинам, не обладает видоспецифичностью.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований получены новые данные о влиянии ростовых факторов на активность ECK, определены некоторые аспекты внутриклеточного механизма активации ECK, а также показано действие противоопухолевых препаратов на естественносупрессорную активность (ЕСА).

Впервые показано, что ГМ-КСФ, вводимый in vivo, влияет не только на иммуносупрессорную, но и на противоопухолевую активность естественных супрессорных клеток костного мозга. Экзогенный эритропоэтин усиливает имиуносупрессорную и противоопухолевую активность костного мозга и индуцирует появление ЕСА в селезенке.

Установлено, что противоопухолевая и иммуносупрессорная активность ECK несколько снижалась при блокировании цитохромоксидазного комплекса азидом натркя, в то время как ингибирование синтеза ДНК митомицином С не влияло как на противоопухолевое, так и на иммуносупрессорное действие ECK.

Впервые показано, что актиномицин Д способен значительно усиливать ЕСА костного мозга. Эффект зависит от дозы препарата и не зависит от генотипа экспериментального животного. Подобное действие, хотя и в значительно меньшей степени, оказывают оливомицин и винкристин. Антипролифера-тивное действие активированных актиномицином Д супрессоров проявляется как при контакте с клетками-мишенями, так и дистантно через растворимый супрессорный фактор(ы). Охарактеризована природа растворимой супрессорной активности: фактор(ы) обладает видонеспецифичностью, не принадлежит к простагландинам и не является белком. Под влиянием актино-мицина Д появляется растворимая иммуносупрессорная активность у спленоцитов и в тимусе, хотя и не столь значительная, как в костном мозге. Индуцируемая актиномицином Д иммуносупрессорная активность частично связана со зрелыми Т-клетка-ми, поскольку удаление ТЬу-1.2-позитивных клеток из костного мозга несколько понижало уровень супрессии.

Теоретическое и практическое значение работы.

Теоретическое значение полученных результатов состоит в расширении представлений о механизмах иммунодефицита и снижения противоопухолевой резистентности, что имеет место при опухолевом росте. Проведенные исследования позволяют глубже понять возможные пути развития устойчивости к противоопухолевым антибиотикам и причины неоднозначных результатов применения ростовых факторов в целях восстановления гемопоэза после химиотерапии. Изучение способов воздействия на активность естественных супрессорных клеток может служить основой для создания новых методов лечения

злокачественных заболеваний системы крови, для предупреждения РТПХ при аллогенной трансплантации костного мозга, а также для предотвращения контаминации опухолевыми клетками аутологического трансплантата костного мозга при его восстановлении после высокодозовой химиотерапии.

Апробация работы.

Основные результаты работы доложены и обсуждены на расширенном заседании Томского общества иммунологов (Томск, 1993), 12 Европейской иммунологической конференции (Барселона, 1994), ежегодном Конгрессе иммунологов Великобритании (Брайтон, 1995).

Публикация результатов исследования.

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных

работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 рисунками, 15 таблицами и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы из 167 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовано 290 мышей, полученных из коллекционного фонда НИЛ ЭБМ ТНЦ РАМН, обоего пола в возрасте 8-14 недель следующих линий: BAlb/c (H-2d), C57B1/6J (H-2b), CBA/CaLac (H-2k), DBA/2 J (H-2<0, CC57W/MvY (H-2b), AKR/J (H-2k), F1 (CBAxC57Bl/6) (H-2b/k). Для цитоста-тического теста использовались клетки асцитного варианта карциномы Эрлиха (H-2d) и мастоцитомы Р815 (Н-2^), поддерживаемые in vivo на самцах линии ВА1Ь/с и DBA/2 соответственно методом внутрибрюшинной трансплантации.

Для выделения и отмывки использовали среду 199. Культу-ральная среда состояла из: RPMI 1640 и 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ИЭМ им. Гамалеи АМН СССР, Москва), 2 шМ L-глютамина ("Flow"), 5x10-5 М 2-мер-каптоэтанола ("Fluka"), 40 мкг/мл гентамицина ("Pharmachím"), 20 mM HEPES. Культивирование клеток проводили в атмосфере,

содержащей 5% С02 и 95% воздуха при 37®С и 100%-ой влажности.

