Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Взаимодействие трансформированных и опухолевых клеток различной степенизлокачественности с нормальным клеточным микроокружением

РГ6 од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР пи H.H. Влохпна

На пропан рукоппсп

Гурова Енатсрпна Владпинротза

ВзаимодеостЬие тронсфсрмироЬанных и опухолевых клеток различной степени злокачестбенности с кормолькым клеточным микроохружением

14.00.14 - отсологш!

ADTOPBOBP AT дпссортацлп па еопсвовне учопой стопепп вандодата недпцннских наук

Москва 1996

Рабата амлолиам« а лаборатории гц>оти»оолухоло»ого иимуматата (румояодмтал» - цохто) медицинских наук, профаооор Г.И. ДоРчкаи) НЮ камцаоогамааа Онкологкчаояого научного Центра РАИ*

Научим* рукоаодмтнпк - дсыстсо мадииимеяих наук, профаооор Г. М. Дайчиай.

Офидоалямыа олпонг»мтм: доятор ö»0»0f мчаских наук в.П. «ошсим (ММ4

канмаро,-ам«эа. онц рамм),

доктор медицинским наук, пра+аооор А.Д. АпатетоДн (Иивтатут виологмм гама, РАН).

Радумеа учрежден*« i ним иммунология Минздрава Роовии

Зачета диосартацим оостоитса СКТ&5ру igte г. нл »poaaaiw спациалиамроааммогр Ученого Совета К .001. U .0» омяологичоваого научного центра РАМН (Москва, Матрскоа м>оое, (4).

С диооартаииай моаио оанаяомитяс» • вшЛпявгаа* Онкологического научило цантра рами.

Ааторааерат разослан '1 моля IM* г.

Учанмд секретарь слециализироеамиого Уналого Соната

ОЗДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАКЛИ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОЗКЗ&1. OBqenpHaitftMO многообразие путей регуляции вролкферации, росте и дмффвремцкровки нормальных клеток в Многоклеточном opratw змо, многие ms которых достаточно херово изучены или мзучеитол g настоящее время. Среди ник. а пер»ум очередь, необходимо назвать эндокринную, ларекриннув и оуто*ринму» регуляции, a такле контроль пролиферации со стороны иммунной системы. Хотя изменение размнсяения нормальных и опухолевых клеток под влиянием их нереального клеточного кмкроокрупенмя исследуется более 30 лет, механизмы контактной регуляции пролиферации до настоящего времени еотеятсй поясными. Современные исследования в змвриологии и к ле-очной Биологии сделали очевидным, что органное или ткеневое мыкроокруяеике, е котором идет пролиферация нормальных клеток, является регулятором их еоэревомия и дмфф 1ренцировки, как о морфологическом, так и ■ функциональном пламэ (Färber and Саяегоп, 1990, ftchlrnrachar, 1900, Dulbecoo, 1980)• Поэтому понимание «эхами»из межклеточных

'в затю действия в норме, иосоЗэнно, изменение этих отмоыений при Трансформации я опухолевой лрогрзвони предстаалтггся важными в Теоретическом и практическом плане.

Как известка, трансформированная или опухолевая клетка возникает В организме, кек правило, среди нормальных клеток-предаэствениц. Счень •©«¿йо понять, кокни образом одной из множества мутентных клочок удается преодолеть или использовать рост-регулируючее влияние нормального клеточного микроокруяения и оОрезовать опухоль. Огромный «итерео эта проблем* .вызывает в связи с' исследованием механизмов ратгстазнров&ния. 0 тох случаях, когда метастазы развивается, к at <м еОразом клетки, часто единичные, преодолевает регуляторные сигналы йормэльного микроокружения, выяивамт и формируют метастатические узлы? Ответы на эти вопросы леиат на пути расшифровки механизмов взаимодействия нормального клеточного микроокруяения и опухолевой клетки.

Одним из основных злементов нормального клеточного пмкроокру*е«ия является клетки соединительной ткани - фиОровласты. Функции этих клеток, как ооновного элемента стропы, давно и детально изучайте«: синтез и реутилизация белков внеклеточного матрикса, создание

'■• - 1 - .

фундамента для кмгок эпителиального и зндотелиельного типа, заполнение дафактов при механическом и воспалительном повреждениях тканей. Распространенность фиОровлестов а организма, их опособиоеть к раду регуляторных функций, таких как оиитез и секреция ростовых факторе», влияние на пролиферации клаток эпителиального,

зндотелиельного и мегеихимального происхождении, описанные в последние десятилетия, свидетельствует • пользу возможной роли фивробластов . ■ контроле над ростом опухоли на различных этапах канцерогенеза ц опухолевой прогрессии (Stoker, 1вв7, We1aa.lt. ,1970, Nlldoleon, в., 1МЗ, JurQensaeier, eft al., 1ФФ4).

Эта роль занимает умы исследователей уже более 30 пет. ja »то время о«1исамы многочисленные феномены взаимодействия фибровластоо И опухолевых клеток, иалоплены примеры как ингиОирушцего, так и усиливающего влияния фибровластов на пропифердтмвиу» активность 1п vitro, и туморогениум и метастатическую активность In ylvo (Abercromble and Ambrcee, 1967, Stoker, 1804, Chao Lu, at al., 1891, Benethan, at al., 1991;. Однако обилие разноречивых данных, связанных о использованием различных моделей трансформированных и опухолевых клеток, иаходмцихся м* различных этапах канцерогенеза и опухолевой прогрессии затрудняет юминвние роли коатом фи&роОластноге тип* t это* процессе

8 последнее время возникли новые аспекты проблемы взаимодействия опухолевых клеток с нормальным никроокружением, анализ которых, как мам кажется поможет пролить свет a честности на роет-рагулмруициф функции фивробластов. к мим относятся: 1) роль отдельных онкогенов в изменении взаимоотношений фиВровпестов и трансформированных клеток; 2) роль опухолевой прогрессии в этом взаимодействии; 9) возможное впи ж ж а опухолевых клеток на фиброблаоты.

Ц*пё м j «дачи мсс/шАо$вимщ. Настоям в исследование выло лосаяоюме изучении рост-регуг.ируе«»вго дейотвия фибровластов на каетки* трансформированные In vitro различными агентами и на отобрамкие in vivo опухолевые клетки различной степами злокачественности целы» установления закономерностей изменения чуаст<ительмости клеток к рост-регулируицему влиянии фивробластов на различных этапах канцерогенезе и опухолевой прогрессии.

• Z -

Задач* мееяедоеаяит . 1. Изучение рост-регупирумчего влияния нормальных фибробпасто» на >иброОласты, иммортализовамнме н трансформированные различными агентами или спонтанно.

I. Установление возможной связи между трансформируя«!»! агентом и чувствительностью трансформированных клаток к рост-регулируяцим сигналам нормального клеточного микроокружения.

1. Сравнительное изучение рост-регупирующего влияния ноомальных Эибробластов на высоко- и низкозлокачестаеиные опухолевые втеммы одного происхождения, и, • частности, установление -вязи между чувствительностью клеток к рост-регулируяаим сигналам нормального клеточного микроокружения-- и способностью к спонтанному яетаетазированим.

