Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Полиморфизм и особенности экспрессии генов врожденного и адаптивного иммунитета у пациентов с тяжелой термической травмой

На правах рукописи

КУЗЬМИНОВА Елена Петровна

ПОЛИМОРФИЗМ И ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ВРОЖДЕННОГО И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА У ПАЦИЕНТОВ С ТЯЖЕЛОЙ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМОЙ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 Я АПР 2013 005051890

Челябинск - 2013

005051890

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинский государственный университет» и областном государственном унитарном предприятии "Челябинская областная станция переливания крови"

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Бурмистрова Александра Леонидовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор, ГБОУ ВПО Цейликман Вадим Эдуардович

"Челябинская государственная медицинская академия", заведующий

кафедрой биологической химии

доктор медицинских наук, Гусев Евгений Юрьевич

доцент, Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук, г. Екатеринбург, заведующий лабораторией иммунологии воспаления

Ведущая организация: Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук (ИЭГМ УрО РАН) (г. Пермь)

Защита состоится "15" апреля 2013 г. в _часов на заседании

диссертационного совета Д 208.117.03 в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия" Минздрава России по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия" Минздрава России (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

Автореферат диссертации разослан "_"_2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Латюшина Л.С.

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

По данным ВОЗ, ожоги занимают третье, а в некоторых странах (Япония) - второе место по частоте возникновения среди прочих травм, уступая лишь транспортной травме. В последние годы распространенность ожогов в России стала нарастать и составила 294,2 случая на 10 тысяч населения [Афоничев К.А., 2010]. Высокий процент летальности при обширных термических поражениях является одной из главных проблем ожоговых реанимаций.

Считается, что наиболее частой причиной смерти обожженных являются септические осложнения ожоговой болезни, способные развиться в течение нескольких недель после травмы [Алексеев A.A., 2001; Козлов В.К., 2007; Абелевич А.И., 2011; Sheridan R.L., 2005; Barber R.C., 2007].

Важность проблемы сепсиса подчеркивает возникшее в 2002 году международное движение специалистов "Переживем сепсис", поставившее перед собой задачу снижения летальности на 25% в течение ближайших пяти лет [Савельев B.C., 2006]. Несмотря на всю серьезность этой проблемы [Руднов В.А., 2002; Руднов В.А., 2003], до сих пор не существует общепринятой классификации и четкого определения такого понятия как ожоговый сепсис. Данное положение вещей значительно усложняет диагностику и прогноз, а также подходы к профилактике и лечению септических состояний у ожоговых больных [Гординская H.A., 2008]. Более того, до сих пор не достаточно ясна картина иммунологических особенностей сепсиса, возникающего на фоне ожогов.

В 2001 году группой авторов Levy М.М., Fink М.Р., Marshall J.C. и др. была предложена классификационная схема развития сепсиса PIRO (Predisposing factors, Infection, Response, Organ disfunction): синдром системного воспалительного ответа (ССВО), сепсис, тяжелый сепсис, септический шок. В ее основе заложена характеристика определенных персональных свойств больного, а именно: конституционные особенности больного, особенности и локализация повреждающего фактора, системная реакция организма хозяина, выраженность сопутствующей органной дисфункции [Levy М.М., 2001; Levy М.М., 2004]. Экспертиза схемы PIRO позволяет заключить, что различные генетические составляющие индивидуума являются детерминирующими признаками риска развития осложнений и преждевременной смерти, связанной с сепсисом.

И действительно, современная концепция патогенеза инфекционных заболеваний основана на изучении генетических ассоциаций специфических кандидатных генов, вовлеченных в регуляцию иммунного ответа. Согласно этой концепции, генетические факторы человека играют главную роль в исходе инфекционных заболеваний [Holmes C.L., 2003; Цыган В.Н., 2010].

Таким образом, на сегодняшний день одной из задач исследований, при рассмотрении проблемы сепсиса, является поиск генов-кандидатов, определяющих генетическую предрасположенность/устойчивость к развитию сепсиса/осложненного сепсиса лиц с тяжелыми термическими травмами [Stuber F., 2005; Sutherland A.M., 2005; Sipahi Т., 2006]. Еще одним приоритетным направлением является индикация специфических маркеров, чётко отражающих степень тяжести заболевания и результативность лечения и позволяющих вовремя диагностировать и прогнозировать развитие ожогового сепсиса. Одним из достоверных показателей происходящих в организме изменений является экспрессия иммунокомпетентных генов. Регистрация изменений в экспрессии генов, продукты которых участвуют в иммунопатогенезе сепсиса, позволяет, в той или иной мере, своевременно оценить состояние больного и спрогнозировать дальнейшее развитие и исход заболевания [Tang В.М.Р., 2009]

Все вышесказанное определило направление исследований - анализ распределения полиморфных вариантов генов цитокинов и рецепторов врожденного иммунитета и оценка уровня их экспрессии у больных с ожоговым сепсисом. Цель исследования

Провести сравнительный анализ особенностей распределения аллелей/генотипов иммунокомпетентных генов и уровней их экспрессии у лиц, проживающих в Челябинской области: здоровых и пациентов с тяжелой термической травмой, для выделения генетических маркеров предрасположенности/устойчивости развития сепсиса, прогноза его течения и исхода, которые могут использоваться при дополнительном мониторировании течения ожоговой болезни. Задачи исследования

1. Выявить общие закономерности в распределении аллельных вариантов генов IL-10, TLR2 и TLR4 среди европеоидов Челябинской области и оценить уровни экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, СИТА, цитокинов IL-ip, TNFa, IFy, IL-6, IL-10 и рецепторов TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 у здоровых лиц различных популяционных групп, проживающих в Челябинской области, для создания групп контроля.

2. Определить особенности распределения генотипов и аллелей генов цитокинов IL-IRa, IL-ip, TNFa, IL-10 и рецепторов врожденного иммунного ответа TLR2, TLR4 у лиц русской популяции, проживающих в Челябинской области: здоровых и больных с тяжелыми ожогами.

3. Изучить частоты встречаемости аллелей и генотипов генов IL-IRa, IL-ip, TNFa, IL-10, TLR2 и TLR4 при различных клинических вариантах и исходах септического процесса у ожоговых больных.

4. Определить особенности экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, СИТА, цитокинов IL-ip, TNFa, IFy, IL-6, IL-10 и рецепторов TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 у ожоговых больных по сравнению со здоровыми лицами.

