Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Специфическая адоптивная клеточная иммунотерапия онкогематологических заболеваний и инфекций иммунной системы

На правах рукописи

Дубровина

Екатерина Сергеевна 003060043

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ АДОПТИВНАЯ КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОТЕРАПИЯ ОНКОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ИНФЕКЦИЙ ИММУННОЙ

СИСТЕМЫ.

14.00.29 - гематология и переливание крови 14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 2006

003068043

Работа выполнена в ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ (директор - член-корреспондент РАМН, профессор А.Г. Румянцев) и лаборатории адоптивной клеточной иммунотерапии отделения трансплантации костного мозга Мемориал Слоан-Кетгеринг Онкологического Центра, США (руководитель отделения - профессор Р.Дж.О'Райли)

Научные консультанты: Член-корреспондент РАМН,

Доктор медицинских наук, профессор А.Г.Румянцев

Доктор медицины, профессор Р.Дж.О'Райли

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Б.В.Афанасьев Заслуженный врач РФ,

Доктор медицинских наук, профессор Н.А.Финогенова Академик РАЕН,

Доктор медицинских наук, профессор А.А.Ярилин

Ведущая организация: Гематологический научный центр РАМН

Защита состоится «_19_»_января_2007_г. На заседании диссертационного совета

Д208.050.01 в ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитиюРФ по адресу: 117997, Москва, Ленинский проспект, дом 117

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ФКНЦ детской гематологии, онкологии и гематологии Росздрава.

Автореферат разослан «___»_200_г.

Ученый секретарь диссертационного

Совета, доктор медицинских наук, профессор В.М.Чернов

Введение.

Актуальность проблемы.

Данные исследований последних лет показали, что развитие онкогематологических, иммунологических и вирусных заболеваний, как правило, коррелирует со снижением иммунного клеточного ответа на чужеродные антигены [Collins RH, 1997, Lucas К, 1996 ]. Эффективность лечения этих заболеваний ограничена, с одной стороны, резистентностью опухоли или вируса к проводимой терапии, а, с другой стороны, невозможностью эскалации терапевтических доз в связи с риском развития системной токсичности по отношению к здоровым органам и тканям [Kold Щ, 1990 ]. Поиск высокоспецифичных биологических методов лечения, базирующихся на естественных механизмах распознавания и удаления чужеродного агента без повреждения здоровых тканей организма привел к разработке методов адоптивной клеточной иммунотерапии, основанной на введении в организм больного аутологичных или аллогенных клеток иммунной системы, способных специфически распознавать и убивать вирус-инфицированные или опухолевые клетки.

Основы развития адоптивной клеточной иммунотерапии были заложены на стыке иммунологии, гематологии, онкологии, и вирусологии [Walter ЕА, 1995]. Изначально было показано, что проведение аллогенной трансплантации костного мозга позволяло добиться большего терапевтического эффекта при лечении онкогематологических заболеваний, включая хронический миелолейкоз [O'Reilly RJ, 1983]. Такой терапевтический эффект пересадки аллогенных стволовых клеток костного мозга при лечении гемобластозов связывали не только с циторедукгивным действием химиотерапии и общего облучения, но также и с дополнительным иммунологическим воздействием Т лимфоцитов здорового донора стволовых клеток. Выявление корреляции между частотой развития РТПХ и сниженным риском развития рецидивов лейкемии после пересадки костного мозга позволило предположить, что Т лимфоциты, отвечающие за развитие РТПХ, могут являться также медиаторами противолейкемического эффекта, так назывемого эффекта «трансплантат-против-лейкемии» (ТПЛ). Подтверждением этой гипотезы являлось повышение частоты развития рецедивов лейкозов при проведении аллогенной трансплантации костного мозга с деплецией зрелых Т лимфоцитов донора [Goldman JM, 1988; Apperley JF.1988]. Более того, было показано, что введение мононуклеарных клеток периферической крови, полученных от первоначального донора стволовых клеток, при рецидивах ХМЛ после ТКМ может приводить к гематологической и цитогенетической ремиссии в 70-80% случаев [Kolb HJ, 1990]. В дальнейшем острая необходимость проведения специфической иммунотерапии возникла в результате выявления ЭБВ-ассоциированных лимфопролиферативных заболеваний (ЭБВ-