Научная новизна. Впервые на Вот том количестве клеточных ятсммов «сходно полученных иа основе эмбриональных фмброЗпастоа Сирийского коняке были определены закономерности рост-рвгулирукз»его влияния нормальных фибробластов на трансформированные и олухглевые клетки а зависимости от тр аисформм p'ytr^a г о агента, этапа трансформации, уровня шокачеетвемностм опухолевых клаток, (туморогеннои и метастатической активности). Показано, что при иммортелизации клетки сохраняет •аксимаяьный, аналогичный родительским нормальным клеткам, уровень чувствительности к рост-ингибируяцеиу действия фиброОлаатов. При грансформации чувствительность клеток к рост-ингибируюцему действия Эмбробластов сохраняется в различной степени а зависимости от граисформируяцего агента: максимально - у спонтанно-трансформированных <леток и клеток, трансформированных Бычьим Аденовирусом (тип 3), а вредней степени - у клеток, трансформированных диким типом вируса 8V40 I минимально - у клеток, трансформированных Вирусом Саркомы Рауса [ктамм Вмидт-Руппим). Обнаружена корреляция межд/ уровнем экспрессии »рвО-v-arc в клетках, трансформированных Вирусом Саркомы Рауса и их >эзнстемтиостьм к рост- ингибируяцему влияним фибровластов. Показана юль отдельных онкогенов в изменение чувствительности клеток nrateta tJTP к рост-регулируицему влиянии фибробластов. Онкогены N-raa, 4а-гаа, и ту с не влияят на чувствительность трансфецированных ими слеток к рост-ингибируячему действия фиВробпастов. Введен*« гена bcl-2

- 3 -

онийает чувствительность клеток, • введение иутантмой формы гена рва (по 178 еиинокиолотм) делает клетки практически реаивтемтныии к рост-ингиЛнру*ще*«у епиянн* нормальных фиброОпастов. Показано, что чуютвителькость опухолевых кпетск к рост- регупирутсвму действие фибробластов зависят от уровня их злокачественности. Так низкоапокачествеиные клетки оказались высоко чувствительными к роет-ингибирумцему действие фибробластов в теч&нми есего времени маСлядаиим (в ди«й клнтактного взаимодействия). выоокотуморогениые, но иизкомвтестатичвекие клетки выли , ненов чувствительны к роот-ингнбирумцему действия фибробластов, и их чувствительность смишалооь в течении эксперимента, вплоть до полного выхода етик клеток и* индуцированного фиброОлаотами цитостазиса. Высокеметастатичеоки* клетки» - помимо приобретения ' способности к преодолении рост-имгибируюцего влияния нормальных фиброОластов, приобрели также чувствительность к рост-стимулируш«Я!му дейотвпа нормальных фивроВл«стов после 2-6 дней контакта с ними.

Псякгичасквя значимость работы. Работа носит фундаментальный характер. Полученные данные описывает закономерности рост-рагупирующего влияний нормальных фибробластов на трансформированные и опухолевые клетки ма различных этапах канцерогенеза и опухолевой прогреосии. Данные о влияние отдельных онкогенов на чувствительность клеток к рост-мнгибирумцему действия фиБровластов позволяет предполагать участие отдельных сигнальных путей в прзпифоративиом ответе клеток на контакт с нормальными фибро&ластвми.

ЛуОпмкяции. По теме диссертации опубликовано 4 работы. 1 находится а печати.

Апробация дисслрглции. Ооиовные положения работы допоаекы не Международной школе иммунологов им. Дщ. Канфри в Румынии (198?), ив Международной конференции посвященной столетие со дня рождении л.А. Зильбера в Москве (1Й04), на Международной «коле по клеточному циклу В Иерусалиме (1ввС), на Ученом Совете НИИ Канцерогенезе, не лабораторных »Г мажлвОора-1 ор|<ых конференциях НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАНИ в 1Й11- 1В8в гг.

, и структура работы. Материал диссертации изложен на 1>7 страницах мавтиоп».сног о текста, «кгмчая указатель литературы.

Диссертация состоит мэ введения, сЗгора литературы, якспормнонтапьноА частя исспвдввкний, нзпоявнмоа а 9 rntsstx, оЯсу«,«,омяя результатов м екэодов. Экспериментальная катерная представлен » 10 рисунка* и Э ТоЗлмц&х. Указатель литературы содержит ссылка на, 15* работы отс*аатввкммх и эаруОевснык авторов.

СОДЕРЖАНИЕ Р АЗОТЫ Кэтегяалм п мтоды исследования. ,

1. Кпоткн

О этой исследовании мы считали целесообразным сравнить чувствительность к рост-рогулкрук^зну впияни»» нормального кмкроокруяоння (СяСроОлостов Сирийского хомяка) кммортализованных или попностьи трансформированных In vitro различными агентами клеток, а такаэ их отобранных In vivo вариантов, полученных на основе СнЗриомальКых фиСроЗластоа Сирийского хомяка. Такая схема исследования Позволяла в условиях экспериментов In vitro оценить возмояное влияние трансформирукаэго агента, стадии трансформации и onyxonetcft прогрессии «а хергятср .аэскподвйствмя" нормальных и опухолевых клаток. Сравнение Трансформированных 1r> vitro родительских клеток с их отобранными In Vivo вериантеми, раэличакзимися по уровню злокачественности позволяло увидать связь иеаду чувствительность» клеток к рост-регулируидему огщЬнк?! «ормальках СмвроСластоз и прогрессией опухоли. Норнзлькиз кna тки

□ качества нормальных ОиСроВлестов Выли использованы первичные культуры гкЗриемалькых Онбробластов Сирийского хомяка (ХЭО) на 3-8 пзссея&х 1n vitro. Культуру эмбриональных фибровластов (ХЗЭ) получали путем трипоинмэвцнн хомячьих эмбрионов разных сроков эмбрионального развития: ранние (рХЗЭ) получали при обработке эмбрионов 7-9 дневного возраста, поздние (пХЭФ) получали из плодов непосредственно перед родами (17-13 дней). Клетки использовали для опытов на Э-в пассажах 1п vitro, когда преобладании типом клеток являлись фибробласты Трансформированные клегки (ТК)

D качестве ТК использовали следующие атаммы клеток: рХЭСТ - спонтанно иммортализоваииые 1n vitro рХЗО (получены в иааей лаборатории H.A. Дьяковой и Г.И. Дейчман). Клетки способны

- 5 -

неограниченно пролифарировать 1n vitro (ßonoo 40 пассажей)« но на способны давать роет опухолай при прививке Сирийским хомякам, но отпичаится от ХЭв мсрфопогмай а сватовом микроскопа. ХЭТР-спонтенмо трансформировании« In vitro ХЭФ (охарактеризовали Дейчмвн Г.И. и Ввндро» Е. 1986;). Да»т рост опухопай при прививка Сирийским хомякам, имеют измененную норфопоги».

хэт-вя, X3T-SR-1, X3T-8R-10 - ХЭо, трансформированные In vitro Вирусом Саркомы Рауса (ВСР) нтамма Шмидт- Руплин (Дейчнан и coast., lees). Без клетки высокотупорогвииыв, оОпадаят рвзиым уровнен «зтестьтичаской активности,

ХЭ-4 - ХЗД, трансформированные 1п vitro Бычьим Аденовирусен 3-го типа (гаобаэна предоставленным в лабораторию £. Запжшгон), низкотуморогенина и ненвтестяэирувдиа.

X3wtBV40 - ХЭФ, трансформированные In vitro диким типом вирусе 6V40 (Дейчман и соакт., 1977), тукорогенныа, но намзтаставируфзиа. ХЭТР-СЗ-пео, ХЭТР-СЗ-На-гав, ХЭТР-СЗ-вус, X3TP-C8~fccl-8,

ХЭТР-СЗ-рбЗ-routl76 - варианты клеток ХЭТР, в коториз Сети ивадакы соотватствувцме ген» » состава ратровирусного вектора о тропностыа к СЗ рецептору, предварительно траксфециров&ннсму в к потки ХЭТР (д. Гудков. Иппинойский Университет (COA) 1896); ХЭТР-поо кл.21, ХЗТР-поо кл.22, ХЭТР-N-raa кл.102 - варианты кпеток ХЭТР, в которые П.Г. Тополь (1892) выпи трансфвцированы соответствующие гамм. Опумопвана клетки (OK)

HS коллекции опухолевых клеток, полученных и охарактеризованных в иа&ай лаборатории (Дейчиаи и бондров, 1836)Смл выбреш рад атдомов о определенными злокачественными характеристиками. Линии олуховзаыч клеток Сыпи получены при отбора 1п vx<о на Сирийских хомяках двух типов трансформ&нто»: 1) варианты атамна ХЭТР - ХЭТР-120, ХЭТР-12®, ХЭТР-Ю2 (ниэкотуморогенные, наматастазируицие), ХЭТР-74/tO« КЗТР-76/1В, X3TP-8S/2Ü (аысомотумороганныа, выеокоиетастатичаекиа) были выделены из легких хомяков через разима сроки после введения мм внутривенно клеток ХЭТР; варианты ХЭТР-МЛИ-1, ХЭТР-КЯН-в, (выоокотунорогвиныа, ниэкомвтастетические) ХЭТР-МЛН-в

(вывоиотуиойогемный, выоокометастатичеокий) выделаны из

в -

иэтастатнческих узлов е легких у животных с подкоэтныим опухолями поело введения клеток ХЗТР;

2) варианты ВСР-транефорнантов (все высокотуморог^нные) - ХЭТ-ВЛ-ИЛУ-1 (натаотпэирукзиП), ХЗТ-Ш1-МПУ-4 (кгиатастазирухсций) выделены из »тэтаствтичвских узлов у яшвотиых-носителвй опухогяй X3T-6R (1 пасса* 1п vivo). язт-ея-гпк-мпу (высокомэтостатич. <.кнй) выделены из метастатических узлов посла 3 пассаиой 1n vivo клеток X3T-8R ^(Двйчивн и каилова, 1669).

