Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Динамика естественного отбора опухолевых клеток in vivo при локальном росте и диссеминации

На правах рукописи

Дьякова Наталья Анатольевна

ДИНАМИКА ЕСТЕСТВЕННОГО ОТБОРА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК in vivo ПРИ ЛОКАЛЬНОМ РОСТЕ И ДИССЕМИНАЦИИ

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2002г.

Работа выполнена в Российском Онкологическом Научном Цсшрс нм.Н.Н.Блохнна Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Г.И. Дейчмаи

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.Д. Альтштейн

доктор биологических наук М.А. Краснлышков

Ведущая организация:

Научный центр - Институт Иммунологии МЗ РФ

Защита диссертации состоится "_"_2002г. '

и_часов на заседании Специализированного Совета (К.001.17.01)

Российского Онкологического Научного Центра им. Н.П. Бдохина РАМН но адресу 115478, г.Москва, Каширское шоссе, д.24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Российского Онкологического Научного Центра им.Н.Н.Блохина РАМН

Автореферат разослан" 3 " 2002г.

Ученый секретарь специализированного совета,

доктор медицинских наук Ю А.Барсуков

ч. 9.

Рег* _ Э 6 Г>

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Иммунологические взаимоотношения опухолевых клеток с нормальным клеточным микроокружением in vivo включают способность эффекторов системы естественной резистентности хозяина /макрофагов (Мф), нейтрофилов и НК клеток/ распознавать и элиминировать опухолевые клетки. Значительное число трансформированных и опухолевых клеток погибает путем апоптоза, вызванного различными сигналами, в том числе цитотоксической активностью (ЦТА) Мф, НК клеток и нейтрофилов. Очевидно, что для роста in vivo отбираются редкие варианты опухолевых клеток, обладающие различными механизмами выживания in vivo и, в частности, преодоления ЦТА эффекторов системы естественной резистентности хозяина.

По литературным данным отобранные in vivo высокозлокачественные варианты опухолевых клеток по сравнению с их трансформированными in vitro предшественниками демонстрируют увеличение их туморогенной активности, сопровождаемое, или не сопровождаемое спонтанной метастатической активностью, а также ряд других новых характеристик. Среди них важно отметить повышение резистентности опухолевых клеток к цитостатической активности Мф, НК клеток и нейтрофилов.

В лаборатории противоопухолевого иммунитета НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН впервые было показано, что в процессе подкожного роста и прогрессии опухолей in vivo из клеток, исходно трансформированных in vitro, отбираются варианты, обладающие двумя новыми дискретными биохимическими свойствами, существенными для защиты опухолевых клеток против эффекторов системы естественной резистентности. Эти свойства: высокий уровень антиоксидантной, НгОг-катаболизирующей (Н202са) активности и способность к выбросу простагландина Е2 типа (PGES) при контактном сигнале НК клеток, ведущая к подавлению цитотоксической активности НК клеток. Показано, что эти свойства

опухолевых клеток возникают в процессе их отбора in vivo одновременно и экспрессируются как кластер признаков, обозначенный [H202CA+PGES] (далее НР) фенотип. Селективные преимущества опухолевых клеток, связанные с приобретением ими НР-фенотипа, т.е. способности защищаться против эффекторов системы естественной резистентности и обязательный характер приобретения НР-фенотипа в процессе опухолевой прогрессии in vivo, а также его связь с туморогенностыо составляют важные особенности описанного фенотипа (Дейчман и соавт, 1989а,Ь, 1998,2000).

Наш основной подход в настоящих исследованиях состоял в прослеживании процесса опухолевой прогрессии в динамике, начиная с трансформации нормальных клеток Сирийского хомяка in vitro (или in vivo) различными онкогенами или спонтанно, с последующим естественным отбором их потомков in vivo и приобретением ими злокачественного фенотипа. Этот подход позволяет исследовать прогрессию индивидуальных опухолей in vivo и идентифицировать те дискретные изменения опухолевых клеток, которые регулярно возникают при злокачественном их развитии, т.е. вторичные фенотипические изменения опухолевых клеток.

Цель и задачи исследования

Целью данного исследования являлось выявление возможных различий в скорости отбора in vivo опухолевых клеток различной этиологии при их подкожном росте и диссеминации. Впервые для этой цели в качестве функционального маркера был использован НР-фенотип.

В работе были поставлены следующие задачи:

I. Определить скорость отбора in vivo опухолевых клеток, исходно трансформированных или трансдуцированных различными онкогенами.

II. Изучить динамику отбора опухолевых клеток при первичном вирусном канцерогенезе.

III. Сравнить скорость отбора опухолевых клеток при локальном (подкожном) росте и при их естественной и искусственной диссеминации.

Научная новизна

Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о возможности использовать HP-фенотип в качестве биологического маркера определенной, относительно ранней (предметастатической) стадии опухолевой прогрессии. Разработана стандартная схема отбора опухолевых клеток Сирийского хомяка in vivo по HP-фенотипу при их локальном росте и диссеминации.

Впервые показано, что клетки, трансформированные in vitro спонтанно или рядом онкогенов (Ha-ras, myc, р53175, bcl-2), не экспрессиругот HP-фенотип и относительно низко-туморогенны; однако при естественном отборе в условиях локального (подкожного) роста опухоли, варианты этих линий приобретают экспрессию НР-фенотипа. Установлено, что скорость отбора трансформированных клеток in vivo в подкожно растущих опухолевых узлах по HP-фенотипу была одинаковой для большинства исследованных трансформантов и коррелировала с существенным усилением их туморогенной активности.

Также впервые было показано, что при первичном вирусном канцерогенезе, индуцированном вирусами SV40 и SA7(C8) на новорожденных Сирийских хомяках, сроки отбора по HP-фенотипу клеток первичных вирусных опухолей совпадают со сроками отбора in vivo НР-фенотип-экспрессирующих опухолевых клеток, исходно

трансформированных различными агентами in vitro и составляют около 100 (± 20) дней.

