Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Значение врожденного иммунитета слизистой оболочки полости носа у больных с гипертрофией аденоидных вегетаций.

На правах рукописи

ГАНКОВСКИЙ ВИКТОР АНАТОЛЬЕВИЧ

ЗНАЧЕНИЕ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА СЛИЗИСТОИ ОБОЛОЧКИ ПОЛОСТИ НОСА У БОЛЬНЫХ С ГИПЕРТРОФИЕЙ АДЕНОИДНЫХ ВЕГЕТАЦИЙ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология 14.01.03 - Болезни уха, горла, носа

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 6 СЕН 2013

005533327

Москва - 2013

005533327

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор кафедры патофизиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России

доктор медицинских наук, ГБУЗ «Московский научно-практический Центр оториноларингологии» ДЗМ, заведующий отделением ЛОР-патологии детского возраста Ивойлов Алексей Юрьевич

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « » 2013 года в 14 часов на заседании

диссертационного совета Д 208.072.05 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, Д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, Д.1

Автореферат разослан« » 2013 года

Ковальчук Леонид Васильевич

Рахманова Ирина Викторовна

Салмаси Жеан Мустафаевич

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент Кузнецова Татьяна Евгеньевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Заболевания лимфоглоточного кольца Вальдейра-Пирогова являются одной из наиболее актуальных проблем в детской оториноларингологии, [Крюков. А.И. и др., 2008, Богомильский М.Р., 2009]. В последнее время отмечается тенденция к увеличению частоты встречаемости гипертрофии глоточной миндалины у детей, что в свою очередь ведет к увеличению количества оперативных вмешательств в носоглотке. Вопрос о приоритете хирургического или консервативного метода лечения остается в настоящее время дискутабельным [Гаращенко Т.И., 2011]. Не менее актуальной проблемой является рецидив гипертрофии аденоидных вегетаций (AB), патогенез которого до конца не изучен. По данным ряда авторов рецидив аденоидов встречается у 40-75% пациентов, которым была проведена аденотомия [Гаращенко Т.И., 2007, Тулупов Д.А. и др., 2011].

Проблема комплексной диагностики отклонений в иммунном статусе у детей с гипертрофией аденоидных вегетаций, сопровождающейся частыми ОРВИ, нарушением носового дыхания, различными формами средних отитов, снижением слуха, недостаточно изучена и практически не разработана.

В настоящее время системе врожденного иммунитета отводится ключевая роль в защите слизистых оболочек от различных патогенов. В последние годы достигнуты впечатляющие успехи в изучении роли распознающих рецепторов врожденного иммунитета То11-подобных рецепторов (TLRs), их роли в патогенезе различных заболеваний человека [Akira S., 2004, Montero Vega М., 2004, Ковальчук JI.B. и др, 2011]. Распознавание TLRs патогенов и эндогенных лигандов запускает активацию генов цитокинов, противомикробных пептидов (ПМП), и др. молекул [Janeway С., 2005; Ярилин A.A., 2010]. Дефекты в системе То11-подобных рецепторов могут привести к развитию тяжелых инфекций, аутоиммунных процессов, аллергии и других патологических состояний.

В связи с этим изучение То11-подобных рецепторов и эффекторных молекул : противомикробных пептидов (ПМП), цитокинов - представляется реальным шагом в понимании роли механизмов врожденного иммунитета в защите слизистых оболочек JIOP-органов в норме и при различных заболеваниях.

Анализ компонентов врожденного иммунитета (TLRs, ПМП, цитокинов) слизистой оболочки полости носа у детей с гипертрофией АВ имеет важное значение для оценки прогноза заболевания, дополнительного обоснования метода лечения.

Принимая во внимание тот факт, что в лимфоидной ткани носоглотки формируется мукозальный иммунитет JIOP-органов, разработка и внедрение молекулярно-генетических методов исследования врожденного иммунитета представляется актуальным, т.к. позволит научно обосновать и разработать новые подходы к адекватной иммунотропной терапии с учетом индивидуальных особенностей иммунной системы.

В лечении воспалительных заболеваний ЛОР-органов с успехом применяются препараты иммуномодуляторов, в том числе и иммунопептиды [Пчеленок C.B., 2007,Снимщикова И.А.,2008]. Однако, согласно данным Л.В. Ковальчука (2002г.) с соавторами, локальное использование комплекса иммунопептидов, а не отдельных цитокинов, позволит стимулировать иммунные механизмы в патологическом очаге, направленно воздействовать на определенные стадии воспаления, избежать развития тяжелых осложнений.

Цель исследования: проанализировать особенности врожденного иммунитета слизистой оболочки полости носа и глоточной миндалины у детей с гипертрофией аденоидных вегетаций, разработать и обосновать алгоритм персонализированной иммунотерапии в комплексном лечении гипертрофии АВ.

Задачи исследования:

1. Провести клинико-лабораторное обследование детей с гипертрофией АВ.

2. Разработать комплексный подход к оценке врожденного иммунитета слизистой оболочки полости носа у детей. Провести сравнительный анализ показателей врожденного иммунитета (экспрессии генов распознающих рецепторов (TLR2, TLR4, TLR9), противомикробных пептидов и цитокинов) у детей с гипертрофией АВ в возрасте от 2-х до 7 лет и практически здоровых детей того же возраста.

3. Сравнить исследуемые показатели врожденного иммунитета (экспрессию генов TLR2, TLR4, TLR9, ПМП и цитокинов) слизистой полости носа и слизистой глоточной миндалины у детей с гипертрофией АВ, которым показана эндоскопическая аденотомия.

4. Оценить показатели врожденного иммунитета (экспрессии генов Т1Л12, ТЫ14, Т1Л19, ПМП и цитокинов) у пациентов с рецидивом гипертрофии АВ.