Варианты кпяток о двумя онкогенами

О хпэтки родительских »таймов хэт-an, хэт-ОП-1 и хэт-оя-гпк-млу Л. Тополь и соавторами (1Q92) Сули тренс$оцироввиы гены N-ree 1 (сплайеированмая форма мутаитпэго человеческого гена) и nao (бактериальный ген устойчивости к гвнитицину). Было показано практически полноз подавление зкслрассии ррво-v-erc в клетках ХЭТ-8Я, частичное подавление экспрессии ррвО-v-erc в клетках ХЭТ-ЗП-2ПК-МЛУ и оохранзнив экспросии этого гона в клетках хэт-SR-l. О мввнх опытах для исследования роли v-src гена а устойчивости клеток к рост-ннгкОирукзвму действи» фиОрсбластов были использованы следующие клоны этих трансОвктантса: ХЗТ-СП-М-гяа клоны 2,3,4,в, X3T-SR-1-N-raa клоку 11-14, ХЗТ-бП-гПК-МПУ-N-ras клоны 34, 44/3, 4в/б, 47/4, 43/4, 33/в кпэтки итвима ХЭТ-8П, ХЭТ-8П-1, ХЗТ-зп-гЛК-МЛУ соответственно. 'Для'контроля были использована варианты этих ка клеток с тпансСмжци 1й одного гона neo.

2. Срода

Для водония культур эмбриональных клеток, втвмма ХЭТР, и его оериактов использовали сроду НГЛа или DMEM с добавлением гидролизата лактапьбумима в состноэении 1:1, 10* сыворотки крупного рогатого скота, 0,03 мг/мп глжтамина. Для ведения клеток трансформированных GCP использовали среду F-12 с добавлением ЮХ сыворотки крупного рогатого скота. Для опытов Врали среду DHEM с добавлением 5S эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, глятамииа, а такта с бмМ Нереа-буфора и 0,08 мг/мп гентамуцина.

3. Определение злокачественных характеристик клеток

Туморогениу» активность клеток (ТГА) определяли в количественном трансплантационном тесте в группах из 5-в сирийских хомяков, которым

- 7 -

1 4

вводили подкожно 4-6 десятикратно различаедихся доз кпэток (10 >10 ), и по истечении двухмесячного сроке определяли логарифм BOX привнвочивА дозы по модифицированному методу Reed и Muench

Экспериментальную метастатическую активность (Зад) определяли путем внутривенной инокуляции 8-8 животных 2-ия или 3-мя десятикратно различающимися дозами клеток. Животных усыпляли через 14 дня и производили подсчет колоний опухолевых клеток в легких, о помоцыв диссекционного микроскопа. Эа ЗМА принимали кииюшльмуп дозу клеток, вызываввуи появление не мзмге 10 опухолевых узлов у на немее чем вох животных.

Спонтанную нетастатическую ектиьиооть (СНА) определяли у емвоткдо носителей подкожных опухолей в течении 2 месяцев путем подсчета метастатических узлов в легких: *-" в случае отсутствия метастазов у 00 и более процентов миютных, - в случав

появления у большинства животных в группе от 1 до 10, 10 -60, 60 -100, и более 100 мегестезов соответственно.

Характеристики злокачественных свойств использованных i; лете« по денным Дейчман и соавт., (i860, 1808) приведены в тавлице 1. Описание использоввиной экспвряявктальной иодвга» для изучшмв взаимодействия опухолевых клеток о нормальным кпэточжм кмкроокрувениеи

При подборе условий эксперимента мы исходили из елздуждох соображений:

1) количество ХЭ® должно многократно превышать количество ТК или ОК, для того чтобы последние контактировали только о нормальным окружением. С другой стороны, в культуре клеток ИЗ* при выбранных нами условиях должна была глявляться контактная ингиОиция размножения. 8 предварительных опытах эти условия были определены при разной плотности посадки клеток и иеОлидеиия эа включение* (ЗН)-тимидина (ЭН-Тд) в течении 0 дней. Отдельно была иослодооана пролиферативная активность эмбриональных фиБроВлаотов, полученных не ршних (рХЭФ) и поздних этапах эмбриогенеза (пХЭФ). Включение ЭН-Тд а клетки, посаженные в дозе, оЬеслечмвамцвй монослой .в момент посадки, не только не нарастало, но и имело тенденцию к снижению в течении окопврймвнта вплоть до полной остановки пролиферации. Неболькие

- в -

ТАВЛКЦЛ 1. ЗПО;<АЧ£СТОЕКНЫ2 ХАРАКТЕРИСТИКИ НЕКОТОРЫХ КЛЗТОЧНИХ QTWCiOa, ГСПОЛьгзОАШМХ а PAGOTG (по доннам ДсПч*жн и соэзт.)

Нзззшшэ втехма Злокачественны» характеристики

* я *

ТГА ЗМА СНА

pXSCT из растет 1i 1 Vivo

КЭТР 2.3-3.3 >>юв * -

ХП-4 > 4.0 >>10° ' -

xa-titGvio 2.0-2.0 >10° - •

кзт-ег? 0.5-1.3 ю4-юа -

ХЗТ-СП-1 О.В-1.0 10*-10а ♦-м-

ЯЗТ-СГЫО 0.S-1 .0 104-105

ЗПТР-120 1.7-2.4 »10® -

ХЗТР-120 1.7-2.4 0 >10 -

ХЗТР-102 1.7-2.4 >>10® -

ЯЭТР-74/10 0.7-1 .2 ю4-юв

кзтр-70/ia 0.7-1 .3 ю4-ю0

X3TP-83/20 0.7-1.2 ю4-ю°

КЭТР-!!ПН~1 1.0-2.0 104-10S

ЯЗТР-МЛН-О 1.3-1.7 104-105

хотр-мпн-а 1.2-1.4 ,о4-юв

ХЗТ-5П-!!ЛУ-1 0.6-1.а 104-105

ЙЭТ-ОП-НПУ-4 0.3-1.3 104-105 -

ХЗТ-2К-2ПК-МПУ 0.5-1 .а ю4-.о5

ТГА - туморогонма»! ектье^ость:lg 60s прививочной дозы (см.

Материалы и Кэтоды); ЗНА - экспериментальная метастатическая активность: минимальная

доза кпэток (см. Материалы и Методы); СМА - спонтанная иетостатичоская активность (см. Материалы и Методы).

отличия в поведений клеток рХЭ® и пХЗЭ закпэчбпмоь в тем, что клетке рХЗЭ во всех дозах имели более высокий уровень включения SH-Тд, и продолжали пролиферировать лрн несколько Оопоа высокой ппотноотн, чен пхзе.

Тек кок монослой ХЭФ образуется при посадке в лунку 60

4

луночной платы 6*10 фибробластов, о наинсньыао количество кгютен

мишеней в такой лунхе, позвошиедее клеткам сразу вступить С

4

пролиферетивниЯ цикл составляет около 1*10 клеток, еоотнейэныа

эффекторов и миаамой в момент начала эксперименте составляло 6:1.

2) неблмдение за пролиферацией'клеток должно было осуществляться

»

в динамике: исходя из предварительных наблюдений и условий культивирования клеток, был выбран срок - 0 дней с ежедневное оценкой пролнферативной активности клеток. В течении этого периода клетки ХЭФ, посаженные в пластиковые лунки, остаются кивынн и в хорошем состоянии, е затем увеличивается вероятность открепления и гибели части момослоя, появляются визуальные признаки дегенерации клеток. В тоже время этот период времени вклычвет логарифмическую фазу росте для подавлюевдего большинстве исследуемых клеток-мишеней, посаженных в выбранной нет) дозе. D тех случаях, когда скорость роста отдельных клеточных вариантов было немного выше средней, срок эксперименте сокращался до 4-6 оуток.