ЛПЗ) у больных с иммунодефицитами различной природы (в том числе после химио-лучевой терапии злокачественных новооборазований и длительной иммуносупрессии после пересадки органов и тканей) в корреляции с низким уровнем предшественников ЭБВ-специфичных Т лимфоцитов в крови пациентов [Heslop Н, 1996, Rooney С, 1998]. Введение неселектированных донорских лейкоцитов для лечения ЭБВ, так же как и для лечения ХМЛ, приводило к регресии опухоли и коррелировало с повышением предшественников антиген-специфичных Т лимфоцитов [O'Reilly RJ, 1997], демонстрируя таким образом перспективность применения адоптивной клеточной иммунотерапии в лечении опухолевых и вирусных заболеваний. Однако, в связи с высоким риском развития РТПХ как результата аллогенного ответа вводимых неселектированных Т лимфоцитов [Mackinnon S, 1995 ] представляется необходимым дальнейшее развитие данного подхода в направлении поиска биологических мишеней для антиген-специфичного Т клеточного ответа и развития методик экстракорпоральной антиген-специфической стимуляции Т лимфоцитов, позволяющих обогащать вводимую Т клеточную популяцию эффекторными клетками, способными оказывать дифференцированное цитотоксическое вздействие на опухолевые и пораженные вирусом клетки организма, не повреждая при этом здоровые ткани.

Следует отметить, что несмотря на корреляцию между частотой развития РТПХ и ремиссии у больных с лейкозами после проведения иммунотерапии неселектированными лейкоцитами донора, было выявлено, что исчезновение лейкемических клеток также отмечалось и у больных, не развивающих симптомов РТПХ, позволяя предположить, что ТПЛ и РТПХ не всегда вызываются теми же эффекторными клетками. Проведенные за последние годы исследования позволили выявить целый ряд антигенов, специфически представленных на опухолевых и вирус-пораженных клетках и не экспрессируюцщхся в достаточном количестве в здоровых тканях организма [ Riddell SR, 1991; Kern F, 1999; Ohminami H, 2000]. В результате этого стало возможно разрабатывать методы антиген-специфичной Т клеточной терапии таких заболеваний как OMJI, ОЛЛ, ХМЛ, мезотелиомные опухоли, рак толстого кишечника, рак простаты, рак яичников, рак легких, рабдомиосаркомы, десмопластические мелко-круглоклеточные опухоли, опухоль Вильмса, неходжкинские лимфомы, первичные лимфомы головного мозга а также таких жизнеугрожающих осложнений высокодозной химиотерапии и длительной иммуносуппрессии как ЭБВ-ЛПЗ и ЦМВ [Small Т, 1999].

Исключительно важное значение приобретают данные о том, что эффективность адоптивной клеточной иммунотерапии зависит не только от функциональной активности эффекторных клеток, но и от восприимчивости опухолевых или вирус-инфицированных клеток к их цитотоксическому действию [ Knutson К, 2006]. Способность таких аномальных клеток избегать контроля со стороны клеточного звена иммунитета путем изменения своих функционально-морфологических характеристик зачастую приводит к развитию

4

злокачественных заболеваний у иммунокомпетентных больных [Falkenberg F, 2000 ]. В связи с этим чрезвычайно актуальным является проведение исследований, направленных на изучение механизмов противовирусного и противоопухолевого клеточного иммунного ответа с целью выявления причин его несостоятельности и разработки методов ее коррекции [Speiser D, 2005 ]. Проводимые в настоящее время доклинические и клинические испытания безопасности и эффективности адоптивной клеточной иммунотерапии позволяют разработать оптимальный дозо-временной режим проведения такого метода иммунокоррекции для лечения злокачественных и вирусных заболеваний у онкогематологических и иммунологических больных.

Таким образом вклад адоптивной антиген-специфичной клеточной иммунотерапи в область породивших ее базовых наук, а также в практическую и клиническую науку неоценим. Адоптивная специфическая клеточная иммунотерапия представляет собой новый прогрессивный и перспективный подход в лечении широкого спектра онкогематологических, иммунных и вирусных заболеваний, позволяющий осуществлять направленное удаление пораженных клеток из организма без повреждения здоровых органов и тканей. Разработка, изучение и внедрение в клиническую практику данного метода лечения является актуальной проблемой, так как его применение способно расширить терапевтические возможности современной медицины в лечении онкогематологических и вирусных заболеваний и повысить эффективность существующих в настоящее время методов лечения этого спектра заболеваний

Цель исследования.