5.Разработать и оценить клиническую эффективность применения персонализированной иммунотерапии в комплексном лечении гипертрофии АВ.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное изучение показателей врожденного иммунитета слизистой оболочки носа на уровне экспрессии генов распознающих рецепторов (ТЫ12, ТЫ14, ТЬЯ9) и эффекторных молекул (противомикробных пептидов и цитокинов) у здоровых детей и пациентов с гипертрофией аденоидных вегетаций.

Выявлено отсутствие отличий в показателях врожденного иммунитета у детей с гипертрофией АВ II и III степени, которым показано консервативное лечение, и здоровых детей. Впервые выявлен дефект в защите слизистой оболочки полости носа, характеризующийся высоким уровнем экспрессии генов рецепторов ТЫ12, ТЬЯ4, снижением противомикробных пептидов (НВ01, НВ02, НЫР1) у детей с гипертрофией АВ, с абсолютными показаниями к проведению аденотомии.

Выявлено изменение экспрессии генов провоспалительных цитокинов ФНОа и ИЛ-18 и снижение экспрессии противовоспалительного цитокина ИЛ-10 у пациентов с рецидивом гипертрофии аденоидов.

Впервые обосновано применение метода персонализированной иммунотерапии, включающего локальное использование комплекса аутологичных цитокинов и противомикробных пептидов, в комплексном лечении гипертрофии АВ; показана также клиническая эффективность метода.

Практическая значимость

Выявленный дисбаланс показателей врожденного иммунитета слизистой полости носа в группе пациентов с гипертрофией АВ позволяет рекомендовать включение методов исследования экспрессии генов ТЫ12, ТЫ14 и противомикробных пептидов НВ01, НВ02, НЫР1 в комплекс клинико-лабораторных методов обследования для получения информации о состоянии врожденного иммунитета слизистой оболочки носа и носоглотки пациентов.

Увеличение экспрессии генов рецепторов врожденного иммунитета и снижение экспрессии противомикробных пептидов является дополнительными критериями для раннего обоснования метода хирургического лечения гипертрофии АВ.

Сохранность иммунных механизмов на уровне слизистой оболочки полости носа в сочетании с другими методами обследованиями обосновывает проведение консервативной терапии.

Патогенетически обосновано включение в комплексное лечение детей с гипертрофией АВ индивидуального аутологичного комплекса иммунопептидов (цитокинов и ПМП) в виде назальных капель. Применение аутологичного комплекса иммунопептидов, в сочетании с консервативным лечением способствует нормализации носового дыхания, снижению частоты развития отитов и ОРВИ в течение 6-ти месяцев наблюдения после лечения.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработана комплексная оценка врожденного иммунитета слизистой оболочки полости носа у детей, основанная на определении экспрессии генов распознающих рецепторов врожденного иммунитета (Т1Л12, ТЬЯ4, ТЬЯ9), противомикробных пептидов и цитокинов. В слизистой оболочке полости носа здоровых детей экспрессируются гены ТЬЯ2, ТЫ14, ТЫ19, гены противомикробных пептидов (НВ01, НВ02, НЫР1) и цитокинов (ФНОа, ИЛ-18 и ИЛ-10), обеспечивающих иммунную защиту.

2.У детей с гипертрофией АВ, которым по клиническим проявлениям показана аденотомия, выявлен дефект в механизмах врожденного иммунитета слизистой оболочки полости носа, проявляющийся резким увеличением экспрессии генов распознающих рецепторов Т1Л12, ТЫ14 и снижением экспрессии генов эффекторных молекул-противомикробных пептидов. Выявленный дисбаланс может служить обоснованием для назначения иммунотерапии

3. Разработан алгоритм проведения персонализированной иммунотерапии в комплексном лечении гипертрофии АВ у детей, основанной на применении аутологичных иммунопептидов в виде назальных капель; показана клиническая эффективность метода.

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертационной работы внедрены в клиническую практику КДЦ Морозовской ДГКБ, а также в учебный процесс кафедры оториноларингологии

педиатрического факультета и кафедры иммунологии Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова для студентов, аспирантов и ординаторов.

Апробация

Основные результаты диссертационной работы доложены на совместной конференции кафедры иммунологии и кафедры оториноларингологии педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им.Н.И. Пирогова Минздрава России и отделения оториноларингологии Морозовской детской городской клинической больницы г.Москвы, на XI Российском конгрессе оториноларингологов «Наука и практика в оториноларингологии» (Москва, 2012 г.), на конгрессе EAACI (Женева 2012 г.), на симпозиуме «Экспериментальная ринология и иммунология носа» «SERIN» (Бельгия, 2013г).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 13 печатных работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы « Материалы и методы исследований», 3-х глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 125 источника, из которых 75 отечественных и 50 зарубежных. Работа содержит 30 рисунков и 14 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Характеристика групп обследованных пациентов

На базе кафедры оториноларингологии педиатрического факультета (зав. кафедрой -член-корр. РАМН, заслуженный деятель науки, проф., д.м.н. М.Р. Богомильский) и НИЛ «клинической и экспериментальной оториноларингологии детского возраста» (зав. д.м.н. И.В. Рахманова), на базе ГБУЗ Морозовской детской городской клинической больницы департамента здравоохранения г. Москвы (гл. врач больницы - заслуженный врач РФ, проф., д.м.н. И.Е.Колтунов) в отделении оториноларингологии (зав. к.м.н. А.П.

Китайгородский) и амбулаторно в консультативно-диагностическом центре (зав. к.м.н.Г.М. Зинкер) в период с 2009 по 2013 год проведен анализ результатов обследования и лечения 122 пациентов с гипертрофией аденоидных вегетаций в возрасте от 2-х до 7-ми лет и 33 здоровых ребенка того же возраста.

