Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Закономерности экспрессии генов цитокинов в нервной системе и лимфоидных органах

На правах рукописи

Повещенко Александр Федорович

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ В НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ

И ЛИМФОИДНЫХ ОРГАНАХ

14.00.36 - «Аллергология и иммунология»

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Новосибирск 2003

На правах рукописи

Повещеико Александр Федорович

VKOHOMEPHOCTИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ В НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ И ЛИМФОИДНЫХ ОРГАНАХ

14.00.36 — «Аллергология и иммунология»

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Новосибирск 2003

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН.

Научный консультант

Доктор медицинских наук, профессор Абрамов Валерий Васильевич.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Аутеншлюс Александр Исаевич. Доктор медицинских наук, профессор Зубахин Александр Анатольевич. Доктор медицинских наук, член-корр. РАМН, профессор Трунова Лилия Алексеевна

Ведущая организация:

ШШ психического здоровья Томского НЦ СО РАМН.

Зашита состоится «_»_2003 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 001.001.01. «Аллергология и иммунология» в ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу 630099, г.Новосибирск, ул.Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ клинической иммунолог»

СО РАМН.

Автореферат разослан «_»_

2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Кандидат биологических наук

Список использованных сокращений.

СО - симпатический отдел ПО - парасимпатический отдел

ВНС - вегетативная нервная система---------------------------

ГГНО - гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая ось. ИКК - нммунохомпетентные клетки ИЛ - иктерлейкин

ИЛ-1 -Р - рецептор к интерлейкину -1 ИЛ-1ра- интерлейкина-1 рецептора антагонист ЛПС - липополисахарид мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота кг. - нанограмм

ПСКК - полипотентная стволовая кроветворная клетка

Т-зависимый - тимус-зависимый (антиген)

Т-независимый - тимус-независимый (антиген)

ЦНС - центральная нервная система

ЭБ - эритроциты барана

ЭП - эритропоэтин

ЭП-Р - рецептор к эритропоэтину

^ - иммуноглобулин

КСФ - Колониестимулирующий фактор.

КОЕс - колониеобразующая единица селезенки.

8СР - фактор стволовой клетки

ИФН - интерферон

ФИО - фактор некроза опухоли

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Формирование иммунного ответа сопровождаете: взаимодействием основных гомеостатических систем: иммунной, кроветворной нейроэндокринной. В последние годы опубликовано достаточное количество работ, которы< свидетельствуют о существовании механизмов взаимодействия иммунной, эндокринной i нервной системы (Абрамов В.В. 1988.; Абрамов В.В. 1991.; Абрамов В.В., и соавт., 2001. Девойно JI.B., Ильюченок Р.Ю. 1993.; Козлов В.А., и соавт. 1982.). Проблема изучена механизмов, принципов, закономерностей и значения для организма человек; взаимодействия иммунной, эндокринной и нервной систем является ключевой в биологии i медицине, имеющей как теоретическое, так и прикладное зачение. В настоящее врем: общеизвестны достижения в исследовании гормонального контроля иммунного ответ; (Корнева Е. А. и соавт. 1984.) и механизмов взаимодействия иммунной и гемопоэтическо! систем (Козлов В.А., и соавт. 1982.) поведенческих реакций, связанных i моноаминергическими системами и иммунных реакций. (Зозуля А.А., Пацакова Э. 1986. Идова Г.В., и соавт. 2000.; Трекова Н.А1999.; Девойно Л.В., Ильюченок Р.Ю. 1993.; Евсее! В.А ., и соавт., 2001.)

Несмотря на вышеизложенное, комплексные механизмы интеграции иммунной гемопоэтической и нейроэндокринной систем, особенно на молекулярно-биологическо» уровне, требуют дальнейшего изучения.

Так, формирование клона иммунокомпетентных клеток (ИКК) в процессе иммунноп ответа сопровождается процессами пролиферации и дифференцировки гемопоэтически; предшественников костного мозга. При иммунизации эритроцитами барана наряду с ИК1 активируется эригроидный росток. (Гайдуль К.В., 1986.; Цырлова И.Г. 1987.). Регуляци: пролиферации гемопоэтических предшественников и ИКК осуществляется одними и тем1 же цитокинами: ИЛ-1, ИЛ-4, ИФН-у, эритропоэтин (ЭП). Влияние цитокинов иммунно) системы на гемопоэтическую систему опосредуется как цитокинами, стимулирующи» эритропоэз : ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6, так и подавляющими эритропоэз цитокинами: ИЛ-1, ФНО-а ИФН-у, ( Ogawa М. 1993.).

Эти данные свидетельствуют о ключевой роли цитокинов в интеграции иммунной i гемопоэтической систем в процессе иммуногенеза. Хорошо известно о регуляторной рол1 нервной системы в регуляции иммунного ответа и лимфоидной системы в целом (Абрамо; В.В. 1988. ; Абрамов В.В. 1991.; Абрамов В.В., 2001.; Акмаев И.Г. 1996. Девойно Л.В. Ильюченок Р.Ю. 1993; Корнева Е. А. и соавт. 1984.; Husband А., 1995; Blalock J., 1994). I последние десятилетия интенсивно исследуются механизмы взаимодействия этих систем подтверждением этого взаимодействия является то, что строма и паренхима лимфоидньп органов имеет богатое представительство афферентных и эфферентных нервных окончаний При этом ИКК и нерцные окончания образуют своеобразные синапсы, активирующиеся npi изменении мембранного потенциала указанных клеток, а также при воздействии н мембрану нейронов цитокинов, продуцирующихся ИКК (Веселовский Н. С., Федулова С. А 1983.). Известно также, что активированные Т-лимфоциты и моноциты способны проникат через неповрежденный гематоэнцефалический барьер. Кроме того, ИКК способт продуцировать множество гуморальных факторов (интерлейкины, гормоны, нейропептидь интерфероны, гистамин), которые с током крови проникают в ЦНС (Crowe R.R., Noyes R 1987). В ответ на импульсы из иммунной системы изменяется продукция рилизинг-факторо в гипоталамусе, что, например, инициирует работу гипоталамо-гипофизарнс надпочечниковой оси. В свою очередь, нейромедиаторы симпатического (СО) парасимпатического отделов (ПО) вегетативной нервной системы (ВНС), а так» нейропептиды влияют на пролиферацию, дифференцировку ИКК и в целом иммунный отв< в организме. Указанное влияние имеет место, поскольку иммунные клетки hccj специфические рецепторы к нейромедиаторам СО и ПО ВНС. Например, на клети моноцитарно-макрофагального звена, Т- и В-лимфоцитах обнаружены а, р-адренорецептор!

i также H- и М-холинорецепторы (Abrass С.К., et al., 1985; Lutton J.D., et al., 1993.; Puren U.,et al., 1999. )

Изучение процессов межсистемных взаимодействий в основном сводится к изучению

>егуляторных—влияний — со— стороны_ЦНС___на иммунную___систему.^ Причем,

[ейроиммуномодуляция в настоящее время ограничивается в основном исследованием рункций гипоталамических центров в регуляции иммунного ответа и сравнительно мало гавестно о роли полушарий головного мозга в этих процессах. Немногочисленные работы (емонстрируют неодинаковое влияние противоположных полушарий головного мозга на функциональную активность иммунной системы (Neveu P.J., 1990; Renoux G., 1991). И еще <енее изучено влияние иммунной системы на ЦНС, причем воздействие иммунной системы ia асимметрию полушарий головного мозга остается практически не гаученным. 1родемонстрирована функциональная асимметрия дофаминергических систем ЦНС Delaplaque В. et al., 1993; Delrue С. et al., 1994), изменяющаяся при введении антигенов. )днако маловероятно, что только моноаминергические системы головного мозга [симметрично функционируют в процессе формирования иммунного ответа. В этой связи гредставляется перспективным изучение общих для нервной и иммунной систем шологически активных веществ - цитокинов, их распределение и роль в ЦНС при иммунном >твете.

Первоначально цитокины были охарактеризованы как факторы, секретируемые шмунокомпетентными клетками и предназначенные для регуляции функций внутри шмунной системы. (Dinarello С.А., 1994). В настоящее время имеется много свидетельств ■ого, что они оказывают физиологическое регулирующее действие в головном мозге и функционируют как мессенджеры взаимодействия иммунной и нервной систем. (Dantzer R_, :t al., 1999.; Jiang S., et al. 1994.; ). Выявлены изменения содержания ИЛ-1 и его рецепторов ) ЦНС при активации иммунной системы (Bodmer S. et al., 1985; Takao T. et al.,1994, 1995). {есмотря на довольно большое количество публикаций о роли ИЛ-1 в регуляции функций ДНС, по большей части исследования в них проведены на уровне белковых продуктов, а не ia уровне мРНК. До недавнего времени ничего не было известно об экспрессии гена ЭП-Р в -оловном мозге и роли самого ЭП в регуляции его функций, и лишь в последнее время юявились отдельные публикации о нейрорегуляторной, нейропротективной роли ЭП ( sakanaka M. et al.,1998).

Представленные выше данные свидетельствуют о том, что клетки иммунной, сроветворной и нервной систем экспрессируют гены обипгх медиаторов и рецепторов, 1ричем при различных внешних воздействиях (гемо- и иммунопоэзвозмущающих) возникает зтветная реакция всех этих тканей, которая опосредуется через одни и те же цитокины. Зместе с тем, изучение влияния различных факторов на функциональное состояние этих ;истем и экспрессию медиаторов, регулирующих их эффекторные реакции, происходит, как травило, отдельно, с игнорированием того факта, что на уровне организма в реализации зтвета на внешнее воздействие участвуют все указанные системы.

Отсутствие комплексных исследований по оценке влияния различных воздействий на жспрессию генов цитокинов и функциональные активности клеток кроветворной, шмунной и нервной тканей, не позволяет ответить на ряд важных вопросов: 1 ) изменяется |ш экспрессия генов одних и тех же медиаторов в лимфоидной, кроветворной и нервной канях при одинаковых внешних воздействиях; 2) сходен ли характер указанных изменений; ) имеется ли связь между изменениями экспрессии медиаторов с эффекторными функциями [ммунной, кроветворной и нервной систем. Ответы на эти вопросы помогут лучше понять, ущесгвует ли закономерная взаимозависимость экспрессии генов цитокинов в лимфоидной, емопоэтической и нервной системах, т.е. единая «цитокиновая сеть», регулирующая ункционирование на этом уровне.

Для того, чтобы ответить на эти вопросы, изучалась экспрессия гена ИЛ-1(5 и его ецептора 1-го типа (ИЛ-1-Р), а также гена рецептора эритропоэтина (ЭП-Р) на уровне мРНК

клетках лимфоидной, гемопоэтической и нервной тканей. Данный выбор не был

случайным. Так, ИЛ-1 - плейотропный цитокин, являющийся важным медиатором межклеточного взаимодействия кроветворной, иммунной и нервной систем, участвующий в регуляции их функций. Он обладает как местным, так и системным действием и претендует на роль универсального медиатора, с помощью которого может происходить интегрирование указанных систем при ответе на специфические стимулы.

Поскольку иммунный ответ является интегративным процессом, в котором задействованы клетки кроветворной ткани, в частности, эритроидного ростка, было интересно изучить влияние гемопоэтического фактора - эригропоэтина на формирование иммунного ответа. Кроме того, в последнее время появились немногочисленные пока данные о том, что ЭП секретируется клетками нервной системы (Cunningham Е.Т., et al. 1992.: Dantzer R., et al.,1999.; Jiang S., et al., 1994.; Juul S.E. et al., 2000.; Montgomery D.W., et al., 1987.). Следовательно, и этот медиатор также претендует на роль универсального медиатора иммунной, кроветворной и нервной систем.

Таким образом, необходимо сопоставить в одном исследовании - как изменения экспрессии генов ИЛ-ip, ИЛ-1-Р и ЭП-Р в лимфоидных органах и ЦНС связаны с функциональной активностью этих органов и систем.

В связи с вышеизложенным, целью исследования было выявление закономерностей и механизмов экспрессии генов цитокинов ИЛ-1 р, ИЛ-1-Р 1-го типа и ЭП-Р в лимфоидной, гемопоэтической и нервной тканях и взаимосвязи указанной экспрессии с эффекторными функциями клеток этих систем.

В рамках поставленной проблемы решались следующие задачи:

1.Определить характер экспрессии генов (ИЛ-lp, ИЛ-1-Р 1-го типа и ЭП-Р) в клетках селезенки в процессе иммунного ответа на ЭБ и после введения ЭП.

2, Исследовать экспрессию генов (ИЛ-lfi, ИЛ-1-Р 1-го типа, ЭП-Р) в клетках костного мозге и способность последних к формированию КОЕс-8 в процессе иммуногенеза и посл< введения ЭП.

3. Установить особенности экспрессии генов (ИЛ-ip, ИЛ-1-Р 1-го типа и ЭП-Р) в клеши головного мозга в процессе иммуногенеза и после введения ЭП, а также сопоставить их с характером поведенческих функций экспериментальных животных.

4,Выявить закономерности экспрессии генов (ИЛ-ip, ИЛ-1-Р 1-го типа и ЭП-Р) в клетка? селезенки, костного и головного мозга в процессе иммуногенеза и после введения ЭП ) мышей (CBAxC57Bl)Fl.

5.Исследовать уровень мРНК ИЛ-ip, ИЛ-1-Р 1-го типа и ЭП-Р в контралатеральны? полушариях головного мозга интактных животных (мышей), в процессе иммуногенеза v введения ЭП.

б.Определить кинетику экспрессии мРНК ИЛ-ip в полушариях головного мозга и органа? иммунной системы (селезенке) при периферическом введении Т-независимого антиген: (липополисахарида) и Т-зависимого антигена (эритроцитов барана).

7.Исследовать роль афферентных нервов в регуляции экспрессии гена ИЛ-ip в полушария? головного мозга и иммунной системе. Изучить роль просгагландинов на экспрессию мРШ ИЛ-ip в полушариях головного мозга и селезенке.

8.Исследовать влияние введения ИЛ-ip на экспрессию мРНК ИЛ-ip в полушария головного мозга и селезенке.

Основные результаты исследования и их новизна:

Научная новизна работы заключается в том, что впервые установлены закономерност экспрессии генов (ИЛ-ip, ИЛ-1-Р 1-го типа, ЭП-Р) в клеггкахиммунной, гемопоэтической нервной тканей в процессе иммунопоэз и гемопоэз возмущающих воздействий.

