Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль белков теплового шока HSP90 и HSP27 в дизрегуляции митохондриального пути апоптоза опухолевых клеток

Ни правах рукописи

005012439

МАРОШКИНА Анна Николаевна

РОЛЬ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА Н8Р90 И Н8Р27 В ДИЗРЕГУЛЯЦИИ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ПУТИ АПОПТОЗА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

14.03.03 - патологическая физиология 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 2 Ш

Томск-2012

005012439

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Томск).

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских паук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры биохимии и молекулярной биологии ГБОУ ВПО СибГМУ

Минздравсонразвития России Федорова Татьяна Сергеевна

доктор медицинских наук, заведующий лабораторией нейробиологии ФГБУ

«11ИИГ13» СО РАМП Солонский Анатолий Владимирович

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф.Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Красноярск).

Рязанцева Наталья Владимировна Зима Анастасия Павловна

Защита состоится иШ^О" 2012 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.096.01 Сибирского государственного медицинского университета (634050, г. Томск, Московский тракт, д. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсонразвития РФ

Автореферат разослан «¿У*» ^кЗуюдЛ 2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета

И.В. Петрова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По данным ВОЗ смертность в мире ог злокачественных новообразований занимает второе место после сердечнососудистых заболеваний [Чиссова В.И. и соавт., 2011]. Несмотря на то, что в последние годы отмечаются определенные успехи в лечении онкологических больных, противоопухолевая терапия не является совершенной и имеет множество побочных действий. Общеизвестно, что идеальным лекарством будет то, которое уничтожит опухолевые клетки, не повреждая при этом клетки нормальной ткани. Такое средство должно действовать на молекулярные мишени, приводя к остановке пролиферации раковых клеток и/или инициации программированной клеточной гибели.

В настоящее время актуальным направлением медицины является исследование молекулярных механизмов модуляции апопгоза как основного звена патогенеза злокачественных опухолей. Реализация танатогепной программы зависит от соотношения индукторов и ингибиторов апоптоза, а также от регуляторных внутриклеточных молекул, к числу которых относятся белки теплового шока [Москалева Е.Ю., Северин С.Е., 2006; Arya R., et al., 2007; Krampe В., Al-Rubeai M., 2010]. Эти протеины обладают шаперонной активностью и играют важную роль при фолдинге и сборке белковых комплексов, способствуют приобретению белком активной конформации, препятствуют нежелательной агрегации белков, стабилизируют частично свернутые белки и облегчают их транспорт через мембраны внутри клетки. Белки теплового шока направляют поврежденные белки к протеасомам для протеолиза и поддерживают денатурированные белки в состоянии готовности к рефолдингу [Ellis R.J. et al., 2006; Arya R. et al., 2007; Lanneau D. et al., 2008].

В опухолевых клетках имеет место сверхэкспрессия протеинов семейства Hsp (heat shock proteins - белки теплового шока), которые влияют на про- и антианоптотические молекулярные мишени, непосредственно взаимодействуя с ними или через внутриклеточные сигнальные системы [Kamal A. et al., 2004; Parcellier A. et al., 2005; Kawakami H. et al., 2007]. Известно, что под контролем белков-шаперонов находятся белки семейства Вс1-2, являющиеся основными регуляторами митохондриалыюго пути апоптоза. Повреждение митохондрий и выход аполтогенных факторов (цитохром с, Smac/Diablo, A1F, Omi/I ltrA2 и эпдонуклеаза G) из межмембранного пространства митохондрий происходит и при индукции рецепторного и ядерного путей [Antonsson В., 2004; Бра М. и соавт., 2005; Rasoia A., Bernardi Р., 2007]. Таким образом, белки теплового шока, подавляя активацию митохондриального пути программированной гибели, обеспечивают резистентность опухолевых клеток к апоптозу. В частности, Hsp способны влиять на проницаемость митохондриалыюй мембраны, связываться с апоптогенными факторами, ингибировать образование апоптосомы и инактивировать каспазы-9 и -3 [Mosser D.D. et al., 2004; Arya R. et al., 2007; Lanneau D. et al., 2008, 2010; Joly A.L. et al., 2010].

Несмотря на большое количество экспериментальных работ о роли белков теплового шока в регуляции танатогенной программы, апоптотическая функция данных шаперонов в канцерогенезе недостаточно изучена. В связи с этим исследование механизмов модуляции митохондриального пути апоптоза белками

теплового шока в опухолевых клетках важно не только с точки зрения понимания особенностей патогенеза опухолевого процесса; при этом открываются перспективы новых направлений определения таргетной терапии злокачественных новообразований.

Цель исследования: установить роль белков теплового шока (Hsp90 и Hsp27) в молекулярных механизмах дизрегуляции митохондриалыюго пути апоптоза опухолевых клеток линий ТНР-1 и Jurkat. Задачи исследования:

1. Оценить уровень мРНК генов hsp90 и hsp27 и содержание фосфорилированных форм белков теплового шока Hsp90 и Hsp27 в интактных опухолевых клетках линий ТНР-1 и Jurkat и при действии модулятора митохондриалыюго пути апоптоза этопозида in vitro.

2. Оценить особенности изменений трансмембранного потенциала митохондрий опухолевых клеток линий ТНР-1 и Jurkat в условиях селективного ингибирования белков теплового шока Hsp90 и Hsp27 с использованием 17-(Allylamino)geldanamycin (17-AAG) и 5-(5-Ethyl-2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4-(4-methoxyphenvl)isoxazoIe (KRIBB3).

3. Установить закономерности влияния белков теплового шока Hsp90 и Hsp27 на содержание проапоптотических (Вах, Bad) и антиапоптотических (Вс1-2) белков в интактных культурах клеток (клеточные линии ТНР-1 и Jurkat) и при действии селективных ингибиторов белков теплового шока.

4. Установить общие закономерности и особенности участия белков теплового шока Hsp90 и Hsp27 в реализации митохондриального пути апоптоза в опухолевых клетках линий ТНР-1 и Jurkat.

Научная новизна. Получены новые данные о влиянии белков теплового шока Hsp90 и Hsp27 на реализацию митохондриального пути апоптоза опухолевых клеток линий ТНР-1 и Jurkat. Впервые в условиях in vitro показано, что в опухолевых клетках линий ТНР-1 и Jurkat увеличена экспрессия мРНК и внутриклеточное количество фосфорилированной формы индуцибельного белка теплового шока Hsp27 на фоне сниженного количества клеток, вступивших в апоптоз. Содержание активной формы конститутивного белка Hsp90 снижено в клетках острой моноцитарной лейкемии линии ТНР-1 и в клетках Т-лимфобластного лейкоза линии Jurkat.