Перед включением в исследование было получено информированное согласие у родителей пациентов. Протокол клинического обследования и иммунотерапии утвержден на заседании Этического комитета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова (протокол № 103 от 13 декабря 2010 г.),

Критерием для включения в исследование явилось наличие у детей в возрасте от 2-х до 7-ми лет гипертрофии АВ II и III степени, отсутствие на момент исследования вирусной инфекции, острых воспалительных заболеваний и обострения хронических заболеваний, аллергопатологии.

Пациенты с гипертрофией АВ были разделены на три группы в зависимости от клинических проявлений. В первую группу были включены 39 пациентов с гипертрофией АВ, у которых преимущественно отмечалось затруднение носового дыхания, гнусавость, храп в ночное время, частые ОРВИ (группа I). Пациенты данной группы нуждались только в консервативной терапии. Вторую группу составили 38 детей, у которых наблюдались частые острые средние отиты (катаральные и гнойные), экссудативные средние отиты, снижение слуха (группа II). При этом на эндоскопическом исследовании носоглотки определялся блок глоточных устьев слуховых труб, гипертрофия трубных валиков, трубных миндалин. Данным пациентам была произведена эндоскопическая аденотомия в условиях интубационного наркоза. Третью группу составили 30 детей с диагнозом рецидив АВ (группа III). У данных пациентов в анамнезе уже была аденотомия.

Четвертая группа представлена 15 пациентами с гипертрофией АВ, которым, наряду с консервативным лечением, была проведена персонализированная иммунотерапия. В контрольную группу вошло 33 здоровых ребенка в возрасте от 2-х до 7 -ми лет 1-ой группы здоровья [Вельтищев Ю.Е., 1994; Шабалов Н.П. 2002].

Методы исследования Клинические методы исследования включали в себя: сбор анамнеза, оценку соматического статуса пациента, оториноларингологический осмотр (передняя

риноскопия, фарингоскопия и отоскопия). Всем обследованным нами пациентам было произведено эндоскопическое исследование полости носа и носоглотки жесткими и гибкими оптическими системами фирмы KARL STORZ и WOLF (Германия), которое позволяет оценить форму носоглотки и расположенную в ней лимфоидную ткань, пролабирование ее в задние отделы полости носа, предлежание к хоанам и расположение в носоглотке по отношению к глоточным устьям слуховых труб. Также всем пациентам было произведено обследование слуховой функции методом тимпанометрии.

Все пациенты были обследованы JTOP-аллергологом для исключения аллергопатологии. Иммунологические и молекулярно-биологические методы исследования Исследование факторов врожденного иммунитета проводили на кафедре иммунологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова совместно с доцентом, к.м.н. Д.Д. Карташовым и д.м.н., в.н.с. НКЦ персонализированной медицины O.A. Свитич. Получение и обработку клинического материала проводили в соответствии с методическими рекомендациями «Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР- диагностики» Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ (2004). В качестве исследуемого материала в работе были использованы соскобы слизистой оболочки полости носа и слизистой глоточной миндалины, полученные с помощью «цитощеточки», тип D.

На рис. 1 представлена схема определения экспрессии генов TLRs и ПМП .

Соскоб со слизистой оболочки

Выдлление РНК с использованием РНК-сорбента и серии отмывок (комплект реагентов РИБО__COPC)___.

Определение уровня экспрессии генов

TLR-2, TLR-4, TLR9 и противомикробных пептидов[НВО-1.HBD2.HNP1-3 анализ результатов

ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ

Рисунок 1 Последовательность операций по определению экспрессии генов ТЫ^в и противомикробных пептидов в слизистой оболочке носа и глоточной миндалины.

Уровень экспрессии исследуемых генов определяли с помощью метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Свитич О.А.,2010). Для этого вначале выделяли РНК из биологического материала при помощи комплекта реагентов «РИБО-сорб». Выделенную РНК использовали как матрицу для синтеза кДНК в реакции обратной транскрипции с использованием набора Реверта (ИЛС,РФ). На последнем этапе ставили реакцию ПЦР-РВ. Последовательность праймеров TLR2, TLR4, TLR9 и ПМП (HBD1,HBD2,HBD3) подбирали с помощью программы Vector NTI 8,0, анализируя последовательность генов, полученную из электронной базы данных GenBank. Реакцию проводили в амплификаторе АНК-32. Все реакции проводили в строгом соответствии протокоов фирм производителей.

Методику персонализированной иммунотерапии проводили согласно медицинской технологии (ФС№2011/212 от 28.07.11) (Ковальчук Л.В. с соавт., 2011). В полученном бесклеточном супернатанте аутологичных культур лейкоцитов определяли содержание цитокинов и ПМП методом иммуноферментного анализа. Для определения концентраций ФНОа и ТФР01 использовали комерческие наборы фирмы Bender MedSystem, Австрия . Для определения концентрации HNP1-3 использовали наборы Ну Cult Biotechnology, Нидерланды, для а-тимозина - наборы фирмы Immunodiagnostic, Германия. Определение иммунопептидов проводили согласно протоколам, предлагаемым производителями тест-систем.

Статистическая обработка

Статистический анализ проводили с использованием общепринятых статистических методов [Гланц С., 1999]. Полученные данные обрабатывали с помощью программ BioStat и Excel. Для сравнения групп использовали непараметрические методы статистической обработки данных: критерий Манна-Уитни, критерий Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Клиническая характеристика детей с гипертрофией аденоидных вегетаций

Распределение 122 пациентов с гипертрофией АВ по возрасту и полу представлено в таблице 1

Таблица 1.