Показано, что увеличение количества антителообразующих клеток (АОК) после введения рекомбинантного ЭП сопровождается увеличением экспрессии генов (ИЛ-1-Р 1-го типа и ЭП-Р) в клетках селезенки.

Обнаружено, что увеличение колониеобразующей способности костного мозга, оцениваемой по формированию КОЕс-8 после введения ЭП, протекает на фоне стимуляции экспрессии мРНК ЭП-Р в клетках костного мозга.

Показано, что иммунизация ЭБ приводит к увеличению экспрессии указанных генов и не эказывает выраженного влияния на поведение мышей (СВАхС57В1)Р1, а после введения ЭП наблюдается значительное усиление двигательной активности на фоне подавления жспрессии генов (ИЛ-1(3, ИЛ-1-Р 1-го типа и ЭП-Р) в клетках головного мозга.

Впервые установлено, что экспрессия рецептора ЭП в клетках головного мозга изменяется в зависимости от возраста, а именно, указанная экспрессия достоверно выше у старых животных, чем у новорожденных и молодых.

Впервые установлено, что содержание мРНК ИЛ-1Р, ИЛ-1-Р 1-го типа и ЭП-Р в тротивоподожных полушариях головного мозга мышей неодинзково. Уровень экспрессии *РНК ИЛ-1Р, ИЛ-1-Р 1-го типа достоверно выше в правом полушарии, а уровень экспрессии аРНК ЭП-Р в левом полушарии головного мозга, что свидетельствует о существовании «шекулярно-биологической асимметрии мозга.

Впервые определено, что в ранний период формирования иммунного ответа на Т-(езависимый и Т-зависимый антигены происходит преобладание относительной активности фавого полушария головного мозга по параметру экспрессии мРНК гена интерлейкина-1р. 1оказано, что это явление обусловлено разными механизмами регуляции экспрессии гена 1нтерлейкина-1Р в правом и левом полушариях головного мозга, зависящими от типа кгигена, использованного для стимуляции иммунной системы.

Так, выявлены закономерности изменения экспрессии мРНК ИЛ-1Р в контр ал атеральных юлушариях головного мозга в процессе активации иммунной системы антигенами разных ипов - Т-независимым (липополисахарид) и Т-зависимым (эритроциты барана). 1родемонстрировано, что эти изменения в левом полушарии не зависят от типа [спользованного антигена и проявляются в виде снижения уровня мРНК этого цитокина в 1ммунной системе, тогда как в правом полушарии головного мозга экспрессия мРНК ИЛ-1р ювышается главным образом при введении Т-зависимого антигена при усилении экспрессии )РНК данного гена в иммунной системе.

Показано, что блокада периферических чувствительных нервных окончаний капсаицином [риводит к повышению уровня мРНК ИЛ-1р в правом полушарии головного мозга и елезенке, но не в левом полушарии мозга мышей.

Обнаружен разный характер влияния блокады синтеза простагландинов на экспрессию [РНК гена ИЛ-1Р в противоположных полушариях мозга. Продемонстрировано отсутствие лняния блокатора синтеза простагландинов - индометацина на экспрессию мРНК ИЛ-1(5 в евом полушарии головного мозга и стимулирующее действие его на уровень мРНК этого итокина в правом полушарии.

Выявлено, что цитокин интерлейкин -10 при периферическом введении оказывает гимулирующее влияние на уровень мРНК интерлейкина -1р. Показан эффект разных доз екомбинантного интерлейкина -1Р на асимметрию экспрессии мРНК гена интерлейкина -1Р полушариях головного мозга.

Теоретическая значимость и практическая ценность работы.

Теоретическая значимость работы заключается в определении закономеностей экспрессии знов (ИЛ-1р, ИЛ-1-Р 1-го типа и ЭП-Р) в органах лимфоидной, гемопоэтической и нервной 1стем в процессе иммуногенеза и после введения ЭП, свидетельствующих о существовании (иных механизмов регуляции эффекторных функций в этих тканях. Представленные 1нные имеют большое теоретическое значение, поскольку позволяют установить

существование принципиально нового явления - молекулярно-биологической асимметрии полушарий головного мозга, параметры которой зависят от активности иммунной системы. Так, показано наличие тесной взаимосвязи между состоянием иммунной системы и асимметричной экспрессией гена ИЛ-ip в левом и правом полушарии головного мозга. Полученные результаты значительно расширяют существующие представления о регуляции экспрессии генов цитокинов в центральной нервной системе, а также о процессах взаимодействия важнейших гомеостатических систем организма (нервной и иммунной гемопоэтической) в ходе антигенной стимуляции. Кроме того, работа расширяет представление о роли ЭП в модуляции иммунного ответа.

Практическая значимость работы заключается в обосновании необходимости учета изменения экспрессии одних и тех же генов и модуляции функций кроветворной и нервной систем в процессе иммунотерапевтических мероприятий, в частности при использовании иммунокоррегирующей цитокинотерапии. Выяснение конкретных биохимических маркеров функциональной активности контр алатералькых полушарий головного мозга при иммуногенезе и механизмов их взаимосвязи с иммунной системой может прояснить роль контралатеральных полушарий в нейроиммунорегуляции и послужить предпосылкой дом обоснованной иммунокоррекции посредством воздействия на иммунорегулягорнук функцию конкретных полушарий головного мозга.

Положения, выносимые на защиту.

1) Экспрессия изучаемых генов цитокинов связана с функциональными активностями те* тканей, в которых они экспрессируются.

2) Изменения экспрессии генов цитокинов зависят от характера возмущающего воздействия развитие иммунного ответа вызывает однонаправленные изменения экспрессии все> изучаемых генов в гемопоэтической, иммунной, нервной системах, а введение эритропоэтина приводит к изменению экспрессии генов цитокинов, имеющей своя особенности в гемопоэтической, иммунной и нервной системах.

3) Существует единая «цитокиновая сеть» общая для иммунной, гемопоэтической и нервно? систем.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1) International Workshop "Measurement! of cytokines and their receptors in the brain".- Amsterdam, (Netherlands), October 21-22.-1994. 2] CONGRES " Cytokines as communication factors between the immune system and the centra nervous system".- Arcachon, (France), September.-ll-13.-1995. 3) 3-й 5-й отчетной сессии ИКР СО РАМН (Новосибирск 1996г.,2000г.); 4) Семинаре лаборатории нейроиммунологш (Новосибирск 2001, ,2002); 5)Съезде РНОИ (1999г. Сочи.) 6) Конференции НИИ Мозп РАМН «Актуальные вопросы функциональной межполушарной асимметрии». Москва. 13-1^ декабря 2001г. 7) Семинаре ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск 2002). Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 публикаци, в том числе 14 статей i центральной печати.

Объем и структура работы.

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзор! литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Диссертация изложена на 24( страницах машинописного текста, иллюстрирована 26 рисунками и 5 таблицами. Списо) цитируемой литературы включает 500 источников из них 55 отечественных авторов. Работа выполнена в лаборатории нейроиммунологии ГУ НИИКИ СО РАМН Руководитсл лаборатории - доктор медицинских наук, профессор В.В.Абрамов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Экспериментальные животные.

В работе использовались мыши-самцы (CBAxC57Bl)Fl, средний вес животных составлял 1Î

20 грамм, возраст 3 месяца. Для экспериментов по определению экспрессии рецептора эритропоэтина у различных возрастных групп мышей использовались интактные животные линии BALB/c новорожденные, молодые двухмесячного возраста и старые - 1.8 года.

Животные были получены из питомника НИЛЭМ РАМН (Томск) . Животные содержались------

в клетках по 5-10 мышей без каких либо ограничений , в течение не менее двух недель до начала эксперимента на стандартной диете, при свободном доступе к воде и нормальном световом режиме. При планировании эксперимента для каждой группы «опыт» формировали группу контрольных животных. Количество животных в группе 5-6 штук. Все органы и ткани до выделения РНК хранились в жидком азоте. Экспериментальные воздействия.

1.Иммунизация взвесью эритроцитов барана. Эритроциты барана отмывали три раза пятью объемами среды199. Затем готовили 5% взвесь на среде 199 и вводили в хвостовую веку мыши в объеме 0,5 мл.

2.Иммуностимуляция липополисахаридом. Липополисахарвд В Е. coli Ol 1:В4 ("Difco") разводился до концентрации 20 мкг/мл в седе 199 и вводился однократно в объеме 0,5 мл. в хвостовую вену мыши.

3.Введение рекомбинантного эритропоэтина (Recormon, Boehringer Mannheim GmbH, Германия). Эритропоэтин вводили подкожно по 10 единиц 3 раза в неделю, общая доза препарата составила 30 единиц.

4.Интерлейкин-1р. Рекомбинантный интерлейкин-lß крысы, любезно предоставленный нам, Dr. R. Dantzer в рамках гранта "Intas", был разведен до концентраций 20, 200 и 2000 нг/мл в среде 199 и вводился однократно в объеме 0,5 мл в хвостовую вену мыши.

5.Индометацин. Для изучения влияния простагландинов на экспрессию мРНК ИЛ-lß в

полушариях головного мозга использовалась блокада синтеза простагландинов шщометацином. Индометацин ("Sigma") растворялся в этиловом спирте, с последующим разведением средой 199 до 5% спиртового раствора, содержащего 1 мг/мл препарата. Индометацин вводился по 0,25 мг/мышь внутрибрюшинно 3-кратно (Повещенко А.Ф., 1987) за 30, 8 и 6 часов перед исследованием. Контрольным животным вводилось эквивалентное количество 5% спиртового раствора.

6.Капсаицин. С целью определения роли периферических чувствительных нервных окончаний в регуляции иммунной системой экспрессии мРНК ИЛ-lß в головном мозге использовались временная блокада первичных афферентов капсаицином. Капсаицин ("Merk") растворялся в среде 199, содержащей 10% этанола и 2% твин-80 до концентрации 2,5 мг/мл. Капсаицин вводился подкожно по 0,1 мл раствора курсом из 4-х инъекций через каждые 12 часов. Общая доза капсаицина составляла 1 мг/мышь или 50 мг/кг веса животных (Hiura А. Et al., 1989). Контрольным животным проводилось введение курса растворителя. Исследование влияни^ препарата проводилось спустя 12 суток после 1-й инъекции (Hiura А. etal., 1989).

МЕТОДЫ.

Получение необходимого для работы количества ДНК зонда.

Плазмида pBS ("Stratagene"), содержащая в EcoRI сайте нуклеотидную последовательность гена ИЛ-lß мыши (275-1327 и.о.), была любезно предоставлена нам Dr. Т. Hamilton (Ohmori Y.et al., 1990). Переданная нам как стабильная культура в клетках Е. Coli пггама XL-1BL, она, таким образом, не нуждалась в трансформации. Для получения достаточного количества вставки гена ИЛ-lß мыши было необходимо выделить достаточно большое количество плазмиды, затем рестриктировать ее эндонуклеазой EcoRI и после этого отделить препаративным электрофорезом фрагмент гена ИЛ-lß мыши.

Выделение отдельной колонии (Маниатис Т. и соавт. 1984). На чашки Петри диаметром 9 см с 1,1 % бакгоагаром на среде Луриа-Бертани ("Sigma"), содержащим ампициллин в дозе 50 мкг/мл, как маркера селекции для плазмиды pBS, стерильной платиновой бакпетлей сеяли клетки из предоставленной нам культуры. Инкубировали при 37° С в течение ночи. Для дальнейшей работы брали отдельно взятую колонию, в стерильную пробирку на 50мл

наливали Змл стерильной среды ЬВ с добавлением 50мкг/мл ампициллина, оставляли на ночь при 37° С. После этого из «ночной культуры» выделяли плазмидную ДНК. , содержащую вставку ИЛ-1р. Колония, содержащая плазмиду со вставкой ИЛ-1Р, использовалась для препаративного выделения.

Препаративный посев (Маниатис Т.и соавт. 1984). 500 мл среды Луриа-Бертани наливали в колбу объемом 2 литра, добавляли 25 мг ампициллина и 500 мкп. культуры клеток, выросших из одной колонии, содержащей вставку гена ИЛ-1Р мыши, помещали на ночь при 37° С.

Получение ДНК плазмиды. Для выделения ДНК плазмиды из отдельной колонии использовали микромодификацию метода щелочной экстракции по Бирнбоу - Доли (Харди К.Дж. 1989). Осаждали 1,5 мл ночной культуры бактерий в микроцентрифуге 1 мин. При 14000 & надосадок отбрасывали, а осадок ресуспендировали в 100 мкл. Раствора I (50мМ глюкоза, 1 ОмМ ЭДТА, 25 мМ трис -НС1, рН 8,0) с добавлением лизоцима (2мг/мл). После 15 мин. инкубации на льду добавлялось 200 мкл. раствора II (1% додецил-сульфат натрия, 0,2М ЫаОН) содержимое пробирки перемешивали и оставляли на льду на 5 мин. После добавления 150 мкл ЗМ ацетата натрия, рН 4,8 (раствор Ш), проба инкубировалась на льду в течение 30 мин и затем центрифугировалась в микроцентрифуге 5 мин. 14000 g. К супернатанту, перенесенному в чистую пробирку, добавляли 1 мл этанола для осаждения нуклеиновых кислот в микроцентрифуге при 14000 g 5 мин. К осадку добавляли 1 мл. 80% (объем/объем) этанола для обессоливания, и проба вновь центрифугировалась в микроцентрифуге при 14000 g 5 мин. Осадок подсушивался в эксикаторе под вакуумом и растворялся в 100 мкл ТЕ-буфера (ЮмМ трис-НСЬ, рН 8,0, 1мМЭДТА). При такой процедуре выделения в пробе содержалось достаточное для рестрикции количество плазмидной ДНК, незначительные примеси низкомолекулярной РНК.

Препаративное выделение ДНК. В этом случае использовалась аналогичная процедура выделения с соответствующими большому объему пробы изменениями. Для лучшего разделения плазмиды и низкомолекулярной РНК при гель-хроматографии проб« обрабатывалась РНК-азой А, свободной от примесей ДНКаз (Харди К.Дж. 1989). С этот целью навеску сухой РНК азы А 1 мг. растворяли в 1 мл. стерильной дистиллированной водь: и кипятили в течение 10 мин. на водяной бане (Маниатис Т. и соавт. 1984). Пробу, содержащую плазмиду и примеси РНК, также подвергали нагреванию при 65°С в течение 15 мин для инактивации возможных примесей ДНКаз, охлаждали до комнатной температуры I добавляли МзС12 и РНК азу А до концентрации 10 мМ и 1мкг/мл соответственно. Поел« гидролиза в течение 30 мин. РНКазу А удаляли путем экстракции равным объемом смео фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (49:49:1), добавляли 0,1 объем ЗМ ацетата натрия, рЬ 4,8 и 2 объема этанола для преципитации ДНК , инкубировали при -20°С в течение 16 часов Затем пробу центрифугировали 12000 об/мин на центрифуге К-24 пори 4°С. Осадо) промывали 80% этанолом, подсушивали в вакуумном эксикаторе и растворяли в 0,5 мл ТЕ буфера.