Впервые выявлено, что в культуре опухолевых клеток линий ТНР-1 и Jurkat ингибирование белков теплового шока Hsp90 и Hsp27 приводит к повышению количества клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий на фоне увеличения количества клеток, вступивших в апоптоз. Установлено, что ингибиторы Hsp90 и Hsp27 (17-AAG и KRIBB3, соответственно) разнонаправлепо влияют на соотношение белков семейства Bcl-2 (Вах, Bad и Вс1-2) в опухолевых клетках линий ТНР-1 и Jurkat, что определяет механизмы активации митохондриалыюго пути апоптоза.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования, проведенного с использованием селективных ингибиторов к белкам теплового шока Hsp90 и Hsp27 (17-AAG и KR1BB3, соответственно), раскрывают молекулярные механизмы влияния шаперонов Hsp90 и Hsp27 на модуляцию митохондриального пути апоптоза в опухолевых клетках линий ТНР-1 и Jurkat. Установлена роль Hsp90 и Hsp27 в изменении баланса про- и антиапоптотических

белков семейства Bcl-2.

В результате проведенного исследования идентифицированы молекулярные мишени, которые могут быть использованы при разработке технологических основ таргетной терапии злокачественных новообразований. Положения, выносимые на защиту

1. В опухолевых клетках линий Jurkat и ТНР-1 разнонаправлено изменяется уровень экспрессии мРНК и содержание фосфорилировапных форм белков теплового шока Hsp90 и Hsp27 на фойе снижения количества клеток, вступивших в апоптоз.

2. Белки теплового шока Hsp90 и Hsp27 играют роль ингибиторов митохондриалыюго пути апоптоза опухолевых клеток линий ТНР-1 и Jurkat.

3. Шанероны Hsp90 и Hsp27 оказывают неоднозначное влияние на белки семейства Вс1-2 в зависимости от типа опухолевых клеток: в клетках линии Jurkat изменяют соотношение белков семейства Вс1-2 (Вах и Вс1-2), в клетках линии ТНР-1 снижают содержание белка Bad.

Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Россия, Пермь, 2009), X, XII конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Россия, Томск, 2009, 2011), XII межрегиональной научно-практической конференции «Вопросы сохранения и развития здоровья населения республики Хакасия» (Россия, Абакан, 2009), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Россия, Пущино, 2009, 2011), V, VI международной (XIV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Россия, Москва, 2010, 2011), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 1000-летию Ярославля «Актуальные вопросы медицинской науки» (Россия, Ярославль, 2010), 13-й, 14-й межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы медицины» (Россия, Абакан, 2010, 2011), XVI межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Россия, Санкт-Петербург, 2010), IV международной конференции молодых ученых-медиков (Россия, Курск, 2010), III общероссийской научной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Россия, Сочи, 2010), международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Россия, Санкт-Петербург, 2010), 6-м международном конгрессе по патофизиологии «Gene-environment interaction in health and disease» (Канада, Монреаль, 2010), VI региональной конференции молодых ученых-онкологов, посвященной памяти академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Россия, Томск, 2011), 4-й международной телеконференции «Фундаментальные науки и практика» (Россия, Томск, 2011).

Исследования выполняли в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» («Идентификация молекулярных мишеней коррекций нарушений регуляции апоптоза опухолевых клеток» (Государственный контракт от 27.08.2009 г. № П1203) и «Разработка технологической платформы молекулярной диагностики и

лечения социально-значимых заболеваний и подготовка на ее основе научно-исследовательских кадров для молекулярной медицины» (Государственный контракт № 02.740.11.0311)), поддержаны грантом Президента Российской Федерации «Исследование молекулярных механизмов регуляторного влияния белков теплового шока на апоптоз опухолевых клеток» (Государственный контракт №16.120.11.480-МК), грантом Carl Zeiss «Программа поддержки научно-исследовательской работы молодых ученых» «Роль белков теплового шока Hsp27 и Hsp90 в регуляции апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat» (от 23.12.2009 г. № СибГМУ 1/11 КЦ) и «Модуляция апоптоза опухолевых и нормальных лимфоцитов ингибиторами белков теплового шока» (№ СибГМУ 1/11 КУ).

Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедр патофизиологии (разделы «Опухолевый рост», «Патофизиология клетки»), фундаментальных основ клинической медицины (дисциплина «Клиническая лабораторная диагностика», раздел «Молекулярные маркеры в алгоритмах диагностики онкологических заболеваний») ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы, из которых - 3 в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы, включающего 190 источников, из которых 28 отечественных и 162 иностранных. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 24 рисунками.

ХАРАКТЕРИСТИКА МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу настоящей работы положены результаты комплексного исследования опухолевых клеток линий Jurkat (Т-лимфобластный лейкоз человека) и ТНР-1 (острая моноцитарная лейкемия человека). Клетки приобретены в институте цитологии РАН (г. Санкт-Петербург).

Опухолевые клетки линии Jurkat синтезируют интерлейкин-2, трансформирующий фактор роста и ростовой фактор Т-клеток. Кроме того, клетки линии Jurkat экспрессируют на поверхности цитоплазматической мембраны CD2+, CD3+, CD4+, CD5+, CD6+, CD7+, TCRaIpha/beta+, различные хемокиновые рецепторы (CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR4) и FasR. Клетки ТНР-1 экспрессируют CD4+, CD13+, CD15+, CD68+, Fc и СЗЬ рецепторы, при этом отсутствует поверхностные и цитоплазматические иммуноглобулины. Кроме того, опухолевые клетки синтезируют TNF-a, IL-la и IL-ip, обладают фагоцитарной активностью и способны дифференцироваться в макрофагоподобные клетки.

Наряду с этим материалом исследования явились культуры мононуклеарных лейкоцитов, полученных у 25 здоровых доноров (12 мужчин и 13 женщин в возрасте от 18 до 45 лет). Клинически и анамнестически у всех здоровых доноров были исключены инфекционные заболевания, обострение хронических патологических процессов, а также онкологические, психические, наследственные, аллергические заболевания, алкогольная и наркотическая зависимости. Материалом исследования являлась венозная кровь, обследованных лиц, взятая из

локтевой вены утром до приема пищи (кровь стабилизировали гепарином - 25 ЕД/мл). Для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени венозную кровь стабилизировали ЭДТА.

