Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Цитокиновый профиль больных лимфомами в динамике полихимиотерапии

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ

НОВОСИБИРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

СКВОРЦОВА НАТАЛИЯ ВАЛЕРЬЕВНА

)

ЦИ ГОКИНОВЫЙ ПРОФИЛЬ БОЛЬНЫХ ЛИМФОМАМИ в ДИНАМИКЕ ПОЛИХИМИОТЕРАПИИ

14.00.29 - I емаголо) ия и иереливамие крови

ЛВЮРЕ-.ФГ.РМ диссертации па соискамие ученой еюпсии камдидша медицинских паук

I

11овосибирск- 2005

Работа выполнена в Новосибирской государственной медицинской академии Росздрава.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оннопеш ы:

академик РАМН,

доктор медицинских наук,

профессор

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая ормипиация:

Гемаюло! ический научный цешр РАМН, i. Москва

Защша диссертации состои!ся «_»_2005 i. в_часов на

■заседании диссер1ационно1 о сове i а Д 208.062.04 при Новосибирской государственной медицинской академии Росздрава по адресу: 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Новосибирской государственной медицинской академии.

Автореферат диссср1ацни раюслан «___»_____2005 i.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медйцинских наук, профессор Зубахин А.А.

Поспелова Та1ьяна Ивановна

Сидорова

Лидия Дм и i риевпа

Журавскаи Эмма Яновна

2.7 G Щ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В последнее десятилетие большое значение придается роли цитокинов (интерлейкинов, интерферонов, факторов роста) в патогенезе онкологических заболеваний, активно разрабатываются вопросы взаимосвязи дисбаланса в системе цитокинов с течением опухолевой прогрессии и прогнозом [Антонов В.Г., 2004; Чердынцева М.В. и соавт., 2005J. Повышенная секреция цитокинов при злокачественных новообразованиях человека приводит к их системному воздействию на организм, синтезу белков острой фазы, подавлению деления гемопоэтических стволовых клеток, что приводит к развитию анемии, лимфопении и формированию значимых субпопуляционпых нарушений со стороны клеток иммунной системы [Бредер В.В., 2003].

Известно, что в процессе возникновения и развития опухоли происходит, прежде всего, нарушение баланса между секрецией проопухолевых (IL-6. кислоюлабильная фракция U-'N-a/ß), нрожвоопухолевых (IL-2, кислотостабильиая фракция IFN-a/ß, TNF-a). а тюке регуляюрпых (ll'N-y) цшокинов [Бережная U.M., 2000; Козлов В.А. и соавт., 2002J. Секреция определенных цитокинов может обеспечивать преимущества роста для клеток опухоли аутокринным или паракринным путем [llsu S.M et al., 1993]. Ишерлейкины (IL) способны влиять на росг опухолевых клеток, изменяя экспрессию белков про- и ангиапототического действия, различных онко1енов. маркеров иролиферативпой активности клеток, основного регуляюра клеточного цикла белка -р53 и маркера множественной лекарственной резистенпкхми - р-гликопротеина (p-gp), что может иметь большое значение при определении прогноза заболевания и выборе тактики ведения больного [Ellis R.E. et al., 2002J.

Результаты изучения уровней цитокинов в ткани опухолей молочной железы [Müller et al., 1996], лёгких [Schweiger et а!., 2000], мола [Berquin et al., 1996|. желудочно-кишечного факта [Sivaparvatlii et al., 1995], в сыворотке крови больных мелапомой [Kagesliita et al., I995J, опухолями матки, яичников [Lall et al.. 1992], прямой кишки [Kos et al., 2000] свидетельствуют о том, что данные показатели имеют большое шачение для прогнозирования выживаемости, оценки риска рашишя рецидивов и смергкости онколо! ических больных. Показана взаимосвязь увеличения уровня

rbtru I imiioirактивнос i и опухолевых

JC НАЦИОНАЛ мч л ь ■>

БИБЛИОТЕКА | СПетев««»гЛД А 1 1

оэ

цитокинов с повышением пр<

Iпи1ьлл :

клеток и ускорением процессов метастазирования [Владимирская Е.Б., 2002]. Связь концентрации цитокинов с основными свойствами злокачественной опухоли делает возможным использование данных показателей в качестве маркеров опухолевой прогрессии и прогноза новообразований. Однако данные литературы по этому вопросу часто являются противоречивыми. Проблема участия цитокинов в процессах роста и распространения опухолей остается до конца не изученной. Не выявлена зависимость уровня циюкинов ог конкретных нозологий, не описана динамика этих показателей в ходе опухолевой прогрессии, не определены изменения уровней цитокинов, происходящие при лечении опухолей.

Наименее изученными в этом ог ношении являются опухоли системы кроветворения - темобласюзы. В литературе имеются лишь единичные работы, посвященные оценке циюкинов при развитии данной паюлогии [Бережная U.M.. 2000; Полосухина, 20001. Вмсое с тем. изучение роли циюкинов в паготеисзе гемобласюзов позволит использован, их в качестве возможных протпостическич факюров и средств мониторинга течения заболевания.

Учитывая вышеизложенное, представляется важным и перспективным исследование ряда циюкинов в сыворотке крови больных лимфомами с целыо установления закономерностей изменения данных показателей в зависимости от стадии, тяжести процесса, ответа на терапию.

Цель работы: изучить уровень провоспали тельных, противовоспалительных и ре1уляторны\ циюкинов в сыворотке крови больных лимфомами и установить связь данных показателей с характером течения заболевания. клинико-лабораторными проявлениями, морфологическими особенностями, выраженностью экспрессии основных регуляторных молекул и эффективностью проводимой терапии.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.

Задачи исследования:

1. Исследовать уровень циюкинов (IL-Iß, l'Nla. IL-2, ll'Ny, IL-4. IL-6) в сыворотке крови больных лим(|юмой Ходжкипа и не.чоджкинскими злокачественными лимфомами до лечения и в динамике полихимиотерапии.

2. Изучить цитокиновый профиль у больных лимфомой Ходжкипа и неходжкинскими злокачественными лимфомами в зависимости от стадии заболевания, поражения костного мола, клинико-лаборагорных проявлений болезни.

?

3. Определить процент клеток костного мозга, экспрессирующих рецепторы к IL-lp, IL-6, IL-10 у больных лимфомами.

4. Изучить уровень экспрессии регуляторных молекул р-53, bcl-2, c-myc, Ki-67, CD95, р-гликопротеина (p-gp) у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами.

5. Выявить взаимосвязь между уровнем цитокииов, итенсивнос1ыо экспрессии белков блока апотпоза (р-53, bcl-2), нролиферативной активности опухолевых клеток (c-myc, Ki-67), множественной лекарственной устойчивости (p-gp) и прогнозом заболевания у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами.

Научная новизна. Показано, что у больных лимфомами (неходжкинскими злокачественными лимфомами и лимфомой Ходжкина) до начала лечения, на лапе диашостики опухолевого процесса, происходит повышение уровней провоспали тельных цинжипов (IL-ф и TNRx), цитокииов Th-1 (IL-2, IFNy) и Th-2 типов (IL-4, IL-6). Обнаружена зависимость между уровнем цитокииов в сыворотке крови пациентов и стадией заболевания, гистологическим вариантом опухоли, клиническими особенностями течения, изменениями лабораторных показателей.

Доказано, что проведение больным неходжкинскими злокачественными лимфомами (IIX3JI) и лимфомой Ходжкина (JIX) полихимио1ерапии приводит к снижению уровней исследуемых цитокииов в сыворотке крови, чю коррелирует с эффективностью терапии.

Впервые проведено исследование количества клеток кос итого мозта, экспрессирующих рецепторы к IL-ф, IL-6 и IL-I0 у больных лимфомами. Выявлено, чю рецепторы к данным циюкинам экспрессирукнся как на опухолевых клетках, гак и на нормальных мопонуклеарных клетках костпою мояа. Отмечено, чю количество клеюк кос i ною мола, экспрессирующих рецепторы к IL-6 коррелирует с процентом лимфоидных клеюк в периферической крови и костном мозте, а также с уровнем IL-6 в сыворотке крови, что подтверждает факт ау токрипной и паракринпой регуляции pocia опухолевых клеток у больных НХЗЛ.

Изучена экспрессия Tía опухолевых клетках больных ПХЗЛ маркеров блока апоптоза р53 и ЬсР-2. нролиферативной активности (ki-67 и c-myc) и множественной лекарственной устойчивости (p-gp). Показано, чю i иперэксирессия p-gp. Ki-67, bcl-2. c-myc и р-53 у

больных лимфомами сочетается с первичной резистентностью и безремиссионным течением заболевания.

Установлена взаимосвязь между повышением уровня цитокинов в сыворотке крови больных НХЗЛ и процентом опухолевых клеток костного мозга, экспрессирующих молекулярно-биологические маркеры опухолевой прогрессии: белки блока апоптоза - мутантный р53 и Ьс1-2, пролиферативной активности клеток - к!-67 и с-тус и множественной лекарственной устойчивости - р-гликопротеин, что коррелирует с эффективностью проводимой терапии.

Практическая значимость. Результаты, полученные при исследовании уровней цитокинов и регулягорных белков в процессе развития и лечения неходжкипских злокачественных лимфом и лимфомы Ходжкина вносят вклад в современные представления об участии цитокинов в паюгенезе злокачественных заболеваний крови.

Полученные данные, отражающие изменение уровня цитокинов в сыворотке крови больных лимфомами и их корреляцию с основными характеристиками болезни, позволяют использовать ли показатели в качестве дна1 постических и прогностических критериев при онкогемаюлотических заболеваниях.

Наличие корреляционных связей между высоким уровнем цитокинов в сыворотке крови больных ПХЗЛ и ЛХ и резистентностью к проводимой терапии указывает на их участие в формировании лекарственной устойчивости и позволяет прогнозировать вероятность достижения ремиссии и риск развития рецидива у данных больных.

Положения выноснмые на защиту:

1. У больных неходжкинскими злокачественными лимфомами и лимфомой Ходжкина в дебюте заболевания происходит увеличение в сыворотке крови уровней провоспалительпых цитокинов (Н.ф. ГЫ1чх), циюкипов, вырабатываемых Т1т-1 (IГЫу. 11.-2) и ГЬ-2 шна (11.-4. 11.-6). После курсов полихимиотерапии. при достижении клинико-гематолотичсской ремиссии. наблюдается снижение ттх показателей.

2. Уровень цитокинов в сыворотке крови больных лимфомами (1Ь-1Р, 'ПМРа. ИТ\1у, 11.-2, И_-4, 1Ь-6) зависит от стадии процесса, морфологического варианта опухоли, клинических проявлений болезни, поражения костното мозга, изменения

лабораторных показателей, экспрессии рецепторов на опухолевых клетках (к 1Ь-6 и 1Ь-1Р).