S) из методов оценки пролиферетивной ектмвиооти клеток мы остановились на меченим ДНК ЗН-Тд, так как он отрешает уровень синтеза ДНК и поэтому является наиболее приемлимым в системе, где количество непролиферируюцих клеток-зффекторов многократно лробкзоат количество пролиферирумачих клеток-мишеней. Для того чтобы снизить до минимума включение ЗН-Тд в моноспой Филообластов, мы облучали их не гамма-установке.. Фиброблаоты в таком состоянии оставались вполне жизнеспособными, что и» определяли по им митахондрнальному дыханий (о помощью окраски МП), но заметно слабее вкгезчали и не роутилидировали SH-Тд. Кроме того результаты тимидинового теста была подтверждены прямым подсчетом клеток а камере Горяеве.

Для того чтобы определить влияет ли облучение не роот-регулирумцие функции фибробластов, мы сравнивали эффект облученных и необлучанных ХЭФ не включение ЗН-Тд трансформированными

Взяючотм ЗН-Тд

1£035

ШЯф Ш

2 3 4

Дни аупьтпвпровашм

"Рисунок 1. Октпнио ЗН-Т* кпатквин ХЭТР в Я по о гношению к интактюну контрою, прннимаомону за 100Я (1) а контакта с облученнмми (2) и »воблучзкнг^мм (3) кп«ткани ХЗФ.

кл^тк™ ХЭТР. Результаты на отличались принципиально (рис.1) из чего t-.it 'сделали смоод о том, что мы моясм использовать облученные клетки для изучения рост-регулнругечих свойств вибробластов.

4) на следуем этапа работы им определили способ приведения во взаимодействие нормальных и опухолевых клеток. Рассматривались 2 верманта: 1) посадка смэси ОК и облученных клеток ХЭЭ в соответствующих дозах; 2;посадка сначала насблучеиных клеток ХЗО, облучение их после достиасния ими состояния монослоя и наслаивание затем на них ОК. При сравнении результатов, полученных при этих способах кокультивтрования (рис.2) был выбран второй вариант. Во-первых, потому, что при посадке облученных ХЭ* часть из них сразу вступают в цикп и погибает, что ухудваот общее состояние культуры, и делает трудно учитываемой дозу выяивших клеток. Во- вторых, сравнение включения ЗН-Тд ОК при посадке в смеси и ХЗО и путем

- И -

наслоении на иомоолой хэо показало, что есо осоОсммости потения ОК

при контакте с ХЗ« проступит явственнее именно при наспоонии ОК. на

КЭО! иигиОицнп и стимуляция оклячония ЗН-Тд, там где она

присутствовала, Выли выреивны снльнзо.

Рисунок 2. Скточонне ЛИ-Та к лот- иыо/шаг1 „» коми ХЭТР при контакт» с сОпу- 40

чвиными клетками ХЭ& в зависимости от способа посадки:

1 - мнтактмы* контрольною клетки

ХЭТР;

2 - при поселке к па гок ХЭТР одновременно с оВпучфнными в суспан-яии клетке«н хэо;

3 - при посадке кпоток ХЭТР не моиослой предварительно обрученных клеток ХЭО.

Кемаак точке - среднее значение включении ЗН-Та клеткой» в 4-х поеторасщихст лункам.

1 в V в

Дча куткагахревгтяя

Зависимость рост-рог упируюцих свойств фнвроВластоа от срока знбриогеноза

Поскольку им использовали в качестве ксркал&ных эмбриональные фибровпесты это стеамло ряд дополнительных вопросов, какой степени эмбриональные клетки способны осуцэстелять контроль над пролиферацией ТК н ОК, меняется ли рост-рвгулируедю потенция ОиОроблостов в зависимости от возраста эмбриона. Для . ответа на эти вопросы ни сравнили рост-регулирукэдио действие фнОроблестоа, полученных из эмбрионов в-10-дж>»мого возраста - рХЗО (середине энбриогенеза у хомяков и 17-18-дневиого возраста (непосредственно перед родвии) в отноменьи нескольких клеток. Экспериненты проводили в соответствии

условиями. В течении 4-х дне».

Включен** ЗН-Тд в контакте с рХЗ* и с пХЗО различными вариантами тк Выло неодинаковым (р»с.З). Ингибирукщев действие рХЗ® было вырвевнв сильнее, чем пХЭФ. Тек пролиферация спонтенно - 12 -

КИОТО«

О

ПХЭ® вариантов описанными выше

несколько

Дни культивирования

Рисунок 3. ВХПИЧ0НН& ЗН-Тд различными агаихями трансформированных клоток о контакта с рХЗЭ 11), пХЗО (г) и я мнт&ктныо ¡слетки (3).

трансформированных клеток ХЭТР была подавлена в течении всего времени наблюдения как при контакте с рХЗФ, так и при контакта с пХЗФ. Такое же соотношение кривых мы наблюдали и для трах ССР-трансформантов -клеток ХЭТ-ЗЯ, ХЭТ-8Г}-1 и ХЭТ-БП-Ю, только ингибируккяее действие как р'ХЗО, так и ПХЭЗ было выражено спабео, а иногда и вовсе исчезало к концу эксперимента ХпХЭО - на клетки ХЭТ-БИ-10, рис.3).

Приведенные данные говорят о том, что нормальные фибробласты на разных сроках эмбриогенеза, по-видимому, в некоторой степени различаются по способности контролировать процессы размножении ТК и ОК в культуре. Оказалось, что ОиВробласты, полученные от эмбрионов на более ранней стадии эмбрионального развития обладают более выраженным рост-ингибирующим влиянием на пролиферацию ТК и ОК.

Поэтому в работе приводятся • основном результаты с использованием клеток рХЭ®.

Таким образом мм остановились ме следумчей модели эксперименте! использосели 8в-луночн*е плоскодонные пластины. ХЭ» снимали о флаконов раствором версена, разводили опытной средой до необходимой

4

концентрации и сажали в лунки по 5*10 клеток на лунку. Примерно через 20 часов (посла формирования монослоя) пластины с клетками облучали Г-пучами на установке "Стебель" (в мин., 40 Гр). После этого приготовленные заранее суспензии ОК вносились в лунки из расчета 1*10* клеток на лунку. Кокультивировамме продолжалось б суток с ежодновным визуальным контролен и ежедневной сменой среды на 1/2 объема лунки, в стандартных условиях (37 °С, В» СО^).

Определение пролифчрагизной активности опухолевых кпаток

Стандартный эксперимент

Проводили по включений в ядра клеток меченного тритием тимидима (ЗН-Тд, 0,26 икКи/лунку, б Ки/Мм, разведенного холодным тимидииои Юикл/мл), который добавляли в среду ма 20 часов. После этого клетки отмывали, снимали с пластика раствором версена, переносили на стекловолокониые фильтры с помоцьм клеточного карвестера (1.К8. Ввоция) и количество включенной метки просчитывали на В-счетчике (сря/кни).

Уровень стимулирующего или ингибируюцего действия фибробластов.на опухолевые клетки определяли по формуле:

ерш ОК - ( ерт 0К/Х30 - ере ХЭ»)

. Я « -------------------------------«100

с ре ОК.

где ерга - количество импульсов в минуту, ере ОК- включение метки а контрольные ОК в отсутствии контакта с ХЭ0; ерш (Ж/ХЗФ - включение метки в ОК , находящиеся в контакте ч. облученными ХЭ«; сро) ХЗФ -«кпечени* метки в облученные ХЭФ .

Прямой подсчет клеток

Проводили в лункех экспериментальной ллшты, содержимое которой после удаления опытной среды заливали стандартным количеством раствора Вероена, ' инкубировал* 30 минут,. ресуспедиросапи, добавпяпи

трилаиовый синий, и с помощь» камеры Горяева подсчитывали количество

- 14 -

аивыя клеток в лунках.