5. Изучить различия в экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, СИТА, цитокинов IL-ip, TNFa, IFy, IL-6, IL-10 и рецепторов TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 на различных клинических стадиях септического процесса с учетом исхода у ожоговых больных.

6. Оценить возможную связь особенностей экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, СИТА, цитокинов IL-ip, TNFa, IFy, IL-6, IL-10 и рецепторов TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 с наличием полиморфизмов генов IL-lRa, IL-lp, TNFa, IL-10, TLR2 и TLR4.

Научная новизна

Впервые установлены распределения частот аллельных вариантов и генотипов генов TLR2, TLR4, IL-10 у европеоидов Челябинской области.

Впервые получены данные об уровнях экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, СИТА, IL-ip, TNFa, IFy, IL-6, IL-10, TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 среди здоровых индивидов Челябинской области.

Определены полиморфные варианты генов цитокинов и TLR, отвечающих за предрасположенность/устойчивость пациентов с ожоговой травмой к развитию сепсиса и его осложнений.

Показаны особенности экспрессии генов основных цитокинов, рецепторов врожденного иммунитета и генов адаптивного иммунного ответа, отвечающих за презентацию антигена у пострадавших на различных стадиях ожоговой болезни, и представлены предиктовые иммуногенетические маркеры развития сепсиса с синдромом полиорганной недостаточности (ПОН) и его неблагоприятного исхода.

Впервые проведен поиск связи между особенностями экспрессии генов и их полиморфизмом у лиц, проживающих в Челябинской области. Теоретическая и практическая значимость

Данная работа носит фундаментальный характер. Нами установлены общие закономерности распределения частот полиморфных вариантов генов IL-10, TLR2, TLR4 у здоровых представителей русской популяции Челябинской области. Установлены общие закономерности экспрессии генов основных цитокинов IL-ip, TNFa, IFy, IL-6, IL-10 и рецепторов врожденного и адаптивного иммунитета HLA-DRA, -DMA, СИТА, TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 у здоровых представителей населения Челябинской области. Полученные данные могут быть использованы в качестве контроля при решении ряда задач по направлению «иммуногенетика» и «HLA и болезни», а именно: при изучении ассоциации иммуногенетического статуса с предрасположенностью/устойчивостью индивидов к различным заболеваниям,

оценки прогноза тяжести течения и их исхода, выбора адекватных методов медикаментозной терапии, мониторинга и разработки современных биотехнологических процессов, в плане создания препаратов группы предиктовой медицины и персонифицированной терапии.

Полученные результаты позволили установить у ожоговых больных наличие генов предрасположенности/устойчивости, определяющих течение ожоговой болезни - развитие сепсиса, осложненного сепсиса и его исход. Следовательно, изучение иммуногенетического статуса индивидов дает возможность своевременно определить риск развития осложнений и индивидуальную тактику лечения при возникновении критических состояний, вот числе таких, как тяжелая ожоговая травма. Положения, выносимые на защиту

1. Предрасположенность и устойчивость к развитию сепсиса у больных с тяжелой термической травмой может определяться особенностями иммуногенетического статуса пострадавших: повышенная частота встречаемости генотипов 2г/2г и 4г/5г гена IL-IRa, аллеля 753*А и генотипа G/A гена TLR2 у ожоговых больных по сравнению с донорами может свидетельствовать о предрасположенности лиц с наличием данных генотипов к развитию сепсиса при ожоговой болезни, а наличие генотипа 2г/4г гена IL-IRa, аллеля 753 *G и генотипа G/G гена TLR2 может обеспечить протекторный эффект. Более того, развитие сепсиса с синдромом полиорганной недостаточности четко ассоциировано с гетерозиготностью гена IL-10 в точке -819 и наличием гаплотипа GTA гена IL-10 -1082/-819/-592.

2. У пациентов с тяжелой термической травмой по сравнению со здоровыми индивидами наблюдаются одновременные изменения в экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов: снижение уровней экспрессии IL-6, IFy, повышение экспрессии IL-ip, TNFa, IL-10, и повышение экспрессии генов рецепторов врожденного иммунитета TLR2, TLR4 на фоне снижения экспрессии генов адаптивного иммунитета HLA-DRA, - DMA, CIITA и TREM-1. Установленные закономерности позволяют прогнозировать развитие сепсиса, сепсиса с синдромом полиорганной недостаточности и его исход на ранних сроках течения ожоговой болезни. Внедрение результатов исследования

Результаты исследовательской работы внедрены в учебный процесс: включены в список обязательной литературы для студентов и в лекционный курс дисциплины "Иммунный гомеостаз в норме и патологии" магистерской программы "Медико-биологические науки" на кафедре микробиологии биологического факультета ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет».

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены и обсуждались в виде научных докладов на конференциях: конференция зональной лаборатории иммунологического типирования тканей «Фундаментальное и прикладное значение оценки генов иммунного ответа» (г. Челябинск, 2008), XIII Всероссийский форум с международным участием им. Академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 2009), «VIII конференция Иммунологов Урала» (г. Сыктывкар, 2010), научно-практическая конференция «Инфекции кровяного русла» (г. Челябинск, 2011), «IX конференция Иммунологов Урала» (г. Челябинск, 2011), VI международная западно-восточная конференция по иммуногенетике EWIC (Чехия, 2012). Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 19 рисунками. Список литературы содержит 153 источника, в том числе 38 работ отечественных и 115 зарубежных авторов. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Содержание работы

Материалы и методы

Работа проводилась на базе научно-учебного центра молекулярной иммуногенетики Уральского отделения Российской академии наук / федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Челябинский государственный университет" / областного государственного унитарного предприятия "Челябинская областная станция переливания крови" (УРО РАН / ФГБОУ ВПО "ЧелГУ" / ОГУП "ЧОСПК").