Гель-хроматография на колонке с сефарозой 4В. (Остерман Л.А. 1985) Обработаннук РНК-азой А пробу подвергали дальнейшей очистке от примесей РНК путем хроматографш на сефарозе 4В с детекцией пиков на проточной ячейке спектрофотометра ШасЫ-320 установленного на длину волны 260 нм. Фракции первого пика, содержащие плазмид) объединяли. ДНК после преципитации с 0,1 объемом ацетата натрия и 2 объемами этанола 20°С в течение 16 часов, осаждали в центрифуге К-24 (12000 об/мин , 15 мин, 4°С промывали 80% этанолом и растворяли в 0,5 мл ТЕ-буфера. Количество выделяемой ДНК наличие белковых примесей определяли спектрофотометр ически по соотношени) поглощения при длине волн 260 и 280 нм : 1 о.е. при длине волны 260 нм соответствует 5 мкг/мл ДНК (Маниатис Т. и соавт., 1984).

Выделение вставки гена ИЛ-1Р из плазмиды. С целью максимальной точности чувствительности гибридизационного анализа мы использовали в качестве зонда толы вставку генаШИР мыши выделенную из ИЛ-1Р-содержащей плазмиды рВБ. Для выделен!

(НК ИЛ-ip, 100 мкг плазмиды гидролизовали с эндонуклеазой рестрикции EcoRI кСибэнзим») в прилагаемом к рестриктазе буфере в общем объеме 200мкл. Контроль олноты рестрикции проводился при помощи электрофореза на 1% агарозе ("Serva") в трис-цетатном буфере, как описано Маниатис Т.и соавт (1984). По окончании электрофореза ель~окрашйвали бромистым этидием 1 мкг/мл 1 час и фотографировали в ультрафио;1ете. [олностью рестриктированиая проба ДНК подвергалась препаративному разделению на 1% гарозном геле в трис-ацетатном буфере, содержащем бромистый этиднй (1 мкг/мл ) что озволяло визуально контролировать степень и полноту разделения. По окончании пектрофореза, полоса, содержащая, ДНК- вставку ИЛ-ip, вырезалась и ДНК элюировалась з геля на диализную мембрану в аппарате электроэлюции. Полнота элюции онтролировалась визуально по исчезновению флуоресценции окрашенной бромистым гидием ДНК в геле, а также последующим фотографированием геля в ультрафиолетовом свещении. ДНК с диализной мембраны снимали пипетированием в объеме 250 мкл и саждали этанолом. Эффективность и чистоту выделения контролировали электрофорезом а 1% агарозе п трис-ацетатном буферном растворе, а также спектрофотаметрически. '.олученный таким способом кДНК-фрагмент гена ИЛ-1 (i мыши был использован в качестве энда для определения мРНК ИЛ-lp в пробах суммарной РНК селезенки и головного мозга ышей.

Введение радиоактивной метки в зонд. (Салганик Р.И. 1990).

Для введения радиоактивной метки в зонд мы применяли синтез на матрице ИЛ-1(3 эмплементарных последовательностей с использованием метода олигонуклеотидной правки. (Салганик Р.И. 1990). Для меченья 1 мкг ДНК-фрагмента ИЛ-1Р использовалось Э МБ к а-32Р дЦТФ (5000 Кю/мМ, НПО «Биосан»), что позволило нам применять ысокоспецифические зонды с удельной активностью свыше 1х10' имп/мин/мкг

Качество зонда проверяли с помощью электрофореза ДНК зонда в трис-ацетатном уферном растворе. В работе не использовали зонды, имеющие малую размерность

Выделение суммарной РНК. Суммарную РНК выделяли из клеток головного мозга, ;лезенки и костного мозга по методу (Chomczynsy P., Sacchi N. 1987). Спектрофотометрические характеристики препаратов РНК определяли на лекгрофотометре "Hitachi-320" при 260 нм и 280 нм, что позволило судить о чистоте репаратов и о количестве РНК: 1 о.е. при 260 нм соответствует 40 мкг/мл (Маниатис Т.и завт.,1984)

Электрофорез РНК, денатурированной формальдегидом. Для качественного определения удержания мРНК ИЛ-ip и отработки оптимальных условии гибридизации использовался етод блот-гибридизации, первым этапом которого является разделение РНК по олекулярной массе. Для этого мы использовали электрофорез РНК в гелях, содержащих ормальдегид. Перенос РНК на нитроцеллюлозные фильтры производился, как описано Маниатис Т. и соавт. 1984) в течение 16 часов. Буфером при переносе служил 20-кратный SC. После переноса фильтры высушивали в вакууме при 80°С в течение 2 часов и хранили з гибридизации.

Нанесение РНК на нитроцеллюлозу для дот-гибридизации. При проведении дот-{бридизации использовались одинаковые количества суммарной РНК, денатурированные эи 65°С в 7,4% параформальдегиде и 6-кратном SSC (Chianale J et al., 1988). После Ьнатурации пробы помещались в лед и для нанесения разводились 20-кратным SSC до 1нцентрации последнего 15-х. Лунки аппарата для дот-гибридизации и нитроцеллюлоза юмывались также 15-кратным SSC. Пробы наносились в равных объемах и концентрациях, нцентрация РНК в первой пробе составляла 20 мкг, с последующими 2-кратными зведениями. После нанесения проб, лунки аппарата дважды промывались 15-кратным SSC. процеллюлоза с нанесенными пробами вынималась из аппарата, высушивалась на воздухе фокаливалась в вакууме при 80°С в течение 2 часов.

Предгибридизация. (Chianale J. Et al.,1988) Перед предгибридизацией фильтр вымачивали 5xSSC 5 минут. Раствор для предгибридизации (50% формамид "Fluca", 5х SSC, 50мМ

фосфат натрия рН 6,5, 0,5% SDS, 5х раствор Денхардта, ДНК лосося ЮОмкг/ии денатурированная кипячением). Предгибридизацию проводили в течение 10-12 часов пр температуре 42°С под пленкой Saran Wrap.

Гибридизация. Меченый зонд денатурировали кипячением и быстро охлаждали во льд; Зонд вносили в раствор для предгибридизации, тщательно перемешивали и оставляли на 3 часов при температуре 42°С. Для уменьшения поверхности соприкосновения с воздухо; реакционную смесь также закрывали пленкой Saran Wrap. После гибридизации фильтр] отмывали последовательно 4 раза по 15 минут в 2х SSC - 0,1% SDS при комнатно температуре. Результаты гибридизации выявляли радиоавтографией на рекггеновско пленке РМ-1 с усиливающим экраном ЭУ-И1 при -20°С в течение 3-15 суток. Пробна экспозиция 2 суток.

При обработке данных, полученных методом количественной дот-гибридизацш учитывали оптическую плотность полученных радиоавтографов на лазерном денситометр "Ultroscan-XL" ("LKB") с учетом фона и внутренних стандартов на каждом из фильтров. 1 качестве негативного контроля гибридизации использовалась РНК дрожжей ("Calbiochem" а позитивным стандартом являлась контрольная селезеночная суммарная РНК первой сери каждого эксперимента. Поскольку РНК на фильтры наносилась в убывающи концентрациях, результаты денситометрии пересчитывались для концентрации РНК 20 мю при помощи определения коэффициента линейной регрессии (Ь) в компьютерно статистической программе Statistical Graphic System. После этого производилось вычитан« фона и сравнение положительных внутренних стандартов, на основании которых вычисляло коэффициент пересчета для разных серий каждого эксперимента. Результат] количественной гибридизации выражались в условных единицах оптической плотност (У.Е.). Количество выделенной суммарной РНК в исследуемых органах (определенной н спектрофотометре) выражались в оптических единицах плотности (ОЕ). Достоверность сравниваемых группах оценивали методом непараметрического сравнения рядов п Вилкоксону-Манну-Уитни. Коэффициент межполушарной асимметрии (КА) вычислялся ка (А+В/А-В) к 100% (Л.В.Бианки, 1989). Всего было проведено по 3-4 независимых сери каждого эксперимента с общим количеством наблюдений, равным 6-8 значениям. Дл анализа данных использовали также корреляционный анализ с использованием програм: статобработки Statistical Graphic System.

Оптимизация метода количественной дот-гибридизации.

Несмотря на имеющиеся в литературе сведения о методе количественной дол гибридизации (Chianale J. Et al., 1988), сообщений о применении данного метода для анализ экспрессии мРНК гена ИЛ-ip нет. С другой стороны, имевшийся в нашем распоряжени фрагмент кДНК ИЛ-lp мыши ранее не применялся без векторной последовательности дл определения содержания мРНК гена ИЛ-ip, а также для количественного анализа. Эт послужило причиной для выяснения пригодности данного фрагмента кДНК ИЛ-ip мыши дл детекции специфической мРНК и ее количественного анализа. Специфичность процедур: гибридизации фрагмента гена ИЛ-ip мыши, меченного методом статистической затравки, соответствующей мРНК HJI-ip, была определена при помощи блот-гибридизации про суммарной РНК привлеченных крахмалом мышиных перкгонеальных макрофагов радиоактивно-меченным фрагментом гена ИЛ-ip, использованным в качестве зонда. Пр этом обнаруживалась только мРНК с длиной около 1400 нуклеотидных оснований (и.о. присутствовавшая как в пробах суммарной РНК стимулированных ЛПС макрофагах, так и пробах суммарной РНК нестимулированных ЛПС макрофагов. Также выявлялось, 4i стимуляция ЛПС в течение 6 часов значительно усиливает экспрессию данной мРНК, ч" соответствует общепринятым представлениям об индукции мРНК ИЛ-ip макрофагами ш действием ЛПС. Таким образом, данный зонд (фрагмент кДНК мышиного ИЛ-ip), меченнь методом статистической затравки, гибридизуется только с мРНК длиной около 14i нуклеотидных оснований, которая индуцируется в макрофагах мышей под действием ЛП Это позволяет заключить, что данная мРНК является специфической мРНК ИЛ-ip.

Радиоавтографы дот-гибридизации были подвергнуты денситометрическому анализу эпределения оптической плотности на лазерном денситометре Ultroscan-XL (LKB) по программе Gelscan (LKB). Результаты денситометрии свидетельствуют о линейности

анализа. Для дальнейшей обработки данных результаты денситометрии были переведены в_________

этносительные величины путем определения соотношения единиц оптической плотности 'ОП) каждой пробы к микрограммам (мкг) суммарной РНК в пробе : ОП/мкг (условные гдиницы - УЕ). Этим показателем , отражающим содержание специфической мРНК в пробе,

пользовались в дальнейшем для определения достоверности различий между пробами и юстроения графических изображений.

Исследовано относительное содержание мРНК ИЛ-ip в стимулированных ЛПС и яестимулированных макрофагах. Уровень мРНК ИЛ-ip в стимулированных макрофагах (231 t 11,8) значительно превышает содержание мРНК ИЛ-lp в макрофагах, не подвергнутых ггимуляции ЛПС (70,9 ± 0,74 , р < 0,05 ). Эти результаты полностью подтверждаются определением ИЛ-1-подобной биологической активности супернатантов среды от лтшулированных и нестимулированных ЛПС макрофагов. Так и при определении уровня мРНК ИЛ-1 р, ИЛ-1- подобная активность значительно выше в пробах от макрофагов, эмулированных ЛПС (2,34 против 1,64).

Таким образом, фрагмент кДНК ИЛ-ip мыши, меченный методом статистической ютравки, пригоден для выявления мРНК ИЛ-ip у мышей как методом блот-гибридизации, гак и количественной дот-гибридизацией.

Реакция обратной транскрипции (РТ1.

Суммарную РНК выделяли по ранее описанному методу (Chomczynsy P., Sacchi N. 1987). Качество и полимерность выделенной РНК оценивали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле (Sigma), приготовленном на Трис-боратном буферном растворе. Спектральные характеристики РНК определяли на спектрофотометре (Hitachi-320, Япония). 2 мкг суммарной РНК «отжигали» со 100 нг oligo(dt)12-!6 при 65°С 15 мин, охлаждали до комнатной температуры и хранили до реахшш на льду. Реакционная смесь для проведения мнтеза кДНК по РНК-матрице в 20 мкл содержала 2 мкг сумарнон РНК, 100 нг oligo(dt)12-16, 20 мМ МпС12> 50мМ DTT, 20 мМ трис-HCl (рН 8,3), ЮОмМ КС1, 500микроМ каждого iNTP, 1 ед РНКазина., 15ед. фермента обратной транскриптазы M-MuLV (Promega, USA). Реакцию проводили в течение 1,5 часов при 37° С. Фермент обратную транскриптазу ««активировали в конце реакции нагреванием 95° С 5 минут.

Полнмеразкая цепная реакция (ПЦР).

Праймеры к рецептору эртропоэтина и рецептору ИЛ-1 1-го типа (Gui-Quan J. ; Gutierrez-Ramos J.C. 1995.), ИЛ-ip, и Р-актину соответственно (Allen R.D., et al., 1993.) для полимеразной цепной реакции (ПЦР) были синтезированы согласно структуре описанной вышеуказанными авторами. Р-актин использовался в качестве внутреннего контроля для ггандартизации и выравнивания результатов полуколичественного анализа исследуемых образцов ДНК. Общий объем реакционной смеси полимеразной цепной реакции (ПЦР) :оставлял 20 мкл, на нее сверху наслаивали 20 мкл минерального масла (Sigma, USA). Реакционная смесь содержала 2 мкл смеси после обратной транскрипции. Концентрации лраймеров были по 2,5 мкМ каждого, концентрация dNTP 250 мкМ. Реакционный буфер содержал 67мМ трис-HCl (рН 8,3 при 25°С), 2мМ MgCb, ЮмМ 2-меркаптоэтанола, 16бмМ [NHOjSO*. Режим термоциклирования состоял в целом из 30 циклов: 1 цикл - денатурация: 1 минута 95°С, отжиг 2 минуты 58°С. Затем вносили под масло 1 ед. Taq-pol. (Promega, USA) и проводили реакцию амплификации: 1 мин. 95°С, 2 мин 58°С, 3 мин 72°С. Последний цикл составлял: 1 мин 95°С, 2 мин 58°С, 9 мин 72°С. Продукты амплифицирования анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле (Sigma, USA), приготовленном на Трис-боратном буферном растворе. В качестве маркера молекулярного веса использовали Msp I гидролизат плазмиды Рис18. После проведения электрофореза гель

окрашивали водным раствором бромистого этидия (0,5 мкг\мл). Продукты ПЩ визуализировали в ультрафиолете в денситометре фирмы (Pharmacia-LKB), дш полуколичественной оценки использовали программу ImageMaster VDS Software USA Результаты полуколичественной ПЦР выражались в условных (относительных) единица? оптической плотности.