С целью изучения влияния белков теплового шока Hsp27 и Hsp90 на реализацию митохондриального пути апоптоза опухолевых клеток исследование проводили в два этапа. На первом этапе осуществляли подбор апоптотической дозы селективных ингибиторов белков теплового шока Hsp27 и IIsp90 на опухолевых клетках линии Jurkat. Также была подобрана лроапоитотическая концентрация противоопухолевого средства - этопозида - для оценки цитотоксического эффекта и совместного действия данного препарата с ингибиторами белков теплого шока Hsp27 и Hsp90 на опухолевые клетки. На втором этапе была проведена проверка гипотезы об участии белков Hsp27 и Hsp90 в дизрегуляции митохондриального пути апоптоза опухолевых клеток in vitro в условиях инкубации с 17-AAG (конечная концентрация 5 мкМ). K.RIBB3 (конечная концентрация 0,1 мкМ) и этопозидом (конечная концентрация 8 мкг/мл) и при их совместном действии.

Описание экспериментальных моделей в соответствии с использованными методами исследования и культурами клеток представлено в таблице 1.

Мононуклеарные лейкоциты выделяли в стерильных условиях из цельной венозной крови методом градиентного центрифугирования [Натвиг Дж. и соавт., 1980]. Венозную гепаринизировапную кровь (25 Ед/мл) выдерживали при температуре 37°С в течение 40 мин для отделения плазмы и эритроцитов. Полученную плазму наслаивали на градиент плотности Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) (р=1,077г/см3) в соотношении 1:2 и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 20 мин. Образовавшееся интерфазное кольцо из смеси молонуклеарных клеток собирали в стерильную центрифужную пробирку. Дважды отмывали средой RPM1-1640 («Вектор-Бест», Новосибирск), последовательно ресуспендируя и центрифугируя каждый раз в течение 10 мин при 1500 об/мин.

Выделенные мононуклеарные лейкоциты крови и опухолевые клетки линий Jurkat и THP-J культивировали в полной питательной среде, состоящей из 90% RPM1-1640 («Вектор-Бест», Новосибирск), 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Invitrogen», США), инактивированной при 56°С в течение 30 мин, 0,3 мг/мл L-глутамина и 100 мкг/мл гентамицина («INS», США). Клетки инкубировали при температуре 37°С и в 5% атмосфере С02.

Количество клеток в состоянии апоптоза и некроза оценивали с помощью FITC-меченного аннексина V и пропидий йодида («Beckman Coulter», США) методом флуоресцентной микроскопии. Количество клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий регистрировали с помощью набора реагентов («BD MitoScreen», США) на проточном цитометре FacsCanto II («Becton Dickinson», США).

Для исследования внутриклеточного содержания белков теплового шока Hsp90 и Hsp27, а также белков семейства Bcl-2 (Bcl-2, Вах, Bad) был использован метод вестерн блоттинга. Клетки сначала подвергали лизису, а затем белки разделяли по молекулярной массе методом электрофореза в 5%-ном концентрирующем полиакриламидном геле (0,13 мМ Tris-HCl, рН=6,8 («Helikon», США)) и 10%-ном разделяющем полиакриламидном геле (375 мМ Tris-HCl, рН=8,8 («Helikon», США)), содержащем 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfate

Таблица 1

Экспериментальные модели исследования (мононуклеарные лейкоциты здоровых доноров и опухолевые клетки линий ,1игка1 и ТНР-1)

Методы исследования Клеточные культуры

Мононуклеарные лейкоцить Опухоле вые клетки линии Jurkat Опухолевые клетки линии ТНР-1

Определение количества апопто-тически измененных клеток в аинексиновом тесте методом флуоресцентной микроскопии Условия культивирования клеток Интактные клетки 15 30 15

С 0,1 мкМ KRIBB3 15 35 15

С 5 мкМ 17-AAG 15 35 15

С 8 мкг/мл этопозидом 15 30 15

С 0,1 мкМ KRIBB3 и с 8 мкг/мл этопозидом 15 15 15

С 5 мкМ 17-AAG и с 8 мкг/мл этопозидом 15 15 15

Определение числа клеток со сниженным уровнем трансмембранного потенциала митохондрий методом проточной цитофлуоримет-рии Условия культивирования клеток Интактные клетки 15 15 15

С 0,1 мкМ KRIBB3 15 15 15

С 5 мкМ 17-AAG 15 15 15

С 8 мкг/мл этопозидом 15 15 15

С 0,1 мкМ KRIBB3 и с 8 мкг/мл этопозидом 15 15 15

С 5 мкМ 17-AAG и с 8 мкг/мл этопозидом 15 15 15

Исследование содержания белков-регуляторов апоп-тоза (Bad. Вах, Вс1-2) методом вестерн-блоттинга Условия культивирования клеток Интактные клетки 18 18 18

С 0,1 мкМ KRIBB3 18 18 18

С 5 мкМ 17-AAG 18 18 18

С 8 мкг/мл этопозидом 18 18 18

С 0,1 мкМ KRJBB3 и с 5 мкг/мл этопозидом 18 18 18

С 5 мкМ 17-AAG и с 8 икг/мл этопозидом 18 18 18

Определения содержания белков теплового шока Hsp27, Hsp90 и их фосфорилирован-ных форм методом вестерн-блоттинга Условия культивирования клеток -Тптактные клетки 24 24 24

С 8 мкг/мл этопозидом 12 12 12

Методы исследования Клеточные культуры

Мононук-леарные лейкоциты Опухолевые клетки линии Jurkat Опухолевые клетки линии ТНР-1

Оценка экспрессии генов (уровня мРНК) белков теплового шока НБр27 и НБр90 методом ПЦР в режиме реального времени Условия культивирования клеток Интактные клетки 20 20 20

С 8 мкг/мл этопозидом 20 20 20

Примечание: 17-AAG - 17-(Allylamino)geldanamycin; KR1BB3 - 5-(5-Ethyl-2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4-(4-methoxyphenyl)isoxazole

(PSA), 0,08% TEMED («Helikon», США) под действием электрического поля (10 В/см пути). Для последующего исследования белки электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad», США), при силе тока 45 мА. Затем нитроцеллюлозную мембрану блокировали 1% желатином с последующей инкубацией с первичными моноклональными антителами к белкам Вах (2 мкг/мл), Вс1-2 (1:1000), Bad (1 мкг/мл) («Sigma», США), Hsp27 (phospho S78, 1:2000), Hsp90 (1 мкг/мл), («Abcam», Великобритания) и поликлональными антителами к Hsp90 (phospho S226, 1:1000) и Hsp27 (0,5 мкг/мл), («Abcam», Великобритания). После мембрану инкубировали с вторичными моноклональными антителами с пероксидазной меткой («Biosource», США) в разведении 1:150000. Детекцию производили при добавлении хемилюминесцентного субстрата пероксидазы («Invitrogen», США). Вывод о содержании исследуемого белка в клетке делали по изменению отношения величины сигнала метки искомого белка к величине сигнала с фермента глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа («Sigma», США), используя программное обеспечение TotalLab.