Определение количестве клеток методом окраски МТТ В лунки экспериментальной платы в конца эксперимента

добавляли раствор МТТ (3-[4,5-01те1г1уКМаво1-2-у1]-218-

б<рЬепуИвСгазо11игп ЬготЮе) в дозе 0.5 мг/мл V инкубировали 3 часа. После этого среду с краской удаляли, а г лунки заливали диматилсульфоксид. Посла растворения крисг.'лоа формазаиа,

образующихся из растворимой соли МТТ в . результата нитохондриального окисления в клетке, количество включившегося красителя определяли на спектрофотометре с длиной волны 570 нм. Кокупьтномрованив дглегок . при отсутствии нопосродстмнного контакта наяду ними

Кокультивирование клеток проводили в 24 луночной плат«, куда

ломчщапи специальные внутрипуночмыо вставки (М1111се Л-НА, М1111рогв),

дно которых продставляло собой мембрану с диаметром пор 0.48

микрометров, проницаемую для всех растворимых веществ среды, но

,ме лоэволяючуя клеткам контактировать. Посев клеток производили

с под укусим образом: вставки помещали в лунки и иа дно вставки сажали 5

ХЗо в дозо 2-2.5«10 клеток на лунку. ХЭФ такие сажали на дно тех лунок, где предполагалось кокультивироваиие их в непосредственной контакте с клеткемн-мииеними для контроля наличия рост-рогулирую^аго действий. Принерно через 20 часов, когда ХЭФ образовывали густ5й моноспой их облучали как в стандартном эксперименте. Затом на дно псах лунок: а) с ХЭЭ, посаженными во вставку, б) с ХЭФ, посаженными на дно и в) в пустые, сажали клетки-нивони. ЧepвJ 2-3 часа после прикрепления клеток среду меняли на опытную. Далее через каждые 48 часов пролифвративн'ю активность клеток оценивали как описано в раздела "Оценка пролнферативной активности клеток, Стандартный эксперимент", через каждые 48 часов. Смену среды а лунках проводили по половине объема через каждые 24 часа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ I. Рост-рагупирующее действие фибробластов на нормальные клетки

В раздела "Материалы и Методы" мы описали появление

- 15 -

ингийирукацого пролиферации си! нала о культуре нормальных клеток при определенной плотности посадки, а именно при образования монослой. Для того чтобы проверить действительно ли нормальные фибробласты вырабатывают такой сигнал при разработанной нами схеме эксперимента ни оценивали пропиферативную активность клеток ХЭ2, посаженных в доза 1*10* клеток/лунку на плотный мояоспой облученных клеток ХЗФ по сравнению с их пролиферацией на пластике.

На рис.4А представлены включения ЗИ-Тд нативными клетками пХЗФ при контакте с облученными клетками пХЭО и в контроле, а такие фоновое включение метки в облученные пХЗФ; на рис. 45 соответственно включение ЗН-Тд клетками рХЗ& при контакте с облученными рХЭ».

Натианые пХЭФ н рХЗФ практически но пролнферировали при контакте с облученными клетками. Включение метки на протяяенми всего

3

эксперимента не превышало 2-3*10 импульсов с минуту, что приближается к включению ЗН-Тд в облученные непролкфврирукадиа клетки пХЗФ и рХЗФ.

Далее мы решили проверить возможность передачи этого рост-рогулмруюзего действия фибробластов гуморальным путем. Для этого мы кокультивировали нативныа клетки ХЗФ в присутствии облученных ХЭ®, разделив их проницаемой длп всех компонентов среды мембраной с помощью специальных внутрипуночных вставок (см. Материалы и методы). Это позволяло клеткам обмениваться всеми производимыми ими веществами, но не находиться в непосредственном контакте АРУг с другом. На рисунке «В изображены уровни включения ЗН-Тд клетками ХЭ® в непосредственном контакте с облученными ХЗФ, . в контакте через мембрану и в отсутствии такого контакта. Включение ЗН-Тд клетками ХЗФ было глубоко подавлено при обоих вариантах контакта по сравнения с контролем.

Таким образом, мы показали, что в используемой нами системе нормальные эмбриональные фибробласты действительно производят

рост-ингиОируиций фактор, к которому они сами высоко чувствительны, и который может передаваться гуморальным путем.

- 1С -

з А

гни/мин* 10

гаш/ьпшЧО

а

3 £>.

имп/цин*10

Дни культивирования 3 В.

со

60

40

20

«-'уг'у -

л

I

„ г 4

Дна2огул1тпвцропапзя

О - а - Ь I -

с

Рисунок 4. Рост-рягупируххцво действие фиброСпастое на нормальны» клчтк». А. Включение ЗН-Тд кпеткани пХЭО в контакта с оОлучонными ПХЭО (I), « отсутствии такого контакта (2), и в облученные ПХУО (3). 5. Включение ЗН-Тд клотквми рХЭФ в контакта с овлученныни рХЭО (I), в отсутствии такого контакта (2), н о облученные рХЭФ (3). В. Включение ЗН-Тд в клетки рХЭО в непосредственной контакте с рХЭФ (а), в контакте через момОрану (Ь). и в интактныа клетки рХЭФ (с).

- 1 7 -

О

II. Рост-рвгупмруы*— влияние нормальных фибробластов на клатки, грлнсрормнроеянмма рлзпмчншм агентами

Рассматривая трансформация клетки на как единичный акт, а как сложный процесс, состояний иэ нескольких ступеней, и, «следствии этого, способный реализоваться несколькими путями, нам Выло важно понять на каком иэ этапов превращения к-летки иэ нормальной в трансформированную происходит утрата ею чувствительности к рост-ингибирукхцему влиянии нормальных фибробластов. Для этого мы сравнили влияние нормальных фибробластов на имморталиэоваммме, кпатки и на клетки, трансформированные спонтанно и с помощь» ряда ДНК и РНК содержащих онкогеиных вирусов.

Ичмортапиэованныа кпатки р-ХЭСТ, несмотря иа приобратаниа способности к неограниченной пролиферации in vitro, не отличались от родительских клеток ХЭФ по степени подавления включения ЗН-Тд в контакта с нормальными ХЭФ (рис.Б): вклмчание ЗН-Тд этими клетками выло подавлено практически полностью в течении всего времени кокультивирования с ХЭФ.

Далее мы исследовали чувствительность к рост-регулиручцему влиянию нормальных фибробластов клеток штамма ХЭТР (спонтанные трансфедманты), а тахже клеток ряда вирусных трансформантов (GV40, аденовирус, ВСР), поскольку в этом случае в отличии от спонтанной трансформации известен механизм трансформирующего действия этим в"русов, и с ним мы могли Вы связать и изменение чувствительности клеток, если таковое будет обнаружено.

Спонтанно трансформированные 1n vitro клетки ХЭТР, в отличие от клеток рХЭСТ приобрели полностью трансформированный фенотип (см. Натериапы и Методы). Вкпмчение ЗН-Тд в кпетки 'ХЗТР было также в значительной степени подавлено в дрисутствии нормальных ХЭФ. но уровень подавления был менее стабилен и колебался от SO до 90Х (рис.5).

Клетки, трансформированные Бычьим Аденовирусом «таима ХЭ-4 сохраняли максимальную, аналогичную родительским, чувствительность к ингибиции, вызванной контактом с нормальными ХЭФ (рис.6). Эта

ингибиция составляла 80-95Х и сохранялась на такой уровне в

тачании всех шести дней кокультивтрования.

ха/ваочо

« '

12 3*68

1 2 3 4 5 в

«за/от»!«*

1 2 9 4 6 8

1 2 3 4 5 8

12 3 4 6 8

Рисунок 5. Вкпзчаниа ЗН-Тд иммортализованныпи и трансформированными к па ткани а контакта с оОлученныям ХЗЭ (I), а контрольные клетки (г), и а овпученные Х39 (3). Звездочки поставлены над . достоверно различавшимися значениями 1-ой и 3-оЯ кривых согласно г-нритерхя Стыздента (р>О.Ов).

Трансформация ХЭ® вирусом. БУ40 делала и* несколько Волее устойчивым к рост-ннгивирующему действие нормальных тиОроОластов (рис.6). Як лечение мотки в эти клетки Сыло подавлено на .80-608 и степень подавления снииалвсь после 4-6 дней контакта нормальных и трансформированных клоток.

Влияние трансформации ВСР на чувствительность v. контактно« инги&нцим нормальных фиброСластов исследовали по отношению к трем трансформированным 6СР втанмам: ХЭТ-BR, X3T-SR-1, ХЭТ-SR-IO. Данные по сдиону из них (нтокму ХЭТ-ВР) представлены на рис,6. Включение матки во все 3 штамме в контакте с нормальными ХЭО заметно отличалось от всех вышеописанных вариантов: подавление включения метки Было менее выраженным, в пределах 20-50% /в большинстве случаев/. Более того все три атамма после 2-4 дней кохультивирования начинали преодолевать рост-ингибирукщео действие ХЭО, вплоть до полного выхода из цитостааиса и дохе усиления о некоторых случаях (X3T-SR-1) пролифератмвиой активности в присутствии ХЗЭ по сравнению с контролем.