Гистологическое исследование полушарий головного мозга.

Большие полушария головного мозга фиксировали в 10% нейтральном формалине заключали в парафин. Срезы толщиной 5-8 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Е тестовом поле (у одного животного исследовали 10 тестовьрс полей) определяли 1)количество клеток микроглии и 2) суммарное количество клеток макроглин и нейронов. Определение количества антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей. Количество антителообразующих клеток в селезенке экспериментальных животны? (CBAxC57Bl)Fl оценивали по числу зон гемолиза в полужидкой среде на 4-е сутки посл< иммунизации животных ЭБ методом Cunningham ( Cunningham A.J. 1965.). Число КОЕс в костном мозге и селезенке.

Число КОЕс в костном мозге и селезенке животных исследовали методом экзогенной колониеобразования в селезенках летально облученных сингенных реципиентов (Till J.E. McCulloch Е.А. 1961).

Изучение поведения животных в тесте " открытое поле".

Ориентировочно-исследовательское поведение, суммарную двигательную активности животных оценивали в тесте «открытое поле» (Буреш Я., и соавт., 1991). Для этогс использовалась большая прямоугольная камера (100 х 100 см) с пластмассовыми стенкам* высотой 40 см. Полом служил лист белого пластика, на который черной краской нанесен! решётка, делящая поле на 100 (10 х 10 ) равных квадратов. Освещение проводило« бестеневой лампой мощностью 100 Вт, расположенной на высоте 100 см над центром поля Животное помещалось в угол камеры и регистрировалась его двигательная активность i течение 5 мин. Число посещений 64 периферийных и 36 центральных квадратен регистрировалось отдельно с интервалом в 1 минуту. С 9 часов утра (начало эксперимента) i «открытом поле» регистрировали суммарные показатели горизонтальной и вертикально? двигательной активности для каждого животного в течение 5 минут.

Статистическая обработка результатов.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерш Стьюдента при нормальном распределении изучаемого признака и непараметрическогс метода с использованием парного критерия Манна-Уитни (компьютерные программь «Jandel Sigma Plot», «Statistica»). Различия считали достоверными при р< 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Влияние иммунизации и эрнтропоэтина на экспрессию мРНК цитокинов (ИЛ-lß. рецегтгоро! ИЛ-1 и ЭГП и гуморальный иммунный ответ в селезенке у мышей (CBAxC57Bl)Fl.

Одной из задач данной работы было изучение зависимости гуморального иммунного ответа от изменений экспрессии мРНК интерлейкина-Iß (ИЛ-lß), ИЛ-1-рецептора (ИЛ-1-Р) и рецептора эритропоэтина (ЭП-Р) в селезенке после иммунизации эритроцитами барана (ЭБ) и введения экзогенного эритропоэтина у мышей (CBAxC57BL)Fl.

Так на первом этапе исследования уровня экспрессии генов (ИЛ-lß, рецепторов ИЛ-1 v ЭП) в клетках селезенки мышей (CBAxC57Bl)Fl в процессе иммунного ответа и поел« введения эритропоэтина, изучали экспрессию мРНК указанных цитокинов в спленоцита> интактных животных. Литературные данные по этому вопросу неоднозначны. Согласш данным (Kita М., 1994.; Berleth ES., et al., 1999.) в спленоцитах интактных мыше( определяется мРНК ИЛ-lß. Однако, другими авторами (Puren A.J., et al., 1999.) экспресс» указанного цитокина в селезенке интактных животных показана не была. В наши исследованиях было установлено наличие в интактных спленоцитах мышей (CBAxC57Bl)F

rtPHK ИЛ-ip и рецепторов ИЛ-1-Р 1-го типа и ЭП-Р (рис. 1). Далее изучалось изменение депрессии генов указанных цитокинов в спленоцитах мышей в процессе иммуногенеза (ЭБ) j при введении рекомбинантяого ЭП. Экспрессия мРНК цитокинов тестировалась через 24 taca после иммунизации, т.к. в эти сроки по данным предварительных экспериментов иблюдается максимальная экспрессия мРНК ИЛ-Ки-его рецептора" в клетках селезенки, вровень мРНК рецептора ЭП также определялся через 24 часа, так как в предварительных (сследования:: нами было показано, что экспрессия его определяется уже через 3, 6, 12 и 24 iaca после введения ЭП, причем 24 часа спустя уровень экспрессии гена был максимальный. Как видно из рисунка (Рис.1) формирование гуморального иммунного ответа к ЭБ у мышей CBAxC57Bl)Fl сопровождается усилением экспрессии указанных генов (ИЛ-13, ИЛ-1->ецегггора и ЭП-Р) в селезенке, через 24 часа после иммунизации. Так, в наибольшей степени [роисходит усиление экспрессии мРНК ИЛ-ip и в меньшей степени - экспрессии мРНК ИЛ--Р.

Кроме того, установлено, что введение экзогенного эритропоэтина достоверно увеличивало кспрессию ИЛ-1-Р и ЭП-Р в селезенке и в то же время не оказывало достоверного влияния га экспрессию мРНК ИЛ-ip в спленоцитах.

•ис.1. Экспрессия мРНК ИЛ-1Р, ИЛ-1-Р, ЭП-Р в селезенке СВАхС57В1)Р1 мышей после [ммунизации ЭБ, после введения ЭП (в дозе ЗОед , суммарно).

вровень экспрессии мРНК ИЛ-1Р (А), ИЛ-1-Р (Б), ЭП-Р (В) в селезенке (СВАхС57В1)Р1: -интактных мышей, 2-после иммунизации ЭБ, 3- после введения ЭП . 1о оси ординат условные единицы оптической плотности.

1редставлены результаты 5 серий экспериментов, число животных в одном опыте ( п ) 25-30. - р < 0.05 Достоверность различий с соответствующей контрольной группой.

1ами показано, что введение эритропоэтина приводит к увеличению количества АОК в елезенке. Установлено, что иммунизация экспериментальных животных эритроцитами арана сопровождается достоверным возрастанием экспрессии мРНК ИЛ-1Р в клетках елезенки, увеличивая ее примерно в 1,5 раза по сравнению с контролем (рис.2). Введение >П не оказывает достоверного влияния на экспрессию ИЛ-1Р в спленоцитах, детектируемую ерез 24 часа. Эти данные согласуются с данными другой работы А., « а1., 1998.),

которой показано, что введение ЭП не влияегг на уровень ИЛ-1а в плазме крови, [то касается уровня мРНК рецептара ИЛ-1 1-го типа, то иммунизация Т-зависимым нтигеном (ЭБ) приводит к стимуляции экспрессии указанною гена (на 22%) в клетках елезенки по сравнению с интактными животными (рис.1). В то же время, в работе (Бассаш ., е* а1., 1998.) продемонстрировано, что стимуляция макрофагов селезенки с помощью Т-езависимого антигена (ЛПС) приводит к усилению экспрессии мРНК ИЛ-1-Р. По нашим

данным, введение ЭП (по 10 ед. 3 раза через день) увеличивает экспрессию рецептора ИЛ-1 1-го типа по сравнению с шггактными животными на 44% и по сравнению с иммунизированными животными - на 18,6% (рис. 1).

При изучении влияния иммунизации на уровень мРНК рецептора ЭП в клетках селезенки установлено достоверное увеличение экспрессии по сравнению с контролем (рис.1). Введение ЭП также стимулирует указанную экспрессию: относительно контроля экспрессия увеличивается на 18,5%, однако ниже, чем у иммунизированных мышей на 6,8% (рис.1). Следовательно, было установлено, что иммунизация животных приводит к увеличению экспрессии ИЛ-1 и его рецептора, а также рецептора к ЭП в селезенке мышей (CBAxC57Bl)Fl. Введение же ЭП достоверно увеличивало экспрессию рецепторов ИЛ-1-Р и ЭП-Р в этом лимфоидном органе.

Известно, что ИЛ-1 участвует в регуляции иммунного ответа, воздействуя на пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов, связываясь со специфическими рецепторами на их поверхности (Mitsuzumi Н., et al., 1998.; Lipsky Р.Е. 1985.), а эритропоэтин может как стимулировать, так и подавлять гуморальный иммунный ответ (Журавкия И.Н., и соает., 1978.; Козлов В.А., и соавт., 1982. ; Kimata Н., et al., 1991. ; Kimbal P.M., Кеппап R.H. 1991.). В связи с этим, поскольку в наших экспериментах иммунизация приводит к увеличению экспрессии мРНК рецептора эритропоэтина, а введение эрнтропоэтина стимулирует экспрессию гена рецептора к ИЛ-1, возникла необходимость изучить, как эти воздействия отразятся на функциональной активности спленоцитов, в частности, на величине гуморального иммунного ответа.

Установлено, что введение ЭП мышам до иммунизации ЭБ приводит к достоверному (более чем в 2 раза) увеличению как абсолютного, так и относительного количества аятителообразующих клеток в селезенке (рис.2).

1 2

Рис.2. Влияние трехкратного введения эритропоэтина (30 ед./мышь суммарно) на

гуморальный иммунный ответ в селезенках мышей (СВАхС57В1)Р1.

1.Контрольные мыши (ЭБ). 2.Число АОК у мышей после введения ЭП.

По оси ординат число АОК на 10бядросодержащих клеток селезенки.

Представлены результаты 4 серий экспериментов, число животных в одном эксперименте (п)

8-10. * - р < 0.05 Достоверность различий с соответствующей контрольной группой.

Таким образом, иммунизация мышей (СВАхС57В1)Р1 и введение им ЭП изменяет экспрессию генов ИЛ-1р, ИЛ-1-Р 1-го типа и ЭП-Р в селезенке, а также способность спленоцитов к формированию гуморального иммунного ответа, регуляция которого опосредуется этими медиаторами. Формирование иммунного ответа к ЭБ сопровождает« возрастанием экспрессии генов цитокинов ИЛ-1(5, ИЛ-1-Р и ЭП-Р в селезенке. Введение ЭГ сопровождается возрастанием экспрессии генов цитокинов ИЛ-1-Р и ЭП-Р в сеяезенк< экспериментальных животных, что, возможно, связано с механизмом его стимулирующеп действия на гуморальный иммунный ответ. Введение эритропоэтина приводит к увеличени» экспресии мРНК ИЛ-1-Р и ЭП-Р и к стимуляции гуморального иммунного ответа.

Эффект введения ЭБ и ЭП на экспрессию мРНК цитокинов (ИЛ-1 р. рецепторов ИЛ-1 1-го типа и рецептора ЭГГ) в костном мозге и колониеобразующую активность костномозговых

клеток у мышей (CBAxC57Bl)Fl. __________________________________

В рамках этой задачи проводилось изучение особенностей экспрессии генов цитокинов (ИЛ-lp, рецептора 1-го типа ИЛ-1 и ЭП-Р) в клетках костного мозга и их способности к формированию КОЕс-8 в процессе иммуногенеза и после введения ЭП.

Было установлено, что мРНК указанных цитокинов экспрессируется в клетках костного мозга интактных животных, иммунизация ЭБ стимулирует экспрессию мРНК рецептора ИЛ-1 1-го типа в костном мозге на 30 %. (рис.3). Введение же ЭП не оказало достоверного влияния на экспрессию мРНК ИЛ-1-Р через 24 часа (рис.3). Установлено, что экспрессия мРНК рецептора ЭП в клетках костного мозга мышей, иммунизированных ЭБ, увеличивалась на 36 % (рис.3). Введение ЭП (10 ед 3 раза) достоверно стимулирует экспрессию гена ЭП-Р, но не оказывает достоверного влияния на экспрессию генов ИЛ-ip и ИЛ-1-Р. Исследование экспрессии гена рецептора ЭП в ответ на введение ЭП показало увеличение данного параметра на 48% по сравнению с ингактными, и было на 8% выше по сравнению с иммунизированными животными.

Введение эритропоэтина в той же дозе приводит к стимуляции колониеобразования в костном мозге, оцениваемого по экзогенным КОЕс-8 (8-суточным экзогенным колониям). По данным литературы большая часть экзогенных костномозговых колоний представлена эритроидными предшественниками. Так, 42% макроскопических колоний составляют эритроидные, 21% - гранулоидные и остальная часть смешанные (Curry J.L., 1967). Следовательно, гены ИЛ-ip, рецепторов ИЛ-1 и ЭП экспрессируются в клетках костного мозга интактных мышей (CBAxC57Bl)Fl. Иммунизация ЭБ стимулирует экспрессию всех указанных генов, а введение ЭП увеличивает экспрессию мРНК ЭП-Р, но при этом не обнаружено изменений в экспрессии генов ИЛ-ip и его рецептора.

При изучении гемопоэтнческой функции костного мозга после введения экзогенного ЭП было обнаружено увеличение количества 8-суточных селезеночных колоний (КОЕс-8) на 83% (рис.4). Из литературы известно, что ЭП способен стимулировать образование эритроидных колоний (Stephenson J R., et al., 1971.). Учитывая это, можно предположить, что обнаруженное нами увеличение количества КОЕс-8 после введения ЭП происходит именно за счет стимуляции эрщропоэза. Нужно отметить, что усиление колониеобразуюшей активности клеток костного мозга после указанного воздействия сопровождается усилением экспрессии гена ЭП-Р, что также подтверждает предполагаемый механизм действия ЭП на колониеобразующую активность костномозговых клеток.

Таким образом показано, что мРЖ ЭП-Р, ИЛ-1р, ИЛ-1-Р экспрессируются в клетках костного мозга интактных мышей (CBAxC57Bl)Fl. (рис.3.) Введение экзогенного рекомбинантного ЭП приводит к стимуляции экспрессии мРНК ЭП-Р в указанных клетках

Рис.3. Экспрессия генов ИЛ-1р, ИЛ-1-Р , ЭП-Р в костном мозге мышей (СВАхС57В1)Р1. Уровень экспрессии мРНК ИЛ-10 (А), ИЛ-1-Р (Б), ЭП-Р (В) в костном мозге (СВАхС57В1)Б1 1-интактных мышей, 2-после иммунизации ЭБ ,3-после введения ЭП (в дозе ЗОед. суммарно.) По оси ординат условные единицы оптической плотности.