Для количественного определения экспрессии генов hsp27 и hsp90 использовали метод ПЦР в режиме реального времени. Выделение РНК из мононуклеарных лейкоцитов крови и опухолевых клеток осуществляли с применением гуаиидин изотиоционата с последующей фенол-хлороформной экстракцией с помощью набора «РИБО-золь-В» (Россия). ДНК синтезировали на матрице мРНК при участии обратной транскринтазы. Полученный фрагмент ДНК амплифицировали методом ПЦР в режиме реального времени с использованием SYBR Green I на амплификаторе Mini Opticon («Bio-Rad», США). Для нормализации начального количества мРНК в образце и эффективности обратной транскрипции измерялось количество кДНК гена ß-актин, относительно равной степени экспрессирующихся во всех клетках. Для определения относительного количества кДНК в образце использовался критерий ddCt. Результаты выражали в условных единицах (отношение числа циклов амплификации исследуемого гена к количеству циклов амплификации гена «домашнего хозяйства»).

Оценку полученных данных проводили методами статистического описания

и проверки статистических гипотез. Для проверки нормальности распределения величин показателей использовали критерий Шапиро-Вилка. Для выборок, распределение которых отличалось от нормального, рассчитывали медиану (Me) и квартили (Q1-Q3). Для нормально распределенных выборок вычисляли среднее арифметическое (X) и среднее квадратичное отклонение а. При соответствии нормальному закону распределения признака в исследованных выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали критерий Крускала-Уоллиса. Для попарного анализа независимых групп использовали критерий Манна-Уитни с поправкой Бонферрони при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе проведенного нами исследования оценивали экспрессию генов hsp27 и hsp90, а также содержание белков теплового шока Hsp27 и Hsp90 и их фосфорилированных форм в опухолевых клетках линий Jurkat и ТНР-1. В результате было зарегистрировано усиление экспрессии гена hsp27 в опухолевых клетках линий Jurkat и ТНР-1 по сравнению с количеством мРНК гена hsp27 в мононуклеарных лейкоцитах, полученных у здоровых доноров (р<0,05; табл. 2). Активация белка теплового шока Hsp27 достигается за счет его фосфорилирования в различных фосфоакцепторных сайтах Serl5, Ser78 и Ser82 [Clevenger C.V., 2004; Song H. et al., 2004; Kostenko S., Moens U., 2009]. В нашем исследовании было зафиксировано увеличение внутриклеточного содержания белка теплового шока Hsp27 и его фосфорилированной формы в этих же клеточных линиях, относительно аналогичного показателя, обнаруженных при исследовании клеток, взятых у здоровых доноров (р<0,05; рис. 1). По данным литературы, высокий уровень экспрессии Hsp27 обнаруживается при опухолевых процессах различной локализации: раке молочной железы, яичников, остсосаркоме, эндометриалыюм раке и лейкемиях [Parcellier A. et al., 2005]. Возможные причины, приводящие к повышению экспрессии белков теплового шока в опухолевых клетках, могут быть связаны с особенностями микроокружения опухоли (низкий уровень глюкозы, рН, недостаток кислорода и др.), появлением в ходе канцерогенеза онкобелков (например, мутированный р53) или с усилением экспрессии HSF1 [Tang D. et al., 2005].

Экспрессия гена hsp90 в опухолевых клетках линии Jurkat была снижена, а в культуре клеток линии ТНР-1 значимо не отличалась, по сравнению с аналогичным показателем в мононуклеарных лейкоцитах, полученных у здоровых доноров. Внутриклеточное содержание Hsp90, напротив, определялось на одном уровне во всех исследованных культурах клеток (рис. 1). Вероятно, это связано с тем, что, в отличие от Hsp27, белок теплового шока Hsp90 постоянно экспрессируется в клетках. В ^трансформированных клетках данный шаперон участвует в поддержании правильной конформации белков, вовлеченных в сигнальную трансдукцию (рецепторы, G-белки и транскрипционные факторы) [Козеко Л.Е., 2010]. В опухолевых клетках Hsp90 связывается с трансмембранными тирозиновыми киназами (HER-2/new, рецептор эпидермального фактора роста, Met и рецептор инсулиноподобного фактора роста

линии Jurkat при действии ингибитора белка теплового шока Hsp90 снижалось количество только белка Вах, по сравнению с величиной аналогичного показателя в интактных клетках (р<0,05; рис. 5). Также было установлено, что добавление ингибитора белка теплового шока Hsp90 в культуральную среду опухолевых клеток линий Jurkat и ТНР-1 не влияет на синтез белка Bcl-2. Вс1-2 является антагонистом белка Вах, в связи с этим поддержание экспрессии данного белка на одном уровне в опухолевых клетках необходимо для инактивации Вах путем образования гетеродимеров Bcl-2/Bax. Кроме того, согласно данным литературы, в опухолевых клетках, сверхэкспрессирующих антиапоптотические белки Вс1-Х| и Bcl-2, 17-AAG неспособен вызвать конформационные изменения Вах, а значит, и провоцировать выход цитохрома с и Smac из митохондрий, а также индуцировать расщепление каспазы-3 [Nimmanapalli R. et al., 2003].

А Б В

ч

Рис. 4. Оценка апоптоза опухолевых клеток линий ТНР-1 (А, Г. Ж), Jш-kat (Б, Д, 3) и мононуклеарных лейкоцитов, полученных у здоровых доноров (В, Е, И) с помощью флуоресцентной микроскопии (увеличение 400)

Примечание: А, Б, В - иитакткые клетки; Г, Д, Е - клетки, инкубированные с добавлением 17-ААО; Ж, 3, И - клетки, инкубированные с добавлением КЮВВЗ. 1 - живые клетки (Р1ТС-/Р1-); 2 - клетки, находящиеся на ранней стадии апоптоза (Р1ТС+/Р1-); 3 - клетки, находящиеся на поздней стадии апоптоза (ПТС+/Р1+); 4 - некротические клетки

12 3 4 5 6 Условия культивирования опухолевых клеток линии ТНР-1

12 3 4 5 6 Условия культивирования опухолевых клеток линии Лика!