3. Выраженность экспрессии белков блока апоптоза (р-53, Ьс1-2), ггролиферативной активности опухолевых клеток (с-тус, К1-67), множественной лекарственной устойчивости (р^р), рецепторной молекулы С1Э95 на опухолевых клетках больных ПХЗЛ коррелирует с уровнем про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови и влияет па прогноз,заболевания.

Апробация материалов диссертации

Материалы исследования были представлены на конференциях студентов и молодых ученых «Авиценна» (Новосибирск, 2004, 2005), на Российско-Норвежской конференции гемаюлогов (Санкт-Петербург, 2003), на городских научно-практических конференциях врачей «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 2004, 2005), на юбилейной научно-практической конференции, посвященной 40-ле1ию гематологической службы г. Новосибирска «Фундаментальные и прикладные проблемы онкотемаюлот ии» (Новосибирск, 2004), па заседании гематологического общества (Новосибирск, 2005), на сессии СО РАМП «Фундаментальные и прикладные проблемы опколо! ии» (Новосибирск. 2004). на Всероссийской конференции «Фундамешальпые пауки - медицине» (Новосибирск, 2005).

Внедрение результатов исследования

Полученные в работе данные используются в учебном процессе на кафедре гемаюлоыш и трансфузиоло! ии Новосибирской государственной медицинской академии на лечебном и педиатрическом факультетах.

Работа выполнена на кафедре гематологии и трапсфузиологии лечебного факультета Новосибирской государственной медицинской академии (зав. кафедрой - проф. Г.И. Поспелова), на базе городского гематологическою центра МУЗ I'КБ № 2 (главный врач - проф. Л.А. Шнагина, зав. отделением - к.м.н И.II. Печуиаева), отдельные фрагменты работы выполнялись в иммуноморфоло! ической лаборатории МУЗ ГКБ №2 (¡ав. лабораторией - доцент И.Б. Ковынев).

Автор искренне признателен за поддержку и квалифицированную помощь участникам совместных исследований, сотрудникам кафедры темаюло1ии и трапсфузиологии лечебною факультета 11ГМА, врачам отделения гематолот ни МУЗ ГКБ № 2,

а также выражает большую благодарность научному руководителю - профессору Т.И. Поспеловой.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 3 в центральной печати.

Объем и структура диссертации

Материал диссертации изложен на 236 страницах машинописного текста (без указателя литературы) и содержит разделы: введение, обзор литературы, главу «Материал и методы», 5 глав, отражающих результаты собственных исследований, обсуждение результатов, заключение, выводы и практические рекомендации. Работа иллюстрирована 55 рисунками, 50 таблицами. Указатель литературы состоит из 277 источников, из них 79 отечественных и 198 зарубежных авторов.

Весь материал диссертации собран, обработан и проанализирован лично автором.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая характерце гика обследованных больных

Обследовано 83 пациента с лимфомами: Г- и В-клегочными неходжкинскими лимфомами - 63 человека (75,9%), лимфомой Ходжкина - 20 больных (24.1%). Мужчин было 36 (43,4%), женщин 47 (55,6%). Средний возраст обследованных составил 44,4+1,35 года.

Больные были распределены по гистоло!ическим вариантам гемобластозов, стадиям болезни, а также по наличию Б-симн томом, к которым относятся лихорадка, проливные ночные поты и снижение массы тела на 10% за последние 6 месяцев.

Наибольшее число пациентов 52 человека (62.6%) имели неходжкинские лимфомы III-IV стадии.

Согласно ВОЗ классификации, афсссипныс лимфомы (высокой степени злокачественности) были диагностированы у 31 пациента (49.2%). ипдолешные (низкой степени злокачественности) - у 32 (50,8%). В соонзетснзии с классификацией RíiAL (1994 i ), в i рупне больных лимфомой Ходжкина модулярный склероз и смешанно-клеточный вариант были днат (юстированы у !5 человек (75%), лимфондпое преобладание - у 5 (25%). варианты лимфоидное истощение и «богатая лимфоцитами классическая болезнь Ходжкина» не встречен!,i ни у одною пациента.

Симптомы интоксикации (Б-симтпомы) отмечены у 32 пациентов (50.7%) с IIX3J1 и у 14 больных (70%) JIX.

Больные были обследованы до лечения и после проведения 4-8 курсов полихимиотерапии (ПХТ) - на папе полной или частичной клииико-гематологической ремиссии. В терапии использовались стандартные и высокодозные протоколы I-II линии: при индоленгных НХЗЛ (НСЗ) - СОР, СПОР, при агрессивных НХЗЛ (ВСЗ) - CHOP, СНОЕР, ProMACE-CytaBOM, DHAP, при лимфоме Ходжкина - ABVD, ВЕАСОРР, СОРР, DexaBEAM, DHAP.

Группу контроля составили 20 клинически здоровых доноров из отделения переливания крови Обласinoro центра крови. Средний возраст доноров был равен 38,4±1,42 года; распределение по полу: 10 (50%) женщин и 10 (50%) мужчин.

Общеклнническпе методы исследования

Обязательный комплекс обследования больных включал сбор жалоб, анамнеза, лабораторные и инструментальные методы: оценку гемограммы, миелотраммы в динамике, исследование феианобиошат, стандартные биохимические iесты (общий белок, билирубин, трансаминазы, щелочная фосфатаза, ЛДГ\ СРБ, фибриноген, уровень кальция, электролиты. мочевина, креагинин, мочевая кислота, сахар крови), электрокардиография. Помимо пою, пациетам проводилось улыразвуковое исследование органов брюшной полости, рентгенологическое исследование органов грудной клетки, по показаниям - компьютерная томография или MPT opianoB i рудной клетки и брюшной полости, ультразвуковое исследование сердца. Диагноз ?аболевания был верифицирован на основании гистологическою исследования биоша1а лимфоузла, цитологического исследования миелограммы с

иммунот истохимической или иммуноцитохимической верификацией омухоли с использованием стандартной панели из 37 моноклональных антител к кластерам дифференцировки гемополических клеток.

Специальные методы исследования

Определялся уровень итерлейкинов сыворотки крови (IL-ip, Т1М1;-а. IL-6, IL-4, IL-2, II'N-y) с помощью набора peaieinoB ProCon IL-lp, РтоСоп TNI-ot, ProCon IL-6, ProCon IL-4, ProCon IL-2, ProCon IFN-y (нроишодство ООО «Протеиновый контур», г. Санкт-Петербург). При определении уровня ннтерлейкинов исполыовался твердофазный иммуноферментнЫй метод с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторпото фермента.

Проводилось иммуноцитохимическое исследование мазков костного мозга для определения экспрессии рецепторов к IL-Iß, IL-6, IL-10 с помощью кроличьих моноклональных антител против рецептора к IL-Iß, IL-6, IL-IO («Santa Cruz Biotechnology». США) и моноклональных анти-кроличьих IgG, коныогированных с щелочной фосфатазой («SIGMA». США). В качестве системы визуализации использовался субстрат-хромоген («DAKO»).

Также выполнялось иммуноцитохимическое исследование мазков костного мозга для определения экспрессии белков пролиферации (Ki-67) и апогтгоза (р53 и bcl-2). оикопрогеина с-тус, маркера множественной лекарственной устойчивости p-gp с помощью моноклональных антител (DAKO, Novacastra, R&D) - против антигенов Ki-67, bcl-2, c-myc, р53, CD95 и p-glycoprotein. В качестве системы визуализации использовались наборы (LSAB+, LSAB2 (DAKO) и др.) по стрепгавидин-биотиновой методике с использованием цитохимической метки щелочной фосфактзой или пероксидазой.

Обработка полученных результатов проводилась при помощи" пакета программ Microsoft Lxcel ХР, Microsoft Access ХР, математической - статистической программы STB 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Уровень цнгокннов в сыворотке крови больных лимфомами до лечения и в динамике нолихимиозерапии

Лимфомы относя 1ся к наиболее распространенным опухолевым заболеваниям системы крови. Мноюобразпые клинические и i исюпаюло! ические изменения, наблюдаемые при неходжкинских лимфомах (НХЗЛ) и лимфоме Ходжкина (ЛХ), могут определяться различными нарушениями цигокинового статуса. Работы последних лет покашвают. что такие плейотропные цитокины, как фактор некроза опухолей альфа (TNFa), ишерлейкин Iß (IL-1(3) и ингерлейкин 6 (IL-6), функции кошрых в роуляции иммунною ответа, гемопоэза и про!ивоопухолевого иммупи!С1а широко известны, могу| быть паракрннными и/или ауюкрипными росювыми факюрами при некоюрых лимфомач [II.F>. Серебряная, A.A. Новик, 2003].

В настоящем исследовании при анализе уровня цтокипов в смворо1ке крови больных лимфомами (как ПХЗЛ, 1ак и JIX) до начала прошвооиухолевой терапии выявлено досювсрпое увеличение уровня провоспалительных цитокинов: IL-ф в 8 раз,

TNFa - в 4 раза (204,8±68,2 tiki/мл у пациентов с лимфомами по сравнению с 24,3±3,2 пкг/мл в контрольной группе и 189,0±82,1 пкг/мл по сравнению с 51,6±6,5 пкг/мл; р<0,05, соопзсювенно), цигокинов, вырабатываемых Th-I типа: IL-2 - в 15 раз, IFNy - в 22 раза (433,9+93,7 пкг/мл у больных лимфомами по сравнению с 29,7+2,9 пкг/мл и 845,2+203,6 пкг/мл по сравнению с 38,7+3,! nKi/мл; р<0,001, соответственно) и про тивовоа 1ал и re л ы юго цитокина, вырабатываемого Tli-2 тина - IL-4 - в 2 раза но сравнению с контролем (122.6+43,2 hki/mji по сравнению с 66,5+6,9 пкг/мл; р<0,05).

После лечения, при досжжепии часжчной или полной клинико-гематологичсской ремиссии, уровень данных циюкинов достоверно снижался (IL-lf5 - 57,8±22,l hki/mji у больных лимфомами после лечения по сравнению с 204,8±94,2 hki/mji у больных лимфомами до лечения: ПМГсх - 53,8±25,2 пю/мл по сравнению с 189,0+85,2 пкг/мл. II.-2 - 15l,5±36,6 hki/mji после лечения по сравнению с 433.9±88,6 hki/mji до лечения. ll'Ny -246,8+53,1 iiki/мл по сравнению с 845.21101.1 uki/мл, 11,-4 - 53,9 ±12.5 пкг/мл по сравнению с 122.6±33,l tiki/mji. р<0,()5, cooibcicibchho).