Впервые установлено, что скорость возникновения и отбора вариантов опухолевых клеток, экспрессирующих HP-фенотип при их естественной и искусственной диссеминации ускоряется десятикратно. Исключение составляют клетки Ьс1-2-трансформантов, скорость отбора которых при диссеминации, как и в условиях локального роста опухоли, была существенно замедлена.

Практическая ценность

Поставленные в работе задачи носят фундаментальный характер. Разработана стандартная схема отбора опухолевых клеток по НР-маркерному фенотипу при локальном росте опухоли и диссеминации. Полученные на большом материале данные выявляют закономерности и динамику приобретения НР-фенотипа in vivo при трансплантации опухолевых клеток и/или возникновении и прогрессии опухолей различной этиологии. Полученные результаты способствуют лучшему пониманию того, как на разных этапах естественного отбора опухолевых клеток in vivo меняется характер их взаимодействия с эффекторами системы естественной резистентности организма хозяина.

Апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместной научной конференции лабораторий противоопухолевого иммунитета, генетики опухолевых клеток, механизмов регуляции иммунитета и регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ Канцерогенеза POHD РАМН 22 мая 2002 года. Материалы работы докладывались на Русско-Французском Симпозиуме по молекулярной онкологии в Москве (1999), не Ученом Совете НИИ Канцерогенеза в 2001 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей и '. тезисов докладов.

Структура н объем диссертации

Материал диссертации изложен на 87 страницах машинописног текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов методов, результатов собственных исследований, изложенных в 3 глава? обсуждения результатов и выводов. Работа иллюстрирована 8 рисунками 7 таблицами. Библиографический указатель содержит ссылки на 12 литературных источников, из них 21 отечественных и 105 зарубежных.

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы.

Клеточные линии

В работе было исследовано 140 клеточных линий, каждая из которых получена от индивидуального Сирийского хомяка. Некоторые линии клеток были получены в лаборатории противоопухолевого иммунитета НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН ранее, значительная часть получена нами при выполнении данного исследования. Все исследуемые линии после трансформации in vitro и/или естественного отбора in vivo в условиях локального роста или диссеминации поддерживали в виде однослойных культур тканей и сохраняли в жидком азоте.

Вирусы

Для индукции первичных хомячковых опухолей были использованы: wtSV40 - дикий тип вируса SV40, штамм 128 (106'2 Ш50/1.0 ml); исходно вирус был выделен из почек обезьян M.Rhesus в лаборатории противоопухолевого иммунитета РОНЦ РАМН в 1962 г.; SA7(C8) - обезьяний аденовирус 7, штамм С8 (106'5 ID50/1.0 ml) был любезно предоставлен нам проф. А.Д. Альтштейном (Институт Биологии Гена, РАН).

В работе были использованы следующие методы исследования: культивирование клеток in vitro, получение новых клеточных линий при различных способах естественного отбора in vivo (из подкожных опухолевых узлов и из макроскопически нормальной ткани лёгких при естественной и искусственной диссеминации опухолевых клеток) /см. рис. 1/; индукция первичных вирусных опухолей у новорожденных Сирийских хомяков и получение клеточных линий из этих опухолей; определение туморогенной и спонтанной метастатической активности опухолевых клеток методом количественного трансплантационного теста; определение HP-фенотипа, т.е. (1) НгОг-катаболизнрующей активности (Н202СА) опухолевых клеток с использованием реакции лгоминол-зависимой

хемилюминисценции и (2) реакции выброса простагландина Е2 (РОЕ5) опухолевыми клетками при их контакте с НК клетками с помощью биологического теста, разработанного в лаборатории противоопухолевого иммунитета Т.Е. Ключаревой и В.А. Матвеевой.

Рис.1. Схема отбора ш vivo опухолевых клеток (ОК) по НР- фенотип при локальном подкожном росте и диссеминации /естественной и искусственной/

Клетки, трансформированные in vitro

Подкожная прививка

14-[Н,О,"+PGE']~ фенотип

Внутривенное введение ОК /искусственная диссеминация/

Локальный рост п/к опухоли _

Извлечение ОК из подкожного—► опухолевого узла и перенос в культуру ткани

и естественная диссеминация ОК

-<—Извлечение ОК из -

макроскопически нормальной лёгочной ткани и перенос в культуру ткани

Циркуляция ОК в кровотоке

и оседание в лёгких

Определение [Н,0,"+РСЁ'] фенотипа

t

Результаты исследования

Скорость приобретения HP-фенотипа родительскими клетками ХЭТР и их вариантами, трансдуцированными различными онкогенами при локальном (подкожном) росте in vivo

В качестве основных в нашем исследовании были использованы клетки штамма ХЭТР - спонтанно трансформированные in vitro эмбриональные фибробласты Сирийского хомяка. Эти клетки низкотуморогенны, не метастазируют спонтанно, не иммупогенны, не экспрессируют HP-фенотип и высокочувствительны к цитотоксической и цитостатической активности НК клеток и макрофагов.

Родительские клетки прививали группам из 5-6 Сирийских хомяков методом количественного трансплантационного теста. В большинстве случаев через 50-60 дней после прививки животных летально усыпляли (параллельно определяя уровень туморогенной (ТГА) и спонтанной метастатической активности (СМА)). Выделенные из опухолевых узлов клетки переносили для культивирования in vitro, которые затем исследовали на экспрессию HP-фенотипа. Полученные таким образом вариантные клеточные линии, обозначенные 1ПК- (после 1 цикла отбора in vivo в условиях подкожного роста опухоли) вновь количественно прививали животным и после 2-х /или более/ циклов отбора in vivo получали новые линии, соответственно обозначенные /рис. 1./.