Рекомбинантный мышиный ГМ-КСФ вводили внутрибрю-шинно по 2 мкг/мышь, а рекомбинантный человеческий ЭП -подкожно по 6 ЕД/мышь. Оба препарата инъецировали в объеме 0,2 мл дважды с интервалом в 2 дня. Контрольным группам животных вводили в аналогичных условиях в том же объеме изотонический раствор хлорида натрия. Животных забивали на 1, 3 и 7 сутки после второй инъекции. Препараты любезно предоставлены коллегами из лаборатории иммунохимии института канцерогенеза ОНЦ РАМН.

Кровь для мазков получали из хвостовой вены. Препараты костного мозга и селезенки готовили путем выдавливания карио-цитов из грудины, а спленоцигов - из свежевыделенных селезенок, затем клетки суспендировали в сингенной сыворотке крови на стекле. Мазки фиксировали в метаноле 5 минут, после промывки окрашивали: препараты периферической крови по Романовскому, костного мозга и селезенки - азурН-эозином.

Клетки костного мозга выделяли из бедренных и больше-берцовых костей методом перфузии. Суспензию одиночных клеток получали пропусканием через иглы уменьшающегося диа-метра. Для получения суспензии спленоцитов селезенки гомогенизировали стеклянным гомогенизатором и фильтровали через четырехслойный капрон. Опухолевые клетки получали из асцит-ной жидкости. Мононуклеары из периферической крови здоровых доноров выделяли на одноступенчатом градиенте фиколл-пака ("Pharmacia") [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Подсчет общего количества и числа жизнеспособных клеток проводили в тесте с трипановым синим.

Для удаления адгезивной фракции суспензию клеток помещали в пластиковые чашки Петри на 10-12 ч. Затем неприлипшие клетки собирали, используя теплую среду. В дальнейшем для всех тестов в качестве эффекторов использовали только неадге-зивную фракцию.

Для получения супрессорного фактора (СФ) клетки-эффекторы культивировали 48 ч. (6 х 10© клеток/мл). Затем надосадочную жидкость собирали, удаляли клетки и хранили при -2(РС.

Активность ECK определяли по подавлению пролиферации мишеней [Holda J.H. et al., 1986]. Подготовка мишеней

осуществлялась следующим образом: спленоциты инкубировали 22-24 ч. в присутствии либо 4 мкг/мл Конканавалина А (Кон А) ("Sigma"), либо 50 мкг/мл липополисахарида (ЛПС) ("Диагностикум"), затем митогены были удалены. Эффекторы и мишени культивировали 48-52 ч. За 16-18 ч. до окончания инкубации вносили Зн-тимидин по 0,5-1,0 мкКю/лунку. Контрольные лунки содержали только мишени. Затем содержимое лунок переносили на стекловолокнистые фильтры ("Titertek"), промывали изотоническим раствором хлорида натрия, 5% раствором ТХУ и абсолютным этанолом. Фильтры высушивали и переносили в сцинтилляционную жидкость ЖС-8, включение изотопа (импульсы/минуту) оценивали на ß-счетчике "Mark-Ill". Супрессорную активность выражали в виде индекса ингибиции (%), который вычисляли по следующей формуле:

ИИ = (1 - о/к ) xlOO, где о - количество имп./мин. в лунках (клетки-эффекторы + клетки-мишени), к - количество имп./мин. в лунках с клетками-мишенями.

Активность СФ оценивали по подавлению индуцированной митогенами или антигенами в смешанной культуре лимфоцитов (CKJI) пролиферации клеток, культивируемых в присутствии су-пернатанта эффекторов [Сидорович И.Г. и др., 1987]. Однонаправленную реакцию в СКЛ проводили как описано [Лефковитс и др., 1981], в качестве стимуляторов использовались сплено-циты гибридов Fl (CBAxC57Bl/6) (H-2b/k)> отвечающими клетками выступали спленоциты мышеи линии C57B1/6J (H-2b). Спленоциты-стимуляторы обрабатывали митомицином С ("Serva") (25 мкг/мл, 1 ч.), затем трижды отмывали. Клетки культивировали 4,5-5 суток. Контрольные лунки содержили только клетки-респондеры. К предварительно подготовленным мишеням добавляли СФ в различных разведениях и культивировали 60-64 ч. В контрольные лунки вместо СФ вносили адекватное количество культуральной среды. За 16-18 ч. до окончания инкубации вносили Зн-тимидин по 0,5-1,0 мкКю/ лунку. Дальнейшие манипуляции описаны выше. Супрессорную активность СФ выражали в виде индекса ингибиции (%).