Т.о., мы показали,что иммортализованные или полностью трансформированные клетки исследованных «темпов в различной степени чувствительны к рост-мнгибируадеиу действию нормальных фиВроБяастое. Максимально чувствительными' были нтортолизованные,

слонтанно-трансфонированные и трансформированные Аденовирусом клетки, средняя степень снижения включения ЗН-Тд при контакте с ХЭФ была характерна для клеток, трансформированных вирусом .8V40, и минимальная - у ВСР-трансформантоа. Появление первых признаков устойчивости к ингибирувдему влиянию нормальных фибробл&стов коррелирует со способностью клеток формировать опухоли 1п vivo, что говорит о возможности рост-регулируккчего влияния фнбробластов на развитие олухоли1п vivo.

IV. Влияние различных онкогена» на чувствительность клеток к рост-рвгулмрухщану действию фнОроблвстов.

Мы получили достоверное изменение в поведении трансформированных клеток по сревнению с родительскими при контакте с нормальными фибробластами только в случае трансформации вирусом SV40 и вирусом Саркомы Рауса. Если исходя нэ этого попытаться проанализировать возможные механизмы изменения чувствительности клеток, то встает вопрос о роли двух генов: во-первых, рбЗ, так как с ним, как известно, связывается большой Т-антиген вируса SV40 и вирусного гена вгс.

Для решения вопроса об участии этих генов в изменении чувствительности клеток к рост-ингибирующеиу влиянию фибробластов мы выЗрали два пути: первый, проверка роли гена р53, заключался в

- 20 -

КСГ.ЫТаНИИ чувствительности К рост-рэгулируячсму двлст»|«0 ОмСроОлвстов KivsTOK с трг.не^зцяроааннын геном pes, нутантигАч по 178 еяиисхмслоте, котеру.Ч, ках известно, свпзыаеат дикий тип р5Э а клятве, тем самим кнгктнзнруп его. Помимо этого мы рвеилм испытать таквз клетки с трамс>зцировамкын геном bcl-2, так как спектр его функций в клетка » отношении регуляции клеточного цикла и апсптоза прпно протнвополсязм оункциням рвз.

йторой путь должен был закпячаться в испытании чувствительности кпэток с мнактивированным вирусным гоном егс. Для этого в нсией лгЗсратсрни имаетсп неВор клеточных штаммов ВСР-грансбормангоа, э которых поспо трансакции активированного человеческого гена м-гаэ снизилась экспрессия pSO-v-erc (Тополь и соеат., 1092). Тккоя (-юдоль экспвркмэнтов естественно ставила вопрос о роли гона гаа в изменении чувствительности клеток к рост-рвгулмрук^цаму влиянию фиОр&Зластов.

Панина зтого ни в&геочили в эксперимента такяв изучение роли гона (гус, так как измэкоина a aro экспрессии евпзывечт с «нмортализациой, а такие с отнэной рОЗ-зависимой остановки клеточного цикла, но но апоптоза. Таким образом, ны опнасм рэзупьтаты двух

V

групп зггепзрнмантоэ: 1 - изучения чувствительности клэте:; ХЭТР, тргнефецирозаиных гонами гвв (Н-газ, На-гаа), raye, bcl-2 и рЗ.З; 3 -изучений чувствительности ЕСР-трансфорнантов, тренсканированных гонсн if-газ.

1) Нзучзняэ чувствительности к росг-ингнбнруащвму /}еЯств(в» СнСроВлсатоя кп9ток ХЭТР при аводони» о них различных онкогенов

На рмоунха в продстайлвну кривы» вкпзчонип ЗН-Тд клетками ХЭТР и ми трансфзцнрованными вариантами в контакте о сблучвньыки фубреЗпастеии и в отсутствии такого контакта. Кок видно из рисунка р клетки ХЭТР, транейэцированныэ геном neo на отпичапнсь по чувствительности к рост-регупиругецану АвЯствия ХЗЗ от родительских япато« ХЗТР, как в случае СЗ вариантов, так н в случав кпона 21.

Сзэдсниэ в клетки ХЭТР ганов Н-гая и На-гаа на меняло их чувствительности к имгмВирукяцену деястеи--« ХЗЭ. Их пролиферация сына еяачитзльно подавлена s течении acero времени кокупьтивированмя. Зьгсзчвние ЗН-Тд в клегки ХЭТР-СЗ-гаус также было подавлено в течении^ всэх 0 дней эксперимента. Оклпчоние ЗН-Тд в клетки ХЭТР-СЗ-Ьо1-2 а

- 21 -

•a/Morto'

i e з 4бе —TBff3C8=3S5—

8 3 4 5«

SO/Ш*!^

1 2 3 4 0 6

mm/tts>u?

2 3 4 6 6

aai/eaf vf

\ г з 4 ле

Д 2. _3 4 6 0

Дни культивирования

Рисунок в. Включение ЗН~Тд клетками ХЭТР и их вариантам*, транофецированными генами neo, Ы-гае, На-га», myc, be1-2 и pS3-mut в контакте с облученными ХЭ9 (1), а контрольные клетки в отсутствии такого контакта в отсутствии такого контакта (2) и в оВлученные ХЗФ (3). Звездочки поставлены над достоверно различающимися значениями 1-ой и 2-ой кривых согласно t-критерию Стыедеита (р>0.05).

к сит es та о нормальней ХЗЭ Cano подавлено а неньвей степени по сравизита о родительсзскяи кпаткемя, а а «латки X3TP-C3-p53 практически но Выло достоверно снижено по сравнения с контролен

(рио.7).

Таким оЗразом, изменение чувствительности к рост-инг ибирукг.ену /\еПотвига нормальных $иОробластов было обнаружено а двух . случаях: а случае сведения в клетку иутаитной формы гена рЗЗ и гена Ьс1-2. И," напротив, гены ras и raye оказались не спосоВны изменить чувствительность клеток к рост-регупирукчкм сигнал»« нормального кякроскружекия.

2) Изагнанна чуастпптапьнаст к ' рост-рвгупирукхапу действие фабрсИлзсгсэ ОСР-гранс$орязнтоа при грансёэкцин в них генз Ы~гао

В наивЯ лгСоратории инргатсп нтам»«| клеток, трансфорнкрозвинмхССР, в

которые Сап транс$ацирЬван активированный человеческий ген H-rae, и э

клопах которых при этф» s различной степени в ' зависимости от отекла

снизилась экспрессия. ррЗО-v-crc (Тополь и соавт., 1993), (см.

Материалы и Катоды). На рис.7 приведены результаты эксперияситов с

кломямн варианта ХЭТ-2П-2ПХ-НЛУ, гдо представлен уровень экспрессии

СрЗО-v-src о условных единицах (данные О. КазенкноЯ, лаборатория

Рлгуляции вирусных и клеточных онкогенов неиэго института) по

cnaon2n:ï5 с«, уровнен имгиОиругг;зго действия ХЗЭ (в процентах среднего

ингиВирукчаго действия ХЗЭ по результатам нескольких гяспер«г*знтоа,

рассчитанных по Формуле, приведенной в ' Материалах и Сэтодах) для

родительского оариента и ого кпонов. На рис.7 не приведены даннь»

о чувствительности к рост-ингиЯкрукзему действия ХЗЭ клеток о

траксфзкцисй одного гена neo, поскольку эти. клоны на отличались

¿JJOTOOOPHO от родитальских вариантов по чуаствитапьности к

рэст-ингибируй^вму действия ХЗЭ.

В части клонов ХЭТ-0й-2ПК-НЛУ снижение экспрессии pOO-v-oro Оыло наксинаг.ьнин, например, в клоне 34 она вообще но определялась. Q этой случав иы набоддали максимальное усиление чувствительности к рост-ингиВирукчаму действия ХЗЭ, 0 одном случае (клон 45) экспрессия (сменилась очень мало, а резистентность к ингмбиции ХЗЭ деяе возросла по сравнения с родительским етгкяся. О остальных случаях ноВгеэдал&сь промежуточная кертииа: среднзо снижение экспрессии и. сравнимое

- 23 -

ЕЗ ррво-т-вгс ШЗ % подавления вгшоче-(уровеа пая ЗН-Тд при

экспрессия) контакте с ХЭФ

Рисунок 7. Уровень экспрессии ррео-у-агс и сродноо ннгнбирук^оо Авйствш фиброСластоа не клетки ХЭТ-ВЙ-гпк-МЛУ и их клоны, с трансфецированным геном Н-гаа.