Распределение обследованных детей с гипертрофией АВ по возрасту и полу

Возраст (года) 2-3 года (не включительно) 3-7 лет

Пол Мальчики Девочки Мальчики Девочки

Абс. число (%) 13 (10,7) 7 (5,7) 67 (54,9) 35 (28,7)

Итого: 20 102

Следует отметить, что гипертрофия АВ чаще встречается в возрасте от 3-7 лет.

Таблица 2

Распределение детей обследованных групп по степени гипертрофии аденоидных вегетаций

Степень Пациенты, Пациенты, Пациенты Пациенты, Всего:

гипертро- которым которым показано с рециди- персонализирован-

фии показано оперативное вом АВ ная

аденоидов консерватив лечение группа Ш) иммунотерапия

ное лечение (группа II) п=30 (группа IV) п=15

(группа I) п=38

п=39

II степень 22 8 18 8 56

III степень 17 30 12 7 66

Анализ жалоб детей с гипертрофией АВ, а также клинических проявлений показал, что большинство из них беспокоит затруднение носового дыхания, гнусавость, храп в ночное время, частые простудные заболевания, перенесенные острые средние отиты, экссудативные средние отиты, жалобы на снижение слуха (Таблица 3).

Таблица 3

Клинические проявления у детей с гипертрофией аденоидных вегетаций обследуемых групп

Клинические проявления группа I п=39 группа II п=38 группа Ш п=30

Затруднение носового дыхания 23 (59%) 31 (81,6%) 20 (66,7%)

Храп в ночное время 16(41%) 18(47,4%) 11 (36,7%)

Гнусавость 9 (23%) 8(21%) 8 (26,7%)

Частые простудные заболевания 19(48,7%) 26 (68,4%) 11 (36,7%)

Острые средние катаральные отиты 12 (30,8%) 28 (73,7%) 10(33,4%)

Острые средние гнойные отиты 9 (23,7%)

Экссудативные средние отиты 8 (20,5%) 16 (42,1%) 9 (30%)

Кондуктивная тугоухость 8 (20,5%) 16(42,1%) 9 (30%)

По результатам клинических и инструментальных методов обследования пациенты с гипертрофией АВ, были разделены на три группы. В группу I вошли пациенты с гипертрофией аденоидов II и III степени, с жалобами на затруднение носового дыхания (59%), на частые простудные заболевания. У 48,7% обследованных, в анамнезе отмечался острый средний катаральный отит в 30,8% случаев. Детям этой группы было показано консервативное лечение. У пациентов группы II, нуждающихся в оперативном лечении гипертрофии АВ, в 80% случаев выявлена гипертрофия АВ III степени. Эти дети переносят частые простудные заболевания (пять и более заболеваний в год), острый средний катаральный отит (73,7%), гнойный отит (23,7%) и экссудативный средний отит. У 42,1% детей регистрируется кондуктивная тугоухость. У детей группы III в анамнезе была одна аденотомия (Таблица 3).

Комплексный анализ показателей врожденного иммунитета слизистой оболочки полости носа у здоровых детей и детей с гипертрофией АВ.

Эпителий слизистой оболочки полости носа выполняет функции физиологического и иммунологического барьера, участвуя в 1) распознавание патогенов с помощью То11-подобных рецепторов (ТЬЯв), 2) секреции цитокинов и противомикробных пептидов, 3) активации адаптивного иммунитета (включая пролиферацию специфичных клонов Т- и В-лимфоцитов) [О01 Е.Н., 2008, Быкова В.П.,2011].

Для оценки врожденного иммунитета слизистой оболочки полости носа нами применен аналитический подход, включающий определение экспрессии генов:

1) рецепторов ТЫ12, Т1Л14 и ТЫ19, распознающих широкий спектр патогенов бактериальной и вирусной природы;

2) эффекторных молекул, включая, противомикробные пептиды (альфа-дефенсин -НЫР1, бета-дефенсины слизистой НВ01 и НВ02) и цитокины (ФНОа, ИЛ-18, ИЛ-10).

Первоочередной задачей настоящей работы явилось изучение этих показателей у здоровых детей в возрасте от 2-х до 7-ми лет.

Суммарные результаты этого исследования представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Показатели врожденного иммунитета слизистой оболочки полости носа детей контрольной группы.

Исследуемые гены Уровень экспрессии

ТЬЯ2 2,89 ± 1,02 (0,08±0,03)

ТЬЯ4 3,7±1,14 (0,50±0,12)

ТЬЯ9 2,73 ± 0,64 (0,05±0,01)

НВО 1 4,37 ± 0,40 (2,34±0,97)

НВ0 2 4,03±1,174 (1,07±0,34)

НИР 1 5,77±0,68 (58,88±24)

В таблице 4 представлено относительное количество копий исследуемого гена в десятичных логарифмах, в скобках даны значения количества копий кДНК относительно 104 копий актина. Эти значения приведенные в скобках могут быть использованы, как нормативные показатели для оценки иммунитета слизистой оболочки носа в клинической практике.

Необходимо отметить, что у обследованных детей контрольной группы в слизистой оболочке полости носа экспрессия гена противоспалительного цитокина ИЛ-10 наблюдается в 100% случаев, экспрессия гена ИЛ-18 - в 20% и ФНОа - в 8,6% (рис. 4).

Таким образом мы показали, что эпителий слизистой оболочки полости носа здоровых детей экспрессирует гены распознающих рецепторов врожденного иммунитета ТЫ12, Т1Л4, ТЬЯ9. а также противомикробных пептидов и цитокинов, осуществляющих прямое противобактериальное и противовирусное действие. Баланс этих молекул и обеспечивает защиту слизистой оболочки.