Было показано, что после 1 цикла отбора in vivo в течение 55-69 дней п/к роста опухоли ни одна из 7 полученных вариантных клеточных линий ХЭТР не экспрессировала HP-фенотип, хотя отмечено некоторое усиление ТГА и СМА в 2-х линиях. Однако, после двух циклов отбора in vivo (после 103 - 132 дней суммарного роста п/к опухоли) все 7 вариантных клеточных линий (2ПК) экспрессировали HP-фенотип, были на 1-2 порядка более туморогенны и несколько более активны метастатически, по сравнению с родительскими клетками ХЭТР /Табл.1./.

Таблица 1. Отбор по НР-фенотипу н туморогенной активности вариантов клеток ХЭТР при подкожном росте опухоли

Название линий Экспрессия НР-фенотнпа Рост in vivo /дни/ ТГА* /в IgTrDso/ СМА**

ХЭТР /родительские/ — 0 3.4 —

ХЭТР-1ПК- - (0/7) 55-69 1.8-3.4 ±

ХЭТР-2ПК- + (7/7) 103 -129 1.5-2.2 +

* - приведены минимальные и максимальные значения ТГА для данной группы исследуемых линий;

** - приведены средние значения СМА для данной группы линий.

Поскольку клетки ХЭТР являются спонтанно-трансформированными in vitro, было интересно проверить, повлияет ли трансдукция клеток ХЭТР некоторыми известными онкогенами на экспрессию HP-фенотипа? Ранее в лаборатории противоопухолевого иммунитета было показано, что хомячьи эмбриональные фибробласты при трансформации in vitro вирусом саркомы Рауса приобретают /без отбора in vivo/ экспрессию НР-фенотипа, коррелирующего с высоким уровнем туморогенной, экспериментальной и спонтанной метастатической активностей (Дейчман и Кашлева, 1987).

Для исследования этого вопроса нами были использованы трансдуценты клеток ХЭТР генами Ha-ras, шус, р53175 и bcl-2, полученные М.А. Никифоровым и A.B. Гудковым (Иллинойский университет, Чикаго), а также их варианты, полученные при стандартных циклах отбора in vivo в подкожных опухолевых узлах. Всего в данном разделе работы было исследовано 77 вариантных линий опухолевых клеток. Итоговые результаты представлены на рис. 2.

Рис.2. Трансформирующие гены и приобретение НР-фенотипа при локальном (подкожном) росте опухолей

v-src ? (ХЭТР) Ha-ras myc р53175 bcl-2

О

шж

тп п~1

I (60) II (100) III (140) IV (180) V (210) Циклы отбора in vivo (дни)

]- низкий уровень ТГА п отсутствие экспрессии НР-фенотнпа; - Экспрессия HP-фенотипа; ЕЗ - ТГА (х50 - 150); СМА

Показано, что в отличие от v-src-транеформантов ни одна из исследованных родительских линий ХЭТР не приобрела в процессе трансдукции in vitro онкогенами Ha-ras, myc, р53175 и bcl-2 экспрессию НР-фенотипа и не отличалась существенно по уровню ТГА и СМА от родительских клеток ХЭТР.

При 1-ом цикле отбора in vivo также ни один из вариантов исследованных трансдуцентов ХЭТР не приобрел экспрессию НР-фенотипа. Однако при втором цикле отбора почти все варианты ХЭТР-трансдуцентов Ha-ras, myc и р53175 приобретали экспрессию НР-фенотипа. Таким образом, скорость отбора ХЭТР-трансдуцентов по HP-фенотипу in vivo совпадала со скоростью отбора родительских клеток ХЭТР (100 ± 20

дней in vivo), что коррелировало с усилением туморогенности этих линий, иногда сопровождаемой спонтанной метастатической активностью; несколько более ранняя экспрессия СМА показана для некоторых из отобранных in vivo вариантов ХЭТР-р53175.

Однако, отбор in vivo ХЭТР-Ьс1-2-трансдуцентов был существенно задержан и экспрессия НР-фенотипа, как и существенное усиление ТГА (и СМА) были выявлены нами лишь после 4-х циклов отбора in vivo (примерно 180-200 дней их п/к роста). Характерным для этих клеток было сохранение почти одинакового уровня туморогенности на протяжении трёх циклов отбора (т.е. примерно 140 дней п/к роста ОК), который резко вырос у большинства исследованных вариантов после 4-х циклов отбора in vivo. Один из этих вариантов, проведенный ещё в одном (5-ом) цикле отбора in vivo, обладал высоким уровнем СМА.

Таким образом было установлено, что экспрессия НР-фенотипа не связана с трансформирующей активностью таких онкогенов, как ras, myc, р53, но является закономерным вторичным изменением фенотипа этих трансформантов в условиях их локального (подкожного) роста in vivo.

Для объяснения существенной задержки в прогрессии in vivo опухолевых клеток, экспрессирующих ген bcl-2, могут быть рассмотрены следующие возможности, связанные с антиапоптозной активностью этого гена: клетки, экспрессирующие bcl-2, обладают определенным селективным преимуществом in vivo, а редко возникающие в клеточной популяции при отборе in vivo варианты клеток, экспрессирующих НР-фепотип также обладают селективным преимуществом. В этом случае последние имеют мало шансов для отбора in vivo, поскольку первые исходно доминируют в данной клеточной популяции; т.е. происходит так называемая «селективная' конкуренция». Если в условиях отбора in vivo селективные преимущества редких вариантов клеток, экспрессирующих НР-фенотип выше, чем преимущества, связанные с экспрессией bcl-2, то клетки, экспрессирующие НР-фенотип, будут постепенно вытеснять родительские клетки и доминировать в клеточной популяции. Нельзя исключить и другие

возможности; например, постепенное снижение экспрессии гена bcl-2 при росте опухолевых клеток in vivo; соответственно возрастает шанс для появления и отбора вариантов, экспрессирующих НР-фенотип. При реализации любой из этих возможностей экспрессия гена bcl-2 повидимому препятствует отбору клеток, экспрессирующих НР-фенотип и таким образом задерживает прогрессию опухоли in vivo.