Для определения диамюстической значимости циюкинов оценивали их уровень в зависимости от cieneim злокачесгвенное i и, вариант и стадии iемобласюза.

Наиболее выраженные изменения показа!елей исследуемых циюкинов oí мечены у нацистов с индолетными (низкой оспени злокачес!вениос1и) лимфомами по сравнению с ai рсссивпыми (высокой cieneiiH злокачес! венное i и) (I NKx - был выше в 1.8 раза у нацистов с индолетными лимфомами по сравнению с агрессивными: IL-2 - в 2.1 раза. ll'Ny - в 1.8 раза. II -6 - в 2,3 раза, IL-4- в 1,9 раза, соответспзепно) и при В-клеючном варианте IIX3J1 по сравнению с Г-клеючным (Ib-lp - был выше при В-клеючпых I1X3J1 в 3.2 раза но сравнению с Т-клеючными, TNFa - в 2 раза: 11.-2 - в 2.6 раза: IFNy - в 2 раза: IL-6 - в 1.7 раза: соопкмсгвенно) (iабл.

Таблица 1

Уровень цитокинов в сыворотке крови больных неходжкинскими злокачественными лимфомами

Провоспашпслышс 1 h 1-профиль 1 li2-iipo(|>iuM,

1ШГОКИ1Ш

N 1 руины IL-ф 1 NI a II.-2 ll'Ny 11.-4 11,-6

(HMIMIblV iiki/mji iiki/mji iiki/mji iiki/mji iiki/mji iiki/mji

1 Контроль 24,3 ± 51,6 ± 29.7± 38.7± 66 5+ 28.9 1

п = 20 3,21 6,52 2.91 3.13 6.92 4,33

2 Лимфома 94.4 + 166,7+ 617,81 1317,5+ 129,31 52 8 1

(IIC3) 26.72 38,74 110.22 212.01 30 24 15,51

н = 32 Р, 2 < 0.05 1>, 2<0.05 Р, ,<0,01 Р, ,<0,01 Р, ,<() 05 Р, ,>0,05

3 Лимфочл 191.5 ± 92,7 ± 290.0+ 725 7^ 66,2 ± 21 3 +

(IÎC3) 62.33 15.81 78.94 122 52 11 XI 9.54

п = 31 l'i ,<0.05 1>, ,>0.05 Pi ,<0.05 Р, ,<0.01 1», ,>0.05 Р, »0 05

1', -,<0,05 1*2 ,<0.05 1',, <0.05 1\,, <0.05 Р; ,<0.05 Р, ,<0.05

4 Лимфома 112 9+ 63.3+ 495.1 + 975.01 127.11 56.0 h

13-кл 65.22 17.61 95.23 112 31 35,24 5 62

и-53 1'ы<<>,05 1', 4>0.05 Pi J <0.01 Ри<0.01 Pi ,<0,05 Р, ,>0,05

5 Лимфома 35.1 + 33.5+ 194 4+ 487 0± 149 51 30 1 +

I-KJI 5.42 9,13 38.92 85.22 26.84 4,22

п= К) l>, <>0 05 1', , >0.05 Р, s< 0.05 Р, ,< 0.01 Р, ,<0 (15 Р, ,>0 05

I", « 0.05 1*4 0.05 Р, < <0.05 Р4< <0 05 Р, ,>() 05 1'4 ,<0 05

ПрНМСЧ.ИШС П-ЧИСЛО гн).1ЬП1.1\ II • Р> 11110

Пациенты с генерализованными стадиями (III-IV) лимфом (НХЗЛ и J1X) характеризовались преобладанием в сыворотке крови провоспалительных цитокинов IL-ip и TNFa по сравнению с группой больных, у которых диагностированы локальные стадии процесса (1-И) (у пациентов с НХЗЛ: 167,5±79,2 пкг/мл по сравнению с 43,4±12,5 пкг/мл для IL-lp; 189,0±64,6 пкг/мл по сравнению с 45,2±13,7 пкг/мл для TNFa; р<0,05, соответственно и у пациентов с JIX - 321,5 ± 98,2 пкг/мл по сравнению 117,8±59,5 пкг/мл для IL-ф; 183,5±45,6 пкг/мл по сравнению 51,7±24,5 пкг/мл для TNFa; р<0,05, соответственно). Полученные данные подтверждают предположение о развитии дисбаланса в системе цитокинов па более поздних стадиях лимфонролиферашвных заболеваний и свидетельствуют о диагностической ценности исследования уровня цитокинов при гемобластозах.

Следует отметить, что морфологический вариант ЛХ -лимфоидное преобладание характеризовался более высоким уровнем исследуемых цитокинов по сравнению с модулярным склерозом и смешанно-клеточным вариантом (1Ь-1 (3 - в 3,8 и 15 раза; ТЫРа - в 2,8 и 3,2 раза; 1Ь-4 - 1,8 и 2 раза; 1Ь-2 - в 1,5 и 2,2 раза, соответственно), что, скорее всего, связано с особенностями клеточного состава опухолевого субстрата представленного преимущественно малыми лимфоцитами, схожими по морфологии с клетками зоны мантии лимфоидного фолликула, среди которых в том или ином количестве располагаются реактивные эпителиоидные гистиоциты. Данные особенности обусловливают сходство иммунологических изменений при лимфоидном преобладании с наблюдаемыми при индолентных НХЗЛ.

Снижение синтеза исследуемых цитокинов при вариантах нодулярный склероз и смешанно-клеточный можно объяснить уменьшением реактивного компонента в опухолевом субстрате (лимфоциты, гистиоциты) и увеличением количества клеток Рид-Штернберга, которые продуцируют ТСГ-р фактор и 1Ь-10. Это ведет к угнетению клеточного иммунного ответа по ТЫ-типу, нарушению функциональной активности иммунокомпетентных клеток, угнетению естественной цитотоксичносги и выраженному снижению противоопухолевой резистентности, что в последующем обусловливает неблагоприятный прогноз у данной категории больных.

11аряду со стадией, степенью злокачественности, иммуноло! ическим и морфологическим вариантом лимфом течение заболевания, лечебную тактику и прогноз определяют с учетом клинических и лабораторных прогностических факторов. Важными неблагоприятными прогностическими факторами для лимфом являются: симптомы опухолевой интоксикации (Б-симптомы), наличие экстра модальных поражений, а также вовлечение в опухолевый процесс костного мозга. Следует отметить, что все перечисленные факторы чаще всего связаны с распространенностью процесса и массой опухоли.

Так, больные НХЗЛ и ЛХ, в клинической картине которых присутствовали Б-симгпомы (лихорадка, потливость, снижение массы тела), имели более высокие показатели всех исследуемых цитокинов по сравнению с пациентами без них- 1Ь-1р - был выше в 3,2 раза у больных 11ХЗЛ и в 1,9 раза у пациентов с ЛХ; ТЫГа - в 4,4 и в 2,4 раза; 1Ь-4 - в 2,0 ив 1,4 раза; 1КЫу - в ¡,5 и 1,4 раза; 1Ь-2 - в

2,2 и 1,4 раза, соответственно; 1Ь-6 - в 1,9 раза, как у пациентов с НХЗЛ, так и у больных ЛХ (табл. 2).

Таблица 2

Уровень цитокинов в сыворотке крови больных лимфомами в зависимости от наличия Б-симптомов

N 1 руиим 1 |роноспа11И1елы1мс 1И1 -профиль 1И2- профиль

больных ЦШОКИНМ

11,-ф 1 N1 и II -2 П'Ыу 11.-4 II -6

НК|/МЛ МК1/МЛ ПК|/МЛ НК1/МЛ ПК|/ЧЛ ПК|/мл

1 Контроль 24.3 ± 51.6 ± 29.7± 38 7± 66 5+ 28 9 +

п = 20 3,21 6 52 2.91 3.13 6 92 4 33

2 НХЗЛ 143.6 + 166,0 + 542.6 1 1077 1 > 197 3 ± "¡2 5 +

|> с-мм 44.22 32,61 82.33 142 34 42 20 8 91

СС11. 1', 2 < 0 (И 1', .< 0 05 Р, ,< 0 01 1>, ,< 0 01 1', ,< 0,05 1', 0 0^

н ~ 32

3 НХЗЛ 44,9 + 38,5 + 241,8 ± 737 0 ± 96.8 + 28 4 +

1> с-чоп 9 54 17.12 44.91 99,23 32.11 4 22

НС1 1', 0 05 1', ,>() 05 1', .< оо«; 1', ,< 0,01 1', 41<0 05 I', >0.05

п-31 Р,, < 0.05 1'2 . < 0.05 1',, ^ 0.05 1'; , > 0,05 1>2. < 0.05 Р. . > 0 05

4 ЛХ 168.7 + 127.4 ± 446.2 ± 673,5 + 183.7 ± 28.1 +

II с-мм 48.21 26,25 75.83 134 33 48.12 6.91

СС 1 к 1'м< 0.05 Р,, < 0.05 Р|4< 0 01 1',4< 0,01 Р. 4 <0.05 Р, 4 > 0.05

11= 14

5 ЛХ 88.0 ± 54.4 + 312.01 487,0 ± 106 0 ± 20.6 ±

1) С-М11В 37,52 14.34 52.43 79,20 24.21 7.22

1101 Р,.,< 0.05 Р| < > 0,05 Р, ,< 0.01 1', ,< 0.01 Р,, < 0 05 Р, ,>0 05

11 = 6 IV, <0.05 1»4 < < 0.05 1'4 < < 0,05 1\ < < 0 05 Р, < < 0.05 1>4 < > 0 05

Примечание п-чнело 6ojii.mi.ix к I рупмс

Наличие экстранодальных очагов поражения у больных лимфомами (как НХЗЛ, гак и ЛХ) сопровождалось увеличением в сыворотке крови уровня провоспалительных цитокинов Т1МРа и 1Ь-1(3, их антагониста - противовоспалительного 1Ь-4, а также регуляторно!о цитокипа 1Ь-2, по сравнению с пациенгами, их не 1

имевшими. Таким образом, диссеминация опухолевого процесса при лимфомах характеризуется одновременным увеличением уровня цитокинов, обладающих реципрокными функциями, что, по-видимому, направлено на сохранение баланса в цитокиновой сети и может рассматриваться как компенсаторная реакция организма с системной активацией всех звеньев иммунитета (специфического -клеточного и неспецифического - макрофаг ально! о), способствующего предотвращению дальнейшего распространения

опухолевых клеток и их элиминации. Однако в большинстве случаев, несмотря на активацию, иммунная система организма не способна самостоятельно справиться с опухолью, так как на ранних этапах развития опухолевая ткань не обладает антигенной выразительностью, а на более поздних - суммарное количество опухолевых клеток значительно превышает количество иммунокомпетентных [Антонов В.Г., 2004].

