Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Экспрессия интерлейкина-1бета в контрлатеральных полушариях головного мозга

Р Г Б ОД

Г •• п

на правах рукописи

ГРЕБЕНЩИКОВ АНДРЕЙ ЮРЬЕВИЧ

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ИНТЕРЛЕЙКИНА-1БЕТА В КОНТРАЛАТЕРАЛЬНЫХ ПОЛУШАРИЯХ ГОЛОВНОГО МОЗГА.

14.00.36.- Аллергология и иммунология

Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 1997

Работа выполнена в Институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель - доктор медицинских наук

В. В. Абрамов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

А. В. Шурлыгина доктор медицинских наук К. В. Гайдуль

Ведущая организация: НИИ психического здоровья

ТНЦ СО РАМН

Защита состоится " " 1997 года в часов на заседании диссертационного совета Д 001.01.01. Института клинической иммунологии СО РАМН (630091, Новосибирск, ул. Ядринцовская, 14)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан " " 1997 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических -наук

О.Т. Кудаева

Актуальность исследования: Последнее десятилетие ознаменовалось быстрым развитием нейроиммунологии. возникшей на стыке классических иммунологии и нейробиологии. Получены данные о важнейших иммунорегуляторных функциях центральной нервной системы и механизмах, их опосредующих (Абрамов В.В.,1991. Девойно Л.В.. Ильюченок Р.Ю. 1993, Husband А.. 1995, BlalockJ., 1994). Эти факты доказывают существование тесных функциональных взаимосвязей нервной и иммунной систем In vivo. Однако изучение процессов нейроиммуномодулявди в настоящее время ограничивается в основном исследованием функций гипоталамических центров в регуляции иммунного ответа и сравнительно мало известно о роли полушарий головного мозга в этих процессах. Существующие данные демонстрируют неодинаковое влияние противоположных полушарий головного мозга на функциональную активность иммунной системы (Neveu P.J.,1990, Renoux G.,1991), но результаты этих исследований весьма противоречивы и во многом зависят от использованного авторами методического подхода, что затрудняет их сравнение.

Несмотря на тот факт, что изучение асимметричной нейроимму-норегуляции продолжается более 15 лет, обратное явление, то есть воздействие иммунной системы на асимметрию полушарий головного мозга остается малоизученным. В этой связи представляется перспективным изучение общих для нервной и иммунной систем биологически активных веществ, их распределение и роль в ЦНС при иммунном ответе. «

В последнее время показано существование в ЦНС нового класса потенциальных нейромедиаторов - цитокинов иммунной системы (Qlnarello С.А., 1994). Первым и наиболее изученным цитокином, влияние которого из ЦНС на иммунитет было описано, является ин-терлейкин-1 (ИЛ-1) (Sundar S.K. et al., 1990, Weiss J.M. et al., 1993). Кроме того, выявлены изменения содержания ИЛ-1 и его рецепторов в ЦНС при активации иммунной системы (Bodmer S. et al., 1985, Takao T. et al.,1994,1995). a также ряд регуляторных воздействий на интрацеребральный ИЛ-1 со стороны ряда центральных нейромедиаторных систем, принимающих участие в нейроиммуномоду-ляции (Mohankumar P.S. et al.,1991, Shintani F. et al., 1993, 1995). Эти факты свидетельствуют о возможной физиологической значимости существования интрацеребрального ИЛ-1 и его связи с активностью иммунологических процессов.

Цель исследования: Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы являлось изучение экспрессии гена ИЛ-10 в контрала-теральных полушариях головного мозга в норме и при формировании иммунного ответа, а также выяснение возможных механизмов участия иммунной системы в регуляции экспрессии гена ИЛ-10 в контралате-ральных полушариях головного мозга.

В рамках поставленной проблемы ставились следующие задачи: 1. Исследовать уровень мРНК ИЛ-10 в контралатеральных полушариях головного мозга интактных животных (мышей). 2.Определить кинетику экспрессии мРНК ИЛ-10 в полушариях головного мозга и органах иммунной системы (селезенке) при периферическом введении Т-неза-висимого антигена (липополисахарида). 3. Определить кинетику экспрессии мРНК ИЛ-10 в полушариях головного мозга и органах иммунной системы (селезенке) при периферическом введении Т-зависимого антигена (эритроцитов барана). 4.Исследовать влияние периферического введения капсаицина на экспрессию мРНК ИЛ-10 в полушариях головного мозга и селезенке взрослых мышей. 5.Изучить влияние периферического введения индометацина на экспрессию мРНК ИЛ-10 в полушариях головного мозга и селезенке. 6.Исследовать влияние периферического введения ИЛ-10 на экспрессию мРНК ИЛ-10 в полушариях головного мозга и селезенке.

Основные результат исследования и их научная новизна: Впервые установлено, что содержание мРНК гена ИЛ-10 в противоположных полушариях головного мозга мышей неодинаково. Уровень экспрессии мРНК данного цитокина в правом полушарии превышает таковой в левом полушарии головного мозга.