Отбор опухолевых клеток по НР-фепотипу при первичном вирусном канцерогенезе

В связи с полученными данными естественно возникал вопрос: предсуществуют ли варианты, экспрессирующие НР-фенотип в популяции родительских, трансформированных in vitro клеток? В этом случае в процессе прогрессии опухоли in vivo в силу своих селективных преимуществ они начинают доминировать в популяции. В ином случае экспрессия НР-фенотипа может представлять собой новое свойство, приобретаемое трансформированными клетками в условиях их роста и естественного отбора in vivo. Для ответа на эти вопросы мы провели исследования с линиями опухолевых клеток, полученными из первичных внрус-индуцированных опухолей. В таких условиях опухолевый процесс начинается с заражения и трансформации нормальных клеток новорожденных животных онкогенным вирусом in vivo и последующим появлением, как правило, моноклональных опухолей.

Для индукции первичных опухолей в этом исследовании нами были использованы вирус wtSV40 и обезьяний аденовирус SA7(C8). Препараты этих вирусов вводили Сирийским хомякам в первые сутки после рождения подкожно в объёме 0.2 мл. Животных регулярно осматривали и пальпировали, регистрировали точную дату появления опухолей, а затем через 10-20 дней после возникновения пальпируемых опухолевых узлов животных усыпляли, опухоли извлекали, по стандартной методике получали клеточные линии и исследовали на экспрессию НР-фенотипа и туморогеннуго активность. Полученные результаты представлены в Таблице 2.

Таблица 2. Приобретение НР-фенотипа опухолевыми клетками при первичном вирусном канцерогенезе

Оиковнрусы /онкогены/ Число исследованных опухолей Латентный период /дни/* Экспрессия НР-феиотипа ТГА* /IgTrDs»/

SA7 (С8) 8 24-45 — 3.5-4.6

/Е1 а,Ь/ 1 110 + 2.5

SV40 7 140->300 + 1.5-2.2

/LT SV40/

* Даны минимальное - максимальное значения для данной группы опухолей

Показано, что все исследованные нами первичные опухоли wtSV40, возникшие после длительного (140->300 дней) латентного периода экспрессировали НР-фенотип и высокий уровень ТГА. В отличие от них, большинство первичных SA7(C8) опухолей, которые возникли после существенно более короткого латентного периода (24-45 дней), не экспрессировали НР-фенотип и были примерно на 2 порядка менее туморогенны. Лишь одна из полученных опухолей SA7(C8), возникшая через 110 дней после введения вируса, экспрессировала НР-фенотип (а также имела более высокий уровень ТГА).

Возникло предположение, что в конце латентных периодов ранних SA7(C8) первичных опухолей или вскоре после их возникновения, единичные опухолевые клетки в первичных опухолевых узлах экспрессировали НР-фенотип, но не могли быть обнаружены, поскольку для доминирования их в общей популяции опухолевых клеток этого времени было недостаточно. Это предположение было подтверждено, когда 4 из числа ранних опухолей SA7(C8) были привиты животным, что позволило увеличить суммарное время их отбора до 100-120 дней in vivo /Таблица 3/.

Таблица 3. Продолжительность роста in vivo опухолей SA7(C8) и приобретение ими экспрессии НР-фенотипа

Название Рост Дополнительный Общее Экспрессия.

лшши первичных цикл отбора число НР-

опухолей /дни/ дней фенотипа

in vivo in vivo

/дни/

SA7-41 /род./ 39 (24)* - 39 —

inK-SA7-41a - 62 101 +

inK-SA7-416 - 62 101 +

SA7-43 /род./ 42 (31) - 42 —

iniC-SA7-43 - 62 104 +

SA7-52 /род./ 42 (26) - 42 —

inK-SA7-52a - 62 104 +

inK-SA7-526 - 62 104 +

SA7-56 /род./ 59 (45) - 59 —

inK-SA7-56 - 62 121 +

* В скобках - латентный период в днях.

Все полученные таким образом варианты опухолевых клеток после 100-120 дней in vivo экспрессировали HP-фенотип и были примерно в 10 раз более туморогенны.

Таким образом, сроки приобретения НР-фенотипа клетками индивидуальных SA7(C8) и БУ40-индуцированных первичных опухолей позволили приблизительно определить минимальное время, необходимое для их отбора in vivo по HP-фенотипу в п/к опухолевых узлах. Это время совпадает с отбором НР+ вариантов клеток, исходно трансформированных in vitro, и составляет 100 (±20) дней роста в п/к опухолевых узлах.

В отличие от роста в культуре ткани клеток, трансформированных in vitro, возникновение первичных моноклональных опухолей in vivo, как правило, представляет собой многоступенчатый процесс, включающий трансформацию клеток, возникновение и отбор новых вариантов опухолевых клеток, обладающих определенными селективными преимуществами для роста in vivo (исключением из этого правила является одноступенчатый тип канцерогенеза, обусловленный вирусом саркомы Рауса). Данные, полученные при исследовании первичного SA7(C8) и SV40 канцерогенеза показали, что процесс возникновения и отбора вариантов клеток, экспрессирующих НР-фенотип начинается ещё во время латентного периода и, при достаточной его продолжительности, может быть завершен до его окончания. Моноклональный, как правило, характер возникающих in vivo первичных опухолей свидетельствует в пользу того, что появление НР-фенотип-экспрессирующих вариантов клеток сопровождается жестким отбором, сохраняющим лишь единичные опухолевые клетки, обладающие определенными селективными преимуществами in vivo.

Скорость отбора in vivo по НР-фенотипу клеток ХЭТР и ХЭТР-трапсдуцеитов при диссеминации (естественной и искусственной)

Далее в наших исследованиях возник следующий, вопрос: сколь эффективным будет отбор по НР-фенотипу при диссеминации опухолевых клеток in vivo? Как известно, прививочная доза опухолевых клеток может сильно варьировать от одной линии к другой и пропорция клеток, дающих рост опухоли составляет, как правило, не менее 10%. Гибель опухолевых клеток существенно возрастает при их внутривенном введении: литературные данные и данные нашей лаборатории свидетельствуют, что при внутривенном введении опухолевых клеток, меченых 125IUDR, как правило, выживает не более 0,1-0,01% введенных опухолевых клеток, причем их гибель начинается и достигает пика уже в первые часы после введения. Это означает, что уровень селективного давления на клеточную популяцию in vivo при локальном росте опухоли и при диссеминации может существенно различаться.