Анализ показателей врожденного иммунитета у пациентов с гипертрофией АВ II и III степени, которым было показано консервативное лечение (группа I), не выявил достоверных различий в уроне экспрессии генов ТЬЯ2, ТЫ14, ТЬЯ9 и противомикробных пептидов от нормативных показателей (Таблица 5). Нет достоверных отличий и в частоте выявления экспрессии генов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (Рис. 4). Полученные данные представляются важными, т.к. в комплексе с другими методами обследования позволяют обосновать консервативное лечение гипертрофии аденоидных вегетаций у этой группы детей. Отсутствие изменений в показателях врожденного иммунитета слизистой оболочки полости носа может явиться важным критерием для сохранения глоточной миндалины. Однако, сохраняя свою функцию, гиперплазированная лимфоидная ткань носоглотки в ряде случаев может быть причиной развития патологических изменений, носящих, как местный характер (ринит, острый синусит, средний отит и т.д.), так и общий (нарушение обмена веществ, замедленный рост ребенка, гипоксия и др.) [Богомильский М.Р.; Гаращенко Т.И. 2007]. В данном случае применяют оперативный метод лечения.

В нашей работе было обследовано 38 пациентов, которым по клиническим показаниям показана аденотомия под эндоскопическим контролем (группа II). У детей группы II наблюдалось достоверное увеличение экспрессии генов ТЫ12, Т1Л4, распознающих

бактериальные патогены. Так, экспрессия гена ТЬЯ2 увеличена в 15,8 раза (р=0,006), Т1Л4 - в 10,2 раза (р=0,019) по сравнению с контрольной группой (Таблица 5, Рис. 2).

Экспрессия гена ТЬЫ9 в группе II была снижена в 5 раз по сравнению с показателями ТЬЯ9 у пациентов контрольной группы. Уровень экспрессии гена НЕЮ1 снижен в 33,4 раза, НЕШ2 - в 21 раз, НМЧ - в 3,4 раза по сравнению с контрольной группой (Рис. 2, Таблица 5).

Таблица 5

Экспрессия генов ТЬЫв и противомикробных пептидов в слизистой полости носа у детей с гипертрофией АВ (группы 1,11,III).

Исследуемые группы Экспрессия генов Здоровые дети п=33 Консервативное лечение (группа1) п= 39 Оперативное лечение (группаП) п=38 Рецидив АВ (группа Ш) п=30

Т1Л*2 2,89 ± 1,02 (0,08±0,03) 3,12±0,64 (0,13±0,02) 4,09±1,34 '" (1,23±0,4) 2,80±0,51 (0,06±0,01)

Т1Л14 3,7±1,14 (0,50±0,12) 4,22±1,47 (1,66±0,27) 4,71±0,90 * (5,13±0,98) 4,09±0,63 (1,23±0,189)

Т1Л19 2,73 ± 0,64 (0,05±0,01) 2,95±0,58 (0,09±0,02) 2,02±0,77 * (0,01±0,003) 3,41±0,67 * (0,27±0,03)

НВО 1 4,37 ± 0,40 (2,34±0,97) 4,23±0,27 (1,70±0,54) 2,83±0,70 * (0,07±0,017) 4,54±0,52 (2,47±1,05)

НЕЮ 2 4,03±1,174 (1,07±0,34) 3,93±0,95 (0,85±0,26) 2,67±0,83 * (0,05±0,015) 4,24±0,42 (1,74±0,17)

ГО1Р 1 5,77±0,68 (58,88±24) 5,87±0,53 (74,13±31) 5,24±0,28 * (17,38±0,928) 6,21 ±0,29 (63,3±7,57)

В таблице 5 представлено относительное количество копий исследуемого гена в десятичных логарифмах, в скобках даны значения количества копий кДНК относительно 104 копий актина

* - показатель достоверно отличается от значений здоровых детей (р<0,05)

НВР 2 НВР НМР^г-^

*

*

■ Пациенты контрольной групп! а Пациенты I группы □ Пациенты II группы

Б - Экспрессия генов ПМП

Рисунок 2 Экспрессия генов молекул врожденного иммунитета в клетках слизистой оболочки полости носа у пациентов контрольной, 1-й и Н-й групп.

По оси ординат представлены показатели экспрессии генов в относительных единицах,

определяемых как отношение абсолютного значения количества копий исследуемого гена в группах I и II к значению показателя здоровых детей (принятого за единицу). * - значение достоверно отличается от группы сравнения (контрольная группа),р < 0,05

Таким образом, выявлен дефект в механизмах защиты слизистой оболочки полости носа у детей группы II. Резкое увеличение экспрессии генов распознающих рецепторов ТЫ12, ТЬЯ4 сочетается со сниженной экспрессией генов эффекторных молекул противомикробных пептидов. Выявленные изменения в показателях врожденного

иммунитета слизистой оболочки полости носа могут служить дополнительными критериями для обоснования проведения поднаркозной эндоскопической аденотомии.

В наших исследованиях во время поднаркозной аденотомии был получен соскоб со слизистой глоточной миндалины и с помощью ПЦР-РВ определена экспрессия генов молекул врожденного иммунитета. Следует отметить, что уровень экспрессии генов этих молекул, не отличается от экспрессии в слизистой оболочке полости носа. В работе В.П. Быковой с соавт. (2011г.) с помощью иммуногистохимического метода продемонстрирована экспрессия молекул ТЬК2, ТЬЯ4, ТЬЯ9 в эпителиальных структурах небных и глоточной миндалин, удаленных по поводу гипертрофии, хронического тонзиллита и хронического аденоидита [ Быкова В.П., 2011].Эти результаты подтверждают полученные нами данные по экспрессии генов ТЬЯэ в слизистой оболочке глоточной миндалины.

Т1_Я2 Т1_|}4 ТШ9 НЕЮ2 Н№1

Рисунок 3. Экспрессия генов молекул врожденного иммунитета в клетках слизистой оболочки полости носа и слизистой глоточной миндалины у детей группы II.

По оси ординат представлено относительное количество копий исследуемого гена в десятичных логарифмах.