возрастания чувствительности к ингмОируюаому влиянии ХЗЭ.

При регрессивном анализе изменения чувствительности I поток к рост-ингиЗируюдому действию ХЗФ а зависимости от уровня экспрессии ррбО-у-вгс мы получили коэффициент корреляции СО,38, & в зевисимости от повышения уровня экспрессии р21-Н-гав - 44,6*.

Таким оОразом, приведенные данные свидетельствуют в пользу того, что резистентность кпеток-трано^ормантов ВСР к рост-регулмру! чему ' действию ХЭФ связана с уровнем экспрессии в трансформированных клетках ррбО-у-вгс.

V. Рост-регулирующее в лишние нормальных фнбробластов на опухолевые клетки различной степени злокачественности

: В связи с результатами, представленными в предыдущих разделах,

естественно, возник вопрос, меняется ли чувствительность к

рост-регупирующим сигналам нормального клеточного микроокружония

- 24 -

ТГ5»1С$СрМИрввйМИЫХ 1n vitro клеток ХМ при их последующем отборе 1п vivo? Есть reí корреляция введу уродкам злокачественности таким отеСраикых In vivo ОХ и их чувствительностью к рост-рсгулкрутсдим сягнзлзм нормального клеточного микрсокружения. Для исследования этих вопросов мы выбрали из коллекции клеточных вагиантов втаммое ХЭТР и ХЗТ-ЕЯ ряд их отобранных 1п vivo вариантов, различающихся по туиорогенностн и метастатической активности (табл.1).

- При исследовании коллекции клэток ХЗТР мы разделили нмззэдиеся клэточниэ' варианты .в соответствии с их элохачеотвеммдов! херактсрнстикеми на три сладукциа группы : 1 )ниэкотуморсгоии5Я, нгкэтастазпрукдив кпэтки, 2)*ысокотуморогенн»э, ко

клэкскэтастатичяекио клетки, 3)высокотунорогаш%а ti

i

высояскэтавтатичаскиа клетки. О каждой группа было исслэдовеко 2-4 птratita. Q автореферата представлены результаты, ислытения одного штамма из келдсй группы.

При рассмотрении результатов, по пуча иных при исспвдозЕ^:-^ клоток первой группы, г-я увидали, что как пролиферация родительского втаяма ХЗТР, тох и пролиферации aro кнэкозлэхачаственных вернснтсо, была гмзчнтопвка подаэлзиа при контакта с клаткенн Х39 на асвя сроках геЗгездскйя от 1 Д9 0 дня (рис.О, ХЭтр, ХЭТР-120). Daличина «мгвОирувзаго зффакта дли этих втеимав СХ колебалась в пределах 52-Овя р Оолзэ нмэккяи значениями на ранних р рок ах кокультивкрования (1 сутки) и ого поввзанием до практически полкой остановки flPontti-CpautHi ма Солаэ поздних сроках (2-6 день).

Пэводошо высокотукорогоиких, но- ниэксмзтастатических вариантов ХЭТР - кпаток ХЭТР-МЛН-1 в контакта с нормальными фиОроОлаотами было насколько »«кия (рнс.О). Вначале, в первые сутки контакта о еЗлучонкмии клетками ХЗЭ степень ингибицни пролиферации этих кпетоз осрькровала а пределах от íes до 60S, но в сроднен была ниже, чем у кизхоэлохачаственнык вариантов ХЗТР. Затем ингибирукс$ев дг">стоио ХЗО постапамно нврастало, достигал някоммума к 3 суткам (03К-77К). Посла этого на наблюдали ослабление мнгиБируицэго действия Х2Э на 4 сутки оплоть до полного выхода СК из ХЗЭ-индуциро«аниого цитостазиса к концу эксперимента.

При испытании чувствительности к рост-рогулирукцену действию ХЗФ

- 25 -

нш/шшМС'

шщ/«яга*Ю *

1 2 8 4 5 8

1 2 3 4 5 6

тт/шш*10*

s*=dt

2 3 4 5 6

Дни культивирования

Рисунок в. Включение ЗН-Тд клеткмми ХЭТР и их вариантами, проеиедшнни отбор in vivo, в контакте с облученными ХЭФ (1), в интактные клетки (I), и в облученные ХЭФ (3). Звездочки поставлены над достоверно различающимися значениями 1-ой и 2-ой кривых согласно t-критерию Стыедента (р>0.06).

вмссяотумсрогонных и выеокоматвотатичоских вариантов ХЭТР, все ottti п«пя своя приязрно одинаково. На рис.в в качестве примера приведен» «рмвыэ включения ЗН-Тд клетками ХЭТР-вЭ/20. Включение '2Н-ТД этиим ктеткин было подбелено a первые З-б дней контакта о XW, .затем опухолевые клатки полностью преодолевали снтостаэис, и в конце экспвримнта (б-в день контакта с ХЭ®)екл»чаиие ЗН-Тд этими клетками ймло усилено в присутствии ХЭ$.

Таким образом , а этой серии опытов обнаружено следуйте: 1) рсст-коитролнрувдэе действие нормальных фибробластов распространяется на ОК; г)прол!г$аративнап активность низко- и одсокозлокачвственмых ол.рнамтоо ОХ при контакт© с нормальным» облученными клеткечи ХЗФ

сказалась различной; тф< вклячоми» ЗН-Тд родительскими кяеткеми ХЭТР

■ i

и его низкоэлокечэставнмыми вариантами в контакте с клетками ХЗФ было

сразу зиачйтольно подавлено и это подавление сохранялось, 'а о

i

некоторых случаях увеличивалось в точении 8 суток эксперимента; ботг-3 зпопа«а?твсммиа варианты ХЭТР, высокотунорог®инмэ, но низкохвтастатическне, оказались в меньеей степени подвержены «мгиаирувчсму дейстегсв со стороны нормальных ХЗФ, это дсЗатакэ солгОваало а течении акспоркггамтс; и 3) пролифаротквнсп ехтмзность еисохозпокачеотвенныи вариантов ох, обпадиядини «э^таототичэокйй фзкотмпем посла преодоления цнтостазиса усиливается прм контакте с ногзгздльиыин г?«Зр»она«ькими фяЗреОпостг^и.

Аналогичному исследования была подвергнута другая tt паточная поллекция: ВСР~транс$ос«йиты н их отсЗрйнхыэ 1п vivo верианта. Особенность этого нгборш клеточках итгкмоа состояла в- тем, что по® псР-трансОорианты изначально выоокотуморогфнны (тг.5л.1). tía нмаам а НЕяг9 пайоратории уникальный наЗер независимых ССР тре*ч:фетжзнтоа, на праходиввтх отбора 1п vivo и при этом различведихся по спонтанной-" иэтастатичесхой активности: ХЭТ-8Я неметвстаэиру(в}ие клетки (по тесту■ СМА, см. Материалы и Методы), и клетки X3T-SR-1 чрезвычайно высокометастатичоские. Помимо этого в некем распоряжении Смли варианты клеток ХЭТ-SR, прскздииа отбор ln vivo, часть из которых стала б результате этсго еисокометастатическиод, а часть сохрайилй родительский фенотип. На рисунке 0 представлены результаты испытания всех вьзззулсмяиутых gjt&hho», вкгйочвя ХЭТ-ЗЯ-гпх-НЛУ, ставшего

- 27 -

.*СОКО~Т.СТ.ТИЧ.С*ИМ. И ХЭТ-в*-НЛУ-4. й. И>И.И*М.ГО Своих

»локачастмниых характеристик по ора.».м~. в родит.люкк* отеяиои K3T-8R

1 2 3 4 б в

1 2 3 4 8 0

Шт/ышВЧО

12 3 4 б. в

12 3 4 5 6

1 8 9 4 б в

Дни культивирования

Рисунок Я. Включение ЗН-ГА а «легки, трансформированные ВСР и их варианты, прешедшие отбор 1п vivo а контакте с облученными '

контрольные клетки (2), и , облученные ХЭФ (3). Звездочки над достоверно различение* значениями 1-ой и 2-ой кривых согласно t-критерию стывдент* (р>0.0S).