Для исследования этого вопроса нами были использованы 2 модели диссеминации (естественная и искусственная). Как известно, естественная диссеминация опухолевых клеток происходит постоянно из опухолевого узла, растущего подкожно, в течение всего срока роста опухолей, в то время как искусственная диссеминация осуществляется путем, как правило, однократного введения внутривенно большой дозы опухолевых клеток. В этом разделе работы мы использовали стандартную схему отбора опухолевых ¡меток при их диссеминации (естественной и искусственной) и выделения линий опухолевых клеток из макроскопически нормальной легочной ткани (рис. I.)

На модели естественной диссеминации в качестве родительских были использованы клетки ХЭТР и ХЭТР-Ha-ras. Сирийским хомякам прививали подкожно родительские клеточные линии, через 40 — 70 дней животных усыпляли, стерильно извлекали легочную ткань /свободную от видимых метастазов/, механически её измельчали, выделяли опухолевые клетки и переводили в культуру ткани, получая таким образом новые линии опухолевых клеток от индивидуальных животных; затем эти линии исследовали на экспрессию HP-фенотипа в тестах in vitro и на ТГА в тестах in vivo. Результаты приведены на рис.3.

Показано, что у животных - носителей подкожных опухолей, НР-фенотип-экспрессиругощие (НР+) варианты опухолевых клеток при естественной диссеминации в легкие появляются раньше, чем в подкожных опухолевых узлах. На сроках 50-70 дней подкожного роста опухоли in vivo ни один из 7-ми полученных вариантов клеток ХЭТР не экспрессировал HP-фенотип, в то время как 4 из 7 линий, выделенные из макроскопически нормальных легких животных - носителей подкожных опухолей ХЭТР на тех же сроках экспрессировали НР-фенотип.

Сходные результаты были получены и для клеток ХЭТР-Ha-ras. Ни один из 7-ми вариантов опухолевых клеток при росте в п/к опухолевом узле до 70 дней не был отобран по экспрессии HP-фенотипа, однако при

естественной днссеминации в легкие на этих сроках вариантов, экспрессиругощих НР-фенотип было 3/4 (рис.3.).

Рис. 3. Приобретение НР-фенотипа вариантами ХЭТР н ХЭТР-Ha-ras при подкожном росте и естественной днссеминации in vivo

О 10 20 30 40 50 60 70

На модели искусственной диссеминации имеется возможность более точно оценить скорость отбора опухолевых клеток по НР-фенотипу, поскольку после однократного внутривенного введения опухолевых клеток, они могут быть извлечены из ткани легких в любые сроки. В данной серии опытов группам Сирийских хомяков были введены внутривенно в ретроорбитальный венозный синус большие дозы родительских клеток ХЭТР и ХЭТР-Ьс1-2 (2.0-4.0x106/хом.). Через 5, 10, 15, 20 и 28 дней группы из 5-ти животных были усыплены, легочная ткань стерильно извлечена и подвергнута процедуре получения клеточных линий от индивидуальных животных (рис.1). Полученные результаты представлены на рис. 4 и 5.

Клетки ХЭТР-Ьс1-2 представляли особый интерес, поскольку ранее нами было показано, что отбор вариантов Ьс1-2 по НР-фенотипу при локальном росте опухоли чрезвычайно замедлен по сравнению с вариантами ХЭТР и другими ХЭТР-трансдуцентами.

Как видно из представленных данных, уже через б дней после внутривенного введения родительских клеток ХЭТР клетки одного из пяти полученных вариантов экспрессировали НР-фенотип. Через 10 и 15 дней после внутривенного введения, количество таких НР+ вариантов возрастает суммарно до 7 из 9-ти.

В отличие от клеток ХЭТР, ни один из 14 вариантов ХЭТР-Ьс1-2, извлеченный из легочной ткани на аналогичных, и далее больших сроках после внутривенного введения (5-28 дней пребывания в легких), не экспрессировал НР-фенотип, свидетельствуя таким образом о существенной задержке отбора НР+ вариантов клеток ХЭТР-Ьс1-2 при диссеминации.

Экспрессирующие НР-фенотип варианты ХЭТР были примерно в 5-10 раз более туморогенны, по сравнению с вариантами, не экспрессирующимн НР-фенотип, полученными в те же сроки после внутривенного введения. В отличие от вариантов ХЭТР, туморогенность вариантов ХЭТР-Ьс1-2 оставалась низкой на протяжении всего периода их отбора (5 - 28 дней) в условиях искусственной диссеминации.

Рис.4. Динамика отбора вариантов ХЭТР н ХЭТР-Ьс1-2 по НР-фенотнпу при искусственной диссеминации in vivo

ХЭТР J

ХЭТР-bcl-2

□ - НР фенотип

10 16 20

Дни i n vivo >+

- НР фенотип

Суммарные данные по скорости отбора in vivo клеток ХЭТР и ХЭТР-bcl-2 при различных типах отбора опухолевых клеток в организме представлены на рисунке 5. Как видно из представленных данных первые варианты линии ХЭТР, экспрессирующие НР-фенотип при искусственной диссеминации появляются уже через 6 дней и они доминируют среди вариантов опухолевых клеток, изолированных через 15 дней после внутривенного введения родительских клеток. При п/к росте опухолей варианты клеток ХЭТР, экспрессирующие НР-фенотип, были обнаружены только через 103 - 132 дня. При исследовании в период 51-70 дней п/к роста опухоли естественно-диссеминированных в ткань легких вариантов ХЭТР, 4 из 7-ми полученных «легочных» вариантов экспрессировали НР-фенотип, опережая, таким образом, скорость отбора таких вариантов в подкожных опухолевых узлах на 30-50 или более дней.