Таким образом можно сделать вывод, что определение показателей врожденного иммунитета из биологического материала (соскобов), полученных со слизистой полости носа, является доступным методом, отражающим состояние врожденных механизмов защиты на уровне лимфоидной ткани глотки.

Механизмы возникновения рецидива гипертрофии аденоидных вегетаций до конца не изучены. Какие изменения в показателях врожденного иммунитета наблюдаются при рецидиве гипертрофии АВ? Для решения этой задачи нами была исследована группа, состоящая из 30 детей с диагнозом рецидив гипертрофии аденоидных вегетаций (группа Ш). Проведенные исследования не выявили изменений в экспрессии генов Т1Л2, ТЬЯ4 и

противомикробных пептидов в слизистой оболочке полости носа по сравнению с группой здоровых детей. Наблюдалось достоверное увеличение экспрессии гена Т1Л9, распознающего Срв-повторы ДНК вирусов и бактерий. Известно, что цитокины являются универсальными регуляторными молекулами иммунной системы, контролирующими процессы воспаления, функциональной активности клеток и др. В связи с этим на следующем этапе работы был проведен анализ экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов в слизистой носа в группе детей с диагнозом рецидив гипертрофии АВ и группах сравнения методом ОТ-ПЦР.В группе детей с гипертрофией АВ частота выявления ФНО составила 20%, ИЛ-18-50%, ИЛ-10 выявлялся у 50% детей. У детей с рецидивом гипертрофии АВ (III группа) экспрессия генов ФНОа и ИЛ-18 определялась у всех обследованных детей, напротив, ИЛ-10 - лишь у 50 % (Рис.4) Изменение баланса цитокинов в сторону увеличения провоспалительных и снижения уровня экспрессии противовоспалительного иммуносупрессорного цитокина ИЛ-10 могут рассматриваться как один из прогностических критериев рецидива гипертрофии АВ.

120 100 80 60 40 20 0

Л

■ Контрольная группа

□ Гипертофия аденоидов

□ Рецидив аденоидов

Рисунок 4 Экспрессия генов про- и противовоспалительных цитокинов в слизистой полости носа у пациентов контрольной группы, у детей с гипертрофией аденоидных вегетаций (I группа) и у пациентов с рецидивом АВ (III группа).

По оси ординат представлен % детей с выявленной экспрессией генов цитокинов.

На основании наших результатов можно представить схематически роль факторов врожденного иммунитета в патогенезе воспалительных заболеваний ЛОР-органов (Рис.5). Инфекционные агенты, взаимодействуя с ТЬЯэ на клетках слизистой полости носа индуцируют выработку эпителиальными клетками важных эффекторных молекул: дефенсинов и/или цитокинов. Дефенсины, оказывая прямое противомикробное действие на различные микроорганизмы, защищают слизистые от патогенов. Гиперэкспрессия ТЬЯ

не безопасна для организма. При гипертрофии аденоидных вегетаций с показаниями к хирургическому лечению (группа II) гиперэкспрессия генов ТЬЯ2, ТЫМ сочетается с уменьшением экспрессии противомикробных пептидов. Это приводит к снижению защиты слизистых оболочек. В случае рецидива гипертрофии аденоидов изменения наблюдаются на уровне экспрессии генов цитокинов, причем возрастает уровень экспрессии генов провоспалительных цитокинов. Таким образом, дефект врожденного иммунитета на уровне слизистой оболочки можно рассматривать как один из механизмов патогенеза воспалительных заболеваний ЛОР-органов.

Рисунок 5. Роль врожденного иммунитета в патогенезе заболеваний ЛОР-органов.

Персонализированная иммунотерапия в комплексном лечении детей с гипертрофией аденоидных вегетаций.

Новый взгляд на механизмы врожденного иммунитета слизистых открывает совершенно новые подходы не только к диагностике, но и к лечению гипертрофии аденоидных вегетаций.

В нашей работе применена новая медицинская технология персонализированной иммунотерапии [Ковальчук Л.В. с соавт., 2011]. В основу метода положено локальное применение аутологичного комплекса иммунопептидов (АКИ), вырабатываемых лейкоцитами пациента. При разработке алгоритма персонализированной иммунотерапии в лечении гипертрофии АВ необходимо было решить следующие задачи: 1) получить АКИ и оценить в нем содержание цитокинов (ФНОа, ТФР|3) »противомикробных пептидов и а-тимозина у детей с гипертрофией аденоидных вегетаций; 2) оценить клиническую

эффективность применения АКИ и изменения в показателях врожденного иммунитета у детей с гипертрофией АВ.

В исследование включено 15 детей с гипертрофией АВ II и III степени, в возрасте от 4 до 7 лет, которым наряду с консервативным лечением применялась персонализированная иммунотерапия (1У группа). Группу сравнения составили 39 детей с аналогичным диагнозом, того же возраста, которым проводилось только консервативное лечение (I группа). Обе группы были сопоставимы по клиническим проявлениям, по критерию Фишера (р>0,05).

В таблице 6 представлены средние концентрации пептидов в АКИ здоровых детей и детей IV группы.

Таблица 6.

Концентрации иммунопептидов (ФНОа, ТФРр, Н№1-3, а-тимозина) в аутологичных комплексах пациентов контрольной группы (здоровые дети) и у детей с гипертрофией АВ (1Угруппа).

Определяемые иммунопептиды Концентрация иммунопептидов в аутологичном комплексе (пг/мк)

Контрольная группа -здоровые дети (п=33) 1Угруппа (п= 15)

ФНОа 2,3±1,0 3,9±2,8

ТФРР 368,7±110,3 467,7± 135,8

НЫР 1-3 3256,0±280,0 3500,8±500,1

а-тимозин 660,5± 120,0 780,0± 132,0

Достоверных различий в уровне иммунопептидов в АКИ детей с гипертрофией АВ и детей контрольной группы не выявлено (р>0,05).