Таким образом, исследование цигокинов может дать дополнительную информацию о степени злокачественности, стадии заболевания, вероятности экстранодальных поражений.

Клиническая картина заболевания часто сопровождается лабораторными (биохимическими) признаками активности опухолевого процесса. Из биохимических показателей при лимфомах имеют негативное прогностическое значение увеличение уровня лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (содержится в цитоплазме опухолевых клеток) более чем в 2 раза от нормы и осгрофазовых белков (фибриногена, С - реактивного белка).

При изучении взаимосвязи исследуемых цитокинов с концентрацией в сыворотке крови ЛДГ было отмечено, что у больных НХЗЛ и ЛХ с повышенной концентрацией ЛДГ уровень провоспалителытых цитокинов - 1ИР был выше в 3,8 раза, по сравнению с группой больных с нормальной концентрацией этого фермента (473,6+67,5 гткг/мл по сравнению с 124,5±38,2 пкг/мл; р<0,05, соответственно), "ШРа - в 2 раза (239,6±42,4 пкг/мл по сравнению с 116,3±25,8 пкг/мл у пациентов с нормальным уровнем ЛДГ; р<0,05), 1РНу - в 1,3 раза (1160,0±1 19,2 пкг/мл по сравнению с 860,8±84,3 пкг/мл; р<0,05), а противовоспалительного 1Ь-4 - в 1,9 раза (190,4±42,4 пкг/мл по сравнению с 102,3±28,1 пкг/мл; р<0,05). Подтверждением зависимости между данными показателями является наличие положительной корреляционной взаимосвязи между средним значением концентрации ЛДГ в сыворотке крови и I 1И Р (г = 0,49), ЛДГ и 1ЫЗ (г = 0,4), (р<0,05).

При увеличении уровня фибриногена у больных лимфомами, концентрация в сыворотке крови всех исследуемых цигокинов также была достоверно выше, чем в |рупгге больных с нормальным уровнем этого показателя: 1Г-1р - в 2,3 раза; Т^а - в 2 раза; 1Ь-4 -в 2 раза; 1Ь-6 - 3,3 раза; - в 1,3 раза и 1Ь-2 - в 2,8 раза. Следует также отметить наличие достоверной положительной корреляционной взаимосвязи между 1Ь-1р и 'ШРа (г = 0,52), 1ЫРа и 1Ь-6 (г = 0,46), а также И.-1р, 1Ь-6 и уровнем фибриногена в

сыворотке крови (г= 0,52 и г~ 0,49; соответственно), что указывает на системный воспалительный ответ организма на развитие опухолевого процесса.

Для определения прогностической значимости цигокинов проводилось изучение их информативности в сравнении с международным прогностическим индексом 1Р1, который включает в себя наиболее значимые факторы неблагоприятного прогноза при лимфопролиферативных заболеваниях: возраст старше 60 лет, повышение уровня сывороточной лактагдегидрогеназы (ЛДГ), общее состояние больного, соответствующее 2-4 степени (ЕСОС), Ш-У1 стадии болезни, наличие более одного зксгранодального оча1а поражения [8Ырр М.А. е1 а1, 1994]. Было установлено, что пациенты с НХЗЛ, относящиеся в соответствии с индексом !Р1 к группе промежуточного/высокого риска, характеризовались достоверно более высоким содержанием в сыворотке крови провоспалительных цитокинов 1И(3, TNFa, цитокииа, вырабатываемою Пт-1 типа -и противовоспалительного 1Ь-4 (1Ир - был выше в 6,3 раза, Т^а - в 2 раза, - в 2,2 раза, 11.-4 - в 1,8 раза, соответственно) (Рис. I).

11.-1 бета Т№ альфа 1Ь4 ^ гамма

□ Группа низкого риска 1Р1 _И Группа промежуточного/высокого риска 1Р1_

Рис. I. Уровень цитокинов в сыворотке крови больных 11ХЗЛ в зависимости от прогностического индекса 1Р1 *- р<0,05 по сравнению с уровнем цитокинов в группе низкого риска 1Р1.

У больных труппы промежуточною/высокою риска течение ¡аболевания в дальнейшем характеризовалось резистентностью к

проводимой терапии и иеблаюприятным прогнозом - отсутствием ремиссии.

2. Уровень цитокинов и изменения в гемограмме и миелограмме у больных лимфомами

Наряду с внутрисистемной регуляцией иммунных процессов, цитокины контролируют пролиферацию, дифференцировку и функциональную активность клеток различной тканевой принадлежности, включая клетки крови. Одним из факторов, определяющих течение лимфом и состояние гемопоэза у больных, является вовлечение в опухолевый процесс костного мозга. При эгом происходит не только механическая экспансия опухолевого клона с вытеснением нормальных ростков кроветворения, но и нарушение нормальных межклеточных взаимодействий из-за дисбаланса в системе цитокинов, ингегринов и др.[Zheng et al., 1996; Vizier eta! ., 1998].

У больных НХЗЛ с поражением костного мозга (КМ) уровень провоспалительных цигокинов IL-1(3, TNFa, IFNy, а также антагонистичного им противовоспалительного IL-4 был достоверно выше, чем у пациентов без вовлечения КМ в опухолевый процесс (IL-lp - был выше в 2,3 раза, TNFa - в 4,0, IFNy - в 1.5, а IL-4 - в 1,8 раза, соответственно) (Рис. 2).

1200 юоо 800 I 600

зс

400

200 0

□ Поражения КМ нет ЕЗ Поражение КМ есть

Рис.2. Уровень цитокинов в сыворотке крови больных НХЗЛ

при поражении костного мозга * - р<0,()5 по сравнению с пациентами без поражения КМ

S>>// !

уЛШЛ

IL-1 бета TNF альфа

IL-4

IFN гамма

Полученные данные могут указывать на участие провоспалительных цитокинов (lL-ip, TNFa, IFNy) в негативной регуляции гемопоэза у больных НХЗЛ. Повышение уровня цитокинов в данном случае, вероятно, обусловлено взаимодействием между опухолевыми клетками и клетками иммунной системы, что приводит к активации макрофагов и повышенной экспрессии изучаемых цитокинов. IL-I р стимулирует Т-лимфоциты к выработке IFN-y, а IFN-y, в свою очередь, стимулирует макрофаги вырабатывать IL-ip и TNF-a в еще более повышенных концентрациях, что обусловливает в дальнейшем системные эффекты данных цитокинов [R.T. Means, 1992; R.T. Means, S B. Krantz, 1993].

Наличие цитопеиий у больных лимфопролиферативными заболеваниями ведет к необходимости проведения заместительной гемокомпонентной терапии и увеличению перерывов между курсами Г1ХТ, что существенно ухудшает прогноз заболевания

Для изучения роли цитокинов в нарушениях гемопоэза у больных лимфомами был проведен анализ их влияния па развитие анемии (гемоглобин менее 110 г/л), тромбоцитопении (тромбоциты менее 100,0x10%), лейкопении (лейкоцитов менее 3,0x10%), лейкоцитоза (лейкоцитов более 9,0x10%), а также лимфоцитопении (лимфоцитов менее 20%) до начала специфической терапии.

Так, при развитии у больных лимфомами анемического синдрома уровень IL-ip был в 4 раза выше по сравнению с пациентами без анемии, TNFa - в 4,2 раза, IFNy - в 1,5 раза и IL-4 - в 2 раза, соответственно (Рис. 3).

Таким образом, уровень IL-lp, TNF-a, IL-4 и IFN-y у больных лимфомами с анемией был значительно повышен.

Подтверждением участия данных цитокинов в регуляции эритропоэза является выявленная нами достоверная отрицательная корреляционная взаимосвязь между концентрацией в сыворотке крови IL-lp, TNFa и IFNy, уровнем гемоглобина и количеством эритроцитов в периферической крови: IL-lp и Эр (т= -0,51), IL-ip и НЬ (г= -0,48), р<0,01; TNFa и Эр (г= -0,38), TNFa и НЬ (г= -0,39), р<0,05: IFNy и Эр (г= -0,48), IFNy и НЬ (г= -0,45); (р<0,01, соответственно).

11.-1 бета ТЫЯ альфа 11--4 1РЫ гамма

Р Анемии нет 0 Анемия есть

Рис.3. Уровень цигокинов в сыворотке крови больных лимфомами

с анемическим синдромом *- р<0,05 но сравнению с пациентами без анемии

Таким обраюм, полученные результаты свидетельствуют о важной роли цитокинов 1Ь-ф. !Ь-6. ТЫР-и, ^N-7 в паюгснезс анемическою синдрома у больных лимфомами. Данные цинжины являются не!ативными регуляторами гемопозза, снижают пролиферацию ранних эритроидных предшественников и напрямую угнетают продукцию эритропоэгина [Бр^ак 2002, Павлов Л.Д. и соавт., 2004; Лямкина А.С., 2005].

Достоверно более высокий уровень провоспалительных цитокинов 1Ир, TNFa был отмечен и у больных 11ХЗЛ с лейкопенией и тромбоцитопенией в периферической крови (табл. 3).

Выявлено наличие обратной корреляционной взаимосвязи между 11,- ф, ТМРа, IР~Ыу и абсолютным количеством тромбоцитов и лейкоцитов в периферической крови у больных НХЗЛ, а также, абсолютным количеством клеток гранулоцитарного ряда в костном Г мозге, что подтверждает участие данных цитокинов в развитии

тромбоцитопении и лейкопении при гемобластозах (Рис. 4)

В свою очередь, развитие лимфоцитопении у больных ЛХ 4 характеризовалось увеличением в сыворотке крови уровня

провоспалительных цитокинов (1Ь-1р и Т1^Ра) и их антагониста 4, а также достоверным уменьшением уровня цитокинов, вырабатываемых ТЬ-1 типа (1Ь-2 и 1РЫу) по сравнению с группой больных без лимфоцитопении: так, уровень 11,-1 Р был выше - в 2,9

раза, П^Ра - в 3 раза и 1Ь-4 - в 2,7 раза, 1Ь-2 был ниже - в 1,9 раза, а ^N7 - в 2,2 раза (Рис.5).