03а ВСР-транофорианта выли ■ некоторой степени чуаствмтолыи к рсет-кнггЗарушгвму дейотаю» ХЭ9 а первые дни контакта с миии, и соридмко эксперимента они преодолевали рост-инигиВирувдее действие хээ и выходипм из цитостазисе, но после этого пролиферация меметастатичзских клеток ХЭТ-ЗК оставалась на уровне контроля в подавппицан Оольнинстве экспериментов, а лоолифврвтивная активность метастатических клеток X3T-SR-1 била усилена в контакте с нормальными„ фиЗробластами.

Клетки ХЭТ-8Я-МПУ-4 как и родительские клетки Били чувствительны к роот-ингиВируи=;гму дейстпио ХЗЭ в течении первых дней контакта о кака, а затем преодолевали цитостазие, но при этом включение ЗН-Тд в эти кпэткн крайне редко стимулировалось нормальными £г,;0ро8пастомя (рис.0).

Иначе вели ссв«| клетки ХЭТ-8Я-2ПХ-МЛУ. При сЦ9Кхо их пролйСэративиой активности в стандартном тесте оказалась,, что они поела ?* часов контакта с нормальными' эмбриональными фвЭреЗп&стемн становились практически нечувствительны к - их ингиВирук-гяиу действим (ряс.9). И Волвэ того, вкгевчоние ЗН-Тд в эти клетки в Reanaaytst'-ie В rksíí кокультивирезсняя Выло усилено в . присутствия , »сдельных СяЗреЗпгзтоац. подчас' весьма значительно. о этом гл поэздеииэ отличачтсп от меметастазирукпзго родительского ведасжа втемма ХЯТ-ЕЯ, а таккэ от всах нссладовамгмх до этого атекяоэ- Тй ti СЖ.

Таким еЗрззсм, отбор этих вариантов 1n vivo иэ только усилил

независимость их проттфоративнсй активности от ростго*гкЗмрукг,эго

влияния нормальных клэток, но и 'научил" эти клатки "ny»ese расти s

г отсутствии нормальных СиОроЗластов. Приобретение этих свойств

коррелирует о присОретемнен кми гтзтаотатическсго фенотипе.

УХ. Выяснение возпсяностн гунорапъм&Ц передачи рост-рагупиру1%тзго влияния (мОробпастов

Для проверки возможности гуморальной передачи

pocT-psryn»py«ssro действия фгШрсбластов мы проводили эксперименты в система, где з£$зкторы и имааии были разделены менбреноа, пропусзеязой все рестясрккые естества, находящиеся в среде. -где культивируется к латки, но при этом не позвопляг;зй им контактировать, (см. Материалы и методы).

»о« ниэкозпокачеотвеммые варианты не отличались по своему поведении от родительских клеток ХЭТР, все васокоэпокачественные варианты такая воли себя примерно одинаково. Поэтому но рисунка »0 продеты помы результаты, попу помимо при испытании двух купьтур: ХЭТР и ХЭТР-МЛН-а. На этом рисунко продетоепаны значений вклмчеиия ЗН-Тд клетками, находящимися • контакта с ХЭО, чараз мембрану ипи ммюередственно, и в отсутствии такого контакта.

■■-» вШ-ш са - а Дан >ММ1*«ММ1«<

Рисунок II. Вк/тчвни» ЗН-Тл В к/юткм ХЭТР (А) и ХЗТР-МЛН-9 (В) I непосредственном контакт» с оояучвшшнн ХЭ» а контакт» чараз

жнОрану (Ь) и в читак тин» контрольны« клетки (с).

Показано, что вклечение ЗН-Тд клатками ХЭТР Выло подавлоно как яри непосредственном контакта клеток, так и при их контакта через мембрану. клетки ХЭТР-НЛН-Р выли слабо чувствительны к рост-ингибируммому действия ХЭФ при непосредственном контакте с ними и при контакта через иембрану. А на шестой день эксперимента включение ЗН-Тд е эти клетки Омло усилено при обоих способах контактирования.

Таким образом, ловидимому, как ингибирут|ий(ие)| так и стимулирушкий'ие) сигнал хэо способны передаваться гуморальным путем.

выводи

t.. Показана способность нормальных эмбриональных фибровлес roa Сирийского хомяка оказывать > различно« степени рост-регупиружяее влияние на нормальны«, иммортаяиэованмые, трансформированные и опухолевые клетки км • контакта о ними, так и г умора; i» но.

>. Эффективность рост-регулируицего действия нормальных эмбриональных фибробластов на ТК и ОК зависит от срока эмбриогенеза, на которой бмяи выделены . Сибровласты: на бале« ранних сроках эмбриогенеза рост-ингивируювий эффект фибробластов вырвяен насколько сильнее.

3. При иммортали з ацни клетки сохраняет сходный с родительскими нормальными клетками максимальный уровень чувствительности к рсст-мигибируэдеиу действия нормальных фмбробпастоа.

4. При трансформации 1n vitro клетки полностьи или частично сохраняет чувствительность к рост-иигнбируя-ему дайствмв нормальных фибробластов, уровень которой зависит от трансформируемого агента« максимальный уровень отмечен у клаток, трансформированных спонтанно Или Бычьим Аденовирусом, средний - у клеток, трансформированных 8V40 п кинимэльиыа у клеток, трансформированных Вирусом Саркомы Рауоа.

0.Чувствительность клаток, трансформированных Вирусом Саркомы Рауса к рост-ннгибируетгэму влиянии нормальных фибробластов коррелирует о уровнем экспрессии в этих клетках ррвО-v-arc.

0.Сведение о клетку онкогенов N-гаа, На-гаа, и вус на меняет чувствительности клеток к рост-регулируздему влиянии нормальных фмгрсвпестов. Введение гена Ьс1-2 заметно снимает чувствительность клеток, а введение мутантной формы гена р53 (по 175- аминокислоте) делает клетки практически резистентными к имгиОирумцему влиянию СаброЗлвсто».

7. Чувствительность отобранных 1n vivo опухолевых клеток одного лроисхоадекия к рост-регулируицему действие нормальных" фибробластов

- 31 -

коррелирует с уровнем их злокачественности: низкая туморогеммость - о »ыооко^ чуаатаительиоотые к имгивмрумцаиу действии фивровлаотее, высок ея туморогечиость - с Воле« низкой чувствительность«« и со способность* постепенно и полностью преодолевать цитостезис, индуцированный фиОроВлестоми.

В. Высокая спонтанная метастатическая активность опухолевых клеток, отобранных 1л vivo коррелирует не только со способность* этих клеток к преодолением цитостазиса, но и е усилением их пролиферативмоА активности ■ присутствии нормальных фивровластов.

СПИСОК ПУВПИКДЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гуров* Е.В. П>давленив и активация пролиферативноА активности опухолевых клеток различной степени злокачественности при контакте о нормальными эмбриональными фиВробластами "Сирийского хомяка. Вмлпегомь Экспериментальной биологии и медицины, 4, 413-410, 1993.

2. Гурова C.B. Различи« в рост-коитролирумцем действии фмбрсвлестов Сирийского хомяка ранних и поздмих сроков эмбриогенезе на опухолевые клетки различной степени злокачественности. вмллетень экспериментальной биологии и медицины, В, 190-193, 1983.

3. Delcheian, Q.I., Ourova.K.V., OyaKova, M.A., Accumulation In "noneel" lunge of 11v* tieeorloenic cell« during eub-cuteneoue growth o* weakly and highly Mtaataelslng tuatoure end their In vitro eene1t1v1ty to growth regulation by no ratal flbroblaate. tnt. J. Cancer, 59, 630-537 (19B4).

4. Гурове E.B. Рост-регулируицее влияние нормальных эмбриональных фиброблаотоа Сирийского хомяка на клетки, трансформированные различными агентами. Доклады Академии Наук,318, (1896).

Б. Qurova К» Influence of normal flbrobleete on 1n v1*.ro proliferation of tumor celle differing In tumorlgenlc end ewtaetatlc act1v1t<M. Invaalon and Meteetaala, eubmltted (19ЯВ)

Участок множительной техника ОНЦ РАМН

Тираж 400 экз.

Заказ 410

Подп. к печати >. 9 6