Работа строилась в несколько этапов. Первый этап включал определение полиморфных вариантов генов, продукты которых принимают участие в иммунопатогенезе септических состояний, методами молекулярного типирования. На втором этапе проводилась оценка экспрессии генов (определение количества мРНК), принимающих участие в иммунопатогенезе септических состояний, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Обследуемые лица

Группа исследования. Исследуемую группу составили пациенты реанимации

ожогового центра ГКБ №6 г.Челябинска. В ходе работы было сформировано две группы пациентов. В первую группу были включены 50 пациентов русской национальности для оценки распределения полиморфизмов генов (всем пациентам данной группы на 20-30 сутки после ожога был поставлен диагноз "сепсис" на фоне длительно существующих инфицированных ожоговых ран). Вторую группу составили 58 пациентов (не зависимо от национальной принадлежности) для оценки уровня экспрессии генов (на 20-30 сутки после травмы 53 пациентам был поставлен диагноз "сепсис", у 5 больных развился только синдром системного воспалительного ответа (ССВО)). Больные имели глубокие комбинированные ожоги П-ША, Б и IV степени тяжести с площадью поражения от 12% до 50% общей поверхности тела. Диагноз ССВО, сепсис, тяжелый сепсис с полиорганной недостаточностью (ПОН) ставился на основании положений Чикагской согласительной конференции (1992) и согласительной конференции Американской ожоговой ассоциации (2007). Группа контроля. В качестве контрольных групп использовали популяционные выборки, сформированные случайным образом на основе регистра потенциальных доноров стволовой клетки ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови».

Оценка полиморфизма генов: 213 представителей русской популяционной группы, проживающих в г. Челябинске и Челябинской области, данные представлены в таблице 1. Популяционная принадлежность определялась по данным генеалогического анамнеза до третьего поколения (согласно рекомендациям 8-го Международного Симпозиума в 1980 г., Лос-Анджелес, США).

Таблица 1

Общее количество Полиморфизм Экспрессия

Гру КОНТ1 ппа золя Ожоговые больные Гру КОНТ1 ппа золя Ожоговые больные

213 % 50 % 70 % 58* %

Мужчин 119 55,9 35 70 45 64,3 44 75,9

Женщин 94 44,1 15 30 25 35,7 14 24,1

Средний возраст, лет 34,6±0,75 39±1,7 30,3+1,21 36,9±1,36

* у 20 пациентов образцы крови забирались дважды в динамике ожоговой болезни (от 58 пациентов -78 образцов).

Оценка экспрессии генов: 70 представителей различных популяционных групп (русской, башкирской и татарской), проживающих в Челябинской области, являющихся кадровыми донорами крови ОГУП "ЧОСПК".

Молекулярно-генетические исследования проводились в 2007-2012 гг. на базе ЗЛИТТ ОГУП «ЧОСГЖ». В качестве материала для исследования использовалась венозная кровь, взятая в утренние часы в пробирки с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА).

Методы исследования

Всю экспериментальную часть работы можно представить в виде схемы:

СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА определение полиморфизма оценка экспрессии

выделение ДНК выделение РНК

1 I

постановка ПЦР, амплификация постановка ОТ с получением кДНК

(рестрикция) I

I 1

детекция результатов-электрофорез постановка Реал-тайм ПЦР

1

полиморфные варианты гена относительная экспрессия гена

I

статистика ^

частота встречаемости в %, х2 с медиана (25-75%), критерий Манна-

поправкой Йейтса, Фишера, критерий СЖ Уитни, Критерий Краскела -Уолиса

Определение полиморфизма генов цитокннов

В разделе работы, посвященном определению полиморфизма генов, исследовали 10 полиморфных вариантов 6 генов цитокинов и рецепторов (Таблица 2). Выделение ДНК проводили с использованием реагентов Аху£еп (<31а£еп, Германия) согласно инструкции производителя. Генотипирование осуществляли путем ПДРФ-анализа и аллель-специфической ПЦР, метод детекции результатов - электрофорез в 1,5% и 3% агарозном геле и 8% ПААГе.

Оценка экспрессии генов

Выделение клеток и РНК, постановка реакции обратной транскрипции (ОТ). Эксперимент по оценке экспрессии генов имел следующие особенности. В качестве материала для исследования использовалась венозная кровь, взятая в утренние часы в пробирки с ЭДТА. Все дальнейшие процедуры проводились в течение 2-3 часов после забора крови.

Выделение фракции мононуклеаров из периферической крови здоровых доноров и ожоговых больных проводили с помощью градиента плотности

Lympholyte-H (p = 1,077) (Cedarlane, Канада) по стандартному протоколу производителя. Полученные образцы клеток помещали в лизирующий раствор TRI-реагент (MRC, США). РНК выделяли из клеток, помещенных в TRI-реагент, с использованием хлороформа (Вектон, Россия) и изопропилового спирта (Sigma, США) согласно стандартной процедуре, описанной в инструкциях производителя.

Далее с выделенными образцами РНК ставили реакцию обратной транскрипции с использованием random-праймера («Синтол», Россия), трифосфатов («Синтол», Россия), обратной транскриптазы и ингибитора РНКаз, при 37°С. Следующим этапом была постановка собственно амплификации (ПЦР в режиме "реального времени").

Таблица 2

Характеристика полиморфных сайтов исследуемых генов_

ген SNP Характеристика, рестриктазы, аллели, размеры после рестрикции

IL-lß +3953 C/T Экзон 5: рестрикционный сайт, эндонуклеаза рестрикции Taq I (65°С), Редкий Т: 550 п.н., частый С: 404, 146 п.н.

TNFa -238 G/A Промоторная часть: BamH I (37°С) Редкий А: 128 п.н., частый G: 109; 19 п.н.

-308 G/A Neo I (37°С) Редкий А: 126 п.н., частый G: 104; 22 п.н.

TLR4 Asp299Gly Neo I (37°С) Редкий G: 168; 20 п.н., частый А: 188 п.н.

Thr399Ile Hinf I (37°С) Редкий Т: 98; 26 п.н., частый С: 124 п.н.

TLR2 Arg753Gln Msp I (37°С) Редкий А: 104; 25 п.н., частый G: 129 п.н.

IL-lRa VNTR Variable Number of Tandem Repeats - Вариабельное число тандемных повторов с участком 86 п.н. Интрон 2: аллели с 2-х, 3-х, 4-мя и 5-ти кратными повторами (2г, Зг, 4г, 5г)

IL-10 Промоторная часть: Наборы для аллель-специфической ПЦР ("Литех")

-1082 G/A Редкий А, частый G

-819 C/T Редкий Т, частый С

-592 G/A Редкий А, частый G

Постановка ПЦР в режиме "реального времени". Спектр исследованных генов: человеческий лейкоцитарный антиген локуса DR (HLA-DRA), человеческий лейкоцитарный антиген локуса DM (HLA-DMA), трансактиватор 2 класса (Class II transactivator, CUTA), интерлейкин-lß (IL-lß), фактор некроза опухоли a (TNFa), интерферон у (IFy), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-10 (IL-10), толл-подобный рецептор 2 (Toll-like receptor, TLR2), толл-подобный рецептор 4 (TLR4), триггерный рецептор на миелоидных клетках-1 (TREM-1), триггерный рецептор на миелоидных клетках-2 (TREM-2). В качестве контрольного гена для расчета нормировочных значений был использован ген тирозинкиназы ABL.