Таблица 3

Уровень цитокинов в сыворотке крови больных НХЗЛ в зависимости от наличия тромбоцитопении и лейкопении

л 1 руины ПОЛЫНИ* 11ро воспалительные Г11-2 п мфиль 1И-1 П{ юфиль

11.-1Р 11К1/МЛ ПМ1:<х НК1/МЛ 11 -4 1|К|/мл 11.-6 ню/мл 11 Ыу НК|/МЛ 11 -2 НК(/мл

1 Кошроль п = 20 24.3 ±3.21 51,6 + 6.52 66.5± 6.91 28.9+ 4.33 38.7 ± 3.12 29.7 ± 2.93

3 1ромбоии1 1,1 норма п=13 187,8 ± 48.24 Р| , < 0,05 105,1± 34.82 !>, ,<0,05 143.0± 48.14 1', ,<0.05 46.8± 6.45 1', ,>005 1008,0 ± 184,31 1', -,<0,001 521 6 + 126.32 IV,< 0.01

4 1ромбоии1 онсння п = 28 268,0 ± 57,40 1>, ,<0,01 1',, < 0,04 203,01 42.42 1>м< 0 05 1>,, < 0.05 124.4± 34 21 1', .,<0.05 1' 4 >0.05 26 0 ± 4.22 1',4>0 05 1', 4 <0 05 704,0 + 99.22 Р,4<0 01 Р, 4 < 0 05 340,0 ± 95.63 Р, ,<0 01 Р-4 <0,05

Лснкошиы N 11=24 177,1 + 48.22 Р,, < 0.05 128.4 + 25.84 Р, ,<0.05 158.0 + 28.11 1*1 ,<0.05 39.2 ± 4,41 IV* >0.05 11090 + 204.32 Р, ,<001 529.2 1 94 14 Рм<0 01

6 Лснкоисни я 11=20 254.4 ± 77.51 1'и, <0.05 14, < 0.05 208,0 ± 32.42 1'и, <0.05 14, < 0.05 170.8 + 22.32 1'и. <0.05 1»,* >0,05 21 6 ± 5,22 14, > 0.05 14, > 0,05 772.1 1 82.21 14, <0,01 14,, < 0,05 122 4 + 44 24 14. <0,05 14. >0.05

11 - ЧИСЛО 11ШИ1СН10Н II |р>ипс

Между уровнем 1Ь-1р, 'ШРа и 1Ь-4, с одной стропы, и абсолютным количеством лимфоцитов в периферической крови с другой, найдена корреляционная взаимосвязь, которая носила обратный характер: 1Ыр (г = -0,74), ГИРа (г = -0,93), 1Ь-4 (г = -0,58); р<0,01, соответственно).

Таким образом, увеличение уровня провоспалшельных цитокинов 1Ь-1р, Т^ос и 1Ь-4, а также снижение 1Ь-2 и П-Гч1у способствует уменьшению процента лимфоцитов в периферической крови больных ЛХ. Полученные результаты могут быть связаны с тем, что клетки Рид-Штернберга продуцируют ТвР-Р фактор, 1Ь-4 и 1Ь-10, что ведет к угнетению клеточного иммунного ответа по клеточному типу (ТЫ) и снижению уровня в сыворотке крови 1Ь-2 и ^N7. Последнее приводит к снижению прямого миготенного влияния 1Ь-2 на лимфоциты и развитию лимфопении в

периферической крови, наряду с действием провоспалительных цитокинов, которые синтезируются активированными макрофагами в ответ на опухолевый субстрат [Popperna S., van der Berg A. 2000].

Лейкоциты

Громбошпы

I pjüvtomuapiH.m росюк и KM

Рис.4. Корреляционная взаимосвязь уровней цитокинов, лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови, а также цитокинов и клеток гранулоцитарного росгка в КМ у больных НХЗЛ

II.-I бегя I N альфа

TI N Iамма

□ Лимфоцшм норма

0 Лимф»!!!! IOIICIIIIH

Рис.5. Уровень цитокинов в сыворотке крови больных ЛХ в зависимости от уровня лимфоцитов *- р<0,05 но сравнению с пациентами без лимфоцитопении

Таким образом, изменения, происходящие в костном мозге у больных НХЗЛ и ЛХ можно объяснить не только механической экспансией опухолевого клона с вытеснением нормальных ростков кроветворения, но и дефектом микроокружения в результате воздействия на него опухолевых клеток, качественными и количественными изменениями стромы костного мозга, нарушением синтеза цитокинов и изменением экспрессии рецепторов к ним, что является одним из механизмов развития вторичной миелодисплазии. Известно, что в основе этого процесса лежит усиление программированной клеточной гибели клегок-предшественников гемопоэза, в том числе, за счет увеличения концентрации цитокинов, индуцирующих апоптоз - ГМ7а и 1Ь-1Р Данные цшокины продуцируются как клетками КМ в огвст на развитие опухоли, так и некоторыми опухолевыми клетками. Реализация их проапоптотического действия возможна при наличии на клетках КМ поверхностных рецепторов к цитокинам [Ширин и соавт., 2001; Цветаева и соавт., 200!; Воробьев А.И., 2002]

3. Экспрессия рецепторов к цитокинам у больных иеходжкинскими 1локачествеиными лимфомамн

С целью уточнения роли взаимодействия опухолевых клеток и цитокинов в механизмах опухолевой прогрессии у 58 больных НХЗЛ была исследована экспрессия рецепторов к цитокинам (1Ь-1р, и 1Ь-10) на поверхности клеток костного мозга. У 28 человек (48,3%) были диагностированы лимфомы низкой степени злокачественности, у 30 (51,7%) - высокой степени злокачественности. Выявлено, что экспрессия рецепторов к цитокинам отмечалась как на опухолевых лимфоидных клетках, так и на нормальных мононуклеарах костного мозга (МНК КМ), что, скорее всего, связано с плейотропностью действия данных регуляторных молекул (Рис.6-7).

У 31,1% больных экспрессия рецепторов к цитокинам на опухолевых клетках была низкой, а у 68,9% обследованных количество лимфоидных опухолевых клеюк, экспрессирующих рецепторы к цитокинам было, напротив, повышено и соответствовало общему количеству опухолевых элементов костного мозга, из них у 34,5% пациентов отмечено наличие в цитологических препаратах растворимых форм рецепторов, в основном к 1Ь-ф, что коррелировало с резистентностью к

проводимой терапии и безремиссионным течением заболевания. Полученные данные согласуются с литературными, в которых показано, что продукция растворимых форм рецепторов при опухолях значительно увеличивается. Это приводит к формированию иммуносупрессии и являйся маркёром плохого прогноза и агрессивности заболевания [Лг^егаоп е1 а!., 1994; Браг-геМ е1а!., 1997].

11.-1 бета Я ||_-6 Я 11.-10 К пимфоидные

клетки КМ

□ Экспрессия рецепторов к цитокимам на опухолевых клетках

Рис.6. Уровень экспрессии рецепторов к цитокинам на опухолевых лимфоидных клетках больных 11ХЗЛ

11.-1 бета 13 11.-6 К II--10 Я МНК КМ

0 Экспрессия рецепторов к цитокинам на МНК КМ

Рис.7. Уровень экспрессии рецепторов к цитокинам на мононуклеарных клетках костното мозга (МНК КМ) больных НХЗЛ

У больных с высокой экспрессией рецепторов к циюкинам, уровень в сыворотке крови И,-6 и 11.-1(3 был достоверно выше, чем у пациентов с низким уровнем экспрессии рецепторов (для 11,-6 -

21

135,2±24,51 пкг/мл у больных НХЗЛ с высоким уровнем экспрессии Я к 1Ь-6 по сравнению с 71,6±18,21 пкг/мл у больных НХЗЛ с низким уровнем экспрессии Я к 1Ь-6; для !Ь-1 (3 - 347,3±38,42 пкг/мл по сравнению с 60,3±15,43 пкг/мл; р<0,05, соответственно), чго указывает на способность опухолевых клеток синтезировать данные цитокины и экспрессировать рецепторы к ним для усиления собственной пролиферации [ ].

Следует также отметить, что уровень экспрессии Я к 1Ь-6 коррелирует с процентом лимфоидных клеток в КМ и периферической крови (г= 0,64; г= 0,75) и уровнем данного цитокина в сыворотке крови (г= 0,76), что подтверждает факт ауюкринной и паракринной регуляции опухолевого роста у больных НХЗЛ.

Таким образом, параллельное исследование уровня цитокинов в сыворотке крови и экспрессии рецепторов к ним на поверхности опухолевых клеток дает ценную информацию об участии цигокинов в иммунопатогенезе неоплазий.

4. Уровень цитокинов в сыворотке крови больных лимфомамн и экспрессия основных регуляторных белков опухолевой прогрессии

Для более детального изучения участия цитокинов в патогенезе опухолевого роста исследована их взаимосвязь с выраженностью экспрессии на опухолевых клетках КМ больных НХЗЛ основных регуляторных белков, участвующих в опухолевой прогрессии: антиапоптотичсского - (Ьс1-2), онкопротеина (с-тус), маркера пролиферагивной активности ютсюк - кт-67, основною регулятора клеточного цикла - белка р53, рецепторной молекулы для проведения апоптотического сигнала - С095 и маркера множественной лекарственной резистентности - р-гликопротеина (р-ВР)-

Определение экспрессии данных регуляторных молекул г

проводилось методом иммуноцитохимии. Поскольку у больных ЛХ поражение костного мозга опухолевым процессом встречается редко и учитывая, что в настоящем исследовании таких пациентов не было, данное исследование им не проводилось

Для определения прогностической роли изучаемых молекулярных маркеров опухолевой прогрессии все пациенты с лимфомами, в зависимости от результатов лечения, были разделены

на 2 группы: с хорошим ответом (полная и частичная ремиссия) и отсутствием эффекта от лечения (безремиссионное течение).

В группе больных, где у пациентов не был достигнут эффект от лечения, уровень экспрессии опухолевыми клетками р-53, Ьс1-2 и с-тус был в 1,5 раза, К1-67 в 3 раза, а р-цр в 4 раза выше, чем в группе пациентов, у которых эффект от проводимой терапии был досиниут (Рис.8).

Анализ результатов лечения свидетельствует о юм, что в группе больных с высоким уровнем экспрессии изучаемых ретулягорных белков у большинства пациентов наблюдалась резистентность к проводимой терапии и плохой прогноз, безремиссионное течение отмечено у 60,2% обследуемых, а общий ответ на 1срапию составил 38,8% Международный прот носгический индекс у данных пациентов соответствовал, в основном, фуппе высокою и высокото/промежугочнот о риска у 75% болт,пых.

р-53 bcl-2 c-myc p-gp Ki-67 С95

И Благоприятный ответ на терапию Ш Отсутствие эффекта от лечентия

Рис 8 Выраженное ib жсирессии peí уляторпых белков в i руинах больных лимфомами с различным oibciom на 11X1'

* - р<0.05 по сравнению с уровнем жсирессии в ipyiine с блаюнрия 1ht.im oibciom на icpaiimo

В труппе больных с низким уровнем ичи шсумсизием жсирессии р-53. bcl-2. c-myc. ki-67, p-gp и CD95 общий otbci на проводимую icpaimio составил 60% (полная и частичная ремиссия),

что в 1,7 раза выше, чем у пациентов с высоким уровнем экспрессии исследуемых регуля горных белков. Безремиссионпое течение отмечено в данной группе у 40% обследованных, что также меньше, чем в предыдущей группе. Международный прогностический индекс соответствовал ipynne низкою и низкого/промежуючною риска у 70% больных.