Г 1 2 3 4 5 6

Условия культивирования мононуклеарных лейкоцитов здоровых доноров

Е

12 3 4 5 6 Условия культивирования опухолевых клеток линии ТНР-1

12 3 4 5 6 Условия культивирования опухолевых клеток линии ,)игка|

I 2 3 4 5 6 Условия культивирования мононуклеарных лейкоцитов здоровых доноров

II

В

1-

А

2 12 3 4 5 6

Условия культивирования опухолевых клеток линии Т1 !Р-1

медиана

1 2 3 4 5 6 Условия культивирования опухолевых клеток линии ,|игкаг

максимум

минимум

1 2 3 4 5 6 Условия культивирования мононуклеарных лейкоцитов здоровых доноров

25 - 75% (025-075)

Рис. 5. Внутриклеточное содержание белков семейства Вс1-2 в опухолевых клетках линий ТНР-1 (А, Г, Ж), Лигка! (Б, Д, 3) и мононуклеарных лейкоцитах здоровых доноров (В, Е, И) (по данным вестерн блоттинга)

Примечание: 1 - интактные клетки; 2 - клетки, инкубированные с добавлением этопозида; 3 -клетки, инкубированные с добавлением КШВВЗ; 4 - клетки, инкубированные с добавлением 17-ААО; 5 - клетки, инкубированные совместно с этопозидом и КШВВЗ; 6 - клетки, инкубированные совместно с тгопозидом и 17-ААО

Инкубирование опухолевых клеток линии ТНР-1 в культуральной среде с добавлением ингибитора Hsp90, напротив, приводило к 'значительному внутриклеточному увеличению белка Bad, по сравнению с интактным уровнем данного белка (р<0,05; рис. 5). Повышение количества белка Bad в опухолевых клетках линии ТНР-1 при добавлении 17-AAG может быть связано с разрушением комплекса Hsp90-Akt и с последующей инактивацией данной нротеипкиназы. Кроме того, дефосфорилированная форма белка Bad может взаимодействовать с транскрипционным фактором Р53 и транслоцироваться к наружной мембране митохондрий. Данный комплекс способен активировать олигомеризацию белка Bäk, что приводит к выходу апоптогепных факторов из межмембрапиого пространства митохоидрий и индукции каспаз [Jiang Р. et al.. 2007]. Инкубирование опухолевых клеток линии Jurkat в культуральной среде с добавлением KRIBB3 приводило к значительному увеличению количества Вах на фоне низкого уровня белка Вс1-2. по сравнению с аналогичным показателем в интактной культуре (р<0,05; рис. 5). Изменения содержания белка Вс1-2 в опухолевых клетках линии Jurkat связаны с тем, что Hsp27 способен инициировать убиквитилирование и протеасомальную деградацию ингибитора NF-kB. который усиливает экспрессию генов антиапоптотических белков (например, Вс1-2) и подавляет синтез проапоптотических белков (например. Вах) [Fridman J.S.. Lowe S.W., 2003]. Поэтому логично предположить, что ингибирование шаперона Hsp27 в клетках линии Jurkat не позволяет реализоваться данному механизму и приводит к дисбалансу в семействе белков Вс1-2 в сторону увеличения содержания Вах и снижения количества Вс1-2.

В опухолевых клетках линии ТНР-1 при добавлении KRIBB3, напротив, количество белка Bad увеличилось в 2 раза, по сравнению с аналогичным показателем в иитактных клетках, а содержание белков Вах и Вс1-2 не изменилось (рис. 4). Известно, что фосфорилированная форма белка теплового шока Hsp27, также как и Hsp90, способна образовывать комплекс с Akt. которая участвует в регуляции активности белка Bad [Paul С. et al. 2002]. При ипгибироваиии Hsp27. вероятно, происходит дестабилизация Akt, ведущая к усилению активности проапоптотического белка Bad.

Кроме того, нами были проведены экспериментальные исследования для сравнения эффектов, оказываемых на механизмы реализации митохондриального пути апоптоза ингибиторами белков теплового шока Hsp90 и Hsp27 в опухолевых клетках, с противоопухолевым лекарственным препаратом - этопозидом. Выбор этолозида основывался на его способности активировать митохопдриальный путь программированной клеточной гибели. Основной механизм индукции апоптоза при действии этопозида связан с ингибированием топоизомеразы II, что способствует повреждению ДНК. Это приводит к инициации тирозипкиназы c-abl, которая усиливает активность белка р73. Данный белок участвует в активации белка Bid и транслокации его к мембране митохондрий с последующим взаимодействием с белком Bäk. Активная форма Bäk нарушает целостность митохоидриальной мембраны и тем самым способствует выходу апоптогепных факторов, образованию апоптосомы и активации каспазы-9. а затем каспазы-3 [Liu J. et al., 2011]. В проведенном нами исследовании было установлено, что в отличие от ингибиторов белков теплового шока Hsp90 и Hsp27 добавление этопозида в культуральную среду вызывает активацию митохондриального пути апоптоза не

только в опухолевых клетках линий Jurkat и ТНР-1, но и в мононуклерных лейкоцитах, полученных у здоровых доноров (рис. 2, 3). Кроме того, этопозид приводит к нарушению баланса про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2. Так. инкубация моионуклеарных лейкоцитов и опухолевых клеток линии Jurkat с этопозидом вызывала такие же изменения в содержании белков Вс1-2, Вах и Bad, как и при действии ингибитора белка теплового шока Hsp90. В то же время при добавлении этопозида в культуру опухолевых клеток линии ТНР-1 происходило увеличение не только количества белка Bad, но и Вс1-2 и Вах, по сравнению с аналогичным показателем в интактных клетках (рис. 5).

Перед тем как оцепить влияние совместного действия ингибиторов белков теплового шока Hsp90 и Hsp27 с этопозидом, рассмотрим способность данного препарата влиять на экспрессию шаперонов Hsp90 и Hsp27. В опухолевых клетках линии Jurkat действие этопозида вызывало увеличение синтеза Hsp90 и снижение количества мРНК белка Hsp27 (табл. 2). При этом в опухолевых клетках линии Jurkat содержание фоефорилированных форм данных белков при добавлении этопозида уменьшалось, по сравнению с аналогичным показателем в интактных клетках (р<0,05). Культивирование опухолевых клеток линии ТНР-1 в аналогичных условиях инкубации вызывало усиление экспрессии мРНК как белка Hsp90, так и Hsp27, по сравнению с аналогичными значениями показателей в интактных клетках (табл. 2). В свою очередь исследование внутриклеточного содержания фоефорилированных формы Hsp90-P и Hsp27-P в опухолевых клетках линии ТНР-1 позволило выявить снижение количества Hsp27-P по сравнению с уровнем в интактных клетках, тогда как содержание фосфоформы Hsp90 не изменялось (рис. 1). Как упоминалось ранее, усиленная экспрессия белков теплового шока имеет место при действии на клетку различных повреждающих факторов, к которым можно отнести и противоопухолевые препараты. Повышенный синтез белков теплового шока в опухолевых клетках препятствует развитию апоитотической гибели, а. следовательно - усиливает резистентность к химиотерапии.