В основе ПЦР "в режиме реального времени" - реакция амплификации, которую проводили на приборе АНК-32 («Синтол», Россия). Для определения уровня экспрессии генов HLA-DRA, -DMA и СИТА использовали реакционную смесь с интеркалирующим красителем Eva Green («Синтол», Россия). Для оценки экспрессии генов цитокинов и TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 использовали готовую реакционную смесь производства ЗАО «Синтол». Определение накопления продукта ПЦР проводилось с использованием линейных разрушаемых проб («Синтол», Россия).

Обработка результатов ПЦР. Данные нашего исследования Real-time PCR мы обрабатывали по принципу прямого сравнения данных. При этом применялось следующее уравнение:

R =Е(С(Т)Гст2>~2'ст,тде

R - относительная концентрация продукта реакции;

Е — эффективность амплификации гена;

C(T)i - значение индикаторного цикла ПЦР, на котором наблюдается флуоресценция реакционной смеси контрольного гена (ABL);

С(Т)2 - значение индикаторного цикла ПЦР, на котором наблюдается флуоресценция реакционной смеси исследуемого гена.

Статистическую обработку результатов исследований проводили на персональном компьютере с применением пакета прикладных программ «Statistica 8.0 for Windows», в котором использовали модули: «непараметрические критерии» (критерий Пирсона, критерий Пирсона с поправкой Иейтса/Y ates corrected, точный двусторонний критерий Фишера/Fisher exact, критерий Манна-Уитни/Мапп-Whitney, Краскела-Уоллиса/Kruskal-Wallis), «вероятностный калькулятор» (для расчета значения t - коэффициента Стьюдента) и программы Ms Excel пакета Ms Office для

расчета критериев отношения шансов, медианы, среднего значения и стандартной ошибки среднего (М±т) [Гланц С., 1999].

Результаты исследования и их обсуждение

Исследование имело следующие направления и состояло из 3 основных частей:

I. Оценка полиморфизма генов цитокинов и рецепторов иммунного ответа;

II. Оценка экспрессии генов цитокинов и рецепторов иммунного ответа;

III. Оценка связи между полиморфизмом генов и их экспрессией.

Оценка полиморфизма генов цитокинов и рецепторов иммунного ответа В первой части исследования наше внимание было обращено на изучение распределения полиморфных вариантов иммунокомпетентных генов, продукты которых играют важную роль при септическом процессе. Проведен анализ вклада генов рецепторов ТЫ12, ТОМ и цитокинов 1Ь-1Ыа, 1Ь-1р, 1Ь-10, ЮТ а в предрасположенность, развитие и исход сепсиса у ожоговых больных. Анализ распределения аллелей, генотипов и гаплотипов генов 1Ь-Ша, 1Ь-1р, 1Ь-10, ГЛТ-а, ТЫ12 и ТЫ14у здоровых европеоидов Челябинской области с целью создания групп контроля

Наблюдаемые в исследовании частоты генотипов исследуемых генов в выборке европеоидов Челябинской области соответствуют ожидаемым согласно закону Харди-Вайнберга, популяция находится в состоянии равновесия. Поскольку анализ распределения полиморфных вариантов генов ТЫ12, ТЬЯ4 и 1Ь-10 среди здоровых лиц европеоидной популяции Челябинской области проводился впервые, мы сравнили полученные в нашем исследовании результаты по оценке полиморфизма с данными основных мировых популяций. Данные по распределению полиморфизма, полученные нами среди европеоидов Челябинской области укладываются в рамки других исследований, проведенных в популяциях Европы и Северной Америки и соотносимы с результатами, полученными в популяции европеоидов Западной Сибири [Шевченко А.В., 2010].

Анализ распределения аллелей, генотипов и гаплотипов генов 1Ь-Ша, 1Ь-1р, 1Ь-10, ПУГа, ТЫН и ТЬК4у ожоговых больных по сравнению с выборкой практически здоровых доноров

В группе ожоговых больных обнаружены достоверные различия в частотах встречаемости генотипов и аллелей генов ГЬ-Ша (ЛП^ТЫ) и ТЫ12*7530/А по сравнению со здоровыми (Рис.1, 2 - все ожоговые больные, у которых в последствие развился сепсис обозначены в таблицах и рисунках как группа "сепсис", хотя на момент исследования диагноз сепсис еще не был поставлен и все исследования являлись предиктовыми).

Для группы ожоговых больных с последующим развитием сепсиса по сравнению со здоровым контролем характерны следующие особенности: 1. ген 1Ь-Ша - в группе больных повышена частота встречаемости генотипа

2г/2г (20% против 7%, критерий у2 с поправкой Йейтса=6,47 />=0,011, (Ж=3,3 95%ДИ=1,38-7,84) и редкого генотипа 4г/5г (8% против 1,9%, критерий Фишера />=0,045, (Ж=4,54 95% ДИ= 1,09-18,75), а так же понижена частота встречаемости генотипа 4г/2г (18% против 39,4%, у2 с поправкой Йейтса=7,23 />=0,007, СЖ=0,33 95%ДИ=0,15-0,7) по сравнению с группой контроля. Таким образом, у больных с тяжелыми термическими травмами генотипы 2г/2г и 4г/5г могут выступать в качестве маркеров предрасположенности к развитию сепсиса, а генотип 4г/2г гена 1Ь-1Ыа - в качестве возможного маркера устойчивости.