1аким образом, комплексное исследование экспрессии продуктов ведущих семейсгв 1енов ретуляторов апоптоза, пролиферативной активности и лекарственной резис1ептнос1и на опухолевых клетках гсмопокической системы является важным самостоятельным критерием опухолевой профессии и первичной химиорезистенгное i и.

Анализ взаимосвязи уровня исследуемых циюкинов с выраженностью экспрессии ретуляторных молекул показал, что гимерэкснрессия на опухолевых клетках маркера блока апоптоза р-53 (мугантното типа) сопровождалась увеличением в сыворотке крови, в основном, уровня II -2 - в 1.5 раза и 11,-6 - в 3.4 раза, причем между данными цитокинами и процентом опухолевых клеток, жспрессирующих р-53 найдена положительная корреляционная взаимосвязь: II,-2 и р-53 (г= 0,56), 11,-6 и р-53 (г= 0,72): (р<(),()5, соответственно) (Рис.9)

бета альфа гамма

| В Отсутствие экспрессии р-53 □ Гиперэкспрессия р-53 |

Рис.9. Уровень циюкинов в сывороже кровн больных НХЗЛ в зависимости от выраженности жспрессии р-53 * - р<0.05 по сравнению с отсу тствием жспрессии р-53

Обнаружение на опухолевых клетках друюю антиапонтотичсското белка - Ьс1-2 также характеризовалось

достоверно более высоким уровнем в сыворотке крови 1Р-2 - в 1,8 раза и 1ЧМРа - в 2,3 раза по сравнению с пациентами, у коюрых Ьс1-2 не определялся (584,6±92,9 пкг/мл у больных НХЗЛ с высокой экспрессией Ьс1-2 по сравнению с 333,9+62,5 пкг/мл у больных ПХЗЛ с отсутствием экспрессии Ьс1-2 и 153,1+47,6 пкг/мл по сравнению с 66,27+ 9,5 пкг/мл; р<0,05, соогветственно) Между выраженностью экспрессии Ьс1-2 и уровнем 1Ь-2 1акже имелась положительная корреляционная взаимосвязь (г= 0,49).

Анало! ичные резулыаты получены при изучении экспрессии на опухолевых клетках рецепторной молекулы для проведения апоптогического сигнала СП95 и маркера пролиферашвной активности клеюк (К1-67). Гиперэкспрессия данных молекулярных маркеров сопровождалась значительным увеличением в сыворо1ке крови уровня всех исследуемых цнтокинов (Рис. 10-11).

600 500 400 | 300 200 100 0

0 Умеренная экспрессия К1-67 О Гиперэкспрессия «¡-67

Рис. 10. Уровень цитокинов в сыворотке крови больных 11ХЗЛ в зависимости от выраженности экспрессии К¡-67 * - р<0,05 по сравнению с отсутствием экспрессии К1-67

Анализ полученных результатов чказывает па ю, чю при развинти лимфом (неходжкинекпх злокачественных лимфом и лимфомы Ходжкина) происходит изменение баланса циюкинов в организме, характеризующееся нархшением их продукции и чувствительности к ним рецепторов как опухолевых так и нормальных клеток.

бета альфа гамма

бета альфа гамма

| И Отсутствие экспрессии СР95 И Гиперэкспрессия СР95

V,

Рис. 11. Уровень цитокинов в сыворотке крови больных НХЗЛ в зависимости от выраженности экспрессии С1Э95 * - р<0.05 по сравнению с отсутствием экспрессии С095

СВЯЗЬ урОВНя' ЦИI ОКИ НОВ В СЫВОрОТКе КрОВИ С 1ЯЖСС1ЫО и агрессивностью течения, клиническими проявлениями, резистентностью к терапии, протозом и эффективное! 1,10 лечения лимфом указывает на их участие в паюгенезе опухолевою рос 1а и свидетельствует о диагностической и прогностической значимости исследования уровня цитокинов, возможности их использования в качестве маркеров опухолевой прогрессии и эффективности проводимой терапии при темобласгозах. Данные >ффекты цинжинов как па опухолевые, так и на иммунокомпетепгные клетки в значительной мере реализуются блаюдаря их способности изменять жспрессию основных регуляюрных белков (р-53, Ьс1-2, с-птус. К.1-67, С095, р-цр), определяя тем самым дальнейшую судьбу клетки и прогноз заболевания.

ВЫВОДЫ

!. У больных иеходжкииской злокачественной лимфомой и ?

лимфомой Ходжкипа до лечения отмечено увеличение в сыворотке крови уровня провосиалшельных цитокинов - и '1»Га (в 4,7 -8,5 раза), регуляюрных цитокинов Пт-1 профиля - IЬ-2 и 1ГИу (в 15 -22.2 раза) и противовоспалительною цитокина ТЬ-2 профиля - 1Г-4 (в 1.8 - 2,5 раза) по сравнению с контрольной труппой. Проведение курсов ноли\имио1срапии у больных ПХЗЛ и ЛХ приводи! к снижению уровня всех исследуемых цинжинов при достижении клинико-темагологичсской ремиссии.

2. Наиболее выраженные изменения уровней исследуемых ци Iокинов наблюдаются у пациентов, относящихся к группе промежуточного/высокого риска в соответствии с индексом ПЧ, у больных лимфомами с первичной резистентностью, 1П-1У стадиями заболевания, Б-симпгомами, экстранодальными поражениями, высоким уровнем ЛДГ и фибриногена, а также при В-клеточном подварианте индолентных лимфом и варианте лимфоидное преобладание при лимфоме Ходжкина.

3. Вовлечение в опухолевый процесс костного мозга (лейкемизация процесса) у больных НХЗЛ характеризуется увеличением в сыворотке крови уровня провоспалитсльных цитокинов И.-ф, TNF(X и а гакже противовоспалительною II,-4 и коррелирует с развитием анемии, тромбоцитонении, лейкопении и лимфоцигонении.

4. Исследование экспрессии рецепторов к 1И[3, 1Ь-6 и 1Ь-10 на клетках костного мозга больных НХЗЛ выявило их наличие как на опухолевых лимфоидных, так и на нормальных мононуклеарных клетках, что связано с плейотронносгыо действия данных цитокинов. У 31,1% больных жснрессия рецеторов к цитокинам на опухолевых клетках снижена, а у 68,9% обследованных количество лимфоидных опухолевых клеток, экспрессирующих рецепторы к цигокипам, напротив, повышено и соответствует общему количеству опухолевых элементов костною мозга, из них у 34,5% пациентов отмечено наличие растворимых форм рецепторов, в основном к которые синтезируются опухолевыми клетками и обусловливают резис тент носи. к проводимой терапии и безремиссиоипое течение заболевания.

5. Процент 11.-6-1*+ клеток в костном мозге коррелирует с увеличением уровня 1Ь-6 в сыворотке крови (Т|= 0,76). а также с количеством лимфоцитов в костном мозге и периферической крови (тз= 0,64 и п- 0,75; соответственно), что подтверждает факт ауюкринной и паракринной ретуляции опухолевого роста у больных НХЗЛ.

6. Установлена взаимосвязь между повышением уровня цитокинов и гиперэкспрсссией на опухолевых клетках основных молекулярных маркеров опухолевой прогрессии: регуляторных белков клеточного цикла (мутапшою р-53 и Ьс1-2), онкопротеипа -с-птус. рецешорной молекулы С095. маркера пролиферативной активности - К1-67, что коррелирует с агрессивностью течения заболевания и отсутствием )ффекта от проводимой терапии.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Скворцова Н.В., Зенков А.Н., Поспелова Т.Н., Лосева М.И., Зенкова М.А., Мишенин A.B. Множественная лекарственная устойчивость и её влияние на эффективность ПХ'Г у больных гемобластозами // Сборник материалов XIII научно-практической конференции врачей 2003г. - 11овосибирск, 2003. - С. 182.

2. Скворцова Н.В., Зенков A.M. Взаимосвязь различных механизмов множественной лекарственной устойчивости и ее влияние на эффективность лечения и прогноз у больных гемобластозами // В материалах ежетодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых ПГМА «Авиценна - 2003» - Новосибирск, 2003. - С. 40-41

3. Зенков А.Н., Скворцова М.В.. Ковынев И Б, Черноловская ГЛ., Власов В.В., Поспелова Т.Н. Определение и сравнение часнны встречаемости повышенно!о уровня жснрссси генов MDRI и MRP у больных злокачественными лимфомами // Тезисы докладов Российско-Норвежской конференции темаюлоюв 2003 - Санкт-Петербург, 2003.- С. 73-74.

4. Скворцова П.В., Поспелова Г.И., Зенков А.Н , Лосева М.И., Ковынев И.Б., Воропаева E.H., Макарец A.A.. Бурундукова М.В. Интенсивность накопления онкопро геи нов bcl-2 и р-53 как фактор прогноза при онкогематологических заболеваниях // Сборник материалов XIV научно-практической конференции врачей 2004т. -11 о вое и б и рс к, 2004. - С. 87-88.

5. Ковынев И.Б., Поспелова Г.И.. Лосева М.И.. Агеева Т А., Дъячкова НЮ.. Скворцова II.В. Иммуноморфологический анализ жспрессии р-53, bcl-2 и с-тпус опухолевыми клетками больных крупноклемочной неходжкинской злокачественной лимфомой // В сборнике материалов научно-практической конференции, посвященной памяти профессора Ю.Г. Целлариуса «Клинико-морфологические аспекты общенатолог ических процессов при социально-значимых заболеваниях - 2004». - Новосибирск, 2004 -С.103-104.

6. Скворцова II.В.. Поспелова 1 И.. Лосева М.И . Ковынев И.Б. Концентрация про- и противовоспалительных циюкинов как возможный факюр прошоза у 6ojh>hi>ix iсмобласюзами // В материалах ежегодной научно-практической конференции с международным участием «Медицина и образование в XXI веке -2005». - Новосибирск, 2005 - С 345-147

7. Ковыпсв И.Б., Лосева М.И., Поспелова Т.И., Дъячкова Н.Ю., Воропаева IZ.II., Макарец A.A., Скворцова Н.В. Исследование маркеров апоптоза па опухолевых клетках неходжкинских злокачественных лимфом // В материалах ежегодной научно-практической конференции с международным участием «Медицина и образование в XXI веке - 2005» - Новосибирск, 2005. - С. 166168.