Обосновать, разработать и внедрить в клиническую практику методы направленной специфической иммунокоррекции клеточного звена противоопухолевого и противовирусного иммунитета в качестве адьювантной антиген-специфичной биологической терапии онкогематологических, иммунных и вирусных заболеваний

Задачи:

1. Обосновать необходимость дифференцированного использования различных видов антиген-презентируюпщх клеток для направленной экстракорпоральной стимуляции антиген-специфических Т лимфоцитов.

2. Разработать методы селекции Т лимфоцитов для получения популяции эффекторных клеток путем экстракорпоральной антиген-специфичной стимуляции с целью

последующего их использования при проведении адоптивной клеточной иммунотерапии опухолевых и вирусных заболеваний без риска развития РТПХ.

3. Разработать и внедрить в практику методику идентификации новых иммуногенных вирус- или опухолеспецифичных лигандов, позволяющую проводить антиген-специфичную клеточную иммунотерапию широкому спектру больных вне зависимости от их НЬА типа.

4. Изучить факторы Т клеточного ответа, влияющие на эффективность адоптивной клеточной иммунотерапии.

5. Разработать и внедрить в практику методику экстракорпоральной активации аутологичных НК клеток, специфичных к опухолевому лиганду М1СА/В, для проведения Н1А-независимой аутологичной адоптивной клеточной иммунотерапии опухолей эпителиального происхождения, не экспрессирующих на своей поверхности НЬА молекулы.

6. Изучить особенности антиген-специфичного Т клеточного ответа, развивающегося у больных после ТКМ в зависимости от интенсивности подготовительного режима циторедукции с целью выявления способности Т клеток донора узнавать опухолевые и вирусные антигены в контексте НЬА типа донора и больного.

7. Исследовать терапевтическую эффективность и безопасность адоптивной клеточной иммунотерапии у больных с онкогематологическими заболеваниями, ЭБВ-ЛПЗ и ЦМВ.

8. Определить прогностические факторы эффективности противоопухолевой терапии АУТ1-специфичными Т клетками

9. Изучить особенности противоопухолевого клеточного иммунного ответа у онкологических и онкогематологических больных и возможности проведения адоптивной противоопухолевой иммунотерапии аутологичными эффекгорными клетками, полученными в результате экстракорпоральной активации.

Научная новизна

Адоптивная иммунотерапия является частью лечения больных с онкогематологическими, иммунными и вирусными заболеваниями. Для проведения адоптивной иммунотерапии необходимо разработать эффективные методики специфической экстракорпоральной стимуляции эффекгорных клеток, применимые в клинической практике, изучить механизм их действия, разработать дозово-временные режимы проведения адоптивной клеточной иммунотерапии и особенности антиген-специфичного клеточного иммунного ответа у групп больных с онкогематологическими,

иммунными и вирусными заболеваниями для разработки показаний и наиболее эффективных режимов лечения.

Всвязи с этим в данной работе впервые:

• На основании комбинированного анализа типа химеризма, развивающегося у больных после трансплантации костного мозга с различными режимами кондиционирования, определения доминантного антигенного эпитопа и рестриктирующего доминантного НЬА аллеля цитотоксических антиген-специфичных Т клеток была обоснована необходимость дифференцированного использования различных видов антиген-презентирующих клеток, избирательно экспрессирующих требуемый антиген в контексте требуемого НЬА аллеля/аллелей, для проведения управляемой экстракорпоральной стимуляции эффекторных клеток с заданной специфичностью и НЬА рестрикцией с целью их последующего использования для адоптивной иммунотерапии онкогематологических, иммунных и вирусных заболеваний больным от НЬА несовместимого донора.

• Разработана методика избирательной управляемой экстракорпоральной стимуляции антиген-специфичных Т лимфоцитов, позволяющая получить цитотоксические Т лимфоциты, специфичные к субдоминантным эпитопам, таким как ЬМР1 и \УТ1, для лечения ЭБВ-ЛПЗ и лейкемий соответственно.

• Показано, что цитотоксические Т лимфоциты, полученные путем избирательной управляемой экстракорпоральной стимуляции опухолевым или вирусным антигеном, обладают специфической противоопухолевой цитотоксичностью в лабораторных условиях и позволяют подавлять рост опухоли в экспериментальной модели адоптивной клеточной иммунотерапии лейкозов и ЭБВ лимфом в условиях живого организма без риска развития РТПХ. Опухолеспецифические Т лимфоциты, полученные путем антиген-специфической управляемой экстракорпоральной стимуляции, не оказывают побочного воздействия на здоровые гемопоэтические клетки костного мозга и пуповинной крови.