Противоопухолевую активность ECK и СФ оценивали в ци-тостатическом тесте [Богдашин И.В. и др., 1986]. Для этого опухолевые клетки культивировали 16 ч. либо с клетками-эффекторами либо с СФ. Контрольные лунки содержали только клетки-мишени без эффекторов или СФ. За 4 ч. до окончании

культивирования добавляли по 0,5-1,0 мкКю/лунку Зн-тимидина и по стандартной методике определяли включение метки на ß-счетчике. Индекс ннгибиции (%) определяли по формуле, указанной выше.

Активность синтеза ДНК и РНК определяли по включению меченных нуклеотидов: Зн-тимидина или Зн-уридина. По величине включения Зн-тимидина оценивали также пролифератив-ную активность клеток. Для этого к исследуемым клеткам добавляли за 18 ч. до окончания культивирования по 0,5-1,0 мкКю Зн-тимидина или Зн-уридина и по стандартной методике определяли включение метки на ß-счетчике "Mark-Ill". Результаты представляли в импульсах/минуту.

Для определения чувствительности супрессорной активности к индометацину мишени культивировали с индометацином в конечной концентрации 10-5 и 10"6 М lYoung M.R.I, et al., 1988]. Препарат присутствовал в течении всего срока инкубации. Контрольные лунки содержали адекватный объем культуральной среды.

Для определения чувствительности супрессорной активности к азиду натрия, митомицину С и актиномицину Д клетки-эффекторы инкубировали с препаратами 1 ч., четырехкратно отмывали и определяли ЕСА либо помещали в 24-луночные планшеты для наработки супрессорного фактора.

Зрелые Т-лимфоциты удаляли в микроцитотоксическом тесте in vitro с использованием специфической антисыворотки [Г.Фримель, 1987]. Антисыворотку против ТЬу-1.2-антигена получали иммунизацией мышей линии AKR (Н-2^, Thy-1.1) тимо-цитами мышей линии CBA/CaLac (Н-2Ц Thy-1.2).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Statgraph. Для всех выборок данных проверяли гипотезу нормальности распределения. Проверка гипотезы о равенстве средних проводилась с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ряде работ, посвященных изучению естественных супрессорных клеток, показано, что стимуляция гемопоэза сопровождается активацией ECK. Нами ситуация усиленного

.'мопоэза была смоделирована двукратным введением рГМ-КСФ *спериментальным животным.

Анализируя уровень включения тимидина и мазки кост-эго мозга и периферической крови, можно заключить, что дву-ратное введение препарата привело к усилению дифференциро-эчных, но не про лифе ративных процессов в костном мозге: на сутки повысилось количество сегментоядерных нейтрофилов : 3,1+2,1 до 29,б±1,1, р<0,005), на 3 сутки - палочкоядерных ейтрофилов (с 5,8±0,9 до 10,7±1,5, р<0,02). Известно, что больше концентрации ГМ-КСФ (in vitro) вызывают дифферен-ировку преимущественно в направлении нейтрофилопоэза, в то ремя как малые способствуют образованию макрофагов Афанасьев Б.В. и др., 1985]. На фоне умеренной стимуляции [иелопоэза мы наблюдали повышение антипролиферативной ктивности неадгезивной фракции клеток костного мозга спустя сутки: ИИ повышался с 48,5±1,3 до 68,0±5,0 (р<0,01), однако селезенке никаких изменений зафиксировано не было.

Другими авторами, использовавшими иные модели акти-ации миелопоэза in vivo, получены аналогичные результаты, ак, при росте опухоли, продуцирующей ГМ-КСФ, наблюдали гвеличение количества ГМ-предшественников и усиление имму-юсупрессорной активности костного мозга [Young M.R.I. et al., ,994]. При длительном (в течении 3 недель) введении животным >ГМ-КСФ также наблюдали стимуляцию гемопоэза и иммуносу-фессии [Fu Y.X. et al,, 1991]. Показано, что действие ГМ-КСФ га иммуносупрессоры костного мозга прямое [Sugiura К. et al., L990; Moore S.C. et al., 1992].