8. Русанова Т.С., Лямкина A.C., Скворцова II.B. Роль цинжипов и сывороточного эригропо)тина в развитии анемического синдрома у больных лимфомами // В материалах ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых НГМА «Авиценна -2005». - Новосибирск, 2005. - С. 49-50.

9. Мологкова Г.В., Скворцова II.В.. Лямкина A.C. Особенности цитокинового статуса и его клиническое значение при неходжкинских злокачественных лимфомах // В материалах ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых 11ГМА «Авиценна - 2005». - I !овосибирск, 2005. - С. 44-45.

10. Мельникова Е.М., Воропаева E.H., Скворцова Н.В Уровни экспрессии bcl-2 и р-53 и эффективность химиотерапии лимфом и лимфо| рапулематоза // В материалах еже1 одной конкурс-конференции студентов и молодых ученых НЕМА «Авиценна -2005». - Новосибирск, 2005. С. 42-43*

И. Скворцова II.В., Поспелова Т.И., Лосева М.И., Ковынев И.Б., Лямкина A.C., Воропаева Ell, Печупаева И.П. Клиническое и патотенегическое значение некоторых цитокинов при злокачесгвеппых неходжкинских лимфомах // Сборник материалов XV научно-практической конференции врачей 2005i. Новосибирск, 2005. - С. 266-267.

12. Воропаева E.H., Поспелова Т.И., Лосева М.И., Ковынев И.Б., Скворцова И.В., Дьячкова ILIO.. I ребнева Т.С. Влияние экспрессии Р-53 тт Bcl-2 па клиническое течение лимфом и эффективность терапии I линии // Сборник материалов XV научно-1!ракшческой конференции врачей 2005i. - I (овосибирск. 2005. - С. 268-269.

13. Поспелова Т.И., Зепков All, Макарец A.A., Ковынев И.Б, Скворцова II.В., Зенкова М.А.. Власов В.В. Множественная лекарственная устойчивость и чувствительность опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам у больных гемобласюзами // Сборник материалов Всероссийской конференции «Фундаментальные науки медицине» 2005г. - Новосибирск, 2005. - С. 75.

14. Лосева М.И., Поспелова Т.Н., Ковынев И.Б., Агеева Т.А., Зенкова М.А., Зенков А.Н., Скворцова Н.В., Власов В.В. Клинико-морфологические и молекулярно-биологические основы опухолевой прогрессии гемобластозов // Монография «Терапевтическая школа и прогресс ингернологии» Юбилейный сборник научных работ, посвященный 70-летию НГМА и основателю Новосибирской школы терапевтов, заведующему кафедрой юспигальной терапии (19531977), член-корреспондету АМН СССР Аристарху Александровичу Дёмину, под редакцией Л.А.Дёмина. Новосибирск, 2005. - С. 107-

15. Поспелова Т.Н., Скворцова II.В.. Зенков Л.II., Лосева М.И., Ковынев И.Б. Маркеры блока апотоза как фактор прогноза ири гемобластозах // Проблемы гематологии и переливания крови. Научно-практический журнал. - Москва. - 2004. - С.55.

16. Поспелова Г.И., Лосева МИ., Ковынев И.Б., Ai сева Г.А., Зенкова М.А., Черноловская Е.Л.. Зенков А.П., Скворцова II.В., Власов В.В. Механизмы опухолевой прогрессии ири темобласюзах // Бюллетень СО РАМН. Научно-теорегический журнал №2. 2004. Новосибирск. - 2004. - С. 73-76.

17. Зенков А.П., Скворцова II.В., Черноловская СЛ., Зенкова М.Л., Поспелова Т.Н., Лосева М.И., Власов В.В Экспрессия генов MDRt и MRP у больных лимфомой с первичным поражением костного мозга // Бюллетень СО РАМП. Научно-теоретический журнал №2, 2004. Новосибирск.-2004.-С. 110-114.

18. Поспелова Т.П., Ковынев И.Б.. Лосева М.И., 11счунаева И.11 , Скворцова II.В.. Зенков А.П.. Дъячкова Н.Ю. Молекулярно-биологические и биохимические маркеры протнош опухолевой прогрессии лимфом // Проблемы гематологии и переливания крови. Научно-нрак1ический журнал Москва. - 2004. - С.54-55.

19. Скворцова Н.В., Поспелова Т.Н.. Лосева М.И., Ковынев И.Б. Особенности цитокинового статуса у больных неходжкинскими лимфомами // Журнал эксперименталыюй и клинической медицины №1-2. 2004. - 11овосибирск, 2004. - С 65-72.

20. Поспелова Г.И., Лосева М.И.. Ковынев И.Б., Ai сева Т.А., Зенкова М.А., Зенков АН, Скворцова 11.В., ВВ. Власов. Основы опухолевой прогрессии гемобластозов // Жу рнал экспериментальной и клинической медицины №1-2, 2004 - Новосибирск, 2004. - С 48-

114.

52.

Соискатель

Скворцова П.В.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

II,-ip. IL-2, IL-4, IL-6, IL-IO- имгерлейкимы

TNFa - фактор некроза опухоли альфа

IFNy - интерферон 1амма

"I GF "Р - трансформирующий фактор poeta

IL-ipR, IL-6R, 1L-I0R - рецепторы к шперлейкинам

Th-1 - Т-хелперы I типа

Tli-2 - Т-хелперы 2 типа

КМ - костный мозг

МНК КМ - мопонуклеарные клетки кос шок» мола

Эр - эритроцит ы

НЬ — темоглобин

ЛДГ - лак1агдс1 идрот сна за

СРВ - С - реактивный белок

ПХ'Г - полнхимио1ерания

IPI - международный npoi носшчеекий индекс ЛХ -лимфома Ходжкина

НХЗЛ - неходжкинские злокачественные лимфомы 11СЗ - лимфомы низкой степени злокачественности ВСЗ-лимфомы высокой степени злокачественности

г

Новосибирский государственный архитектурно-строительный университет (Сибстрин) 630008, г.Повосибирск, ул.Ленинградская, 113 Отпечатано мастерской оперативной полиграфии НГАСУ (Сибстрин)

Тираж 100. Заказ 423

Iii л » „,

- / з о

РНБ Русский фонд

2006г4 27644

Актуальность темы

Развитие злокачественных новообразований является одной из интенсивно изучаемых проблем в современной науке, привлекающей внимание ученых различных специальностей. Несмотря на заметный прогресс в понимании патогенеза, разработке методов диагностики и лечения опухолей в последние десятилетия, онкологическая заболеваемость продолжает неуклонно возрастать (Поддубная И.В., 2004; Чиссов и соавт., 1995). Это касается и опухолей системы кроветворения - гемобластозов. По данным Е.В.Козяевой, заболеваемость • гемобластозами, в основном, злокачественными лимфомами и лейкозами, увеличивается темпами, опережающими общую онкологическую [Хозяева Е.В. и соавт., 2003]. На фоне активного изучения процесса возникновения неоплазий много неясного остается в механизмах опухолевой трансформации клеток, приобретении ими свойств, позволяющих расти и метастазировать, избегая при этом действия противоопухолевой защитной системы организма и применяемых методов лечения.

Злокачественные новообразования являются той формой патологии, при которой принципиально извращаются механизмы контроля процессов пролиферации и дифференцировки клеток. Немаловажную роль при этом играют цитокины [Абелев Г.И., 2000].

Цитокины — это биологически активные вещества, которые продуцируются различными клетками организма и являются факторами взаимодействия между клетками всех органов и систем. Во многих случаях они проявляют себя как факторы аутокринной регуляции, осуществляют эндогенную координацию межклеточных взаимодействий различных звеньев гемопоэза, иммунной системы (формирование специфического и неспецифического иммунитета), эмбриогенеза, регенерации, развития нервной системы, функционирования сосудов и воспаления. Цитокины определяют многие клеточные процессы: выживаемость клеток, их дифференцировку, функциональную активность и апоптоз [Локшина JI.A., Голубева Н.В., 1998].

Многообразие биологических эффектов и их ключевая роль в поддержании иммунологического гомеостаза делает понятным, почему нарушение баланса в системе цитокинов - важный механизм развития многих патологических процессов, в том числе и злокачественных новообразований [Кетлинский С.А. и соавт., 1992; Потапнев М.П., 1994; Чекнев С.С., 1993; BerdtzenK., 1994].

В последнее время большое значение придается роли цитокинов (интерлейкинов, интерферонов, факторов роста и т.д.) в патогенезе онкологических заболеваний, активно разрабатываются вопросы взаимосвязи дисбаланса в системе цитокинов с течением опухолевой прогрессии и прогнозом заболевания [Антонов В.Г., Козлов В.К., 2004; Чердынцева Н.В. и соавт., 2005]. Исследованиями В.В.Aggravai, K.Natarajan [1994] и В.В.Бредер [2003] доказано, что в процессе опухолевой прогрессии цитокины индуцируют синтез белков острой фазы, активируют защитную систему плазмы крови, могут подавлять деление гемопоэтических стволовых клеток, что приводит к развитию анемии, лимфопении и формированию значимых субпопуляционных нарушений со стороны клеток иммунной системы [Ширшев C.B., 1998; Dinarello С., 1996].

Гены цитокинов активируются сопряженно с онкогенами при хромосомных аберрациях [Rook А.Н. et al, 1995; Ветра Я.Я. и соавт., 2000; Грачева JI.A. и соавт., 1998; Antoni В.А. et al., 1995]. Известно, что в процессе возникновения и развития опухоли происходит, прежде всего, нарушение баланса между секрецией проопухолевых (IL-6, кислотолабильная фракция IFN-a/p), противоопухолевых (IL-2, кислотостабильная фракция IFN-a /р, TNF-a), а также регуляторных (IFN-y) цитокинов [Бережная Н.М., Чехун В.Ф., 2000; Козлов В.А. и соавт., 2002; Молчанов О.Е. и соавт., 2002].

Секреция определенных цитокинов может обеспечивать преимущества роста для клеток опухоли аутокринным или паракринным путем [Hsu S.M et al., 1993]. В работах Ellis R.E., Yuan J., Horvitz H.R, 2002г. показано, что при некоторых солидных новообразованиях интерлейкины (IL) способны также влиять на рост опухолевых клеток, изменяя экспрессию белков про- и антиапоптотического действия, различных онкогенов, маркеров пролиферативной активности клеток, основного регулятора клеточного цикла - белка р53 и маркера множественной лекарственной резистентности -р-гликопротеина (p-gp), что может иметь большое значение при определении прогноза заболевания и выборе тактики ведения больного [Ellis R.E. et al., 2002; Jacobson M.D. et al., 1996; Kerr J.F.R.,et al., 1992].