Впервые выявлены закономерности изменения экспрессии мРНК ИЛ-10 в контралатеральных полушариях головного мозга в процессе активации иммунной системы антигенами разных типов - Т-независи-мым (липополисахарид) и Т-зависимым (эритроциты барана). Продемонстрировано. что эти изменения в левом полушарии не зависят от типа использованного антигена и проявляются в виде снижения уровня мРНК ИЛ-10 на пике экспрессии мРНК этого цитокина в иммунной системе, тогда как в правом полушарии головного мозга экспрессия мРНК ИЛ-10 повышается главным образом при введении Т-зависимого антигена при усилении экспрессии мРНК данного гена в иммунной системе. Также нами показано, что в ранний период формирования иммунного ответа на Т-независимый и Т-зависимый антигены происходит преобладание относительной активности правого полушария головного мозга по параметру экспрессии мРНК гена ин-терлейкина-10.

Установлено, что блокада периферических чувствительных нервных окончаний капсаицином приводит к повышению уровня мРНК ИЛ-10 в правом полушарии головного мозга и селезенке, но не в левом полушарии мозга мышей.

Также показан разный характер влияния блокады синтеза периферических простагландинов на экспрессию мРНК гена ИЛ-1[5 в противоположных полушариях мозга. Продемонстрировано отсутствие влияния блокатора синтеза простагландинов индометацина на экспрессию мРНК ИЛ-1Р в левом полушарии головного мозга и стимулирующее действие его на уровень мРНК этого цитокина в правом полушарии.

Выявлено, что цитокин интерлейкин-1& при периферическом введении оказывает стимулирующее влияние на уровень мРНК интер-лейкина-1Р в правом и левом полушариях мозга. Показан эффект разных доз рекомбинантного интерлейкина-1|3 на асимметрию экспрессии мРНК гена, интерлейкина-10 в полушариях гдЛовного мозга.

Теоретическая значимость и практическая ценность работы: Представленный материал имеет большое теоретическое значение, поскольку позволяет установить существование принципиально нового явления - асимметрии экспрессии гена ИЛ-1|5 в полушариях головного мозга. Более того, показано наличие тесной .взаимосвязи между состоянием иммунной системы и асимметричной экспрессией гена И/1-10 в левом и правом полушарии головного мозга. Полученные результаты значительно расширяют существующие представление о регуляции экспрессии генов цитокинов в центральной нервной системе, а также о процессах взаимодействия двух важнейших гоме-остатических систем организма (нервной и Иммунной) в ходе антигенной стимуляции.

Представленные результаты имеют также и практическую значимость, поскольку • выяснение конкретных биохимических маркеров функциональной активности контралатеральных полушарий головного мозга -при иммуногенезе и механизмов их взаимосвязи с иммунной системой может в дальнейшем как прояснить роль контралатеральных полушарий в нейроиммунорегуляции, так и послужить предпосылкой для обоснованной иммунокоррекции посредством воздействия на им-мунорегуляторную функцию конкретных полушарий головного мозга.

Положения, выносимые на защит: 1. В контралатеральных полушариях головного мозга ген ИЛ-1(5 экспрессируется асимметрично. 2. Развитие иммунного ответа на Т-зависимый и Т-независимый антигены сопровождаются несходными динамическими изменениями содержания мРНК гена ИЛ-10 в контралатеральных полушариях головно-

го мозга. 3. Мессенжеры иммунной системы ИЛ-10 и простагландины оказывают регулирующее воздействие на экспрессию гена ИЛ-10 в контралатеральных полушариях головного мозга. 4. Периферические чувствительные нервные окончания принимают участие во взаимосвязи экспрессии гена ИЛ-10 в полушариях головного мозга и иммунной системе.

Апробация работы и публикации: Материалы диссертации доложены и обсуждены на 2-й отчетной конференции ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1994); семинаре лаб. нейроиммунологии ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1996); конференции молодых ученых ИКИ СО РАМН (Новосибирск. 1996); 3-й отчетной конференции ИКИ со РАМН (Новосибирск, 1997). Апробация диссертации состоялась на расширенном семинаре ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 27 мая 1997 г.). По теме диссертации бпубликованно 8 работ.

Объем ц структура работы: Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, заключения й- рыводов. Диссертация включает в себя 18 рисунков и 2 таблицы. Библиографический список включает 163 источника, в том числе 146 на иностранном.

- 7 -МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Экспериментальные животные.Исследования Проводились на самцах мышей (CBAxC57BL/6)Fl, 3-4 месячного возраста, из вивария ИКИ СО РАМН. Количество животных в группе 5-6 штук. Органы и ткани от каждой группы животных пулировались. Все органы и ткани до выделения РНК хранились в жидком азоте. В работе использовались индо-метацин ("Sigma"), капсаицин ("Merk"), рекомбинантный ИЛ-lß, ЛПС ("Difco"), эритроциты барана.