Нами разработана схема применения АКИ. После элиминационной терапии закапывали полученный комплекс аутологичных иммунопептидов (назальные капли) в каждую половину носа по 2 капли 2 раза в день в течение 7-ми дней.

Оценка клинической эффективности персонализированной иммунотерапии показала, что в течение 6-ти месяцев после ее проведения наблюдалось достоверное снижение частоты возникновения острого среднего катарального отита (р<0,05). Только у одного ребенка (6,7%) группы IV наблюдался острый средний катаральный отит. В группе I,

частота возникновения острых средних отитов составила 15,4%. Сократилась частота возникновения ОРВИ в этой группе детей. За период наблюдения у 4-х детей (26,6%) выявлено лишь по одному эпизоду ОРВИ. У детей I группы наблюдали по 2 эпизода ОРВИ у 13 детей (33,3%) в течение 6-ти месяцев.

После проведенного лечения у всех детей IV группы носовое дыхание восстановилось, в то время как три ребенка (7,7%) из 1 группы продолжали жаловаться на затруднение носового дыхания.

При анализе показателей врожденного иммунитета слизистой оболочки полости носа у детей 1Угруппы наблюдалось снижение экспрессии гена Т1Л2 и увеличение экспрессии гена НВБ2 наиболее выраженное через 6 месяцев, что свидетельствует о полноценной защите слизистой оболочки.

У пациентов I группы экспрессия Т1Л2 и НВБ2 снизились спустя 6 месяцев (Рис. 6).

0,35

О -,-,-

до начала лечения через 1 мес. лолсе через 6 мес после лечения лечения

А - изменение экспрессии гена ТЬЯ2

о ---,-

до начала лечения через 1 мес. лолсе через б мес после лечения лечения

* IV группа - 1 группа

Б - изменение экспрессии гена НВ02

Рисунок 6. Динамика показателей экспрессии генов ТЫ12, НВБ2 у пациентов, которым проводилась персонализированная иммунотерапия (IV группа) и у пациентов, которым проводилось только консервативное лечение (I группа).

Следовательно, применение аутологичного комплекса иммунопептидов (АКИ) является эффективным, безопасным методом лечения, хорошо сочетающимся с общепринятым

консервативным лечением гипертрофии аденоидных вегетаций. Нами не было выявлено аллергических реакций, повышения температуры тела, отмечена хорошая переносимость назальных капель, также подтверждена безопасность и эффективность АКИ в комплексной терапии гипертрофии аденоидных вегетаций.

Применение индивидуального метода лечения на основе молекул, синтезируемых клетками иммунной системы пациента, представляется перспективным в плане профилактики развития аденоидитов, снижения возникновения средних отитов, ОРВИ и может быть рекомендовано в комплексном лечении патологии JIOP-органов.

В дальнейшем использование разработанного нового подхода к оценке системы врожденного иммунитета слизистой оболочки полости носа на основе определения экспрессии генов TLR и противомикробных пептидов методом ПЦР в реальном времени может быть использовано при различных заболеваниях ЛОР-органов.

ВЫВОДЫ

1. Разработан комплексный подход к оценке врожденного иммунитета слизистой оболочки полости носа у детей, основанный на определении экспрессии генов распознающих рецепторов врожденного иммунитета TLR2, TLR4, TLR9, противомикробных пептидов (HBD1, HBD2, HNP1) и цитокинов (ФИО, ИЛ-18, ИЛ-10), осуществляющих иммунную защиту. Показатели врожденного иммунитета слизистой полости носа здоровых детей не отличаются от показателей пациентов с гипертрофией аденоидных вегетаций, которым показано консервативное лечение.

2. Выявлен дисбаланс в механизмах защиты слизистой оболочки полости носа у детей, которым показано хирургическое лечение: резкое увеличение экспрессии генов распознающих рецепторов TLR2, TLR4 сочетается со сниженной экспрессией генов эффекторных молекул противомикробных пептидов.

3. Определение показателей врожденного иммунитета из биологического материала (соскобов), полученных со слизистой полости носа, является доступным методом, отражающим состояние врожденных механизмов защиты на уровне лимфоидной ткани носоглотки.

4. У детей с рецидивом аденоидных вегетаций в 100% случаев определяется экспрессия гена ФНОа и ИЛ-18, и лишь в 50% случаев - экспрессируется противовоспалительный

цитокин ИЛ-10. Данные показатели могут служить одним из прогностических критериев развития рецидива аденоидных вегетации.

5. Разработан алгоритм проведения персонализированной иммунотерапии в комплексном лечении гипертрофии аденоидных вегетаций у детей, основанной на применении аутологичных регуляторных иммунопептидов в виде назальных капель в течение 7-ми дней. Показана клиническая эффективность метода, проявляющаяся в снижении частоты развития острых средних отитов и ОРВИ в течение 6-ти месяцев после лечения.

Практические рекомендации

1 .Для определения показателей врожденного иммунитета лимфоидной ткани носоглотки разработан метод определения экспрессии генов распознающих рецепторов (ТЬЯ2, ТЫ14, Т1Л9) и противомикробных пептидов (НВЭ1, НВЭ2, НЫР1) в соскобах слизистой оболочки полости носа методом ПЦР в реальном времени.

2,Определены нормативные показатели врожденного иммунитета слизистой оболочки полости носа у здоровых детей в возрасте от 2 до 7 лет.

3.Выявление нарушений в системе врожденного иммунитета слизистой полости носа может служить дополнительным, ранним обоснованием для назначения оперативного метода лечения пациентов с гипертрофией аденоидных вегетаций.