Совершенно иные результаты были получены при работе с клетками ХЭТР-Ьс1-2. В отличие от других исследованных нами трансформантов, варианты ХЭТР-Ьс1-2, экспрессирующие НР-фенотнп, были обнаружены только после 180-200 дней их п/к роста in vivo. Как видно из представленных данных, существенное замедление отбора НР+-вариантов клеток ХЭТР-Ьс1-2 по сравнению с клетками ХЭТР, происходит таюке и при искусственной диссеминации этих клеток в легкие (рис. 4. и 5.).

Сопоставление данных по скорости отбора опухолевых клеток линий ХЭТР и ХЭТР-Ьс1-2 в условиях локального роста и диссеминации свидетельствует в пользу того, что ускорение прогрессии осуществляется в условиях массовой гибели опухолевых клеток, в то время как выживание клеток при подавлении их апоптоза, как это имеет место в случае клеток ХЭТР-Ьс1-2, возможно является препятствием для возникновения и/или отбора НР+ вариантов. Возможно, что при диссеминации трансформированных клеток и их массовой гибели такое ускорение естественного отбора редких вариантов опухолевых клеток in vivo, является важным компонентом метастатического процесса.

Рис.5. Скорость отбора по НР+-фенотнпу вариантов клеток ХЭТР и ХЭТР-Ьс1-2 при локальном росте и диссеминации

Дни in vivo 225

200

175 -150

125 100 75 50

АЛ* Д°Д°Д°Д Л

30 -20 --

□ ИМ

■□ПР □

даааА А

Д Д-Д

д д

д д д д

□ □ □

па о □апааап

ХЭТР

ХЭТР-Ьс1-2

Обозначения: клетки вариантных линий, изолированные из:

▲

Д

подкожных опухолей:

ткани легких при естественной диссеминации: ткани легких при искусственной диссеминации:

О ■

□

НР+ HP" НР+ HP" НР+ HP"

В целом, полученные нами данные позволили впервые объективно оценить и показать различия в скорости прогрессии in vivo опухолевых клеток различного происхождения в условиях их локального роста и диссеминации.

ВЫВОДЫ:

(1) Показана возможность использования в качестве маркера ранней /предметастатической/ стадии опухолевой прогрессии in vivo ранее описанного в лаборатории HP-фенотипа, закономерно приобретаемого опухолевыми клетками in vivo. Разработана стандартная схема отбора опухолевых клеток Сирийского хомяка in vivo по HP-фенотипу при их локальном росте и диссеминации;

(2) Впервые показано, что в процессе трансформации клеток in vitro, спонтанной или вызванной онкогенами Ha-ras, myc, р53175 и bcl-2 они не приобретают экспрессию HP-фенотипа; однако их рост in vivo сопровождается естественным отбором клеточных вариантов, экспрессирующих НР-фенотип;

(3) Установлено, что скорость отбора опухолевых клеток в подкожно растущих опухолевых узлах по HP-фенотипу была одинаковой для большинства исследованных трансформантов и коррелировала с существенным усилением их туморогенной активности. Исключением явились клетки Ьс1-2-трансформантов, скорость отбора которых по НР-фенотипу, как и по туморогенности, была существенно замедлена;

(4) Впервые показано, что при первичном вирусном канцерогенезе индуцированном вирусами SV40 и SA7(C8) на новорожденных Сирийских хомяках, возникновение и отбор вариантов опухолевых клеток, экспрессирующих НР-фенотип происходят во время латентного периода. Этот процесс может быть завершен к моменту появления пальпируемой опухоли. Минимальные сроки отбора по НР-фенотипу клеток исследованных первичных вирусных опухолей совпадают со сроками отбора in vivo НР-фенотип-экспрессирующих опухолевых клеток, исходно трансформированных различными агентами in vitro;

(5) Показано, что скорость возникновения и отбора вариантов опухолевых клеток, экспрессирующих HP-фенотип при их естественной и искусственной диссеминации ускоряется десятикратно; исключение составляют клетки Ьс1-2-трансформантов, скорость отбора которых при диссеминации, как и в условиях локального роста опухоли, существенно замедлена. Рассматривается связь такого замедления с антиапоптозной активностью продукта гена bcl-2.

Список публикаций по теме диссертации

1. Deichman G.I., Gurova E.V., Dyakova N.A. Spontaneous dissemination of low-metastatic and highly-metastatic sarcoma cells and their growth regulation by normal cellular environment XXIst Meeting of ISOBM, Jerusalem, Israel, November 7-11, 1993 p.61

2. Deichman G.I., Gurova K.V., Dyakova N.A. Accumulation in the "normal" lungs of live tumorigenic cells during subcutaneous growth of weakly and highly metastasizing tumors and their susceptibility to growth regulation by normal fibroblasts. Int.J.Cancer, 59, 530-537 (1994)

3. Deichman G.I., Kashkina L.M., Mezenina O.A., Gorojanskaya E.G., Nikiforov M.A., Gudkov A.V., Dyakova N.A., Komelkov A.V., Prilutskaya M.O., Tatosyan A.G. Mechanisms of unusually high antioxidant activity of RSV-SR transformed cells and of its suppression by activated p21. Int.J.Cancer, 66, 747-752 (1996)

4. Дейчман Г.И., Ключарева Т.Е., Матвеева В.А., Кашкина Л.М., Дьякова Н.А., Уварова Э.Н., Горожанская Э.Г., Бурделя Л.Г., Никифоров М.А., Гудков А.В. Влияние трансформирующих генов на эффективность отбора in vivo злокачественных вариантов опухолевых клеток Материалы съезда онкологов стран СНГ, Москва, стр.137 (1996)

5. Deichman G., Matveeva V., Kashkina L., Dyakova N., Uvarova E., Nikiforov M., Gudkov A. The rate of in vivo tumor progression is

significantly delayed by bcl-2 gene" XXV ISOBM Meeting Switzerland, September 1997, abstr. N 079, p.48