Об экспрессии гена ИЛ-lß судили по количеству матричной РНК (мРНК) в препаратах суммарной РНК, выделенной по Chomczynsky Р., Sacchi N (1987). Методом электрофореза (Маниатис Т. и др., 1984) контролировали недеградированность молекул РНК. Степень очистки РНК контролировали по соотношению оптической плотности при 260 нм и 280 нм. Плазмида pBS ("Stratagene"), содержащая в EcoRI сайте нуклеотидную последовательность гена ИЛ-lß мыши (275-1327 и.о.), была любезно предоставленна нам Dr. T.Hamilton (Ohmori Y. et-al., 1990). Наработку плазмидной ДНК осуществляли по рекомендациям Ма-ниатиса Т. и др. (1984). В качестве зонда использовали кДНК гена ИЛ-lß мыши (275 - 1327 и.о.), выделенную электроэлюцией (Маниатис Т. и др., 1984). Мечение [а-32РШТР вставки кДНК гена ИЛ-lß мыши проводилось методом олигонуклеотидной затравки (Салганик Р. И., 1990). Блот-гибридизацию (Маниатис Т. и др.,1984) и количественную дот-гибридизацию (Chianale J. et al.,1988) препаратов суммарной РНК проводили в 50% формамиде (Маниатис Т. и др., 1984). Количественный анализ дот-гибридизации с использованием внутренних стандартов проведен на лазерном денситометре (Chianale J. et al.,1988).

Перитонеальные макрофаги получали с помощью 4% суспензии гид-ролизированного крахмала (Хант С., 1990). Определение ИЛ-1 подобной биологической активности проводилось в культуре мышиных тимо-цитов (Phillips R.. Rabson A.R., 1983).

Статистическую обработку результатов призводили с использованием пакета программ "Statgraf". Результаты количественной дот-гибридизации выражались в условных единицах оптической плотности (У.Е.). Достоверность в сравниваемых группах оценивали методом непараметрического сравнения рядов по Вилкоксону-Манну-Уит-ни. Коэффициент межполушарной асимметрии (КА) вычислялся как (А+В/А-В) х 100% (Л.В. Бианки, 1989). Все данные в работе представлены как среднее значение ± ошибка среднего значения (М±га).

- 8 -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В начале исследования мы выяснили, что зонд кДНК ШЫр мыши, пригоден как для качественного, так и для количественного анализа мРНК соответствующего гена. Результаты блот-гибридизации препаратов РНК из перитонеальных макрофагов представлены на рис.1. В на-' ших опытах обнаруживалась только РНК длиной около 1400 и.о., что согласуется с литературными данными (Gray P.W. et al., 1986} и подтверждает специфичность' реакции гибридизации.

Рис.1 Бл от-ги6ридизация проб суммарной РНК (5 мхг) нестиму лир о ванных (1) и стимулированных ЛПС < 2 ) крахмальных макрофагов мышей-самцов (СВАХС57В1/6) F1 с кДНК зондом ИЛ-lb мыши. Маркеры молекулярном массы - 18S и 28S р и б о с о -мальная РНК.

В аналогичных условия* при использовании количественной дот-гибридизации было показано, что уровень мРНК ИЛ-ip существенно повышен в препаратах суммарной РНК из стимулированных ЛПС макрофагов по сравнению с таковым в нестимулированных клетках (рис.2). Эти данные кореллируют с уровнем ИЛ-1-подобной активности в супернатантах упомянутых клеточных культур (рис.3). Следовательно, данный зонд (кДНК ИЛ-ip мыши) применим для количественного анализа уровня экспрессии гена ИЛ-ip.

Рис.2 Дот-гибридизация

проб суммарной РНК стимулированных (1 } и нестимулированных ЛПС (2) крахмальных макрофагов мышей-самцов (СВАхС57В1/6)

F 1 с кДНК зондом ИЛ-1Р мы/

ы и . Отрицательный контроль - РНК. дрожжей (3). РНК нанесена в г-кратных разведениях от 5 мкг.

- :. • н

о

m ' 12 Т

УЕ"

ИВ"

Т

Р -¡.об

Рис.3 уровень и Л -1 в нестимулированных (1) и стимулированных ЛПС (2) перитонеальных макрофагах мышей-самцов (СВАХС57В1/6) F1. определенный методами количественной дот-гибридизации проб суммарной РНК с кДНК зондом И Л -1Р мычи (А) и тестированием ИЛ-1подобной биологической активности к ульту рально го супернатанта . (Ось орди-нат(А) - единицы оптической плотности / мкг. суммарной РНК (УЕ). ось ординат (Б) - индекс влияния (ИВ).

По имеющимся в литературе сведениям, цитокин ИЛ-1, также как и мРНК ИЛ-i а и (3 присутствует в неповрежденном головном мозге млекопитающих (Breder С. D. et al.. 1988, ТаКао Т. et al.,1993). Однако вопрос о характере распределения данного цитокина в конт-ралатеральных полушариях головного мозга ранее не рассматривался.

Для качественного определения уровня экспрессии мРНК ИЛ-10 в полушариях головного мозга использовался метод блот-гибридизации образцов суммарной РНК, экстрагированной из левого и правого полушария головного мозга интактных мышей с радиоактивномеченным фрагментом кДНК ИЛ-ip. использованным в качестве зонда (рис 4). При этом в пробах суммарной РНК как левого, так и правого полушария головного мозга выявлялась только мРНК длиной около 1400 и.о., что соответствует длине мРНК гена ИЛ-10 в макрофагах (Gray P.W. et al., 1986).