Нами было установлено, что совместное добавление ингибитора 17-AAG и этопозида в культуральную среду приводит к значительному усилению апопготической гибели клеток и увеличению числа клеток со сниженным A\i как в культуре моионуклеарных лейкоцитов, так и в культуре опухолевых клеток (линии Jurkat и ТНР-1), но сравнению с начальным уровнем гибели клеток (рис. 2, 3). Данное обстоятельство может быть связано с тем, что белок Hsp90 способен связывать топоизомеразу II, активируя ее и защищая от повреждающих факторов. Ингибировапие шаперона Hsp90 приводит к снижению активности топоизомеразы II, но не к ее деградации. Совместное добавление ингибиторов Hsp90 и топоизомеразы II способствует нарушению взаимодействия Hsp90 с топоизомеразой II и, в конечном счете, приводит к повреждению ДНК и гибели клетки [Catherine R. et al., 2006].

В связи с этим представляет собой особый интерес оценка баланса белков семейства Вс1-2, регулирующих проницаемость митохондриальной мембраны, а, следовательно, и активацию митохондриального пути апоптоза. Нами было установлено, что добавление в культуральную среду опухолевых клеток линий Jurkat и ТНР-1 этопозида и 17-AAG одновременно приводило к снижению содержания ироаноптотического белка Вах, по сравнению с его интакным

уровнем, тогда как количество белков Вс1-2 и Bad не изменялось (рис. 5).

Полученные нами результаты подтверждаются другими исследованиями, свидетельствующими, что предварительная обработка опухолевых клеток ингибитором 17-AAG подавляет апоптотичсский эффект этоиозида. Так, разрушающее действие 17-AAG па комплекс Hsp90/HSF-1 приводит к транслокации HSF-1 в ядро и связыванию его с HSE в промоторной области гена hsp70, инициируя транскрипцию белка Hsp70 [Morimoto R.I., 1998; Creagh Е.М. et al., 2000]. Сверхэкспрессия шаперона Hsp70 инактивируст Вах-опосредованный апоптоз, вызванный ингибитором белка теплового шока Hsp90 [Guo F. et al., 2005]. Можно предположить, что повышенный синтез белка Hsp70 также подавляет индукцию митохондриального пути апоптоза при совместном добавлении 17-AAG и этопозида. Таким образом, усиление апоптотичсской гибели опухолевых клеток линий Jurkat и ТНР-1 при сочетанном действии селективного ингибитора Hsp90 и этопозида, очевидно, связано с инициацией рецепторопосредованного пути апоптоза.

Оценка активации митохондриального пути программированной клеточной гибели при совместном действии ингибитора белка теплового шока Hsp27 и этопозида показала, что в культуре моноцитов и лимфоцитов число клеток, вступивших в апоптоз, увеличивалось на 41,5%, по сравнению с величиной аналогичного показателя в иитактиых клетках. Инкубирование опухолевых клеток линий Jurkat и ТНР-1 в культуралыюй среде с добавлением KRIBB3 и этопозида приводило к значительному увеличению (на 38,5 и 70,6%, соответственно) числа аиоптотически измененных клеток, по сравнению с интактным уровнем их гибели. При этом количество опухолевых клеток со сниженным Ду было значительно выше, чем в интактных клетках и клетках, культивированных совместно с 17-A AG и этопозидом (рис 2, 3). На сегодняшний день механизмы, вызывающие активацию митохондриального пути апоптоза при совместном действии KRIBB3 и этопозида в опухолевых клетках, остаются неизученными. Известно, что белок Hsp27 способен ингибировать этопозид-индуцированный апоптоз [Schepers Н. et al., 2005]. Логично предположить, что блокирование Hsp27 позволяет этопозиду активировать митохондриальный путь апоптоза. В то же время при сочетанном добавлении KRIBB3 и этопозида в культуральную среду опухолевых клеток линий ТНР-1 и Jurkat нарушения баланса про- и антиапоптотических белков в семействе Вс1-2 соответствовали изменениям, происходящим при действии этопозида (рис. 5). Таким образом, результаты настоящего исследования продемонстрировали, что ингибирование шаперонов Hsp27 и Hsp90 сопровождается индукцией танатогепной программы. При этом в ее осуществлении задействованы разные молекулярные мишени в опухолевых клетках линий Jurkat и ТНР-1. Основные изменения происходят в соотношении белков семейства Вс1-2, активность которых регулируется не только транскрипционными факторами или в результате взаимодействия друг с другом, но и с белками теплового шока Hsp27 и Hsp90. В клетках острой моноцитарной лейкемии линии ТНР-1 добавление селективных ингибиторов белков Hsp27 и Hsp90 вызывает активацию белка Bad (рис. 6). В опухолевых клетках линии Jurkat, напротив, действие ингибитора KRIBB3 приводит к усилению синтеза белка Вах и подавлению экспрессии Вс1-2. В свою очередь, проапоптотические белки Bad и Вах способствуют открытию пор временной проницаемости, снижению трансмембранного потенциала митохонд-

|мРНК Нбр27

\

мРНК Нвр90

| Нзр27-Р

I

Активация транскрипционного фактора ЬИ-~-кВ

Проапоптотический белок Вах

т_

1 НэрОД-Р

1 г

1 Активация Р13ЛШ пути <-

Проапоптотический белок Вас)

Антиапоптотичетиеский белок Вс1-2

И

Проапоптотический белок Вах

Открытие пор

временной проницаемости

I

Снижение трансмембранного потенциала митохондрий

\

Выход апоптогенных факторов в цитоплазму

НэрЭД-Р, 1Ьр27-Р

Цитохром с

НЕ

I

Нзр27-Р

Образование апоптосомы

I

Регуляторные белки Бтас/ТОАВШ и ОтШгЛг

А1Р

иэндонуклсаза О

Активация каспазы-9

Нзр27-Р

И

I

1

I

Деградация ДНК

1АР

Активация каспазы-3

Апоптоз

Рис. 6 Молекулярные мишени действия белков теплового шока Няр27 и }¡яр90 в реализации митохондриального пути апоптоза в опухолевых клетках линий Л1гка1 и ТНР-1 [по результатам собственных исследований (выделено цветом) и данным Я. Агуа й а1., 2007; П. Ьаппеаи с1 а1., 2008]

Примечание: | - повышение, | - снижение, Н - ингибирование, —> усиление

рий и выходу апоптогенных факторов из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму с последующей активацией каспаз -9 и -3.