р= 0,007

54.0

Ё1

СШКонтроль ^Сепсис

р-0,045

I I Коифудь Г~~1 сепсис

rfi

ш

р-0.013

2г/4г 4г/4г

Генотипы IL-IRa

№А

Генотипы ILR2*G755A

Рис.1. Частоты генотипов гена 1Ь-1Ка в группе ожоговых больных и здоровых доноров

Рис.2. Частоты генотипов гена ТЬК2*753 в группе ожоговых больных и здоровых доноров

2. ген TLR2*G753A - при сравнении двух исследуемых выборок оказалось, что для больных с глубокими комбинированными ожогами характерна высокая встречаемость аллеля с заменой *753А (10% против 3%, критерий Фишера />=0,015, OR=û,26 95%ДИ=0,08-Ю,81) по сравнению с контролем. Результаты свидетельствуют, что наличие аллеля *753А в генотипе пострадавшего может являться маркером предрасположенности развития сепсиса. Более того, в группе ожоговых больных повышена частота встречаемости гетерозигот G/A (16% против 3,5%, точный двухсторонний критерий Фишера /7=0,013) по сравнению с группой контроля. Критерий отношения шансов (OR=5,26 95%ДИ=1,32-20,81) показывает статистически значимое влияние данного генотипа на предрасположенность к развитию сепсиса у ожоговых больных. Для гомозиготного генотипа G/G выявлена пониженная частота встречаемости в группе ожоговых больных (82% против 95,3%, у2 = 6,52,/>=0,011, OR=0,22 95%ДИ=0,06-Ю,76) по сравнению с контролем.

Частоты полиморфных вариантов генов 1Ь-1р +3953С/Т; 1Ь-10 -Ю820/А, -819С/Т, -592С/А; TNFa -238С/А, -3080/А; ТЫ14*299А/0, *399С/Т в группе больных не имели статистически достоверных различий с группой доноров. Анализ распределения аллелей, генотипов и гаплотипов генов 1Ь-Ша, 1Ь-1р, 1Ь-10, ТМРа, ТЬЛ2 и ТЬЯ4 у ожоговых больных с различным клиническим течением и исходом

Поскольку у всех ожоговых больных на протяжении 30-40 дней проводился мониторинг течения ожоговой болезни (развитие сепсиса, сепсиса с синдромом ПОН) и ее исхода (благоприятный, летальный), то в зависимости от этого пациенты были поделены на группы:

Группа I - ожоговые больные, сепсис без ПОН, выздоровевшие (34 пациента); Группа II - ожоговые больные, сепсис, осложненный синдромом ПОН (16 пациентов): - Па - выздоровевшие (8 пациентов),

- Пб - летальный исход (8 пациентов). Среди всех сравнений (между ожоговыми больными с различным течением сепсиса и пациентами с различным исходом) статистическую значимость и наибольший интерес представляют отличия между пациентами с различной тяжестью течения ожогового сепсиса (группа I по сравнению с группой II). Достоверной разницы в частотах встречаемости аллелей, генотипов и гаплотипов исследуемых генов между пациентами с благоприятным и летальным исходом (сравнение групп Па и Пб) не было обнаружено. При сравнении частот встречаемости полиморфных вариантов изучаемых генов среди пациентов с разным течением ожогового сепсиса были установлены различия, касающиеся гена 1Ь-10. Статистическая значимость наблюдалась в распределении генотипов в точке 0-819А и гаплотипов гена 1Ь-10 -1082/-819/-592.

В группе ожоговых больных, у которых течение ожоговой болезни осложнилось развитием сепсиса с ПОН, была обнаружена повышенная частота гетерозиготного генотипа С/Т (50% против 20%, х2=4,48, /5=0,034, 011=0,25 95%ДИ=0,07-Ю,93). Полученные результаты позволяют предположить, что гетерозиготность гена 1Ь-10 в точке С-819Т может являться маркером развития сепсиса с синдромом ПОН у ожоговых больных (Рис.3). Кроме того, в группе пациентов с последующим развитием сепсиса с ПОН наблюдается повышенная частота гаплотипа СТА гена 1Ь-10 (22% против 6%, ^2=5,68, р=0,017, точный двусторонний критерий Фишера р=0,023, 011=4,48 95%ДИ=1,2-И6,57) по сравнению с пациентами, у которых развился сепсис не осложненный ПОН. Гаплотип СТА - возможный гаплотип предрасположенности к развитию сепсиса с синдромом ПОН у ожоговых больных (Рис.4).

Полиморфные варианты (аллели, генотипы и гаплотипы) остальных исследуемых генов 1Ь-1(3 +3953С/Т; 1Ь-1Яа (УЫТЯ); Т№а -2ЪША, -308С/А;

ТЬЯ4*299А/0, *399С/Т и ТЬЯ2*753С/А не показали статистической значимости при сравнении больных с различным течением ожогового сепсиса (группы I и II).

100

90

80

I 70

й 60

50

л

40

| 30

20

10

<1

1 ICCISCHC- вьшоровсл 11 Y<y Iсспс)(с-тпксямйсет

/г-О.О.И

ш

Геиопшы 11.-10 С-819Т

Рис.3. Распределение генотипов гена 1Ь-10 С-819А у ожоговых больных с различным течением сепсиса

пВД'ГП

Ш

GCC

СТА

АТА

1 »плотины 11,-1« -1U82/-819A5S2

Рис.4. Частоты гаплотипов IL-10 -1082/-819/-592 у ожоговых больных с различным течением заболевания

Следующим этапом работы была количественная оценка мРНК генов цитокинов и рецепторов.

Оценка экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, СИТА, IL-ip, TNFa, IFy, IL-6,

IL-10, TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 Оценка количества мРНК исследуемых генов в группе здоровых доноров и выборке ожоговых больных

На начальном этапе проводилась оценка уровней экспрессии генов у здоровых лиц различных популяционных групп (русские, татары, башкиры), проживающих в Челябинской области для создания группы контроля. При сравнении группы контроля с группой ожоговых больных были установлены следующие особенности экспрессии исследуемых генов (Таблица 3). Значения в виде медианы и 25-75% квартилей.

В группе ожоговых больных по сравнению с контролем (разница статистически достоверна):

1. Повышена экспрессия генов IL-1J3, IL-10, TLR2 и TLR4;

2. Снижена экспрессия генов HLA-DRA, -DMA, СИТА, IL-6, IFy, TREM-1. Такие особенности экспрессии генов в группе ожоговых больных отражают общие положения концепции "геномного шторма" [Xiao W., 2011], при котором наблюдаются одновременные изменения в экспрессии генов врожденного и адаптивного иммунитета, про- и противовоспалительных цитокинов.