Изучение системы врожденного иммунитета слизистой оболочки полости носа у детей с гипертрофией аденоидных вегетаций представляется весьма значимым для оценки прогноза заболевания и дополнительного обоснования метода лечения, включения иммунотропной терапии.

4.Разработанный метод персонализированной иммунотерапии является безопасным, эффективным, хорошо сочетающимся с общепринятым консервативным лечением гипертрофии аденоидных вегетаций. Разработана схема интраназального применения аутологичного комплекса иммунопептидов, включающая закапывание АКИ в каждую половину носа по 2 капли 2 раза в день в течение 7-ми дней.

5. Включение метода персонализированной терапии в комплексное лечение пациентов с гипертрофией аденоидных вегетаций способствует уменьшению частоты развития острых средних отитов, нормализации носового дыхания, снижению частоты возникновения аденоидитов, а следовательно сохранение нормальной слуховой функции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1) Ганковский В.А. Экспрессия противомикробных пептидов слизистой оболочки носа при гипертрофии аденоидных вегетации. / Ганковская JI.B., Богомильский М.Р., Рахманова И.В., Бабакина JI.A., Ганковский В.А. // Вестник уральской медицинской академической науки. -2010. - № 2/1 (29), С 108-109.

2) Ганковский В.А. Экспрессия генов Toll — подобных рецепторов слизистой оболочки носа в норме и при гипертрофии аденоидных вегетаций. / Ковальчук Л.В., Рахманова И.В., Ганковская O.A., Бабакина Л.А., Ганковский В.А. // Вестник оториноларингологии приложение. - 2010. - №5, С 248-249.

3) Ганковский В.А. Изучение ассоциации полиморфных маркеров, локализованных в гене DEFB1, с гипертрофией аденоидных вегетаций у детей. / Свитич O.A., Зайцева И.А., Ганковский В.А., Карташов Д.Д., Аитова Ю.В., Ганковская Л.В. // Материалы конференции :V Всероссийская конференция с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий». 2010, С. 100.

4) Ганковский В.А. Комплексный анализ противомикробных пептидов слизистой оболочки носа в норме и при гипертрофии аденоидных вегетаций. / Богомильский М.Р., Ганковская Л.В.,Рахманова И.В.,Бабакина Л.А.,Ганковский В.А. // Российская Ринология. - 2010. - №3, С. 6.

5) Ганковский В.А. Новые технологии в оценке компонентов врожденного иммунитета слизистой оболочки носа. / Ганковская Л.В., Богомильский М.Р., Рахманова И.В., Бабакина Л.А., Ганковский В.А. // Сборник материалов XVII конгресса человек и лекарство. 2010, С 398-399.

6) Ганковский В.А. Индивидуальный подход к оценке противомикробных пептидов слизистой оболочки носа у детей с гипертрофией аденоидных вегетаций. / Ганковский В.А., Рахманова И.В., Ковальчук Л.В., Ганковская O.A. // Материалы XVIII съезда оториноларингологов России. -2011. - Том 1, С. 203.

7) Ганковский В.А. Роль компонентов врожденного иммунитета в защите слизистой оболочки полости носа в норме и при гипертрофии аденоидных вегетаций. / Ковальчук Л.В., Рахманова И.В.,Ганковская Л.В., Ганковский В.А. //Вестник оториноларингологии. — 2011. - №6, С. 7375.

8) Ганковский В.А. Роль То11-подобных рецепторов в патогенезе инфекционных заболеваний человек. / Ковальчук Л.В., Свитич O.A., Ганковская Л.В., Мирошниченкова A.M., Ганковский

В.А. // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2012. - №2, С. 147-153.

9) Ганковский В.А. Ассоциация полиморфных маркеров, локализованных в 5'-нетранслируемой области гена Р-дефенсина DEFB1, с гипертрофией аденоидных вегетаций. / Свитич О.А., Ганковская JI.B., Рахманова И.В., Зайцева И.А., Ганковский В.А. // Вестник РГМУ. - 2012. - №3, С. 59-62.

10) Ганковский В.А. Персонализированная иммунотерапия в лечении гипертрофии аденоидных вегетаций у детей. / Ковальчук JI.B., Ганковская JI.B., Рахманова И.В., Свитич О.А., Зинкер Г.М., Ганковский В.А., Карташов Д.Д., Волкова Ю.В., Руссанова К.В. // Вестник РГМУ. - 2012. - №4, С. 50-54.

11) Gankovskii V.A. The association of polymorphism in the gene beta-defencin 1 with hypertrophic vegetations. / Svitich O.A., Gankovskii V.A., Zaiceva I.A., Labdginov P.A. // Тезисы докладов на EAACI Congress 2012 in Geneva 16-20 June, p. 1481.

12) Gankovskii V.A The imbalance in expression of genes of innate immunity of children with adenoid hypertrophy vegetations / Svitich O; Gankovskii V; Gankovskaya L; Rahmanova I. // Тезисы докладов на симпозиуме SERIN 2013, с. 30.

13. Ганковский В.А. Оценка показателей врожденного иммунитета слизистой полости носа у детей. / Ганковский В.А.Зайцева И.А., Рахманова И.В. // Российский иммунологический журнал. -2013. - №2-3, С.156

Список сокращений

АВ - аденоидные вегетации

TLR - Toll-like reseptor (То11-подобный рецептор)

ПМП - противомикробные пептиды

ФНО - фактор некроза опухоли

ИЛ - интерлейкин

HBD - human beta-defensin (человеческий Р-дефенсин)

HNP - human neutrophil peptide (человеческий нейтрофильный пептид)

ТФР - трансформирующий фактор роста

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени АКИ - аутологичный комплекс иммунопептидов

Заказ № 63-Р/09/2013 Подписано в печать 16.09.13 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; e-maiUinfo@cfr.ru