Изучение действия ингибиторов белков теплового шока па механизмы реализации апоптоза в опухолевых клетках остается перспективным направлением и требует дальнейшего исследования влияния белков теплового шока на активность сигнальных молекул, участвующих в танатогеппой программе. Это. в свою очередь, позволит получить новые фундаментальные знания в области канцерогенеза и даст возможность разработать новые противоопухолевые лекарственные средства, механизм действия которых будет основываться на ингибировании белков теплового шока.

ВЫВОДЫ

1. В опухолевых клетках линий ТНР-1 и Jurkat повышена экспрессия гена hsp27. При действии этопозида, обладающего проапоптотическим действием, количество мРНК белка теплового шока Hsp27 снижается в опухолевых клетках линии Jurkat и не изменяется в опухолевых клетках линии ТНР-1.

2. Экспрессия гена hsp90 в опухолевых клетках линии Jurkat снижена, а в клетках линии ТНР-1 соответствует таковой в мононуклеарных лейкоцитах, полученных у здоровых доноров; при добавлении в культуральную среду этопозида экспрессия мРНК как в опухолевых клетках линии Jurkat, так в опухолевых клетках линии ТНР-1 усиливается. ;

3. В условиях селективного ингибирования белков теплового шока Hsp90 и Hsp27 в опухолевых клетках линий Jurkat и ТНР-1 регистрируется увеличение как количества клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, так и количества клеток, вступивших в апоптоз.

4. При действии специфического ингибитора белка теплового шока Hsp90 изменяется баланс проапоптотических белков семейства Вс!-2: в клетках линии ТНР-1 увеличивается количество белка Bad. в клетках линии Jurkat снижается содержание белка Вах.

5. При селективном ингибировании белка теплового шока Hsp27 с использованием KRIBB3 в опухолевых клетках линии Jurkat снижается внутриклеточный уровень антиапоптотического белка Вс1-2, увеличивается содержание белка Вах, а в опухолевых клетках линии ТНР-1 увеличивается количество Bad.

6. Дизрегуляция митохондриалыюго пути апоптоза опухолевых клеток линий Jurkat и ТНР-1, характеризующаяся дисбалансом про- и антиапоптотических белков семейства Вс1-2, сопряжена с увеличением фосфорилироваиной формы Hsp27 и снижением фосфорилироваиной формы белка Hsp90.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Роль белка теплового шока 90 в дизрегуляции апоптоза опухолевых клеток Jurkat / E.B. Кайгородова, M.B. Белкина, АН. Марошкина, Л.П. Зима // Актуальные проблемы медицины: Материалы XII межрегиональной, научно-практической конференции, г. Абакан. 3-4 июня 2009. - Абакан, 2009 - С. 242 - 243.

2. Дисбаланс белков семейства BCL-2 в модуляции апоптоза лимфоцитов / А.П. Марошкина, O.E. Чечина, О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева. Т.С. Прохоренко, А.К. Впктасова,

M.B. Белкниа. E.B. Сазонова, А.П. Зима, Т.Т. Радзивил // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: Материалы международной конференции, г. Пчщино, 2-4 июля 2009. -Пущино, 2009. - С. 457-461.

3. Механизмы нарушения митохондриалыюго пути апоптоза / А.Н. Марошкина, М.В. Белкина, Т.С. Прохоренко, Н.В. Рязанцева, А.Г1. Зима, Т.Т. Радзивил // Науки о человеке: Материалы X конгресса молодых ученых и специалистов, г.Томск, 28-29 мая 2009. - Томск, 2009. - С. 88-89.

4. Молекулярные механизмы дизрегуляции апоптоза лимфоцитов / А.Н. Марошкина, O.E. Чечина, О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, А.П. Зима // Симбиоз Россия 2009: Материалы II Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов - г. Пермь, 25-29 мая 2009. - Пермь, 2009. - С. 303-305.

5. Эффект ингибитора белка теплового шока 90 17-AAG на TNF-a индуцированный апоптоз опухолевых клеток линии Jurkat / В.Д. Якушина, М.В. Белкина, А.Н. Марошкина, Е.В. Коновалова, Е.В. Кайгородова Актуальные проблемы патофизиологии: Материалы XVI межгородской комф. молодых ученых - г. Санкт-Петербург, 21-22 апреля 2010. - Санкт-Петербург, 2010 -197-198.

6. Влияние ингибитора белка теплового шока Hsp27 и дексаметазона на апоптоз опухолевых клеток линии Jurkat / М.В. Белкина, Е.В. Кайгородова, А.Н. Марошкина, В.Д. Якушина, Е.В. Коновалова // Актуальные вопросы медицинской науки: Сборник научных работ студентов и молодых ученых Всероссийской научно-практической конф. с международным участием, посвященной 1000-легию г. Ярославля., 21-23 апреля 2010. - Ярославль, 2010. - С. 314.

7. Реализация апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat при действии ингибиторов белков теплового шока 90 и 27 / Е.В. Кайгородова, А.Н. Марошкина, М.В. Белкина, В.Д. Якушина, Е.В. Коновалова // Актуальные проблемы медицины: Материалы XIII межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, г. Абакан, 4-5 мая 2010. -Абакан, 2010. - С. 256-258.

8. Действие ингибитора белка теплового шо-ка HSP90 на активность каспазы-3 в опухолевых клетках линии Jurkat / М.В. Белкина, А.Н. Марошкина, Е.В. Кайгородова, В.Д. Якушина, Е.В. Коновалова // Материалы IV международной конф. молодых ученых-медиков, г. Курск, 25-26 февраля 2010. -Курск, 2010. - С. 80-81.

9. Molecular mechanisms of the oxidative stress effect on BCL-2 family proteins / I.S. Losenkov, L.A. Kleptsova, E.G. Starikova. E.V. Kaygorodova, A.N. Maroshkina // Материалы V международной (XIV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, г. Москва, 18 марта 2010. - Москва, 2010. - С. 437

10. Apoptosis induction in tumor cells by inhibitors heat shock proteins and dexametasone / A.N. Maroshkina, E.V. Kaigorodova, M.V. Belkina, V.D. Yakushina, E.V. Konovalova // Материалы V международной (XIV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конф. студентов и молодых ученых, г. Москва, 18 марта 2010. - Москва, 2010. - С. 438

11. Особенности лекарственно-индуцированного апоптоза опухолевых клеток в условиях иигибирования белков теплового шока HSP27 и HSP90 /А. Н. Марошкина, Е.В. Кайгородова, М.В. Белкина, В.Д. Якушина, Л.А. Клепцова, А.П. Зима // Фундаментальные и прикладные исследования в медицине: Материалы III общероссийской научной конференции, г. Сочи, 22-25 сентября 2010. - Сочи, 2010. - С. 49 - 50.