Представлены результаты 5 серий экспериментов, число животных в одном опыте ( п ) 25-30. *- р < 0.05 Достоверность различий с соответствующей контрольной группой.

(р<0,05), и в то же время, не влияегг на уровень мРНК ИЛ-\р ИЛ-1(}-Р в костном мозге указанных животных.(р>0,05).

Кроме того, показано, что введение эритропоэтина в той же дозе приводит к достоверной стимуляции колониеобразования в костном мозге оцениваемого по 8-сугочным экзогенным колониям. (р<0,05)(рис.4.).

Рис.4. Влияние введения эритропоэтина (по Юед./мышь 3 раза) на число КОЕс-8 в костном мозге мышей (CBAxC57Bl)Fl.

1 .Количество КОЕс-8 в костном мозге интактных мышей. 2.Количесгво КОЕс-8 в костном мозге мышей после введения ЭП. По оси ординат - количество КОЕс-8.

Представлены результаты 3 серий экспериментов, число животных в одном эксперименте (п) 8-10. * - р < 0.05 Достоверность различий с соответствующей контрольной группой.

Известно, что гемопоэтические ростовые факторы, регулирующие продукцию функционально зрелых клеток крови, условно подразделяют на "позднодействующие" линиеспецифические факторы, такие как ЭП или М-КСФ, Г-КСФ, ИЛ-5 (которые являются специфическими для определенной линии гемопоэза) и "раннедействующие," такие как SCF, ИЛ-1, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-6 - стимулирующие ранние, некоммитированные клетки предшественники и не являются линиеспецифическими.(0£а\¥а М. 1993.). Так ИЛ-1 по мнению одних авторов вызывает усиление пролиферации полипотентных предшественников гемопоэза и увеличивает продукцию других цитокинов, и в сочетании с Г-КСФ и ИЛ-3, обладает синергичными гемопоэтическими эффектами (Ogawa М. 1993.). По мнению других авторов ИЛ-1 влияет на гемопоэз, подготавливая ранние предшественники клеток крови к действию колониесгимулирующих факторов, причем ИЛ-1 не обладает видовой специфичностью (Иванов В.Т., Липкин В.М.1995). В отношении рецепторов ИЛ-1 известно, что прямое действие ИЛ-1 на гемопоэтические предшественники требует присутствия специфических рецепторов на них. Введение in vivo ИЛ-1 приводит к стимуляции ИЛ-1-Р на клетках костного мозга (Dubois С.М., et al., 1991.).

Данные литературы о влиянии эритропоэтина на интерлейкин-1 немногочисленны и противоречивы. Так например, по данным одних авторов гипоксия стимулирует ИЛ-1(3 (Ghezzi Р., et al., 1991.). По данным других авторов ЭП не влияет на ИЛ-1(5 (Logofetov A, el

al., 1998.). Эритропозтин, как известно, регулирует рост и дифференцировку эритроидных клеток, взаимодействуя с поверхностными специфическими белковыми рецепторами. Связывание ЭП с рецептором индуцирует специфический сигнал для пролиферации и

созревания эритроидных бурст-образующих колониеобразующих единиц (BFU-E), а также-----

дифференцировочный- сигнал для - эритроидных кожшиеобразующих единиц (CFU-E). Наибольшее количество ЭП-Р обнаружено именно на клетках предшественниках, находящихся на этапах дифференцировки CFU-E и ранние BFU-E. На более поздних этапах дифференцировки количество ЭП-Р и экспрессия его мРНК прогрессивно снижается параллельно с потерей способности к связыванию с ЭП (Kouri M.J., Bondurant М.С. 1992.)

На основании наших экспериментальных данных можно сделать заключение о том, что введение экзогенного ЭП увеличивает количество экзогенных костномозговых колоний -КОЕс-8 (стимулируя среди них эритроидные клетки предшественники) и стимулирует соответственно их эритропоэтиновые рецепторы на уровне мРНК. Эффект ЭП в данных экспериментальных условиях, вероятно, не опосредован ИЛ-13 и его рецептором.

Эффект иммунизации и введения ЭП на экспрессию мРНК цитокинов ГИЛ-ip. рецепторов ИЛ-1 и ЭШ в клетках головного мозга и поведение мышей (CBAxC57BllFl.

Данные литературы об экспресии генов циггокинов в головном мозге относительно немногочисленны и нередко противоречивы (Schobitz В., et al., 1994).На первом этапе нами определялась экспрессия мРНК цитокинов в полушариях головного мозга экспериментальных животных ( СВА х С57В1/6 )F1 мышей.

Нами было установлено, что в полушариях головного мозга интактных (CBAxC57Bl)Fl мышей экспрессируются специфические мРНК ИЛ-1Р ИЛ-1-Р (1-го типа) и ЭП-Р (Рис.5). Полученные данные согласуются с результатами других авторов, показавших, что ген ИЛ-1 зкспрессируется клетками ЦНС (Breder C.D., et al., 1988.; Schobitz В., et al., 1994.; Ilyin S.E., et al., 1998 ). Кроме того, экспрессия мРНК рецептора 1-го типа ИЛ-1 в клетках головного мозга также известна из литературных данных (Parrar W.L., et al. 1987.; Schobitz В., et al., 1994.) Более того, нами установлено наличие гена ЭП-Р в головном мозге мышей (CBAxC57Bl)Fl.

Далее, так как одной из задач данного фрагмента работы было сопоставление в одном исследовании изменения экспрессии генов ИЛ-ip, ИЛ-1-Р и ЭП-Р в полушариях головного мозга с поведенческой активностью животных, нами были исследованы поведенческие реакции (CBAxC57Bl)Fl в тесте «открытое поле» после указанных выше экзогенных воздействии (иммунизации ЭБ и введения ЭП).

Рис.5. Экспрессия генов ИЛ-1Р, ИЛ-1-Р, ЭП-Р в головном мозге мышей (СВАхС57В1)Р1. Уровень экспрессии генов ИЛ-1(3 (А), ИЛ-1-Р (Б), ЭП-Р (В) в головном мозге.

1- интактных мышей, 2-после иммунизации, 3-после введения ЭП (в дозе ЗОед., суммарно ). По оси ординат условные единицы оптической плотности.

Представлены результаты 5 серий экспериментов, число животных в одном опыте ( п ) 25-30. * - р < 0.05 Достоверность различий с соответствующей контрольной группой.

Было показано, что после иммунизации ЭБ экспрессия гена ИЛ-10 в головном мозге экспериментальных животных усилилась на 12,5% (рис.5). В то же время известно, что после введения ЛПС экспрессия этого гена в головном мозге также значительно возрастает (Gabellec М.М. et al., 1995.). Нами установлено, что введение ЭП приводит к подавлению экспрессии мРНК ИЛ-1 Р (на 20%) через 24 часа после последней инъекции этого гормона. При изучении экспрессии мРНК рецептора 1-го типа ИЛ-1 в головном мозге мышей выяснилось, что антигенное воздействие (ЭБ) приводит к увеличению указанной экспрессии на 13,6% (рис.5), что также не противоречит литературным источникам (Gabellec M.M.et al., 1995.). При введении ЭД как и в случае с геном ИЛ-ф, наблюдается достоверное снижение экспрессии мРНК рецептора ИЛ-1 на 39,4% (рис.5). Однако в литературе нет данных не только о влиянии иммунизации на мРНК ЭП-Р, но и до недавнего времени отсутствовали данные об экспрессии мРНК ЭП-Р в головном мозге вообще. В связи с этим из факторов, которые, видимо, в большей степени могут повлшггь на экспрессию именно мРНК ЭП-Р, было выбрано введение экзогенного эритропоэтина. Оказалось, что введение экзогенного ЭП приводит к подавлению экспрессии всех изучаемых генов (рис.5). В целом при исследовании характера экспрессии гена рецептора ЭП в ответ на иммунизацию и введение экзогенного ЭП было установлено: 1) иммунизация ЭБ стимулирует указанную экспрессию на 8 %; 2) введение ЭП подавляет экспрессию гена собственного рецептора на 20% по сравнению с контролем и на 26% по сравнению с иммунизированными животными. Исследование в «открытом поле» (таблица 1, 2 ) после введения ЭБ и экзогенного ЭП показало, что: 1) иммунизация ЭБ стимулирует манежную вертикальную двигательную активность через 24 часа после инъекции антигена, в то время как через 96 часов не наблюдалось каких-либо изменений в ориентировочно-исследовательской активности животных; 2) введение ЭП приводит к достоверному повышению горизонтальной двигательной активности: (периферической, центральной, суммарной) через 24 часа (таблица 2) и вертикальной двигательной активности (свободной, манежной и суммарной) через 96 часов после последней инъекции.

В связи с вышеуказанным можно предположить, что более выраженная активизация поведения в «открытом поле» после введения ЭП может быть связана с подавлением экспрессии в головном мозге гена ИЛ-ip и, возможно, продукции этого цитокина. Так известно, что введение ИЛ-1р в желудочки мозга вызывает индукцию медленно-волновой фазы сна, утрату аппетита, «болезненное поведение» в виде лихорадки и сонливости (Dantzer R.,et al.,1999.; Schobitz В., et al.,1994.; Van Dam A.M.,et al., 1991.). Нами не обнаружено выраженного влияния иммунизации животных ЭБ на их поведение в «открытом поле». Это согласуется с данными некоторых авторов о том, что формирование иммунного ответа либо не влияет на поведение в тесте «открытое поле» (Vidal J., 1999), либо приводит к некоторому повышению исследовательской и двигательной активности животных. (Буров Ю.В. и соавт.,1994.). Повышение же манежной активности (вертикальная двигательная активность) у животных через 24 часа после иммунизации, возможно, связано с активацией дофаминэргической системы мозга (Доведова Е.Л., Монаков М.Ю., 2000.; Трекова Н.А., и соавт. 1999.; Евсеев В.А., и соавт. 2001).

Таблица 1. Влияние иммунизации ЭБ и введения экзогенного ЭП через 24 часа после последней инъекции на поведение мышей (CBAxC57Bl)Fl в тесте «открытое поле».

Группы Горизонтальная двигательная активность Вертикальная двигательная активность

Периферическая центральна я суммарная свободна я-------- манежная суммарная

Контроль к ЭП (физ.р-р) 77,9±10,4 3,25±1,6 81,1±10 0,5±2 8,3±1,5 8,8±],6

ЭП 123,9±12,6** 10,1±2,3* 133,9±14,1* 1,1±0,5 И,2±2,2 12,2±2,6

Контроль к ЭБ (физ.р-р) 118,4*17,6 12,3±3,1 130,7±19,0 0,<Ш),4 8,4±1,9 9,3±2,2

ЭБ 148,5±14,3 14,6±3,2 161,3±1б,0 1,4±0,4 14,3±1,9* 15,6±2,1*

Примечание *- р< 0,05 **-р<0,01 Достоверность различий с соответствующей контрольной группой. (М+ т) количество п=25-30 в каждой группе.

Таблица 2 . Влияние иммунизации ЭБ и введения экзогенного ЭП через 96 часов после последней инъекции на поведение мышей (СВАхС57В1)Р1 в тесте «открытое поле».

Группы Горизонтальная двигательная активность Вертикальная двигательная активность

Периферическа я центральна я суммарная свободна я манежная суммарная

Контроль к ЭП (физ.р-р) 128,1*16,7 8,9±2,2 137,0±18,4 0,4±0,2 7,0±1,5 7,3±1,6

ЭП 158,7±12,1 ¡4,9*3,2 173,6±14,1 2,1±0,7* 12,9±1,9* 15,0±2,2*

Контроль к ЭБ (физ.р-р) 89,3±15,7 15,2±5,1 100,1*18,6 0,3±0,1 5,0±1,2 5,1±1,2

ЭБ 106,6±16,0 13,5±3,5 120,1±19,4 0,7±0,3 5,1±1,4 5,6±1,5

Примечание *- р< 0,05 **-р<0,01 Достоверность различий с соответствующей контрольной группой. (М± т) количество п=25-30 в каждой группе.

На основании вышеизложенного можно сделать выводы о том, что а) в головном мозге ( СВА х С57В1)Р1 мышей экспрессируются гены всех исследованных цитокинов ( ИЛ-1(3, ИЛ-1-Р, ЭП-Р); б) под влиянием иммунизации и введения ЭП изменяется, как экспрессия генов цитокинов в головном мозге, так и поведенческие реакции исследованных лабораторных животных в тесте «открытое поле», в регуляции которых принимают участие, согласно

данным литературы, изучаемые цитокины. В связи с этим, на основании собственных и литературных данных можно выдвинуть предположение о наличии взаимосвязи экспрессии генов цитокинов в головном мозге мышей (СВАхС57В1)Р1 с их поведением в тесте «открытое поле», что указывает на возможные молекулярные механизмы регуляции социальных функций животных.

Суммируя полученные результаты, можно заключить, что используемые внешние воздействия (ЭБ и ЭП) влияют на уровень и характер экспрессии генов ИЛ-1, рецепторов ИЛ-1-Р и ЭП-Р в селезенке, костном и головном мозге, а также приводят к изменению функциональной активности этих органов, регуляция которых и опосредуется указанными цитокинами. В связи с этим представлялось интересным провести сравнительный анализ характера экспрессии изучаемых цитокинов в изучаемых органах в процессе иммуногенеза и после введения ЭП.

Закономерности экспрессии генов цитокинов (ИЛ-1Р. ИЛ-1-Р 1-го типа. ЭП-Р) в селезенке. костном мозге и головном мозге мышей (СВАх С'57В№'1.

Следующей задачей настоящего исследования было выявление закономерностей экспрессии генов штгокинов (ИЛ-1Р, рецепторов ИЛ-1 1-го типа и ЭП) в лимфоидной, гемопоэтической и нервной тканях в процессе иммуногенеза и после введения ЭП. В связи с этим был проведен сравнительный анализ характера экспрессии каждого отдельного из указанных генов в селезенке, костном мозге и головном мозге после иммунизации, а также введения экзогенного ЭП.