Рис.4 Б л от-ги6ридизация проб суммарной РНК (20 мкг) из левого (1) и правого (2) полушария голов-

I

ного мозга интактных мы-

ией-самцов (СВАХС57В1/6)

массы - 18 S и 28S р и босо-

F1. Маркеры молекулярной

м а л ьи а я РНК.

Наши результаты являются Дополнительным подтверждением экспрессии гена ИЛ-1р в ЦНС йнтактнвд животных (Вап(И1о»г С. Е. еЬ а1., 199оС 0. ^ а1г. • УяйиусМ К. е{ а1.. 1993). Также в экспериментах с использованием блот-гибридизаЦии выявляюсь различия в уровне экспрессии мРНК ИЛ-10 между полушариями. Содержание мРНК ИЛ-10 в правом полушарии было повышено'по: сравнению с таковым, в левом полушарии-головного мозга.1 " ' г -

Для количественного' анализа данного явления и'"его-дальнейшего изучения использовался метод количественной дот-гибридизации. При этом также обнаруживалась- асимметричная экспрессия мРНК ИЛ-10 с преобладарзм ее в" правом полушарии головного мозга (рис 5а). Следует отметить/ что уровень экспрессии МРНК ИЛ-10 как в левом, так и в правом полушариях головного мозга был ниже, чем уровень мРНК ИЛ-10 в' селезенке'; После статистического анализа результатов экспериментов были ¡выявлены достоверные различия относительного содержайия мРНК ИЛ-10 меаду контралатеральными полушариями головного мозг^Лриа 5б)'! ий^ктных,животных. Уровень мРНК ИЛ-10 в правом полушарии (89.3 ± 5,2°;. р < 0,05) достоверно превышал уровень мРНК•в^левом'470', 9" ± 2,5). Полученные нами результаты свидетельствуют .об-асимметричной экспрессии гена ИЛ-10 в правом и левом полушариях головнопо мозга.;

А

Ф ♦

2 3

€

• • •

у!00 -• 90

80 70 60 50 Ш -

2

Р< 0,05

Рис.5 А) Радиоавтограф дот-гибридизации проб суммарной РНК из левого (1), правого (2) полушария головного мозга и селезенки (3) интактных мышей-самцов (СВАХС57В1/6) П. Отрицательный контроль -РНК дрожжей (4). Пробы РНК нанесены в 2-кратных разведениях от 20 мкг. Б) Содержание мРНК ИЛ-1Ь в левой (1) и правом (2) полушариях головного мозга интактных мышей-самцов (СВАХС57В1/6) П. По оси ординат - условные единицы оптической плотности (УЕ).

4

- и -

Рядом авторов показано изменение содержания ИЛ-1 в ЦНС при активации иммунной системы (Bodmer S. et al., 1985, Takao T. et al., 1993,1995, Goujon E. et al., 1995), Учитывая это, мы исследовали динамику экспрессии мРНК ИЛ-ip в ..крнтралатеральных полушариях головного мозга и'селезенке при периферическом (внутривенном) введении Т-независимого/антигена - липополисахарида E.coll (ЛПС) в дозе 10 мкг/мышь, и Т-зависимого антигена -.эритроцитов барана (ЭБ) в дозе 5x10®/мышь. В качестве негативного контроля использовался эквивалентый объем физиологического раствора. Содержание мРНК ИЛ-ip в исследуемых органах определялось через 2, 6, 24 и 48 часов после воздействия. Следует отметить, что'в выбранных дозах ЛПС и ЭБ вызывали сходные по силе изменения .уровня экспрессии мРНК гена ИЛ-1 {5 в селезенке мышей, что соответствует литературным данным (Duncan L.M. et al., 1991).

Изменения экспрессии мРНК ИЛ-1(5 в прлушариях головного мозга при введении ЛПС (рис. 5) выражаются главным образом в снижении уровня мРНК ИЛ-ip в левом полушарии, совпадающем по времени с максимальным ответом ИЛ-ip в селезенке и некоторым повышением содержания ИЛ-ip в левом и правом полушариях мозга при нормализации уровня мРНК ИЛ-ip в селезенке.

С другой стороны, при введении ЭБ (рис. 6) наблюдается снижение уровня ИЛ-ip в левом полушарии на пике повышения содержания ИЛ-1(5 в селезенке. Эти результаты подобны изменениям в экспрессии ИЛ-1 в левом полушарии головного мозга и селезенке при введении ЛПС. В то же время при введении ЭБ выявляются значительное увеличение уровни ИЛ-ip в правом полушарии мозга, совпадающие по времени с повышением уровня ИЛ-ip в селезенке.