Таким образом, стимуляция гемопоэза /л vivo, сопровож-1дющаяся усилением дифференцировочных процессов клеток фанулоцитарного ряда, приводит к активации неадгезивных су-íipeccopoB костного мозга. Не исключено, что наблюдаемый эффект рГМ-КСФ связан с увеличением пула иммуносупрессоров.

Изученная нами стимуляция эритропоэза, происходящая после введения рЭП, также активирует нммуносупрессорные клетки. Известно, что ЭП является основным регулятором эритропоэза, действует на унипотентные ко имитированные клетки эритроидного ряда, начиная с поздних БОЕ-Э (эрит-роидная бурстобразующая единица) находящиеся в S-фазе * БОЕ-Э4 [Чертков И.Л. и др., 1977]. Наиболее чувствительны к ЭП КОЕ-Э (эритроидная колониеобразующая единица). Введение экзогенного ЭП экспериментальным животным вызывает про-

лиферацию поздних БОЕ-Э, а вторая инъекция приводит к терминальной дифференцировке КОЕ-Э с последующей волной эритропоэза [Павлов А.Д. и др., 1987].

В результате двукратного введения животным рЭП мы наблюдали незначительные изменения пролиферативной активности костного мозга, из чего заключили, что выбранная нами схема введения и доза ЭП вызывает активацию самых зрелых отделов эритрона. Известно, что стимулирующие эффекты небольших доз ЭП обнаружить практически невозможно, поскольку у интактных животных эритропоэз происходит с высокой и вариабельной скоростью [Павлов А.Д. и др., 1987]. На фоне такой умеренной стимуляции эритропоэза наблюдается усиление ЕСА лишь в ранние сроки, поэтому, возможно, костномозговые эффекторы, взятые на 3 день после введения ЭП, не проявляли противоопухолевое действие. Достоверное усиление иммуносупрессорной активности наблюдали спустя 1 сутки после введения ЭП (р<0,02), к 7 дню эта разница исчезала. При использовании в качестве эффекторов неприлипающих сплено-цитов в контрольной группе супрессии против тех же мишеней не наблюдали, а в опытной группе на 3 день после инъекции наблюдалась супрессия, индекс ингибиции составил 47,5% и 42,7% при соотношении 1:1 и 2:1 соответственно.

Введение ЭП может приводить к инициации эритропоэза вне костного мозга [Udupa К.В. et al., 1979]. Наличие супрессор-ной активности у спленоцитов, возможно, связано с усилением эритропоэза и/или инициацией его в селезенке.

Таким образом, наблюдаемая нами активация эритропоэза под действием экзогенного ЭП приводит к усилению in vivo ЕСА как костномозговых, так и селезеночных супрессоров. Реализация усиливающего ЕСА действия ЭП осуществляется, вероятно, на уровне клеток такой степени зрелости, как КОЕ-Э. Эти результаты не противоречат данным других авторов, показавшим, что МАЕ+ клетки, относящиеся к зрелому отделу эритрона, начиная с поздних КОЕ-Э, обладают ЕСА [Чеглякова В.В. и др., 1989; Кусмарцев С.А. и др., 1993] и блокирование дифференцировки на уровне БОЕ-Э отменяет ЕСА [Цырлова И.Г. 1987].

Мы получили, что ростовые факторы, действующие как на малодифференцированные стволовые кроветворные клетки (гра-нулоцито-эритроидно-моноцито-мегакариоцитарные и бипотент-ные КОЕ) в случае использования ГМ-КСФ, так и на более

и

зрелые - унипотентные кроветворные клетки эритроидного ряда (типа КОЕ-Э, проэритробластов, эритробластов, нормоцитов) при введении ЭП, активируют ЕСА костного мозга. Эти факты позволяют предполагать наличие клеток с супрессорной активностью, которые принадлежат- миелоидному и . эритроидному росткам и имеют,,,разную степень^зрелости. Возможно, что при влиянии факторов, стимулирующих гемопоэз, параллельно с усилением пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток генерируются соответствующие каждой стадии созревания супрессоры данного ростка и данной степени зрелости, которые осуществляют контроль над балансом процессов деления и созревания.