Установлено, что экспрессия мРНК ИЛ-1р имеет место в селезенке, костном и головном мозге интактных мышей (СВАхС57В1)Р1 (рис. 1,3,5), что свидетельствует о распространенности изучаемых цитокинов как в лимфоидной, гемопоэтической, так и в нервной тканях.

Кроме того, показано, что иммунизация животных ЭБ сопровождается совершенно однонаправленными изменениями экспрессии гена ИЛ-ф в этих тканях, а именно, ее достоверным увеличением (рис.1, 3, 5).

Большей частью сходные изменения экспрессии мРНК ИЛ-1Р обнаружены в указанных тканях и при введении животным экзогенного рекомбинантного ЭП (рис. 1,3,5). При этом достоверное ее подавление обнаружено лишь в головном мозге, в то время как в селезенке и костном мозге достоверных изменений экспрессии не обнаружено.

Таким образом, показана экспрессия гена ИЛ-ф в лимфоидной, гемопоэтической и нервной тканях (селезенке, костном и головном мозге) интактных животных, при этом, в каждом из органов ИЛ-10 выполняет функции, свойственные именно им, а именно, участвует в регуляции гуморального иммунного ответа в селезенке, индуцирует гемопоэтические функции клеток костного мозга или способствует формированию поведенческих реакций, экспрессируясь в клетках головного мозга.

Далее, анализируя экспрессию мРНК рецептора 1-го типа ИЛ-1 в изучаемых органах при одинаковых воздействиях можно заметить: 1) мРНК ИЛ-1-Р экспрессируется в селезенке, костном мозге и головном мозге интактных мышей; 2) иммунизация ЭБ усиливает его экспрессию в этих органах; 3) введение ЭП оказывает разнонаправленное влияние на экспрессию мРНК ИЛ-1-Р: в костном мозге - не изменяет экспрессию гена; в селезенке -стимулирует ее; в головном мозге наблюдается подавление указанной экспрессии через 1 сутки после последнего введения ЭП (рис. 1,3,5)

Обращает на себя внимание тот факт, что введение ЭП оказывает разнонаправленное влияние на указанную экспрессию. Такой эффект может объясняться особенностями динамики экспрессии мРНК цитокинов в разных органах.

Кроме того, наличие мРНК рецептора ИЛ-1 во всех изучаемых органах подтверждает, что его лиганд - ИЛ-1р действительно выполняет в каждом га этих органов свою функцию.

Анализируя полученные данные, проследим, как экспрессируется мРНК ЭП-Р в изучаемых органах. Установлено, что указанный ген экспрессируется в селезенке, костном

мозге и головном мозге интактных животных. В то же время, иммунизация животных ЭБ сходным образом влияет на его экспрессию во всех изучаемых органах - усиливает ее. Введение ЭП стимулирует экспрессию собственного рецептора в селезенке и костном мозге

и подавляет ее в клетках головного мозга (рис. 1,3,5). _ _______________________________

________Следовательно, — мРНК—рецептора ЭП экспрессируется в лимфоидной,

гемопоэтической и в нервной тканях, и, кроме того, при иммунизации ЭБ характер экспрессии изменяется совершенно одинаковым образом.

Итак, показано, во-первых, что мРНК ИЛ-1Р, ИЛ-1-Р 1-го типа, ЭП-Р экспрессируются в костном мозге, селезенке и головном мозге. Во-вторых, иммунизация ЭБ стимулирует указанную экспрессию во всех изучаемых органах. В-третьих, введение экзогенного эритропоэтина оказывает разнонаправленное влияние на экспрессию мРНК ИЛ-1(5, ИЛ-1-Р , ЭП-Р. В головном мозге после введения ЭП наблюдается подавление экспрессии гена ИЛ-1Р, ИЛ-1-Р 1-го типа, ЭП-Р, а в селезенке и костном мозге - стимуляция экспрессии ИЛ-1-Р 1-го типа, ЭП-Р

Таким образом, установлено, что одни и те же гены, а именно мРНК ИЛ-1Р, рецепторов ИЛ-1 1-го типа и ЭП экспрессируются в разных тканях (лимфоидной, гемопоэтической и нервной) интактных мышей (СВАхС57В1)Р1 и в процессе иммуногенеза, а также после введения ЭП. Таким образом, изменения экспрессии мРНК генов изучаемых цитокинов и их рецепторов в селезенке, костном и головном мозге подтверждает факт существования в этих органах единой «цитокиновой сети».

В то же время, в каждой из указанных гомеостатических систем гены цитокинов и их белковые продукты выполняют специфические функции, обеспечивая их интеграцию в процессе иммуногенеза.

Кроме общих для всех цитокинов закономерностей существуют особенности экспрессии цитокинов в изучаемых органах, что очевидно связано с разными функциями этих цитокинов в разных органах. Так интерес представляют особенности экспрессии вышеуказанных генов в полушариях головного мозга.

Асимметрия экспрессии генов цитокинов в полушариях головного мозга .

Факт существования асимметрии полушарий головного мозга установлен давно. Показаны анатомические различия полушарий головного мозга (Бианки В.Л. 1989 ), а также установлена асимметрия его двигательных и речевых зон. Несмотря на успехи в изучении химической асимметрии головного мозга, на молекулярно-биологнческом уровне этот феномен никто не изучал. В связи с этим, одной из задач работы было изучение экспрессии мРНК генов цитокинов интерлейкина-1Р (ИЛ-1р), рецептора интерлейкина-1 (ИЛ-1-Р), рецептора эритропоэтина (ЭП-Р) в полушариях головного мозга мышей (СВАхС57В1)Р 1.

При изучении экспрессии генов (ИЛ-1Р, ИЛ-1-Р, ЭП-Р) в ЦНС установлено наличие мРНК этих цитокинов в интактном головном мозге. По данным некоторых авторов, уровень экспрессии мРНК ИЛ-1Р в головном мозге без антигенной стимуляции очень мал и значительно возрастает при иммунизации ЛПС Е.соН (В1аНа5 С.М.1990). В отношении экспрессии мРНК ЭП-Р в полушариях головного мозга, данные литературы еще более немногочисленны и противоречивы. В нашем исследовании показано наличие экспрессии вышеуказанных генов в полушариях головного мозга интактных животных, кроме того, показано, что эта экспрессия асимметрична.

Уровень экспрессии мРНК ИЛ-1Р и ИЛ-1-Р у интактных животных был выше в правом полушарии, чем в левом, иммунизация вызывает стимуляцию данной экспрессии, (рис.6.) При введении ЭП наблюдается снижение экспрессии мРНК гена ИЛ-1Р и ИЛ-1-Р. В целом отмечено, что экспрессия указанных генов выше в правом полушарии, чем в левом (рис.6.).

1 2 3 4 5 6

25

1 2 3 4 5 6

Рис.б. Влияние иммунизации (ЭБ) и введения ЭП на уровень экспрессии генов цитокинов 1А) интерлейкина-1(3 в левом полушарии головного мозга. 1Б) интерлейкина-ф в правом полушарии головного мозга. 11В) ингерлейкина-1-Р в левом полушарии головного мозга. ИГ) интерлейкина-1-Р в правом полушарии головного мозга. 1ЦЦ) рецептора ЭП в левом полушарии головного мозга. ШЕ) рецептора ЭП в правом полушарии головного мозга. По оси абсцисс:

1- Левое полушарие головного мозга контрольных животных.

2- Левое полушарие головного мозга животных после иммунизации (ЭБ).

3- Левое полушарие головного мозга после введениия ЭП.

4- Правое полушарие головного мозга контрольных животных.

5- Правое полушарие головного мозга животных после иммунизации (ЭБ).

6- Правое полушарие головного мозга после введениия ЭП.

По оси ординат условные единицы оптической плотности (УЕ).

Представлены результаты 4 серий экспериментов, число животных в одном

эксперименте (п) 25-30. * - р < 0.05 Достоверность различий с соответствующей

контрольной группой. _______________

#1 - достоверность различий между 1 и 4 группой р<0,05 #2 - достоверность различий между 2 и 5 группой р<0,05 #3 - достоверность различий между 3 и б группой р<0,05

мРНК ЭП-Р экспрессируется в полушариях интактных животных, при этом уровень экспрессии ЭП-Р был достоверно выше в левом полушарии по сравнению с правым. После иммунизации ЭБ была обнаружена стимуляция экспрессии мРНК рецептора ЭП в левом и правом полушариях головного мозга. Введение экзогенного ЭП приводило к снижению экспрессии мРНК ЭП-Р в полушариях головного мозга. В целом, экспрессия мРНК ЭП-Р была выше в левом полушарии по сравнению с правым (рис.6.).

Нами подтверждены данные об экспрессии мРНК ИЛ-1Р.ИЛ-1-Р в полушариях мозга интактных животных, показано наличие экспрессии гена ЭП-Р в головном мозге интактных взрослых животных, а также впервые обнаружена асимметрия полушарий на уровне молекулярно-биологаческих показателей.

Таким образом, обнаружено новое явление: молекулярно-биологическая асимметрия полушарий головного мозга, выражающаяся в существовании закономерных различий экспрессии генов вышеуказанных цитокинов в них, как у интактных животных, так и в процессе иммуногенеза и после введения эритропоэтина.

Исследование различий экспрессии мРНК гена ИЛ-1р в полушариях головного мозга интактных животных методом блот- и дотгибридизации.

Задачей данной главы исследован!« было выявление различий в экспрессии мРНК ИЛ-1 р между полушариями головного мозга интактных мышей методами блот- и дот-гибридизации.

Первоначально для определения уровня экспрессии мРНК ИЛ-1р использовался качественный метод блот-гибридизации образцов суммарной РНК, экстрагированной из левого и правого полушария головного мозга интактных мышей с меченным [32Р] фрагме1Пом кДНК ИЛ-1Р, использованным в качестве зонда. При этом выявлялась только мРНК длиной около 1400 н о. в пробах суммарной РНК как левого, так и правого полушария головного мозга. Обнаружение мРНК данной длинны, характерной для ИЛ-1Р, данным зондом свидетельствует о присутствии мРНК ИЛ-1Р в полушариях головного мозга интактных животных.

В наших экспериментах с использованием блот-гибриднзации выявились различия в уровне экспрессии мРНК ИЛ-1Р между полушариями. Содержание мРНК ИЛ-1Р в правом полушарии было выше по сравнению с таковым в левом полушарии головного мозга.

Для проверки этого факта и его дальнейшего изучения использовался метод количественной дот-гибридизации, он позволяет стандартизовать и количественно анализировать результаты нескольких серий экспериментов (СЫапа1е I е{ а1., 1988). При этом также обнаружилась асимметричная экспрессия мРНК ИЛ-1р, ее уровень был выше в правом полушарии головного мозга . Уровень мРНК ИЛ-1Р в правом полушарии (89,3 ± 5,2 , р < 0,05) достоверно превышал уровень мРНК ИЛ-1р в левом (70,9 ± 2,5). При этом различий в уровнях суммарной РНК в левом и правом полушариях головного мозга выявлено не было, что свидетельствует о преобладании абсолютного содержания мРНК гена ИЛ-1Р в правом полушарии головного мозга мышей.

Следовательно, изучение экспрессии мРНК гена ИЛ-1р в контралатеральных полушариях головного мозга мышей показало существование различий в уровне мРНК ИЛ-1Р в правом и левом полушариях интактных животных. Показано, что содержание мРНК ИЛ-1Р в правом

полушарии достоверно превышает таковое в левом. Обнаруженная нами асимметрия экспрессии гена ИЛ-1[5 в норме отражает возможные различия в синтезе этого цитокина в контралатеральных полушариях головного мозга. Вопрос о причинах асимметричной экспрессии мРНК гена ИЛ-1р в полушариях головного мозга интактных животных остается открытым и нуждается в дальнейшем исследовании. Также не изученным остается вопрос о том, как изменяется во времени экспрессия м РНК ИЛ-1(3 в контралатеральных полушариях головного мозга и иммунной системе под действием Т-зависнмых н Т-независимых антигенов.

Динамика экспрессии мРНК ИЛ-1В в полушариях головного мозга и иммунной системе при

Важной задачей нашего исследования было определение динамики экспрессии мРНК ИЛ-1р в контралатеральных полушариях головного мозга и селезенке при формировании иммунного ответа на Т-независимый антиген - липололисахарид E.Coli (ЛПС), и Т-зависимый антиген - эритроциты барана (ЭБ). Содержание мРНК ИЛ-ip в исследуемых органах определялось через 2, 6, 24 и 48 часов после воздействия. Использованные в работе дозы ЛПС и ЭБ, были выбраны в соответствии с данными литературы, вызывали сходные по силе изменения уровня экспрессии мРНК гена ИЛ-ip в селезенке мышей (Duncan L.M. et el., 1991). В качестве внутреннего стандарта для количественного анализа результатов разных серий экспериментов по влиянию ЛПС и ЭБ использовался единый положительный контроль (сумарная РНК из селезенки мышей непосредственно после введения физиологического раствора) первой серии опытов.

На рис.7 приведены данные изменений экспрессии мРНК гена ИЛ-ip при внутривенном введении ЛПС.

В левом полушарии (рис.7) наблюдается достоверное снижение количества мРНК ИЛ-ip (55,71 ± 2,75 , р < 0,05) через 2 часа по сравнению с уровнем мРНК у контрольных животных (92,75 ± 0,15), с последующим повышением через 48 часов (82,91 ± 1,87 против контрольного значения 65,77 ±2,16).

Уровень мРНК ИЛ-1р в правом полушарии (рис.7) головного мозга достоверно увеличивался только через 48 часов после введения ЛПС (114,8 ± 3,67 против 99,73 ± 0,66 , р < 0,05).

В селезенке уровень мРНК ИЛ-ip существенно повышался уже через 2 часа после стимуляции (270,4 ± 11,8 против контрольного уровня 125,2 ± 32,16, р < 0,05), с последующим снижением до контрольных величин к 48 часам после введения ЛПС (рис.7).

Во всех проведенных нами экспериментах не выявлялось различий в содержании суммарной РНК в исследуемых органах ни на один временной срок.

Подводя итог, можно отметить, что изменения экспрессии мРНК ИЛ-ip в полушариях головного мозга при введении ЛПС выражаются главным образом в снижении уровня мРНК ИЛ-ip в левом полушарии, совпадающем по времени с максимальным ответом ИЛ-ip в селезенке и повышением содержания ИЛ-ip в левом и правом полушариях головного мозга при нормализации уровня мРНК ИЛ-ip в селезенке.