Приведенные результаты свидетельствуют о том, что при периферическом введении антигенов разных типов экспрессия мРНК ИЛ-ip в полушариях головного мозга меняется неодинаково. Левое полушарие отвечает снижением содержания мРНК ИЛ-ip при периферическом (внутривенном) введении Т-независимого и Т-зависимого антигенов на пике экспрессии мРНК ИЛ-1 (5 в органах иммунной системы. Таким образом, ответ левого полушария по данному параметру в ранний период формирования иммунного ответа'не зависит от типа использованного антигена. С другой стороны, правое полушарие головного мозга отвечает преимущественно на системное введение Т-зависимо-го. а не Т-независимого антигена, повышением экспрессии мРНК гена

200 УЕ

150 100 50

0

200 УЕ

150 100 50 О

ЭДР

250 200 150 100 50 О

о-

Т *

1 о

О

Б

6 24 48 ВР0Ш

-о

0 о 6 24

в Ф / * * *

/ X Т

/ /" / ф -1- — ф

- / . 1 _ 1 - о 1

• - — о- X -"О.,

1

о

о

2 6 24 48 -Время (ч.)

1 * - г * - р 0,05

Рис.5 диначика экспрессии мРНК гена И Л - ! Р в левом (А). правом (Б) полушариях головного мозга и селезенке (В) мышей-самцов (СВАХС57В1/6 ) Г 1 при внутривенном введении ЛПС в дозе 1 о мкг/мышь. (1 - контроль введения растворителя. г - опыт. Ось абсцисс - время после введения (часы). ось ординат -условные единицы оптической плотности (УЕ))

200 УЕ

150

100 50

о * аоп

УЕ

¿50

100 -

-О I»

о

Б'

й»

т

-о*

в

-О-

Т

■О,

*

- О -

24 48 время (ч.)

—

— о

("5

а по

УЕ

250

200 ¡-О

то г. о (1

о

о

1 40 Время (ч.)

■ О — 1-

Т *

-I \

-о.

'в.

т (

• О"

.1

А @

.о

6 24 48 Время (ч.)

в

о

* —

р < 0,05

в

Рис.6 Динамика экспрессии мРНК гена ИЛ-1 Р в левом (А), правом (Б) полушариях головного мозга и селезенке (В) мышей-самцов (свАхс 57 В 1/6) п при внутривенном введении эритроциов барана в дозе Зх106/мышь. (1 - контроль введения растворителя, 2 - опыт. Ось абсцисс - время после введения (часы). ось ординат - условные единицы оптической плотности (УЕ)).

ИЛ-10. Эти изменения при воздействии Т-зависимого антигена положительно коррелируют с экспрессией мРНК ИЛ-10 в иммунной системе. Это позволяет заключить, что ответ правого полушария по параметру экспрессии мРНК гена ИЛ-10 зависит от типа примененного антигена. Итак, в полушариях головного мозга существуют как зависимые, так и независимые от типа примененного антигена изменения содержания мРНК ИЛ-10. Однако те и другие наиболее ярко проявляются на пике экспрессии -;-мРНК этого цитокина в органах иммунной системы, что свидетельствует о существовании тесной взаимосвязи.между функциональной активностью иммунной системы и уровнем мРНК ИЛ-10 в противоположных полушариях головного мозга.

Учитывая исходно различные уровни экспрессии мРНК ИЛ-10 в контралатеральных полушариях головного мозга, неодинаковый характер изменений экспрессии мРНК ИЛ-1(5 в правом и левом полушариях, а также тот факт, что головной мозг является цельным органом, логично предположить, что функциональное значение может иметь не столько сами по себе абсолютные изменения уровня ИЛ-10 в противоположных полушариях, а относительные значения преобладания активности какого-либо полушария по данному параметру. Мы определяли сравнительную активность полушарий головного мозга по изменениям коэффициента асимметрии (КА) (Бианки В.Л.,1989) экспрессии мРНК ИЛ-10. В данной модели увеличение КА свидетельствует о преимущественной экспрессии ИЛ-10 в правом полушарии головного мозга, а его снижение - о преобладании экспрессии ИЛ-10 в левом полушарии.

Исследование динамики КА показало, что при введении как ЛПС (рис.7а), так и ЭБ (рис. 76) наблюдается значительное повышение КА. совпадающее по времени с максимальной экспрессией мРНК ИЛ-10 селезенке. Это свидительствует о преобладании функциональной активности правого полушария (по параметру содержания мРНК ИЛ-10) в .начальный период формирования иммунного ответа как на Т-зависи-мый, так и на Т-независимый антигены. Интересно, что сходные изменения КА полушарий головного мозга опосредуются разными механизмами - при введении ЛПС КА повышается главным образом за счет снижения уровня мРНК ИЛ-10 в левом полушарии, тогда как при введении ЗБ увеличение КА зависит в основном от усиления экспрессии мРНК ИЛ-10 в правом полушарии головного мозга. Приведенные результаты показывают преобладание относительной функциональной активности правого полушария головного мозга в процессе ответа организма на антигенную стимуляцию.

-1-4

0

1

о-

т

* 70

ш% ео 50 40 30 20 10 0

0 2 6 24 48 Время (ч.)

в т * * ° * 1

т

■• т ^

0

1

I

0 2 б 24 46 Время (ч.)