Поскольку антипролиферативное действие ЕСК проявляется через растворимые факторы, было изучено состояние клеточного метаболизма, уровень синтеза ДНК во время наработки его эффекторными клетками. Для этого клетки неприли-пающей фракции костного мозга мышей подвергли воздействию блокатора циТохромоксидазного комплекса ( азид натрия -0,008%) [Страйер JI. 1984], ДНК (митомицин С - 10' мкг/мл) [Плонский И.М. и др., 1991] и РНК (актиномицин Д - 1 мкг/мл) [Ашмарин И.П., 1975]. Обработанные клетки тестировали на противоопухолевую и иммуносупрессорную активность, а также исследовали их пролиферацию параллельно проявлению супрессорной активности.

Противоопухолевая активность супрессоров достоверно снижалась,- азидом натрия (с 75,8±0,5% до 6,0±25,7%), значительно повышалась актиномицином Д (ИИ повышался с 75,7±0,5 до 98,0±0,4%, р<0,001). Иммуносупрессорная активность по отношений к активированным В-лимфоцитам. снижалась не изменялась после воздействия азида натрия. Актиномицин Д достоверно и значительно усиливал супрессорную активность эффекторов, ИИ; повышался: а) в случае использования в качестве мишеней стимулированных Кон А спленоцитов с 69,8±6,2 до 95,3± 0,3% (р<0,05); б) в случае В-клеток с 49,3±5,9 до 92,3±0,1% (р<0,01). Митомицин С не влиял на иммуносупрессорную и противоопухолевую активности костного мозга.

Пролиферация костномозговых клеток во время тестирования супрессорной активности достоверно понижалась после преинкубации с азидом натрия, митомицином С и актиномицином Д.

Таким образом, на фоне угнетения митотической активности самих эффекторных клеток азид наюия снижает их противоопухолевую активность, актиномицин Д, напротив, значительно ее усиливает. Иммуносупрессорная активность повышалась после воздействия актиномицина Д, снижалась после обработки азидом натрия. Противоопухолевое и иммуносупрессор-ное действие неспецифических супрессоров костного мозга является, в некоторой степени, энергозависимым процессом, не требующим синтеза ДНК.

Как показано ранее, актиномиодн Д усиливает ЕСА костного мозга. При использовании в качестве эффекторов клеток костного мозга мышей различных линий (CBA/CaLac, CC57W/Mv и BAlb/c) этот эффект сохр»нялся. Кроме того,

60000 Т

М К 1 2 3 4 5

А

М К 1 2 3 4 5

М К 1 2 3 4 5

В

Рис.1. Влияние актиномицина Д на иммуносупрессорную и противоопухолевую активности клеток костного мозга.

Мишени: сингенные спленоциты (соотношение эффектор:ми-шень 0,5:1), стимулированные Кон А (А) или ЛПС (Б), и масто-цитома Р815 (соотношение эффектор:мишень 5:1) (В).

Эффекторы: клетки костного мозга, предварительно культивированные 1 час с культуральной средой (К) или с актиномицином Д в концентрации (мкг/мл) 0,001 (1), 0,01 (2), 0,1 (3), 1,0 (4), 10,0 (5). М - мишени без эффекторов. * р<0,05; ** р<0,02.

актиномицин Д вызывал до зо завися мое достоверное повышение противоопухолевой и иммуносупрессорной активности костномозговых клеток и наблюдался при концентрациях 0,1, 1,0 и 10,0 мкг/мл. Меньшие концентрации препарата (0,001 и 0,01 мкг/мл) не изменяли ЕСА (рис. 1).

Определяли также уровень синтеза ДНК и РНК в клетках-эффекторах, происходящего параллельно проявлению ими су-прессорной активности: в наблюдаемые сроки (через 22-24 ч.) после культивирования с актиномицином Д в концентрациях 1 и 10 мкг/мл происходит достоверное угнетение (более чем на 60% от исходного уровня) синтеза РНК и ДНК.

Таким образом, актиномицин Д на фоне угнетения синтеза ДНК и РНК значительно повышал противоопухолевую и имму-носупрессорную активность супрессоров костного мозга. Эффект зависит от дозы препарата и не зависит от генотипа животных.