Таблица 3

Экспрессия генов HLA-DRA, -DMA, СИТА, IL-ip, TNFa, IFy, IL-6, IL-10, TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 среди всех ожоговых больных при сравнении с группой контроля

Экспрессия гена, о.е.* Ожоговый сепсис, n=78 Контроль, n=70 P (через U-критерий Манна- Уитни)

DRA 47,09 (32,33-70,27) 118,6 (92,73-145,51) «0,001

DMA 6,12 (3,9-8,08) 11,85 (9,91-16,5) «0,001

СИТА 2,16 (2,16-1,15) 5,09 (3,9-6,4) «0,001

IL-ip 22,29 (10,05-39,12) 13,31 (7,83-26,35) 0,020

IL-6 0,72 (0,3-0,98) 0,89 (0,47-1,83) 0,031

TNFa 3,78 (2,32-6,45) 3,62 (2,93-5,06) 0,544

IFy 0,11 (0,04-0,22) 0,25 (0,17-0,49) «0,001

IL-10 19,08 (10,04-32,08) 3,17 (2,01-6,01) «0,001

TLR2 39,88 (21,78-77,17) 26,67 (18-41,21) 0,006

TLR4 22,35 (10,66-43,71) 13,41 (9,12-20,82) 0,002

TREM-1 39,81 (17,02-79,61) 71,01 (40,64-105,78) 0,001

TREM-2 0,12 (0,06-0,4) 0,18 (0,11-0,32) 0,198

*о.е. - относительные единицы, показывающие относительную экспрессию гена, вычисленную по формуле 2 А с(т>

Оценка экспрессии исследуемых генов в зависимости от клинического течения и исхода ожоговой болезни пострадавших

Все больные условно были отнесены к двум группам, в зависимости от сроков иммуногенетического обследования:

I группа - 3-6 сутки ожога, период после ожогового шока (35 пациентов),

II группа -10-17 сутки ожога, период септикотоксемии (43 пациента).

При обследовании больных в разные периоды ожоговой болезни были выявлены достоверные различия в экспрессии генов ТЪ112 и ТЬЯ4. На 3-6 сутки после травмы ожоговые пациенты имели более высокие уровни экспрессии генов ТТЛ12 (р=0,046) и ТЫ14 (р=0,032) по сравнению с данными, полученными

на 10-17 сутки. Скорее всего, это связано с тем, что в первые дни после ожога происходит активация врожденного иммунитета, в частности рецепторов, распознающих PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns) и DAMPs (Damage Associated Molecular Patterns). Появление в результате ожога в организме эндогенных молекул повреждения тканей и присутствие и/или проникновение из окружающей среды инфекционного агента приводят к усилению экспрессии генов врожденного иммунитета.

Поскольку у всех пострадавших прослеживались дальнейшее течение ожоговой

болезни и исход, то для поиска ранних маркеров прогноза (сепсис, сепсис с синдромом ПОН) и исхода (выжили, летальный исход) заболевания было целесообразно всех больных (78 образцов) по дням исследования распределить по подгруппам:

3-6 сутки ожога: 1. ССВО-выжили (п=5)

2. сепсис - выжили (п=23)

3. сепсис с ПОН - выжили (п=3)

4. сепсис с ПОН - летальный (п=4) 10-17 сутки ожога: 5. сепсис - выжили (п=28)

6. сепсис с ПОН - выжили (п=8)

7. сепсис с ПОН - летальный (п=7)

На 3-6 сутки после ожога, наиболее выраженные изменения в экспрессии генов отмечены у больных с летальным исходом (подгруппа 4). IL-lß показал самую низкую экспрессию гена в группе больных с сепсисом, сопровождающимся синдромом ПОН и летальным исходом (подгруппа 4), по сравнению со всеми остальными пациентами (подгруппы 1, 2 и 3 - р=0,004; р=0,007; р=0,003 соответственно и подгруппы 5, 6 и 7 - р=0,042; р=0,04; р=0,076). Больные с ПОН и летальным исходом (подгруппа 4) имели повышенные уровни TLR2 (по сравнению с подгруппой 2,тенденция к различиям р=0,053). У выздоровевших после ССВО больных (подгруппа 1) отмечены сниженные уровни TREM-2 по сравнению с теми у кого в дальнейшем развился сепсис (по сравнению с группой 2 р=0,003).

Экспрессия генов HLA-DRA, -DMA, СИТА, TNFa, IL-6, IFy не имела статистически значимых различий среди больных разных групп на 3-6 сутки ожога.

На 10-17 сутки после ожога для пациентов характерны следующие особенности экспрессии генов. Пациенты с летальным исходом (подгруппа 7) по сравнению с выжившими имели:

- пониженную экспрессию генов HLA-DRA (р=0,032), HLA-DMA (р=0,003), IFy (по сравнению с подгруппами 5 и 6 - />=0,011; ¿>=0,0002 соответственно),

- повышенную экспрессию генов TNFa (по сравнению с подгруппами 5 и 6 -

р=0,011; р=0,034 соответственно), TLR2 (по сравнению с подгруппой 5 р=0,001), TLR4 (по сравнению с подгруппой 5 р=0,002), TREM-2 (по сравнению с подгруппой 6р=0,03).

Экспрессия генов IL-6, IL-ip и IL-10 не показала статистически значимых различий среди больных на 10-17 сутки с разной тяжестью и исходом.

Таким образом, установлены особенности экспрессии генов у больных с летальным исходом сепсиса в ранние сроки ожоговой болезни (25-40 сутки): 1) на 3-6 день ожоговой травмы - чрезвычайно низкая экспрессия гена IL-ip по сравнению с остальными пациентами (подгруппы 1-3, 5-7) и повышенная экспрессия гена TLR2 по сравнению с выжившими; 2) на 10-17 сутки после травмы достоверно снижены уровни экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, IFy и повышены уровни экспрессии генов TNFa, TLR2, TLR4 и TREM-2 по сравнению с выжившими.

Связь полиморфизма с экспрессией исследуемых генов

Поскольку в группе ожоговых больных достоверные различия с группой контроля имели полиморфизмы генов IL-10, IL-IRa и TLR2, то следующим этапом исследования было определение влияния данных полиморфизмов на уровни транскрипции этих генов. В результате среди всех изученных ассоциаций, нами не было установлено достоверных различий в экспрессии данных генов в зависимости от их полиморфизма.