На рис.8 представлена динамика уровней мРНК ИЛ-1р в полушариях головного мозга и селезенке на ранних этапах формирования иммунного ответа на ЭБ. Обнаружено, что уровень экспрессии мРНК ИЛ-ip в левом полушарии головного мозга (рис.8) снижается достоверно через 6 часов после введения ЭБ (59,91 ± 7,06) по сравнению с введением физиологического раствора (91,84 ± 2,16, р < 0,05). Через 24 и 48 часов после

350 3 00 250 200 1 50 1 00 50

о

В *

* *

2

В

24

4 а

Рис.7. Динамика экспрессии мРНК гена ИЛ-1(3 в левом (А), правом (Б) полушариях головного мозга и селезенке (В) мышей-самцов (СВАхС57В)Р1 при внутривенном введении ЛПС в дозе 10 мкг/мышь. (1 - контроль введения растворителя, 2 - опыт. Ось абсцисс — время после введения (часы), ось ординат—условные единицы оптической плотности (УЕ). Представлены результаты 3 серий экспериментов, число животных на точку ( п ) 12-14 *- р < 0,05 Достоверность различий с соответствующей контрольной группой.

1 о о

9 О 8 О 7 О 6 О 5 О 4 О 3 О 2 О

1 О О

1 6 О 1 4 О 1 2 О 1 О О 80 60 40

2 0 О

300 250 200 150

100 50 0

Рис.8. Динамика экспрессии мРНК гена ИЛ-1(5 в левом (А), правом (Б) полушария головного мозга и селезенке (В) мышей-самцов (СВАхС57В1/6)Р1 при внутривенно введении эритроцитов барана в дозе 2 х 10* /мышь.

1 - контроль ведения растворителя, 2- опьгг. Ось абсцисс - время после введения (часы), о< ординат — условные единицы оптической плотности (УЕ). Представлены результаты 3 сери

О 2 6 2 4 4 8

О 2 в 24 4 8

экспериментов, число животных на точку ( п ) 12-14 *- р < 0,05 Достоверность различий с соответствующей контрольной группой.

введения ЭБ содержание мРНК ИЛ-1 р в левом полушарии головного мозга не отличается от контрольных значений. В правом_полушарии_(рис.8) через -2-часа-после~введения" ЭБ наблюдается тенденция к увеличению уровня мРНК ИЛ-1р, приводящая к достоверному увеличению экспрессии мРНК ИЛ-1Р через 6 часов после воздействия (155,2 ± 9,24) по сравнению с введением аналогичного объема физиологического раствора (99 ± 2,25, р < 0,05). Через 24 и 48 часов уровень экспрессии мРНК ИЛ-1Р остается повышенным (127,2 ± 5,55 и 130,6 ± 11,9) по сравнению с контрольными уровнями (98 ±7,31 и 99,73 ± 0,66, р < 0,05), однако содержание мРНК ИЛ-1Р в эти сроки снижается по сравнению с уровнем экспрессии мРНК ИЛ-1Р через 6 часов после иммунизации.

Динамика экспрессии мРНК ИЛ-1Р в селезенке при введении ЭБ (рис.8) характеризуется повышением уровня экспрессия мРНК этого цитокина через 6 часов после воздействия (246,4 ± 29,84 по сравнению с контрольным значением 123,3 ± 20,25 , р < 0,05) и последующим снижением к 48 часам. Одако и через 48 часов после введения ЭБ уровень мРНК ИЛ-1Р в селезенке остается выше соответствующих контрольных значений (167,3 ± 4,43 против 133± 0,64 р < 0,05)

Следует отметить, что в этих экспериментах также не выявлялось различий в содержании суммарной РНК в исследуемых органах.

Полученные результаты свидетельствуют о том , что при введении антигенов разных типов экспрессия мРНК ИЛ-1р в полушариях головного мозга меняется неодинаково. Левое полушарие отвечает снижением содержания мРНК ИЛ-1р при внутривенном введении Т-кезависимого и Т-зависимого антигенов на пике экспрессии мРНК ИЛ-1Р в органах иммунной системы. Таким образом, ответ левого полушария по данному параметру не зависит от типа использованного антигена. С другой стороны, правое полушарие головного мозга отвечает преимущественно на введение Т-зависимого, а не Т-независимого антигена, повышением экспрессии мРНК гена ИЛ-1р. Эти изменения при воздействии Т-зависимого антигена положительно коррелируют с экспрессией мРНК ИЛ-1Р в иммунной системе. Это позволяет заключить, что ответ правого полушария по параметру экспресии мРНК гена ИЛ-1Р зависит от типа примененного антигена. Итак, в полушариях головного мозга существуют как зависимые, так и независимые от типа примененного антигена изменения содержания мРНК ИЛ-1р . Однако те и другие наиболее ярко проявляются на пике экспрессии мРНК этого цитокина в органах иммунной системы. Это свидетельствует о существовании тесной взаимосвязи между функциональной активностью иммунной системы и уровнем ИЛ-1 в противоположных полушариях головного мозга.

Механизмы регуляции иммунной системой экспрессии гена ИЛ-1р в контралатеральных полушариях головного мозга.

В предыдущих главах было показано существование асимметрии экспрессии генов цитокинов в полушариях головного мозга, в частности гена ИЛ-1 р. Кроме того, наличие зависимых и независимых от типа примененного антигена изменений асимметричной экспрессией мРНК гена ИЛ-1Р в контралатеральных полушариях головного мозга. Закономерным образом возникает вопрос о конкретных мессенджерах иммунной системы, регулирующих содержание мРНК ИЛ-1Р в правом и левом полушариях головного мозга, а также путях, опосредующих эти влияния.

В связи с вышеизложенным, была поставлена задача изучения роли периферических чувствительных нервных окончаний в процессе регуляции содержания мРНК ИЛ-1р в контралатеральных полушариях головного мозга и иммунной системе. Изучалось влияние введения капсаицина - вещества, вызывающего периферическую деафферентацию чувствительных нервных окончаний, на уровень мРНК ИЛ-1Р в полушариях головного мозга и селезенке через 12 суток после окончания курса введения препарата. В качестве контроля

использовалось введение растворителя аналогичным курсом. В качестве внутреннего стандарта для сравнения различных серий использовалась суммарная РНК селезенки контрольных животных первой серии опытов.

Было обнаружено,что капсаицин не вызывает изменений в экспрессии мРНК ИЛ-1Р в левом полушарии (37 ±6 по сравнению с контрольным значением 34 ± 3 ). В то же время у обработанных капсаицином животных достоверно повышено содержание мРНК ИЛ-1)3 в правом полушарии (43 ± 2 по сравнению с контролем 37 ± 3 , р < 0,05). Статистически достоверное увеличение экспрессии мРНК ИЛ-1Р (61 ±6) по сравнению с контрольной группой (46 ± 5, р < 0,05) отмечено также в селезенке. Также показано, что коэффициент асимметрии экспрессии мРНК ИЛ-1Р в контралатеральных полушариях головного мозга при обработке капсаицином имеет тенденцию к увеличению (7,9 ± 5,2 по сравнению с 3,25 ± 7,25 ). Содержание суммарной РНК в исследуемых органах при этом не изменялось.

Следовательно, деафферентация капсаицином приводит к повышению уровня мРНК ИЛ-1р в правом полушарии головного мозга и селезенке, в то время как в левом полушарии изменений экспрессии мРНК данного гена не происходит. Из этого можно сделать вывод об участии периферических чувствительных нервных окончаний во взаимодействии процессов экспрессии мРНК гена ИЛ-1Р в правом полушарии головного мозга и органах иммунной системы, а также высказать предположение, что роль периферических чувствительных нервных окончаний заключается в передаче икгибиторных влияний иммунной системы на экспрессию мРНК ИЛ-1Р в правом полушарии.

Таким образом, исследован один из механизмов регуляции экспрессии генов цитокинов в нервной и иммунной системах, осуществляемый периферической нервной системой с участием периферических нервных окончаний. Кроме нервных путей регуляции, существует целый ряд медиаторов, которые составляют основу гуморального пути регуляции экспрессии генов.

На следующем этапе нами исследована роль простагландинов, как возможных мессенджеров иммунной системы, регулирующих уровень мРНК ИЛ-1р в контралатеральных полушариях головного мозга.

Для изучения роли простагландинов в регуляции уровня мРНК ИЛ-1р в полушариях головного мозга было использовано внутрибрюшинное введение блокатора синтеза простагландинов (циклоксигеназного пути метаболизма) индометацина. Исследовалось влияние блокады синтеза простагландинов индометацина на содержание мРНК ИЛ-1Р в контралатеральных полушариях головного мозга и селезенке через 6 часов после окончания введения препарата. Контрольная группа в этих экспериментах состояла из животных, которым вводили 5% спиртовый раствор, использованный в качестве растворителя для препарата индометацина.

Показано, что индометацин увеличивает содержание мРНК гена ИЛ-1Р в левом полушарии мозга. Однако это повышение (43 ± 10) не является статистически достоверным по сравнению с контрольной группой (32 ± 3). С другой стороны, отмечено достоверное повышение уровня мРНК ИЛ-1р в правом полушарии (61 ± 1 по сравнению с контролем 38 ± 3, р < 0,05), возникающее под воздействием индометацина. В селезенке было отмечено недостоверное повышение уровня мРНК ИЛ-1Р (60 ± 12 по сравнению с контрольным значением 44 ± 11). Уровень суммарной РНК в исследуемых органах при этом не изменялся.

Следовательно, блокада синтеза простагландинов приводит к достоверному увеличению экспрессии мРНК ИЛ-1Р в правом полушарии головного мозга, что говорит о ингибирующем влиянии простагландинов на экспрессию мРНК ИЛ-1Р в правом полушарии. Хорошо известно, что простагландины как мессенджеры второго порядка могут регулировать синтез и продукцию ИЛ-1 по принципу обратной связи, то есть ИЛ-1 индуцирует увеличение уровня ПГЕ, они в свою очередь ингибируют ИЛ-1. В меньшей степени изучены механизмы ауторегуляции ИЛ-1. Поэтому на следующем этапе нами исследована роль самого ИЛ-1 {5, как мессенджера иммунной системы, регулирующего уровень мНРК ИЛ-1Р в контралатеральных полушариях головного мозга.

Для изучения роли цитокина ИЛ-1Р в регуляции экспрессии мРНК гена ИЛ-1Р в ЦНС бьши проведены эксперименты по определению влияния внутривенного введения рекомбинантного цитокина ИЛ-1р на содержание мРНК ИЛ-1Р в контралатеральных полушариях головного мозга и селезенке мышей. Рекомбинантный цитокин был использован в дозах 10,-100 и 1000 нг/ммшь. Уровень мРНК ИЛ-Гр в исследуемых органах определялся через 2 и 24 часа после воздействия.

Выяснено, что внутривенное введение рекомбинантного ИЛ-1Р в дозе 100 нг значительно стимулирует экспрессию мРНК ИЛ-1Р в левом полушарии головного мозга (рис. 10а). Этот эффект проявляется как через 2 часа (39,91 ± 1,6 по сравнению с контрольным значением 20 ± 1, р < 0,05), так и через 24 часа после воздействия (44,38 ± 5,35 протир 26,98 ± 1,64 , р < 0,05). В то же время не было отмечено достоверного влияния более низкой (10 нг.) и более высокой доз (1000 нг.) рекомбинантного ИЛ-1Р на уровень мРНК гена ИЛ-1Р в левом полушарии головного мозга.

Иная зависимость от дозы ИЛ-1Р наблюдалась в правом полушарии головиого мозга (рис. 106) Рекомбинантный ИЛ-1Р в низкой дозе (10 нг.) существенно не влиял на содержание мРНК ИЛ-1р При дальнейшем увеличении дозы препарата до 100 нг. Проявлялся стимулирующий эффект на содержание мРНК гена ИЛ-1Р в правом полушарии через 2, 24 часа после воздействия (24,25 ± 0,44 и 26,08 ± 1,64 по сравнению с контрольными величинами 13 ± 1 и 17,75 ± 0,44 соответственно, р < 0,05). Следует отметить, что дальнейшее увеличение дозы цитокина (до ЮООнг.) не приводило к усилению его стимулирующего эффекта на уровень мРНК ИЛ-1Р в правом полушарии головного мозга.

В селезенке рекомбинантный ИЛ-1Р повышал уровень мРНК ИЛ-1Р дозозависимым образом (рис.Юв). Эти эффекты проявлялись как через 2, так и через 24 часа после введения цитокина. Доза ИЛ-1р 10 нг существенно не увеличивала уровень экспрессии мРНК ИЛ-1Р в исследуемый период времени. Дальнейшее увеличение дозы ИЛ-1Р до ЮОнг. приводило к значительной стимуляции содержания мРНК ИЛ-1Р в селезенке, причем уровень экспрессии его через 24 часа (25 ± 1,5) снижался по сравнению с таковым через 2 часа после воздействия (41 ± 1,1 , р < 0,05 по сравнению с введением физиологического раствора). В дозе ЮООнг. рекомбинантный ИЛ-1Р оказывал более выраженный стимулирующий эффект, при этом уровень мРНК ИЛ-1р слабо изменялся в исследуемый период времени (44 ± 0,5 и 40 ± 2 соответственно через 2 и 24 часа, р < 0,05 по сравнению с введением физиологического раствора). Уровень суммарной РНК в исследуемых органах при этом оставался постоянным. Таким образом, рекомбинантный ИЛ-1Р вызывает сходные дозозависимые изменения экспрессии мРНК ИЛ-1Р в контралатеральных полушариях головного мозга, проявляющиеся в стимуляции содержания мРНК гена ИЛ-1Р в левом полушарии при средней дозе препарата, и в стимуляции уровня мРНК ИЛ-1Р в правом полушарии головного мозга и селезенке при использовании средаптх и высоких доз цитокина. Достижение эффекта влияния рекомбинантного ИЛ-1Р на экспрессию ИЛ-1Р в полушариях головного мозга требует использования высоких доз препарата, а однонаправленный характер этих изменений показывает, что сам Ш1-1Р не является ведущим фактором, регулирующим асимметрию экспрессии мРНК гена ИЛ-1р в правом и левом полушариях головного мозга Мы предполагаем, что наряду с этим цитокином в регуляции экспрессии мРНК ИЛ-1(5 участвуют н другие факторы иммунной системы.

Итак, нами выявлены некоторые закономерности экспрессии генов и рецепторов цитокинов в нервной системе и лимфоидных органах. А также механизмы и пути влияния иммунной системы на асимметричную экспрессию гена ИЛ-1 [1 в контралатеральных полушариях головного мозга мышей.