Супернатант клеток костного мозга тестировали на наличие супрессорного фактора (ов). Предварительное воздействие актиномицина Д приводило к увеличению продукции супрессорного фактора (ов) (табл. 1).

Противоопухолевое действие супернатанта в контроле было значительным и дозозависимым, после обработки актиномицином Д супернатант почти полностью подавлял рост опухолевых мишеней во всех тестируемых разведениях. Иммуно-супрессорное действие супернатанта интакТных клеток в данных разведениях не проявлялось, однако в опыте иммуносупрес-сорная активность супернатанта была высокой и дозозависимо снижалась по мере повышения разведения.

Можно заключить, что подавление пролиферации мишеней опосредовано выработкой эффекторами растворимых факторов.

Для выяснения роли простагландинов в проявляемой су-прессорной активности клеток костного мозга, обработанного актиномицином Д изучили влияние индометацина (10"6м и 10-5 М) на супрессорную активность эффекторов по отношению к трем мишеням: опухолевым клеткам Р815, спленоцитам, стимулированным Кон А и ЛПС (рис. 2). Клетки интактного костного мозга проявляли значительную противоопухолевую активность, после обработки актиномицином Д противоопухолевая активность повышалась и не изменялась с увеличением концентра-циии индометацина, практически не зависела от соотношения эффекторов и мишеней. Иммуносупрессорная активность

Таблица 1.

Иммуносупрессорная и противоопухолевая активность супернатанта клеток костного мозга мышей линии ВА1Ь/с, предварительно обработанных актиномицином Д

Разведение . Спленоциты + Кон А* . Спленоциты + ЛПС* Мастоцитома Р815*

супернатанта Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт

М±ш М±ш М±т М*т М±т М±т

1/4 18183*917# 1883±433 (в) 9100*1700 644*144 (а) 25871*874 216*50 (г)

(-10,5) (88,4) (9,3) (93,6) (57,5) (99,6)

1/8 14118*2149 3720* 574 (а) 11463*111 1216*216 (д) 34323*193 366*33 (г)

(13,2) (77,1) (-14,3) (87,9) (43,8) (99,4)

1/16 17390±159 9316*1316 (а) 13025*1413 1483*183 (а) 50067 *3536 500*100 (в)

(-6,9) (42,7) (-29,8) (85,2) (17,8) (99,2)

1/32 17466*1433 11049*483 (а) 9066* 733 1633*167 (б) 60306*1332 1266*166 (д)

(-7,4) (32,1) (9,6) (83,7) (1,0) (97,9)

Примечание: - * используемые клетки-мишени;

- пролиферацию мишеней оценивали по включению радиоактивной метки, данные представлены в имп./мин., а также в скобках указан индекс ингибиции (%); -

- контроль - супернатант интактного костного мозга, опыт - супернатант костномоз говых клеток, преинкубированных с актиномицином Д (1 мкг\мл).

- (а) р < 0,05; (б) р < 0,02; (в) р < 0,01; (г) р < 0,002; (д) р < 0,001; п=6.

100 -I

80 -

vP гг-

S «о

\о

Е §

О 40

S

20 -

-20

I

1

I É

I

I

il

1

2

А

i

I

i

ч

i

2 Б

I

i

■

1

i 1

СЛ

В

Рис 2. Влияние индометацина на иммуносупрессорную и противоопухолевую активности интактных (светлые столбцы - контроль) и обработанных актиномицином Д (заштрихованные столбцы - опыт) клеток костного мозга.

Мишени: сингенные спленоциты (соотношение эффектор:мишень 2:1), стимулированные Кон А (А) или ЛПС (Б); мастоцитома Р815 (соотношение эффектор:мишень 10:1). Тест проводился в среде без индометацина (1), с индометацином 106М (2) и 105М (3). *р<0,01; **р<0,001.