Таким образом, данное исследование имеет два основных направления и посвящено, во-первых, анализу вклада аллельных вариантов и генотипов генов TLR2, TLR4, IL-IRa, IL-ip, IL-10, TNFa в предрасположенность пациентов с тяжелыми ожогами к развитию сепсиса, тяжести его течения - сепсис с синдромом ПОН, его исходу; и, во-вторых, особенностям экспрессии генов адаптивного и врожденного иммунного ответа, как основному признаку, отражающему клиническое состояние ожоговых больных на определенный момент времени, и по которому можно прогнозировать исход заболевания.

В результате проведенного исследования, нами установлена ассоциация аллельных вариантов и генотипов IL-IRa, TLR2, IL-10 ожоговых больных с предрасположенностью к развитию сепсиса и его осложненному течению. Кроме того, показано, что изменения в экспрессии генов-участников иммунного ответа у ожоговых больных имеют разнонаправленный характер, затрагивают про- и противовоспалительные цитокины, врожденный и адаптивный иммунитет и отражают общие положения концепции "геномного шторма"[Xiao W. et al., 2011].

Поскольку предрасположенность и устойчивость к развитию сепсиса у больных с тяжелыми ожогами определяются особенностями иммуногенетического статуса пострадавших - а именно полиморфизмом генов

IL-lRa, TLR2, то эти данные могут быть использованы при создании генетического паспорта человека. Это, в свою очередь, позволит при возникновении критических состояний, например, таких как обширные ожоги, сразу стратифицировать пострадавших по риску развития осложнений (сепсис, сепсис с синдромом ПОН) и своевременно определить индивидуальную тактику лечения с учетом наличия в его генотипе определенных вариантов иммунокомпетентных генов.

Изменения в экспрессии генов, характерные для ожоговых больных в ранние периоды ожоговой болезни, могут служить дополнительными предиктовыми маркерами прогноза (развитие сепсиса, сепсиса с синдромом ПОН) и исхода заболевания (благоприятный, летальный исход).

Выводы

1. Выявлены общие закономерности в частотах встречаемости генов ILIO, TLR2, TLR4 у здоровых представителей русской популяции Челябинской области, которые укладывается в рамки европейских популяций. Установлены общие особенности экспрессии генов основных цитокинов IL-lß, TNFa, IFy, IL-6, IL-10 и рецепторов врожденного и адаптивного иммунитета HLA-DRA, -DMA, СИТА, TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 среди здоровых людей, проживающих в Челябинской области.

2. В группе ожоговых больных важными факторами, определяющими предрасположенность/устойчивость пострадавших к развитию сепсиса, являются полиморфные варианты генов IL-lRa и TLR2. Маркеры предрасположенности: генотипы 2г/2г и 4г/5г гена IL-lRa; аллель *753А и генотип G/A гена TLR2. Протекторный эффект на развитие сепсиса оказывают: генотип 2г/4г гена IL-lRa, аллель *753G и генотип G/G гена TLR2.

3. Осложненное течение сепсиса у ожоговых больных ассоциировано с наличием гетерозиготности гена IL-10 в точке -819 и гаплотипа GTA гена IL-10 -1082/-819/-592, что может выступать в качестве маркеров предрасположенности к развитию сепсиса с синдромом полиорганной недостаточности.

4. На ранних сроках развития ожоговой болезни (с 3 по 17 сутки после травмы) происходят изменения в экспрессии генов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов: снижение экспрессии генов цитокинов IL-6, IFy и одновременное повышение экспрессии генов цитокинов IL-lß, TNFa, IL-10. Кроме того, у больных с тяжелыми термическими травмами повышена экспрессия генов рецепторов врожденного иммунитета TLR2, TLR4 и одновременно снижена экспрессия генов адаптивного иммунитета HLA-DRA, -DMA, СИТА и TREM-1 по сравнению со здоровыми индивидами.

5. Предиктовыми показателями развития сепсиса с синдромом

полиорганной недостаточности и неблагоприятного исхода у ожоговых больных на 10-17 сутки можно считать пониженную экспрессию генов HLA-DRA, -DMA, IFy и повышенную экспрессию генов TNFa, TLR2, TLR4 и TREM-2.

6. Полиморфизм генов IL-IRa, TLR2, IL-10 не оказывает влияния на уровни их экспрессии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Филиппова, Ю.Ю. Ассоциация синдрома системной воспалительной реакции (SIRS) с полиморфизмами гена HLA-DRB1 / Ю.Ю. Филиппова, Е.И. Лупарь, Е.П. Конева, М.И. Угнивенко, O.A. Струнина, С.С. Шестопалов, A.JI. Бурмистрова // Вестн. Челябинского гос. ун-та. - 2008. -№4.-С. 27-28.

2. Бурмистрова, A.JI. Распределение аллелей и генотипов гена IL-1RA у ожоговых больных с синдромом системного воспалительного ответа / A.JI. Бурмистрова, Е.П. Конева, Ю.Ю. Филиппова, Т.А. Суслова, Д.С. Сташкевич // Мед. иммунология. — 2009. — Т.11, №4-5. — С. 456.

3. Бурмистрова, АЛ. Уровень экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, СИТА у ожоговых больных с синдромом системного воспалительного ответа (SIRS) / A.JI. Бурмистрова, Е.П. Конева, Ю.Ю. Филиппова, М.И. Угнивенко, Т.А. Суслова // Аллергология и иммунология. — 2009. — Т. 10, №2. — С.231. — VII съезд аллергологов и иммунологов СНГ, II всемирный форум по астме и респираторной аллергии.

4. Угнивенко, М.И. Уровни цитокинов в среде культивирования нейтрофилов ожоговых больных в зависимости от стадии развития сепсиса / М.И. Угнивенко, Ю.Ю. Филиппова, Е.П. Конева, Н.Е. Самышкина, Т.А. Суслова, С.С. Шестопалов, A.JI. Бурмистрова // Мед. иммунология. - 2009. - Т.11, №4-5. - С.463.

5. Филиппова, Ю.Ю. Провоспалительные/противовоспалительные цитокины в сыворотке крови ожоговых больных в различные стадии развития сепсиса / Ю.Ю. Филиппова, A.JI. Бурмистрова, М.И. Угнивенко, Е.П. Конева, Н.Е. Самышкина, Т.А. Суслова, С.С. Шестопалов // Мед. иммунология. - 2009. - Т.11, №4-5. - С. 464.