о - 1

9

* —

р; < 0,05-

Рис.7 Динамика коэффициента м ежп ол у шарн ой асимметрии экспрессии мРНК ИЛ-18 у мышей-самцов (СВАкС57В1/6) П. при системном введении ЛПС ^А) и эритроцитов барана (Б}. (1 - контроль введения растворителя. 2 - опыт. Ось абсцисс - время после ВЕодетш (часы), ось ординат 1 процентные значения коэффициент л асимметрии (КА %).

отмеченное некоторое повышение содержания мРНК ИЛ-10 в левом и правом полушарии после введения Т-независимого антигена наблюдается только в поздние сроки после введения препарата (через 48 часов) и не отражается на сравнительной функциональной активности полушарий, определяемой нами по КА. Возможно, это явление не имеет прямого отношения к ответу полушарий головного мозга в ранний период формирования иммунного ответа на периферическое введение ЛПС. Тем не менее, не исключено, что полушария головного мозга реагируют усилением экспрессии гена ИЛ-10 в продуктивную фазу развития иммунного ответа на ЛПС. Отсутствие сходного явления при введении Т-зависимого антигена еще раз подтверждает существование зависимых от типа примененного антигена механизмов регуляции экспрессии гена ИЛ-10 в полушариях головного мозга.

Закономерным образом возникает вопрос о конкретных меесенже-рах иммунной системы, регулирующих содержание мРНК ИЛ-10 в правом и левом полушариях головного мозга, а также путях, опосредующих эти влияния. Имеются веские основания считать, что в процессе передачи сигналов от иммунной системы в ЦНС участвуют чувствительные нервные окончания (Watanabe Т. et al., 1994, Laye S. et al., 1995). В связи с этим нами была поставлена задача изучения роли периферических чувствительных нервных окончаний в процессе регуляции содержания мРНК ИЛ-10 в контралатеральных полушариях головного мозга и иммунной системе. Для этого определяли влияние временной деафферентации капсаицином на уровень мРНК ИЛ-10 в полушариях головного мозга и селезенке через 12 суток после окончания курса введения препарата (Hlura A. et al., 1989). В качестве негативного контроля использовалось введение растворителя аналогичным курсом. Выяснено, что капсаицин не вызывает изменений в экспрессии мРНК ИЛ-10 в левом полушарии (37 ± 6 по сравнению с контрольным значением 34 ± 3). В то же время данный препарат достоверно повышает содержание мРНК ИЛ-10 в правом полушарии (43 ± 2 по сравнению с 37 ± 3, р < 0,05). Статистически значимое увеличение экспрессии мРНК ИЛ-10 (61 ± 6) по сравнению с контрольной группой (46 ± 5, р < 0,05) отмечено также в селезенке. Также показано, что коэффициент асимметрии экспрессии мРНК ИЛ-10 в контралатеральных полушариях головного мозга при воздействии капсаи-цина имеет тенденцию к увеличению (7,9 + 5,2 по сравнению с 3,25 ± 7,25). Эти результаты свидетельствуют об участии периферических чувствительных нервных окончаний во взаимосвязи процессов экспрессии мРНК гена в правом полушарии головного мозга и органах" иммунной системы и позволяют предположить, что роль периферичес-

ких чувствительных нервных -окончаний может заключается в передаче ингибиторных воздействий иммунной системы на экспрессию мРНК ИЛ-13 в правом полушарии головного мозга.

На следующем этапе мы исследовали роль периферических прос-' тагландинов и самого цитокина ИЛ-10 как возможных мессенжеров иммунной системы, регулирующих уровень мРНК ИЛ-10 в контралатераль-ных полушариях головного мозга.

Для изучения роли простагландинов были проведены опыты по определению влияния блокатора циклооксигеназы индометацина. вводимого внутрибрюшинно (Повещенко А.Ф., 1987), на содержание мРНК ИЛ-10 в контралатеральных полушариях головного мозга и селезенке' через 6 часов после окончания введения препарата. Контрольная' группа в этих экспериментах состояла из животных, которым вводили 5% спиртов*® раствор, использованный в качестве растворителя для препарата индометацина. Показано, что индОметацин увеличивает содержание мРНК гена ИЛ-10 в левом полушарии мозга. Однако это повышение (43 ± 10) не является статистически значимым по сравнению с контрольной группой (32 ±3). С другой стороны,отмечено достоверное повышение уровня мРНК ИЛ-10 в правом полушарии (61 ± 1 по сравнению с контролем 38 ± 3, р < 0,05), возникающее под воздействием индометацина. В селезенке было отмечено недостоверное повышение уровня мРНК ИЛ-10 (60 ± 12 по сравнению с контрольным значением 44 ± И). Коэффициент асимметрии экспрессии мРНК ИЛ-10 в контралатеральных полушариях головного мозга также имел тенденцию к увеличению (18,7 * 11,5 против контрольной величины 9,6 ± 1). Полученные результаты свидительствуют об ингибирующем влиянии, простагландинов на экспрессию мРНК ИЛ-10 в правом полушарии головного мозга.