интактных костномозговых клеток зависела от индометацина. Однако активированные актиномицином супрессорные клетки не реагировали на воздействие индометацина, сохраняя высокий ИИ (90-97%). -

Таким образом, актиномицин Д активирует супрессорные клетки костного мозга, действие которых значительно по величине и опосредовано растворимыми факторами, не являющимися простагландинами. Нагревание (56°С, 1 ч.), кипячение (100°С, 2-3 мин.), заморозка и разморозка не изменяли супрес-сорную активность исследуемого супернатанта. Супернатант клеток костного мозга мыши, преобработанных актиномицином Д подавлял индуцированную фитогемагглютинином (ФГА) пролиферацию мононуклеаров периферической крови здоровых доноров ниже уровня спонтанной пролиферации мононуклеаров, культивированных без ФГА (рис. 3). Снижение концентрации супернатанта вплоть до разведения 1 /64 почти не уменьшало его активности: ИИ составлял 92 и 88% (для 1 и 2 пулов соответственно). Эти данные показывают отсутствие видоспецифичности СФ, вырабатываемых активированными актиномицином Д супрессорами костного мозга.

Для характеристики природы клеток, продуцирующих супрессорные факторы после воздействия актиномицина Д изучили иммуносупрессорную активность супернатантов клеток костного мозга, тимуса и селезенки. Супернатанты интактных клеток тимуса и селезенки не обладали способностью подавлять пролиферацию мишеней. Под влиянием актиномицина Д тимо-циты, спленоциты и костномозговые клетки продуцировали значительное количество супрессорного фактора (ов), действие которого проявлялось в разведениях 1/2, 1/4, 1/16 (данные статистически достоверны во всех разведениях). Для выяснения роли зрелых Т-клеток в продукции СФ, индуцированного актиномицином Д из клеток неприлипающей фракцией костного мозга перед наработкой супернатанта были удалены Thy-1.2-позитивные клетки. Полученный супернатант сохранял свою активность в разведении 1/4 и значительно снижал (в случае стимулированных Кон А лимфоцитов с 63,9±2,6 до 24,3±3,8%, р<0,002) либо терял ее в разведении 1/16. Можно предположить, что актиномицин Д кроме активации естественных супрессорных клеток индуцирует продукцию супрессорного фактора также и Т-клетками костного мозга, тимуса и селезенки.

О 1/64 1/32 1/16 1/8 1/4 Разведение супрессорного фактора

Рис. 3. Влияние различных разведений супернатанта клеток костного мозга мышей, предварительно обработанных актиномицином Д, на пролиферацию мононук-леаров периферической крови человека, стимулированных ФГА.

—■—уровень ФГА-индуцированной пролиферации мононуклеаров 1 пула

■ уровень спонтанной пролиферации мононуклеаров 1 пула

—о—уровень ФГА-индуцированной пролиферации мононуклеаров 2 пула

о уровень спонтанной пролиферации мононуклеаров 2 пула

Нами также было проведено сравнение иммуносупрес-сорной активности супернатанта клеток, обработанных актино-мицином Д (1 мкг/мл), оливомицином (10 мкг/мл) и винкрис-тином (10 мкг/мл). Как видно из рис. 4, в разведениях 1/4 и 1/16 пролиферация стимулированных Т-лимфоцитов достоверно подавлялась всеми супернатантами. Пролиферация стимулированных В-лимфоцитов достоверно подавлялась супернатантами клеток, обработанных актиномицином Д и винкристином. Оли-вомицин не изменял ингибиторной активности супернатанта в отношении В-клеток. Можно заключить, что актиномицин Д, винкристин и оливомицин вызывают усиление продукции факторов (а) с иммуносупрессорными свойствами, наибольший эффект оказывает актиномицин Д наименьший - оливомицин.

Обобщая полученные результаты можно заключить, что, во-первых, актиномицин Д активирует продукцию супрессорного фактора, который видонеспецифичен, не простагландин, не интерферон (т.к. синтез интерферона ингибируется актиномицином Д), не белок, во-вторых, вырабатывается неадгеаивными

8 Р Й

90000 у 80000 -70000 » 60000 -50000 -40000 -30000 --

В 20000 --

в 10000 я п

М 1 2 3 4

Б

Рис. 4. Естественная супрессорная активность супернатанта (разведение 1/16) клеток костного мозга мышей, предварительно инкубированных со средой (1-контроль), актиномицином Д (2), оливомицином (3) и винкристином (4). М - мишени культивированные без костномозгового супернатанта

Мишени: сингенные спленоциты, стимулированные КонА (А) или ЛПС (Б). * р < 0,01; ** р < 0,001.