Однако данные литературы по этому вопросу часто являются противоречивыми. Проблема участия цитокинов в процессах роста и распространения опухолей остается до конца не изученной. Не выявлена зависимость уровня цитокинов от конкретных нозологии, не описана динамика этих показателей в ходе опухолевой прогрессии, не определены изменения уровней цитокинов, происходящие при лечении опухолей.

Наименее изученными в этом отношении являются опухоли системы кроветворения - гемобластозы, а поскольку гемопоэтические клетки сами являются продуцентами цитокинов, оценка их влияния на развитие гемобластозов достаточно сложна.

Вместе с тем, изучение роли цитокинов в патогенезе гемобластозов позволит использовать их в качестве возможных прогностических факторов и средств мониторинга течения заболевания.

Учитывая вышеизложенное, представляется важным и перспективным исследование ряда цитокинов в сыворотке крови больных гемобластозами с целью установления закономерностей изменения данных показателей в зависимости от стадии, тяжести процесса, ответа на терапию.

Целью работы явилось изучение уровней про-, противовоспалительных и регуляторных цитокинов в сыворотке крови больных лимфомами и установление связи данных показателей с характером течения заболевания, клинико-лабораторными проявлениями, морфологическими особенностями, выраженностью экспрессии основных регуляторных молекул и эффективностью проводимой терапии.

Задачи исследования:

1. Исследовать уровень цитокинов (1Ь-1р, ТИРа, 1Ь-2, ШЫу, 1Ь-4,1Ь-6) в сыворотке крови больных лимфомой Ходжкина и неходжкинскими злокачественными лимфомами до лечения и в динамике полихимиотерапии.

2. Изучить цитокиновый статус у больных лимфомой Ходжкина и неходжкинскими злокачественными лимфомами в зависимости от стадии заболевания, поражения костного мозга, клинико-лабораторных проявлений болезни.

3. Определить процент клеток костного мозга, экспрессирующих рецепторы к 1Ь-1Р, 1Ь-6,1Ь-10 у больных лимфомами.

4. Определить уровень экспрессии регуляторных молекул р-53, Ьс1-2, с-шус, Кл-67, С095, р-гликопротеина (р^р) у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами.

5. Определить взаимосвязь между уровнем цитокинов, интенсивностью экспрессии белков блока апоптоза (р-53, Ьс1-2), пролиферативной активности опухолевых клеток (с-шус, Кл-67), множественной лекарственной устойчивости и прогнозом заболевания у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами.

Научная новизна

Показано, что у больных лимфомами (неходжкинскими злокачественными лимфомами и лимфомой Ходжкина) до начала лечения, на этапе диагностики опухолевого процесса, происходит повышение уровней провоспалительных цитокинов (1Ь-1р и ТЖ-а), цитокинов ТЬ-1 (1Ь-2, ШЫу) н ТЬ-2 типов (1Ь-4, 1Ь-6). Обнаружена зависимость между уровнем цитокинов в сыворотке крови пациентов и стадией заболевания, гистологическим вариантом опухоли, клиническими особенностями течения, изменениями лабораторных показателей.

Доказано, что проведение больным НХЗЛ и ЛХ полихимиотерапии приводит к снижению уровней исследуемых цитокинов в сыворотке крови, что коррелирует с эффективностью терапии.

Впервые проведено исследование количества клеток костного мозга, экспрессирующих рецепторы к 1Ь-1р, 1Ь-6 и 1Ь-10 у больных лимфомами. Выявлено, что рецепторы к данным цитокинам экспрессируются как на опухолевых, так и на нормальных мононуклеарных клетках костного мозга. Также показано, что уровень экспрессии рецепторов к 1Ь-6 положительно коррелирует с процентом лимфоидных клеток в костном мозге и периферической крови и уровнем 1Ь-6 в сыворотке крови, что подтверждает факт аутокринной и паракринной регуляции опухолевых роста у больных НХЗЛ.

У больных НХЗЛ изучена экспрессия на опухолевых клетках маркеров блока апоптоза р53 и Ьс1-2, пролиферативной активности (кь67 и с-шус) и множественной лекарственной устойчивости (р^р). Показано, что гиперэкспрессия р^р, Кл-67, Ьс1-2, с-шус и р-53 у больных лимфомами сочетается с первичной резистентностью и безремиссионным течением заболевания.

Установлена взаимосвязь между повышением уровня цитокинов в сыворотке крови и процентом опухолевых клеток костного мозга, экспрессирующих молекулярно-биологические маркеры опухолевой прогрессии: белки блока апоптоза - мутантный р53 и Ьс1-2, пролиферативной активности клеток - к>67 и с-шус и множественной лекарственной устойчивости - р-гликопротеин у больных НХЗЛ.

Практическая значимость

Результаты, полученные при исследовании уровней цитокинов и регуляторных белков в процессе развития и лечения неходжкинских злокачественных лимфом и лимфомы Ходжкина вносят вклад в современные представления об участии цитокинов в патогенезе злокачественных заболеваний крови.

Полученные данные, отражающие изменение уровня цитокинов в сыворотке крови больных лимфопролиферативными заболеваниями и их корреляция с основными характеристиками болезни, являются основанием для их использования в качестве диагностических и прогностических критериев при онкогематологических заболеваниях.

Наличие корреляционных связей между высоким уровнем цитокинов в сыворотке крови больных НХЗЛ и ЛХ и резистентностью к проводимой терапии указывает на их участие в формировании лекарственной устойчивости и является фактором прогноза достижения ремиссии и риска развития рецидива у данных больных, а также эффективности проводимой терапии.

Положения выносимые на защиту:

1. У больных неходжкинскими злокачественными лимфомами и лимфомой Ходжкина в дебюте заболевания происходит увеличение уровней цитокинов 1Ь-1Р, ТЪШа, №N7, 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-6 в сыворотке крови. После курсов полихимиотерапии, при достижении клинико-гематологической ремиссии, наблюдается снижение этих показателей.

2. Уровень цитокинов в сыворотке крови больных НХЗЛ (1Ь-1Р, ТЫРа, №N7, 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-6) зависит от стадии процесса, морфологического варианта опухоли, клинических проявлений болезни, поражения костного мозга, изменения лабораторных показателей, экспрессии рецепторов к ним на опухолевых клетках.

3. Выраженность экспрессии белков блока апоптоза (р-53, Ьс1-2), пролиферативной активности опухолевых клеток (с-шус, Кл-67), множественной лекарственной устойчивости (р^), рецепторной молекулы СЭ95 на опухолевых клетках больных НХЗЛ коррелирует с уровнем про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови и влияет на прогноз заболевания.

выводы

1. У больных неходжкинской злокачественной лимфомой и лимфомой Ходжкнна до лечения отмечено увеличение в сыворотке крови уровня провоспалительных цитокинов - IL-ip и TNFa (в 4,7 - 8,5 раза), регуляторных цитокинов Th-1 профиля - IL-2 и IFNy (в 15 - 22,2 раза) и противовоспалительного цитокина Th-2 профиля - IL-4 (в 1,8 - 2,5 раза) по сравнению с контрольной группой. Проведение курсов полихимиотерапии у больных HX3J1 и JIX приводит к снижению уровня всех исследуемых цитокинов при достижении клинико-гематологической ремиссии.

2. Наиболее выраженные изменения уровней исследуемых цитокинов наблюдаются у пациентов, относящихся к группе промежуточного/высокого риска в соответствии с индексом IPI, у больных лимфомами с первичной резистентностью, III-IV стадиями заболевания, Б-симптомами, экстранодальными поражениями, высоким уровнем ЛДГ и фибриногена, а также при В-клеточном подварианте индолентных лимфом и варианте лимфоидное преобладание при лимфоме Ходжкина.

3. Вовлечение в опухолевый процесс костного мозга (лейкемизация процесса) у больных НХЗЛ характеризуется увеличением в сыворотке крови уровня провоспалительных цитокинов IL-ip, TNFa и IFNy, а также противовоспалительного IL-4 и коррелирует с развитием анемии, тромбоцитопении, лейкопении и лимфоцитопении.

4. Исследование экспрессии рецепторов к IL-lp, IL-6 и IL-10 на клетках костного мозга больных НХЗЛ выявило их наличие как на опухолевых лимфоидных, так и на нормальных мононуклеарных клетках, что связано с плейотропностыо действия данных цитокинов. У 31,1% больных экспрессия рецепторов к цитокинам на опухолевых клетках снижена, а у 68,9% обследованных количество лимфоидных опухолевых клеток, экспрессирующих рецепторы к цитокинам, напротив, повышено и соответствует общему количеству опухолевых элементов костного мозга из них у 34,5% пациентов отмечено наличие растворимых форм рецепторов, в основном к 1Ь-1р, которые синтезируются опухолевыми клетками и обусловливают резистентность к проводимой терапии и безремиссионное течение заболевания.

5. Процент 1Ь-6-Я+ клеток в костном мозге коррелирует с увеличением уровня 1Ь-6 в сыворотке крови (Г]= 0,76), а также количеством лимфоцитов в костном мозге и периферической крови (гг= 0,64 и г3- 0,75; соответственно), что подтверждает факт аутокринной и паракринной регуляции опухолевого роста у больных НХЗЛ.

6. Установлена взаимосвязь между повышением уровня цитокинов и гиперэкспрессией на опухолевых клетках основных молекулярных маркеров опухолевой прогрессии: регуляторных белков клеточного цикла (мутантного р-53 и Ьс1-2), онкопротеина - с-тус, рецепторной молекулы С095, маркера пролиферативной активности - Кл-67, что коррелирует с агрессивностью течения заболевания и отсутствием эффекта от проводимой терапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Повышение уровня цитокинов в сыворотке крови больных лимфомами и взаимосвязь данных показателей с основными характеристиками болезни, позволяют использовать их в качестве диагностических и прогностических критериев при онкогематологических заболеваниях. Наличие корреляционных связей между высоким уровнем цитокинов в сыворотке крови больных НХЗЛ и ЛХ и резистентностью к проводимой терапии, а также выраженностью экспрессии молекулярных маркеров опухолевой профессии указывает на более агрессивное течение лимфом, возможную резистентность к полихимиотерапии и определяет развитие лекарственной устойчивости.

2. Для прогнозирования эффективности ПХТ, вероятности достижения ремиссии, риска развития рецидива, формирования лекарственной устойчивости у больных лимфомами целесообразно исследовать в сыворотке крови уровень провоспалительных цитокинов (1Ь-1р, ЮТа), цитокинов ТЪ-2 типа (1Ь-4 и 1Ь-6), цитокина ТЬ-1 типа (1Ь-2 и №N7), а также рецепторов к ним на поверхности клеток костного мозга, что позволит патогенетически обоснованно выделить группу пациентов с высокой вероятностью развития рецидива заболевания и планировать у них более агрессивную программу терапии.