6. Deicliinan G.I., Matveeva V.A., Kashkina L.M., Dyakova N.A., Uvarova E.N., Nikiforov M.A., Gudkov A.V. Cell transforming genes and tumor progression: in vivo unified phenotypic secondary cell changes. Int.J.Cancer, 75, 2, 277-283 (1998)

7. Deichman G.I., Dyakova N.A., Matveeva V.A., Kashkina L.M., Uvarova E.N. [H202CA+PGEs] phenotype of tumor cells as a marker of the definite stage of in vivo tumor progression Tumor Biology, 19, S2, p.52 (1998) XXVI ISOBM Meeting Sweden, September 1998, abstr.N 080

8. Deichman G.I., Dyakova N.A., Kashkina L.M., Matveeva V.A., Uvarova E.N. In vivo acquired mechanisms of tumor cells local defense against the host innate immunity effectors: implication in specific antitumor immunity. Immunology Letters, 70, 37-42 (1999)

9. Deichman G.I., Dyakova N.A., Kashkina L.M., Matveeva V.A., Uvarova E.N. Effectiveness of tumor cells in vivo elimination by the host innate and adaptive immunity: determining role of in vivo acquired local defense mechanisms of tumor cells. Tumor Biology, 20 (S2), 78 (1999) XXVII ISOBM Meeting Japan, October 1999, abstr. P-37

10.Deichman G.I., Dyakova N.A., Kashkina L.M., Matveeva V.A., Uvarova E.N. The fingerprints of the host innate immunity on the cells of primary virus-induced tumors. Immunology Letters, 75 (3), 209-214 (2001)

П.Дьякова H.A., Кашкина JI.M., Матвеева B.A., Уварова Э.Н., Дейчман Г.И. Динамика естественного отбора опухолевых клеток по маркерному [H202CA+PGEs] фенотипу при подкожном росте и при диссеминации ДАН, 378 (2), 269-272 (2001)

12.Дейчман Г.И., Кашкина Л.М., Матвеева В.А., Дьякова Н.А., Уварова Э.Н. Фенотипические различия между трансформированными in vitro и опухолевыми клетками: ранние стадии естественного отбора in vivo Вестник РОНЦ (юбилейный выпуск), 3, 16-24 (2001)

Термин «прогрессия опухоли», впервые использованный в 1935г. Пейтоном Раусом для описания процесса развития опухолей «от плохого к худшему» подразумевает ряд изменений злокачественных свойств опухолевых клеток, возникающих при их росте in vivo. Анализ этого процесса в работах Фулдса (1954) свидетельствовал о независимости развития признаков прогрессии, в частности таких, как усиление туморогенной (ТГА) и возникновение спонтанной метастатической активностей (СМА), снижение гормонозависимости (для гормонозависимых опухолей) и изменения в уровне дифференцировки. Ни один из этих признаков не является дискретным, и каждый представляет сложную многокомпонентную систему, варьирующую качественно и количественно. Было установлено, что процесс канцерогенеза носит многоступенчатый характер и связан с возникновением и накоплением различных мутаций, в т.ч. обеспечивающих редкие варианты опухолевых клеток (ОК) селективными преимуществами для выживания и роста in vivo.

Исследования процесса канцерогенеза в последние 20 лет были в основном сосредоточены на определении роли онкогенов, генов-супрессорог, и генов, участвующих в репарациях ДНК и регуляции апоптоза при опухолевой трансформации нормальных клеток. Меньшее внимание было уделено исследованию процесса отбора злокачественных вариантов опухолевых клеток in vivo, дискретных характеристик, которые определяют их селективные преимущества in vivo и роли эффекторов противоопухолевого иммунитета в этом процессе. Очевидно, что проблема взаимоотношений опухолевых клеток с системой противоопухолевого иммунитета организма хозяина включает следующие основные аспекты: (1) защита хозяина, т.е. механизмы распознавания и элиминации мутантных, трансформированных и опухолевых клеток эффекторами системы врожденного противоопухолевого иммунитета (и специфического противоопухолевого иммунитета в случае антигенных опухолей); (2) механизмы защиты трансформированных и опухолевых клеток против эффекторов системы врожденного противоопухолевого иммунитета; (3) влияние селективного давления врожденного и специфического противоопухолевого иммунитета хозяина на прогрессию опухоли.

Иммунологические взаимоотношения опухолевых клеток с нормальным клеточным микроокружением in vivo основаны на способности эффекторов системы естественного иммунитета хозяина /макрофагов (Мф), дендритных клеток, нейтрофилов и НК клеток/ распознавать и элиминировать опухолевые клетки. При этом значительное число трансформированных клеток погибает путем апоптоза, вызванного различными сигналами, в том числе цитотоксической активностью (ЦТА) этих эффекторов. Моноклональный характер первичных опухолей свидетельствует о том, что для роста in vivo отбираются редкие варианты опухолевых клеток, обладающие (в числе других) различными механизмами преодоления ЦТА эффекторов системы естественного иммунитета хозяина.

Исследование отобранных in vivo высоко-злокачественных вариантов опухолевых клеток по сравнению с их трансформированными in vitro предшественниками демонстрирует усиление туморогенной активности (ТГА), сопровождаемое, или не сопровождаемое спонтанной метастатической активностью (СМА), а также ряд других новых характеристик. Среди них важно отметить повышение резистентности опухолевых клеток к цитотоксической активности макрофагов, НК клеток и нейтрофилов.