Для изучения влияния периферического цитокина ИЛ-10 на экспрессию мРНК гена ИЛ-10 в ЦНС были проведены эксперименты по определению влияния внутривенного введения рекомбинантного цитокина ИЛ-10 на содержание мРНК ИЛ-10 в контралатеральных полушариях головного мозга и селезенке мышей. Рекомбинантный цитокин был использован в дозах 10, 100 и 1000 нг/мышь. Уровень мРНК ИЛ-10 исследуемых органах определялся через 2 и 24 часа после воздействия. В качестве негативного контроля было применено аналогичное введение эквивалентного объема физиологического раствора (рис. 8).

О 10 100 1000 2 ч. ^ *

24 ч.

т

ж

й ш

т.

%

'Ж

0 10 100 1000 Доза (нг) 24 ч.-

Ж

*

Ч

Ра

1

О 10 100 1000 Доза (нг) 24 ч. Цс

О 10 100 1000

- 1

О 10 100 1000 Доза (нг) * - р < 0,05

Рис.8 Экспрессия мРНК И Л -1Р в левом (А). правом (Б) полушариях головного мозга и селезенке (В) мышей-самцов (С ВАх С 57 В1/6) П через 2 и 24 часа после введения рек омб инантно г о ИЛ-1Р крысы. (1 - контроль введения растворителя. 2 - опыт. Ось абсцисс - доза препарата в нг. Ось ординат - условные единицы оптической плотности (УЕ))

Показано, что введение ИЛ-10 дозозавиоимо стимулирует экспрессию мРНК гена ИЛ-10 сходным образом в обеих полушариях головного мозга и селезенке (рис.8 а, б. в) как через 2, так и через 24 часа после введения. Однако характер 'зависимости от дозы несколько отличался в левом и правом полушарии головного мозга. В максимальной использованной нами дозе 1000 нг/мышь рекомбинантный ИЛ-1 не стимулировал экспрессию мРНК ИЛ-10 в левом полушарии, в отличие от правого.

Коэффициет асимметрии (КА) в полушариях головного мозга при введении рекомбинантного ИЛ-1(3 также претерпевал изменения. Низкая и средняя дозы цитокина (10 и 100 нг.) достоверно не влияли на КА по сравнению с введением физиологического раствора, а использование цитокина в высокой дозе (1000 нг.) приводило к статистически значимому (р < 0,05) увеличению этого показателя (4,1 ± 0,1 и 8,7 ± 4,7 через 2 и 24 часа соответствено после введения цитокина по сравнению с соответственным введением физиологического раствора -20,8 ± 4.1 и -24.7 ± 0,25).

Из приведенных результатов следует, что ИЛ-1 может являтся одним из факторов иммунной системы, регулирующих экспрессию мРНК ИЛ-10 в полушариях головного мозга. Однако достижение эффекта влияния рекомбинантного ИЛ-1 на экспрессию мРНК ИЛ-10 в головном мозге требует использования весьма высоких доз препарата, а однонаправленный характер этих изменений показывает, что сам ИЛ-10 не является ведущим фактором, регулирующим асимметрию экспрессии мРНК гена ИЛ-10 в правом и левом полушариях головного мозга. Мы предполагаем, что наряду с этим цитокином в регуляции экспрессии мРНК ИЛ-10 участвуют и другие факторы иммунной системы.

Обобщая представленные результаты, можно заключить, что они позволяют установить существование принципиально нового явления -асимметрии экспрессии мРНК ИЛ-1 в полушариях головного мозга. Более того, в наших экспериментах показано, что в ранний период формирования иммунного ответа левое полушарие головного мозга отвечает на периферическое введение как Т-независимого. так и Т-за-висимого антигенов. В то же время правое полушарие отвечает главным образом на аналогичное введение Т-зависимого антигена. Также отмечен качественно различный характер этих изменений. Левое полушарие в ранний период формирования иммунного ответа отвечает преимущественно снижением экспрессии' мРНК ИЛ-10, тогда как правое - повышением. Таким образом, в контралатеральных полушариях головного мозга существуют как зависимые, так и независимые от типа примененного антигена изменения содержания мРНК ИЛ-10. Поскольку

-готе и другие наиболее ярко_ проявляются на пике экспрессии мРНК этого цитокина в органах иммунной системы, то весьма вероятно, что наблюдаемые зависимости экспрессии мРНК ИЛ-10 в полушариях головного мозга от типа использованного антигена объясняются разным спектром цитокинов, вырабатываемых иммунной системой в ответ на стимуляцию её Т-зависимыми и Т-независимыми антигенами. Кроме того, нами показано влияние периферических простагландинов и ИЛ-1 на регуляцию экспрессии мРНК ИЛ-10 в полушариях головного мозга, что указывает на возможные механизмы влияния иммунной системы на эти процессы. Продемонстрированно, что одним из путей, опосредующих взаимосвязь экспрессии мРНК ИЛ-10 в контралатеральных полушариях головного мозга с иммунной системой являются чувствительные периферические нервные окончания.

Из вышеизложенного можно предположить, что выявленные изменения экспрессии мРНК гена ИЛ-10 в полушариях головного' мозга имеют прямое отношение к процессам нейроиммунорегуляции. Полученные результаты значительно расширяют существующие представление о регуляции цитокинов в центральной нервной системе, а также о процессах взаимодействия двух важнейших гомеостатических систем организма (нервной и иммунной).