12. Особенности реализации апоплоза опухолевых клеток линии Jurkat и мононуклеарных лейкоцитов крови здоровых доноров в условиях иигибирования белка теплового шока 27 кДа in vitro / Е.В. Кайгородова, А.Н. Марошкина, М.В. Белкина, Е.В. Коновалова, В.Д. Якушина, Л.А. Клепцова // Медицинский академический журнал: Материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», посвященная 120-леппосо дга основания НИИЭМСЗО РАМН, г. Санкт-Петербург.-Санкт-Петербург, 2010.-С. 15.

13. Мнтохондриалъный путь апоптоза: роль Hsp27 в опухолевых клетках линии Jurkat / А.Н. Марошкина, М.В. Белкина, Е.В. Кайгородова, А.П. Зима // Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине: материалы первой международной научно-практической конференции, г. Санкт-Петербург, 23-26 ноября, 2010. - Санкт-Петербург, 2010. - С. 72-73.

14. Effects of inhibitors heat shock proteins 90 and 27 on etoposide-induced apoptosis of tumor cells / E. Kavgorodova. N. Ryazantseva, V. Novitsk)', M. Belkina. Л. Maro: hkina // The 6th International Congress of Pathophysiology «Gene-environment interaction in health and disease», Montreal, 22-25 September, 2010. - Montreal, 2010. - P.69-70.

15. Роль белка теплового шока 90 в регуляции апоптоза опухолевых клеток / П.В. Кайгородова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, М.В.Белкина, A ll. Марошкшш // Вголлстснь экспериментальной биологии и медицины.-2010.-Т. 150. № 10. - С. 424-427.

16. Действие ингибиторов белков теплового шока 90 и 27 па дсксамстазоннндуцированнын апопгоз опухолевых клеток / Е.В. Кайгородова. 11.В. Рязанцева. В В. Новицкий. A.II. Марошкина. М.В. Белкина, О.Е. Чечина, А.П. Зима/7 Bhiltciciii.сибирской медицины.-2010. -№3.-С. 6S-72.

17. Исследование механизмов модуляции апоптоза Т-лимфошпов / В.Д Якушина. М.В. Белкина. А.Н. Марошкина, Е.В. Кайгородова. О.А. Васильева // Актуарные проблемы медицины: материалы 14-ой межрегиональной научно-ирактпчсскон конференции с международным участием, г. Абакан, 27-28 апреля. 2011. - Абакан. 2011. -С. 262-265

18. Влияние белков теплового шока на NF-карраВ-огюсрсдованный сигнальный путь опухолевых клеток / Е.В. Кайгородова. М.В. Белкина. А.П. Марошкина. М.В. Клименчепко. ЕЛ. Черкасова // Актуальные проблемы медицины: материалы 14-ой межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, г. Абакан. 27-28 апреля. 2011.- Абакан. 2011.-С. 250-253

19. Апоптозмодулирующие эффекты белка теплового шока 90 кДа в опу холевых клетках / Е.В. Кайгородова, М.В. Белкина, А.Н. Марошкина, Е.А. Черкасова. М.А. Клименчепко // Проблемы и перспективы современной пауки: материалы 4-ой международной гслекопференшш «Фундаментальные науки и практика», г. Томск. 2011,-Томск. 2011. - Т. 3. №1. - С. 63-64.

20. Роль Hsp90 в продукции TNF-н, экспрессии TNF-R1 при дсксамстазон- шдуцировашюм апоптозс опухолевых клеток линии Jurkat / М.В. Клименчепко, Е.А. 1еркасова. М.В. Белкина. А.Н. Марошкина. Е.В. Кайгородова, А.П. Зима // Вестник РГМ'.': материалы VI международной научной Пироговской медицинской кон(||еренн)пилудетовн ■ юлодых ученых, г. Москва, 24 марта, 2011,- Москва, 2011. - №1. - С. 22-23.

21. Функциональные взаимоотношения шаперопа Hsp27 и белков се.УсГюва Вс1-2 в опузолевых клетках TI1P-1 / Е.А. Черкасова. А.П. Марошкина. М.В. Белкина. М.В. Клименчепко, Е.В. Кайгородова // Материалы международной коиф. «Рецепторы п внутриклеточная сигнализация», г. Пушино, 2011. - Пущино. 2011. - С. 630-Г35.

22. Белок теплового шока 90 кДа - молекулярная мишень для коррекции апоптоза опухолевых клеток / Е.В. Кайгородова. А.Н. Марошкина, М.В. Белкина. Е.А. Черкасова, М.В. Клименчепко // Сибирский онкологический журнал. - 2011. -Приложение 1. - С. 58-59.

23. Белки семейства Вс1-2 - молекулярные мишени проапоптотичсского действия ИЛ-2 и ИЛ-4 / О.Е. Чечина, Н.В. Рязанцева, ВВ. Новицкий, Е.В. Сазонова. А.К. Бнктасова. О.Б. Жукова, А.Н. Марошкина, М.В. Белкина, Е.В. Кайгородова. Т.С. Прохоренко // Иммунология. -2011. - Т. 32.№3,-С. 127-130.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

17-А.ЛО - 17-(Allylamino)geldanamycin (17- (аллиламин)гслдапамицнн)

AIF - apoptosis indusing factor (апоитоз-индуцирующпй фактор)

Bad - Bcl-2 - associated death promoter (Bcl-2 - ассоциированный промотор смерти)

Bak - Bcl-2 homologous antagonist/killer (Bcl-2 гомологичный антагонист/кил. icp)

Bax - Bcl-2- associated X protein (Bcl-2-ассоциироваипый X белок)

Bcl-2 - B-cell lymphoma 2 (В-клеточная лимфома 2)

Bid - BH3 interacting-domain death agonist (агоиист ВИЗ взаимодействующего домена смерти)

Hsp - heat shock proteins (белки теплового шока)

IAP - inhibitors of apoptosis proteins (белки, ннгпбируюшие апоптоз)

KR1BB3 - 5-(5-Ethyl-2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4-(4-mcthoxyplicnyl)isox;i/olc (5-(5-тпш-2п1дроксп-4-метоксифеиил)-4-(4-метоксифеннл) пзоксазол) NF-kB - nuclear factor kappa В (ядерный фактор kB)

Тираж 100 экз. II ¡юти.ich» и ншографмн "Печатный Диор" <>34041 I. Томск, v.l. Советский 63, тел.: S (3822) 55-64-81

аЯ^Й^иГ etyüjuutb - // ¿f ^ ¿f.