Механизмы защиты опухолевых клеток против эффекторов системы естественного иммунитета хозяина и их роль в выживании опухолевых клеток in vivo, естественном отборе и прогрессии опухолей являются областью основных интересов и экспериментальных исследований лаборатории противоопухолевого иммунитета НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН на протяжении более 20 последних лет. В ходе исследования этих вопросов были получены данные о дискретных фенотипических отличиях /маркерах/, закономерно приобретаемых опухолевыми клетками при отборе in vivo по сравнению с их предшественниками /клетками, трансформированными in vitro/, не проходившими отбора in vivo. Основной подход в этих исследованиях состоял в прослеживании процесса опухолевой прогрессии, начиная с трансформации нормальных клеток Сирийского хомяка in vitro (или in vivo) различными онкогенами, онкогенными вирусами или спонтанно, с последующим естественным отбором их потомков in vivo и приобретением ими злокачественного фенотипа. Этот подход позволяет исследовать прогрессию индивидуальных опухолей in vivo в динамике и идентифицировать те дискретные изменения опухолевых клеток, которые регулярно возникают при злокачественном их развитии, т.е. вторичные фенотипические изменения опухолевых клеток, характерные для прогрессии опухоли. Так впервые было обнаружено, что в процессе подкожного роста и прогрессии опухолей in vivo из клеток, исходно трансформированных in vitro, регулярно отбираются варианты, обладающие двумя новыми дискретными биохимическими свойствами, существенными для защиты опухолевых клеток против эффекторов системы естественной резистентности. Эти свойства: (1) высокий уровень антиоксидантной, Н202-катаболизирующей активности (Н202СА), позволяющей клеткам нейтрализовать повреждающее воздействие реактивных форм кислорода, продуцируемых Мф; и (2) способность к выбросу простагландина Е2 типа (PGES) при контактном сигнале НК клеток, ведущему к подавлению ЦТА НК клеток. Показано, что эти свойства опухолевых клеток возникают в процессе их отбора in vivo одновременно и экспрессируются как кластер признаков, лд о обозначенный [Н202 +PGE ]-фенотип (сокращенно - HP-фенотип) (Deichman et al., 1989а).

Полученные данные свидетельствовали о возможности использовать НР-фенотип в качестве маркера определенной, относительно ранней (предметастатической) стадии опухолевой прогрессии. Исключительные селективные преимущества опухолевых клеток, связанные с приобретением ими HP-фенотипа, т.е. способности защищаться против эффекторов системы естественной резистентности, обязательный характер приобретения этих свойств в процессе опухолевой прогрессии и связь с туморогенностью, составляют уникальность описанного фенотипа по сравнению со многими другими вторичными изменениями опухолевых клеток, возникающими в процессе опухолевой прогрессии in vivo.

Целью нашей работы являлось определение скорости отбора in vivo опухолевых клеток различной этиологии /первичных и перевиваемых/ при их подкожном росте и диссеминации, используя в качестве маркера НР-фенотип.

При выполнении данной работы мы поставили перед собой следующие задачи:

1) определение скорости отбора in vivo по НР-фенотипу опухолевых клеток, трансдуцированных различными онкогенами;

2) изучение динамики естественного отбора опухолевых клеток при первичном вирусном канцерогенезе;

3) сравнение скорости отбора опухолевых клеток при подкожном росте и при их естественной и искусственной диссеминации.

Полученные результаты могут способствовать лучшему пониманию мало изученного вопроса о динамике процесса отбора при прогрессии опухолевых клеток in vivo в условиях их локального роста и диссеминации.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В ДИССЕРТАЦИИ

ОК - опухолевые клетки;

ТГА - туморогенная активность;

СМА - спонтанная метастатическая активность;

ЭМА - экспериментальная метастатическая активность; в/в - внутривенный; и/к - подкожный;

Мф - макрофаги;

НК-клетки - натуральные (естественные) киллеры; ЦТА - цитостатическая активность; ЦТД - цитотоксическое действие; 125ПЛЖ - 125йоддезоксиуридин;

Н202СА - катаболизирующая перекись водорода активность опухолевых клеток; Н202к - резистентность опухолевых клеток к перекиси водорода; о

РОЕ - способность опухолевых клеток к выбросу простагландина Е2; НР-фенотип - [Н202са+РСЕ8]-фенотип

I. ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

ВЫВОДЫ:

Показана возможность использования в качестве маркера ранней /предметастатической/ стадии опухолевой прогрессии in vivo ранее описанного в лаборатории HP-фенотипа, закономерно приобретаемого опухолевыми клетками in vivo. Разработана стандартная схема отбора опухолевых клеток Сирийского хомяка in vivo по HP-фенотипу при их локальном росте и диссеминации;

Впервые показано, что в процессе трансформации клеток in vitro, спонтанной или вызванной онкогенами Ha-ras, myc, р53175 и bcl-2, они не приобретают экспрессию HP-фенотипа; однако их рост in vivo сопровождается естественным отбором клеточных вариантов, экспрессирующих НР-фенотип; Установлено, что скорость отбора трансформированных клеток in vivo в подкожно растущих опухолевых узлах по HP-фенотипу была одинаковой для большинства исследованных трансформантов и коррелировала с существенным усилением их туморогенной активности. Исключением явились клетки Ьс1-2-трансформантов, скорость отбора которых по HP-фенотипу, как и по туморогенности, была существенно замедлена;

Впервые показано, что при первичном вирусном канцерогенезе индуцированном вирусами SV40 и SA7(C8) на новорожденных Сирийских хомяках, возникновение и отбор вариантов опухолевых клеток, экспрессирующих НР-фенотип, происходят во время латентного периода. Этот процесс может быть завершен к моменту появления пальпируемой опухоли. Минимальные сроки отбора по HP-фенотипу клеток исследованных первичных вирусных опухолей совпадают со сроками отбора in vivo НР-фенотип-экспрессирующих опухолевых клеток, исходно трансформированных различными агентами in vitro;

Показано, что скорость возникновения и отбора вариантов опухолевых клеток, экспрессирующих НР-фенотип, при их естественной и искусственной диссеминации ускоряется десятикратно; исключение составляют клетки bcl-2-трансформантов, скорость отбора которых при диссеминации, как и в условиях локального роста опухоли, существенно замедлена. Рассматривается связь такого замедления с антиапоптозной активностью продукта гена bcl-2.