50 45 40 35 30

А§

20 15 10 5 0

0 10 100 1000 0 10 100 1000

30

25

20 Б.

15

10 5 0

0 10 100 1000 0 10 100 1000

30

40

30

В.

20

10 О

0 10 100 1000 О 10 100 1000

2ч

24 ч

□ 1 П2

Рис.10. Экспрессия мРНК ИЛ-1(3 в левом (А), правом (Б) полушариях головного мозга и селезенке (В) мышей-самцов (СВАхС57В1/6)Р1 через 2 и 24 часа после введения рекомбинантного ИЛ-1Р крысы. (1 - контроль введения растворителя, 2 - опыт. Ось абсцисс - доза препарата в нг. Ось ординат - условные единицы оптической плотности (УЕ). Представлены результаты 3 серий экспериментов, число животных в одном эксперименте ( п ) 25-30 - р < 0,05 Достоверность различий с соответствующей контрольной группой.

ВЫВОДЫ.

1. Гены ИЛ-1Р и рецепторов ИЛ-1-Р и ЭП-Р одновременно экспрессируются в клетках селезенки, костного мозга и головного мозга интактных (СВАхС57В1)Р1 мышей, о чем свидетельствует наличие соответствующих мРНК. Иммуногенез стимулирует экспрессию генов (КЛ-1Р, ИЛ-1-Р, ЭП-Р) в селезенке, костном и головном мозге,-что подтверждается-увеличением уровня "соответствующих мРНК.

2. Эритропоэтин является не только стимулятором гуморального иммунного ответа и гемопоэза , о чем свидетельствует его стимулирующий эффект на количество АОК и КОЕс-8, но и стимулятором экспрессии генов рецепторов ИЛ-1-Р и ЭП-Р в селезенке и ЭП-Р в костном мозге, это подтверждается увеличением количества соответствующих мРНК.

3. Развитие гуморального иммунного ответа у мышей (СВАхС57В1)Р1 сопровождается усилением экспрессии генов (ИЛ-1Р, ИЛ-1-Р, ЭП-Р) в клетках головного мозга и увеличением вертикальной двигательной активности, а инъекции ЭП подавляют указанную экспрессию, стимулируя как вертикальную, так и горизонтальную двигательную активность, что свидетельствует об участии этих генов в регуляции локомоторной активности.

4. Уровень экспрессии мРНК интерлейхина-1Р, рецептора ИЛ-1 1-го типа выше в правом полушарии головного мозга, а уровень экспрессии мРНК рецептора эритропоэтина выше в левом, что свидетельствует об асимметричной экспрессии генов цитокинов и их рецепторов в контралатеральных полушариях головного мозга.

5. Внутривенное введение Т-зависимого и Т-независимого антигенов мышам приводит к снижению уровня мРНК интерлейкина-1Р в левом полушарии головного мозга при максимальных значениях экспрессии мРНК интерлейкина-1Р в селезенке, что свидетельствует о независимости экспрессии мРНК гена интерлейкина-1Р в левом полушарии головного мозга от типа использованного для иммунизации антигена.

6. В правом полушарии головного мозга мышей выявлено повышение содержания мРНК интерлейкина-1Р в ответ на введение Т-зависимого, но не Т-независимого антигена. Отмечено значительное совпадение динамики экспрессии мРНК в правом полушарии мозга и селезенке при введении Т-зависимого антигена. Экспрессия мРНК гена интерлейкина-1 [1 в правом полушарии головного мозга зависит от типа антигена, использованного для стимуляции иммунной системы.

7. Обнаружено повышение содержания мРНК интерлейкина-1р в правом полушарии головного мозга и селезенке мышей после введения блокатора первичных афферентных нервных окончаний капсаицина, что говорит об участии периферических чувствительных нервных окончаний во взаимодействии процессов регуляции экспрессии гена интерленкина-1Р в правом полушарии головного мозга и органах иммунной системы.

Введение индометацина усиливает экспрессию мРНК интерлейкина-1р в правом, но не в левом полушарии головного мозга, что свидетельствует об ингибирующем действии простагландинов на Экспрессию гена интерлейхина-1р в правом, но не левом полушарии головного мозга.

8. Показан сходный характер дозовой зависимости стимулирующего действия периферического введения цитохина интерлейкина-1Р на экспрессию мРНК интерлейкина-1р в правом и левом полушариях головного мозга, что свидетельствует об участии медиатора иммунной системы интерлейкина-1Р в регуляции экспрессии гена интерлейкина-1р в полушариях головного мозга.

9. Изменения экспрессии мРНК (ИЛ-1, ИЛ-1-Р, ЭП-Р) в клетках селезенки, костного и головного мозга в процессе иммуногенеза и после введения ЭП свидетельствуют о регуляторном значении этих генов в модуляции активности лимфоидной, гемопоэтической и нервной тканей, а также о существовании единой «цитокиновой сети» в межсистемных взаимодействиях.

Список работ опубликованных по теме диссертации :

1. Повещенко А.Ф., Громыхина Н.Ю., Козлов В.А. Роль внутриклеточных регуляторов в реализации иммунных реакций. Здоровье человека в Сибири. Тез. Докл. Краевой научно-практической конф,- Красноярск.-1986.-С.91-92.

2. Громыхина Н.Ю., Волкова Л.Г., Повещенко А.Ф., Козлов В.А. Влияние монокинов н функциональную активность надпочечников. // Всесоюзный симпозиум «Регуляци иммунного гомеосгаза». Тезисы докладов,- Л.-1996.-С.34.

3. Kozlov V. A, Gromykhina N.Yu., Poveshchenko A.F., Gorlenko E. Immunomodulating affect с PGE2 and its role in 1L-1 production. 3rd Interscience world conference on Inflammatior Analgetics, Immunomodulators. Monte-Carlo.- 1989.-P.208.

4. Markova E.V., Poveshchenko A.F. Monokine production by spleen macrophages of mic oppositely responding to SRBC. Abstracts Mononuclear Phagocyte System in Normal am Pathological States. Novosibirsk, 1990.-P.179.

5. Громыхина Н.Ю., Крымская Л.Г., Повещенко А.Ф., Куракина О.В., Маркова Е.В. Козло:

B.А Механизмы иммунорегуляторной функции макрофагов. Тезисы международной симпозиума. Патогенез хронического воспаления. Новосибирск.-1991.-С.80-82.

6. Громыхина Н.Ю., Маркова Е.В., Любимов Г.Ю., Повещенко АФ., Козлов В.А Продукци: интерлейкина-1 и простагландина Е2 макрофагами мышей в условиях индукции Р-448 зависимой монооксигеназной активности. // Иммунология,- 1992.-№1.-С.37-40.

7. Громыхина Н.Ю., Куракина О.В., Повещенко А.Ф. Продукция |3-эндорфинов клеткам! гипоталамуса и перитонеальными макрофагами мышей в процессе формированш гуморального иммунного ответа. // Бюллетень Сибирского отделения РАМН .-1994.-.КН.

C.65-68.

8. Gromykhina N., Markova Е., Poveshchenko AF., Kurakina О., Krymskaya L., Kozlov V.A Prostaglandin-dependent mechsnisms of synthesis and action of different regulatory factors. 9° International Conference on Prostaglandins and Related Compounds. Florence (Italy), June 6-10,.-1994,-Abstract Book.-1994.-P.S6.

9. Абрамов B.B., Повещенко А.Ф., Гребенщиков А.Ю,, Козлов В.А. Асимметрия экспрессия гена ИЛ-1р в головном мозге мыши в процессе формирования иммунного ответа, h Бюллетень Сибирского отделения РАМН.-1995,- №1.-С,60-64.

10. Гребенщиков А.Ю., Повещенко А.Ф., Абрамов В.В. Функциональная асимметрия интерлейкина-ip в головном мозге. // Сб. тезисов «Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМН» .-Новосибирск.-1996.-С.26. 1]. Громыхина Н.Ю.,Чугунов А.Н., Гонтова И.А., Повещенко А.Ф., Колесникова О.П., Любимов Г.Ю., Вольский Н.Н., Козлов В.А. Методы исследования функциональной активности макрофагов у мышей в эксперименте. Н Новосибирск. Методические рекомендации.-l997.-19С.

12. Abramov V.V., Poveshchenko AF., Grebenshikov A.Yu., Expression of IL-ip mRNA in brain hemispheres in immunized mice. Int. Workshop Measurement of Cytokines and their Receptors in the Brain. Meeting Abstracts.-1994.-P.12.

13. Abramov V.V., Poveshchenko AF., Grebenshikov A.Yu., Interleukin-lp gene expression in mouse brain. 3l4 International conference on cytokines. Meeting Abstracts.-1994.-P.30.

14. Grebenshikov A.Yu., Abramov V.V., Poveshchenko A.F., Kozlov V.A. The asymmetric expression of IL-lp gene in mouse brain. 27th Scandinavian Society for Immunol. Meeting Abstracts. // Scand.J. Immunol.-1996.-V.43.-N.6.-P.72S.

15. Lozkin I.D., Grebenshikov A.Yu., Poveshchenko A.F., Abramov V.V., Kozlov V.A. Nerve growth factor differentially regulates IL-lbeta and TNF-alfa gene expression in murine macrophages. 27th Scandinavian Society for Immunol. Meeting Abstracts .- // Scand. J. Immunol.-1996.-V.43.-N.6.-P.725.

16. Poveshchenko A.Yakushenko E., Abramov V., Kozlov V. Eiythropoietin receptors are expressed in the brain hemispheres of (CBAxC57BI)Fl mice. // European Cytokine Network 1998,-V.9. N.3-P.523.

17. Гребенщиков А.Ю., Повещенко А.Ф., Абрамов B.B., Козлов В.А Влияние интерлейкина-1Р и индометацина на экспрессию гена интерлейкина-1 р в полушариях головного мозга. Н Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-1999.-Т.127.-№5,-С.557-559.

18. Гребенщиков А.Ю., Повещенко А.Ф., Абрамов В.В., Козлов В. А Экспрессия гена ИЛ-1Р в полушариях головного мозга при перифирическом введении тимусзависимых и тимуснезависимых антигенов. // Доклады АН,- 1999.-T.366.-J65.-C.712-715.

19. Повещенко А.Ф., Абрамов ВВ., Якушенко Е.В., Козлов В.А. Экспрессия мРНК

рецепторов эр1ггропоэтина в полушариях головного мозга мышей (СВAxC57BL)F 1._ II_________

Российский журнал иммунологии.-2001.- Т.4.Дополнит.-С.54.

20. Повещенко А.Ф., Козлов В.А Влияние фактора активирующего тромбоциты, и его антагониста - BN 52021 на иммунные реакции in vivo у мышей и in vitro. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 1999.-№4.-С.53-56.

21. Poveshchenko A, Yakushenko Е., Filimonov P., Abramov V., Korotkova N., Kozlov V. Dependence Etythropoietin Receptor mRNA Expression in Brain on Different Age Mice. Sixth International Symposium on BIOLOGICAL REACTIVE INTERMEDIATES Chemical and biological mechanisms in susceptibility to and prevention of environmental diseases PARIS July 16-20, 2000,-P.41.

22. Повещенко АФ., Филимонов П.Н., Абрамов B.B., Короткова НА., Якушенко ЕВ., Козлов В.А. Экспрессия мРНК рецепторов эритропоэтина в полушариях головного мозга мышей. // Цитология. - 2001. - № 3. - С.279-283.

23. Yakushenko E.V., Poveshchenko A.F., Markova E.V., Korotkova N.A., Abramov V.V. The expression of mRNA of cytokines in hemispheres and behavior reactions of (CBAxCS7Bl)Fl mice. // Scand. J. of Immunol., 1 Iй International Congress of Immunology. - 2001.- V.54, Suppl. 1.- A3, 5.15, 1322,- P. 115.

24. Abramov V.V., Marcova E.V., Poveschenko A.F., Gontova I.A., Yakushenko E.V., Korotkova N.A., Abramova T.Ya., Kozlov V.A. The interdependence of behavior and immunity: possible mechanisms and significance. // Russian Jornal of Immunology. - 2001. - V.6. -N.2. - P. 215-220.

25. Повещенко А.Ф., Абрамов B.B., Маркова E.B., Короткова НА, Якушенко Е.В., Козлов В А. Экспрессия генов цитокинов в полушариях головного мозга и поведенческие реакции у мышей (CBAxC57BL)Fl. // Сибирский вестник психиатрии и наркологии - 2001- №3. -С.

26. Повещенко А.Ф., Абрамов В В., Козлов В.А. Эритропозтин и его функции в лимфоидной и нервной ткани. У/ Аллергология и иммунология. - 2001,- Т2,- №1.-С.68-75.

27. Повещенко А.Ф., Якушенко ЕВ, Короткова H.A., Абрамов ВВ., Козлов В.А Асимметрия экспрессии генов цитокинов в полушариях головного мозга. // Актуальные вопросы функциональной асимметрии . Материалы конференции 13-14 дек.2001г., Москва-С. 141-145.

28. Повещенко А.Ф., Якушенко Е.В., Короткова H.A., Абрамов В.В., Козлов В.А. Экспрессия генов цитокинов в селезенке и иммунный ответ у мышей (CBAxC57Bl)Fl. // Иммунология -2001 ,-№б.-С.27-28.

29. Повещенко А.Ф., Маркова Е.В., Короткова H.A., Якушенко Е.В., Абрамов В В., Козлов В.А. Экспрессия генов цитокинов в полушариях головного мозга и поведенческие реакции у мышей (CBAxC57Bl)Fl -БЭБиМ.-2002.-Т.47.-№2.-С.23-24.

30. Якушенко Е.В., Повещенко АФ., Филимонов П.Н., Короткова H.A., Абрамов В.В., Козлов В.А. Экспрессия гена и рецептора эритропоэтина в клетках головного мозга мышей в процессе окгогенеза. // Нейроиммунология. Материалы второй Росс. Конф. Москва. 21-23 мая,.- 2002,- С.87.

31. Маркова Е.В., Повещенко А.Ф., Короткова H.A., Якушенко Е.В., Абрамов В.В., Козлов В.А. Модуляция ориентировочно-исследовательского поведения у мышей в процессе развития гуморального иммунного ответа. // БЭБиМ.-2002.-Т.-133.-№5.-С.534-536.

32. Повещенко АФ., Абрамов В.В., Козлов В.А. Биология эритропоэтина и его функции в лимфоидной и нервной ткани. // Успехи современной биологии.- 2002.-Т.122.-№5.-С.480-488.

38-39.