клетками разных органов (костный мозг, селезенка и тимус) и, частично, зрелыми Т-клетками (ТЬу-1.2-позитивными), в-третьих, этот супрессорный фактор действует на антиген- и митогенинду-цированную пролиферацию, а также на опухолевые клетки, причем, для реализации эффекта достаточно кратковременного контакта фактора с мишенями. В-четвертых, кроме актиномицина Д оливомицин и винкристин способны усиливать выработку супрес-сорного фактора костным мозгом, однако, только в отношении Кон А-стимулированных спленоцитов, в отношении ЛПС-индуци-рованного бластогенеза оливомицин не эффективен.

ВЫВОДЫ

1. Введение рекомбинантного гранулоцитарно-макрофа-гального колониестимулирующего фактора приводит к усилению активности естественных супрессорных клеток костного мозга. Введение рекомбинантного эритропоэтина приводит к появлению в селезенке и повышению в костном мозге естественной супрес-сорной активности.

2. Противоопухолевая и иммуносупрессорная активность костномозговых естественных супрессорных клеток снижается при блокировании цитохромоксидазного комплекса. Ингибирова-ние синтеза ДНК не влияет на иммуносупрессорную и противоопухолевую активность естественных супрессорных клеток костного мозга.

3. Актиномицин Д существенно усиливает иммуносупрессорную и противоопухолевую активность естественных супрессорных клеток костного мозга через увеличение продукции су-прессорного фактора (ов). Подобное действие оливомицина и вин-кристина менее выражено.

4. Супрессорный фактор (ы), индуцируемый актиномици-ном Д, имеет небелковую природу, не является простагландином, не обладает видоспецифичностью.

5. Удаление из костного мозга Т-лимфоцитов приводит к некоторому снижению индуцированной актиномицином Д продукции супрессорного фактора (ов). Тимоциты и спленоциты после воздействия актиномицина Д приобретают способность вырабатывать фактор (ы), обладающий иммуносупрессорной и противоопухолевой активностью.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Землянская Н.В., Кусмарцев С.А. Влияние рекомбинант ного ГМ-КСФ на активность естественных супрессорных клето! //Сборник трудов молодых ученых СО РАМН, Новосибирск.' 1993.-C.I25-128.

2.Kusmartsev S.A., Belsky Y.P., Zemlyanskaya N.V. Increa sing activity of natural supressor cells and production suppressoi factor by bone marrow cells in aging of mice of high-tumor strair //Abstr. 2nd Int. Congr. ISNIM, Paestum (Salerno), Italy.-1993. P.248.

3. Кусмарцев C.A., Вельский Ю.П., Агранович И.М., Зем лянская Н.В. Естественные супрессорные клетки (обзор)//Успе хи. современной биологии.-1994.-Т.114.-Вып. 6.-C.7Q5-714.

4. Belsky Y.P., Zemlyanskaya N.V., Agranovitch I.M. Ar increase of natural suppressor cell activity in mice following thf injection of GM-CSF in vivo//Abstr. 12 Europ. Immunol. Congr. Barcelona, Spain.-1994.-P.520.

5. Kusmartsev S.A., Zemlyanskaya N.V., Belsky Y.P Characteristics of suppressor factor produced by bone marrow cells after DT treatment//lmmunology.-I995.-V86.-Suppl.l.-P.126.

6. Землянская H.B., Кусмарцев C.A. Влияние экзогенного эритропоэтина на супрессорную активность клеток костного мозге и селезенки мышей//Сборник: "Экспериментальная и клиничес кая иммунология", Томск, 1995.-С.31-38.

7. Лимарева Т.Д., Плотников В.М., Кусмарцев С.А., Ерма^ ков Г.Ф., Землянская Н.В. Синтез и изучение цитотоксическш свойств иммунотоксинов на основе бактериального токсина фос фолипазы С//Иммунология.-1995.-№ 5.-С.60-62.

8. Землянская Н.В., Кусмарцев С.А. Индукция супрессор ного фактора, обладающего выраженными антипролиферативным* свойствами in vitro //Клинические и экспериметальные иссле дования молодых учёных СО РАМН./Сб. тезисов, посвящённыл 25-летию СО РАМН, Новосибирск.-!996.-С.44.