ВЫВОДЫ

1. В левом полушарии головного мозга интактных мышей содержится меньшее количество мРНК интерлейкина-10, чем в правом полушарии, что свидетельствует об асимметричной экспрессии гена интерлейки-на-10 в контралатеральных полушариях головного мозга.

2. При периферическом введении Т-независимого и Т-зависимого антигенов мышам уровень мРНК интерлейкина-10 снижается в левом полушарии головного мозга на пике экспрессии мРНК интерлейкина-10 в селезенке, что говорит о независимости экспрессии мРНК гена интерлейкина-10 в левом полушарии головного мозга от типа антигена.' использованного для иммуностимуляции.

3. В правом полушарии головного мозга мышей выявлено повышение содержания мРНК интерлейкина-10 в ответ на периферическое введение преимущественно Т-зависимого, но не Т-независимого антигена. Отмечено значительное совпадение динамики экспрессии мРНК в правом полушарии мозга и селезенке при введении Т-зависимого антигена. Это свидетельствует о том, что экспрессия мРНК гена интерлейкина-10 в правом полушарии головного мозга зависит от типа антигена, использованного для стимуляции иммунной системы.

4.Показано преобладание функциональной активности правого полушария головного мозга по параметру экспрессии гена интерлейки-на-lß в ранний период формирования иммунного ответа на Т-незави-симый и Т-зависимый антигены, о чем свидительствует сходство динамик коэффициента межполушарной асимметрии экспрессии мРНК ин-терлейкина-lß в полушариях головного мозга и уровня мРНК интер-лейкина-lß в селезенке при периферическом введении Т-зависимого и Т-независимого антигенов.

5. Обнаружено повышение содержания мРНК интерлейкина-lß в правом полушарии головного мо'зга и селезенке мышей после периферического введения блокатора первичных афферентных нервных окончаний капсаицина, что говорит об участии периферических чувствительных нервных окончаний во взаимодействии процессов регуляции экспрессии гена интерлейкина-lß в правом полушарии головного мозга и органах иммунной системы.

6.Введение индометацина усиливает экспрессию мРНК интерлейкина-lß в правом, но не в левом полушарии головного мозга,что свидетельствует об ингибирующем действии простагландинов на экспрессию гена интерлейкина-lß в правом, но не левом полушарии головного мозга.

7. Показан сходный характер дозовой зависимости стимулирующего действия цитокина интерлейкина-lß на экспрессию мРНК интерлейкина-lß в правом и левом полушариях головного мозга, что свидетельствует об участии медиатора иммунной системы интерлейкина-lß в регуляции экспрессии гена интерлейкина-lß в полушариях головного мозга.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Гребенщиков А.Ю. // Экспрессия гена ИЛ-lß в головном мозге и селезенке мышей (CBAxC57Bl/6)Fl. Сб. "Научный отчет ИКИ СО РАМН 1993"- Новосибирск. - 1994 - с.47

2. Абрамов В. В., Повещенко А. Ф.. Гребенщиков А. Ю., Козлов В.А. Асимметрия экспрессии гена ИЛ-lb в головном мозге мыши в процессе формирования иммунного ответа.// Бю'лл. Сибирского отд. РАМН. - 1995. - N 1.- с. 62-64

З.Гребенщиков А.Ю., Повещенко А.Ф., Абрамов В.В. Функциональная асимметрия интерлейкина-lß в головном мозге.//Сб. тезисов "Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых Сибирского отделения РАМН" - Новосибирск. -1996, - с.26

4. Гребенщиков А.Ю. Повещенко А.Ф., Абрамов В. В. //Функциональная 'асимметрия ИЛ-ip в полушариях головного мозга. Сб. "Научный отчет ИКИ СО РАМН - 1996". - Новосибирск - 1997. -с. И .

5.Повещенко А.Ф., Гребенщиков А.Ю., Абрамов В.В.// Влияние .системного введения ИЛ-10 на экспрессию мРНК гена ил-ip в полушариях головного мозга мышей. - Сб. "Научный отчет ИКИ СО РАМН - 1996" - Новосибирск - 199-7. - с. 15

6.V.V.Abramov, A. F. Poveschenko, A.Y. Grebenschikov// Expression of IL-lb mRNA in brain hemispheres in Immunized mice. Int. Workshop Measurment of Cytokines and Their Receptors in the Brain. Meeting Abstracts,- 1994, p.- 12

7. V.V.Abramov, A.F.Poveshchenko, A.Y.Grebenschikov// Interleukln-ip gene expression in mouse brain. 3rd International Conference on cytokines. Meeting Abstracts.-1994,- p.- 30

8. A.Y. Grebenschikov, V.V. Abramov, A. F. Poveshchenko, V. A.Kozlov// The asymmetric expression of IL-ip gene In mouse brain. 27th Scandinavian Society for Immunol.Meeting Abstracts - Scand. J. Immunol. - 1996. - V.43 - N.6 - p. - 725

Формат 60x84Vi6-Печ. л. Заказ $6 Тир. №0

Типография СО РАМН. Новосибирск, ул. Ак. Тимакова,