6. Бурмистрова, A.JI. Диагностическая значимость определения растворимого триггерного рецептора, экспрессируемого на миелоидных клетках-1, как маркера сепсиса у ожоговых больных / A.JI. Бурмистрова, Ю.Ю. Филиппова, М.И. Угнивенко, Е.П. Конева, Н.Е. Самышкина, И.А. Кочергина, И.А. Скорик // Рос. аллергологический журн. — 2010. — №5, Вып. 1. — С. 59-60. — Тр. межрегионального форума «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии — междисциплинарные проблемы».

7. Бурмистрова, АЛ. Содержание некоторых цитокинов в сыворотке крови ожоговых больных с сепсисом, вызванным грам-позитивной и грам-негативной флорой / A.JI. Бурмистрова, Ю.Ю. Филиппова, М.И. Угнивенко, Е.П. Конева, Н.Е. Самышкина, И.А. Кочергина, Л.И. Бахарева, C.B. Андреева, И.А. Скорик // Вестн. уральской мед. академической науки. - 2010. - №2/1. - С.103-104.

8. Конева, Е.П. Распределение полиморфизмов генов цитокинов ИЛ-1 и ИЛ-1 РА среди ожоговых больных с сепсисом / Е.П. Конева, Ю.Ю. Филиппова, М.И. Угнивенко, Д.С. Сташкевич // Вестн. уральской мед. академической науки. - 2010. -№2/1. -С. 151-152.

9. Конева, Е.П. Экспрессия генов HLA в норме и патологии / Е.П. Конева, А.Л. Бурмистрова, Т.А. Суслова, М.И. Угнивенко, Ю.Ю. Филиппова, И.В. Шмунк // Материалы межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 75-летию службы крови Челябинской области. Актуальные вопросы клинической и производственной трансфузиологии. - Челябинск, 2010. - С. 127-128.

Ю.Филиппова, Ю.Ю. Оценка цитокинового профиля ожоговых больных при синдроме системного воспалительного ответа в зависимости от тяжести и исхода болезни / Ю.Ю. Филиппова, А.Л. Бурмистрова, М.И. Угнивенко, Е.П. Конева, Н.Е. Самышкина, Т.А. Суслова, Д.Ю. Нохрин, И.А. Скорик // Рос. аллергологический журн. - 2010. - №1, Вып.1. - С. 34-35. - Тр. нац. конф.

11.Конева, Е.П. Оценка уровня экспрессии генов цитокинов у ожоговых больных с сепсисом / Е.П. Конева, М.И. Угнивенко // Вестн. уральской мед. академической науки. - 2011. - №2/2, (35). - С. 113114.

12.Филиппова, Ю.Ю. Лабораторные маркеры в качестве предикторов различных фаз развития и исхода сепсиса у ожоговых больных / Ю.Ю. Филиппова, А.Л. Бурмистрова, М.И. Угнивенко, Е.П. Конева, Е.В. Семенов, Л.И. Бахарева, П.С. Садовников // Материалы II Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий» 15 декабря 2011 г. - Екатеринбург, 2011. - С. 227-229.

13.Филиппова, Ю.Ю. Цитокины как предиктовые маркеры летального исхода у ожоговых больных на стадии сепсиса / Ю.Ю. Филиппова, М.И. Угнивенко, Е.П. Конева, Н.Е. Самышкина, И.А. Кочергина, И.А. Скорик // Вестн. уральской мед. академической науки. - 2011. -№2/1, (35).-С. 211-212.

14.Бурмистрова, А.Л. Нелинейный анализ главных компонент в оценке

вклада цитокиновой активности лейкоцитов периферической крови в развитие сепсиса у ожоговых больных / A.JI. Бурмистрова, Ю.Ю. Филиппова, М.И. Угнивенко, Е.П. Конева, И.А. Кочергина // Рос. аллергологический журн. - 2012. - №1, Вып.1. - С. 68-69. - Тр. нац. конф. «Клиническая иммунология и аллергология - практическому здравоохранению» (20-21 февраля 2012 г., Москва).

15.Конева, Е.П. Гетерозиготность гена ИЛ-10 как предиктовый маркер осложненного сепсиса у ожоговых больных / Е.П. Конева, A.JI. Бурмистрова, Ю.Ю. Филиппова, Т.А. Суслова // Вестн. уральской мед. академической науки. -2012. - №4 (41). - С. 123-124.

16.Burmistrova, A.L. Expression of HLA-DRA,-DMA and CIITA genes in burn injury patients with systemic inflammation response syndrome / A.L. Burmistrova, E.P. Koneva, T.A. Suslova, I.V. Shmunk, J.J. Philippova // European Journal Of Natural History. - 2008. - № 3. - C. 52-53.

17.Koneva, E.P. HLA class II messenger RNA expression depending on TNF-A promoter polymorphism / E.P. Koneva, T.A. Suslova, A.L. Burmistrova, J.Y. Philippova // International Conference. 6-th East-West Immunogenetics Conference. - Olomouc, Czech Rep, 2012. - P. 39.

Список используемых сокращений

Комплементарная ДНК

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов Полимеразная цепная реакция Полиакриламидный гель Полиорганная недостаточность Обратная транскрипция Pathogen-associated molecular pattern / Паттерн патоген-ассоциированных молекул Факторы предрасположенности (Predisposing factors — Р), особенности этиологии и локализации первичного очага (Infection — I), системная реакция организма (Response — R), выраженность органной дисфункции (Organ disfunction — О) Single Nucleotide Polymorphism, полиморфизм по одному нуклеотиду SIRS/CCBO Systemic inflammatory response syndrome / Синдром

системного воспалительного ответа TREM Триггерный рецептор на миелоидных клетках

TLR Toll-like receptors / Толл-подобные рецепторы

кДНК

ПДРФ

ПЦР

ПААГ

ПОН

ОТ

PAMPs PIRO

SNP

На правах рукописи

КУЗЬМИНОВА Елена Петровна

ПОЛИМОРФИЗМ И ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ВРОЖДЕННОГО И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА У ПАЦИЕНТОВ С ТЯЖЕЛОЙ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМОЙ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Челябинск - 2013

Заказ № 893 Подготовлено к печати и отпечатано в студии дизайна и типографии ТЕТА 454048, г. Челябинск, ул. Яблочкина, 23 (351)225-09-18 http://www.tetadesign.ru e-mail: teta-art@mail.ru