• Разработаны методы ранней селекции Т лимфоцитов с помощью деплеции НК клеток и избирательной трансдукции ретровирусным вектором, позволяющие получать в короткие сроки ЦТЛ, обладающие высокой антиген-специфичностью и низкой аллореактивностью.

• Разработана эффективная методика идентификации новых иммуногенных вирус- и опухолеспецифичных эпитопов-мишеней индивидуально для Т клеток конкретного донора с помощью перекрывающихся пентадекапептидов, кодирующих полную последовательность антигенного белка, позволяющая проводить Т клеточную терапию онкогематологическим больным вне зависимости от их НЬА типа.

7

В условиях живого организма показана корреляция между специфическим противоопухолевым ответом адоптивно введенных ЭБВ специфичных ЦТЛ и их специфической миграцией, инфильтрацией и персистенцией, наблюдаемых в области специфической опухоли-мишени при динамической прижизненной визуализации Т клеток.

Выявлено, что направление миграции ЭБВ специфичных Т клеток в аутологичную ЭБВ-ассоциированную опухоль определяется экспрессией в опухоли специфического антигена ЭБВ и иммунодоминантного рестриктирующего HLA аллеля. С помощью неинвазивного длительного повторного мониторинга введенных ЦТЛ описаны факторы, такие как экспрессия специфического антигена, доминантного HLA аллеля, CCR7 и LFA1 молекул, которые влияют на длительность циркуляции антиген-специфичных Т лимфоцитов, направленность их миграции в опухоль-мишень и эффективность противоопухолевого ответа. Снижение экспрессии одного из этих факторов предотвращает специфическую инфильтрацию опухоли цитотоксическими Т лимфоцитами и снижает эффективность проводомой адоптивной клеточной иммунотерапии

Впервые была изучена динамическая роль CD4+ и CD8+ субпопуляций Т клеток в протвоопухолевом ответе на модели адоптивной иммунотерапии, продемонстрировав предпочтительность использования поликлональной популяции Т клеток, содержащей как CD8+, так и CD4+ Т лимфоциты, необходимые для их сочетанного действия, позволяющего повысить эффективность проводимого лечения.

С помощью неинвазивной визуализации определена эффективная терапевтическая доза ЭБВ-специфичных Т клеток, составившая 4400 клеток на 1см3 опухолевой массы. Разработана методика активации аутологичных клинически применимых НК клеток больных с аденокарциномой толстого кишечника, способных проявлять цитотоксическую специфическую активность против опухолевых клеток больного в лабораторных условиях и в экспериментальной модели адоптивной иммунотерапии рака толстого кишечника, для иммунотерапии опухолей эпителиального происхождения со сниженной экспрессией молекул HLA I класса и повышенной эксрессией NKG2D лиганда (ШСА).

Продемонстрирована корреляция между типом химеризма, развивающимся у пациентов после пересадки костного мозга, миелоаблативным режимом и типом HLA рестрикции антиген-специфичных Т клеток донора, развивающихся в микроокружении организма реципиента.

Показано, что доминантные рестриктирующие HLA аллели Т клеток донора,

развивающихся в организме реципиента стволовых клеток костного мозга, могут

8

отличаться от доминантных рестриктирующих элементов основного комплекса гистосовместимости Т клеток той же генетической природы, развивающихся в организме самого донора, и являются общими для HLA типа как донора, так и больного при их неполной тканевой совместимости.

• Проведеное клиническое исследование по изучению клинической эффективности ЭБВ специфичных и ЦМВ специфичных Т клеток при лечении ЭБВ-ЛПЗ и ЦМВ у иммунокомпрометированных больных после пересадки органов и тканей продемонстрировало терапевтическую эффективность этого метода лечения и приводило к ремиссии заболевания у 76% больных с ЭБВ-ЛПЗ и не вызывало побочных эффектов и признаков РТПХ в 100% случаев.

• Разработаны прогностические факторы течения заболеания и эффективности адоптивной клеточной иммунотерапии для больных с опухолями, экспрессирующими WT1 антиген.

• Внутриклеточная экспрессия WT1 белка в более чем 20% клеток-мишеней была определена как благоприятный прогностический фактор эффективности ответа антиген-экспрессирующей опухоли на специфическую клеточную иммунотерапию WT1 специфичными Т клетками.

• Описан механизм устойчивости аденокарциномы толстого кишечника к лизису НК клетками, основанный на снижении поверхностной экспрессии их активирующего рецептора NKG2D за счет его интернализации под действием высоких концентраций растворимого лиганда этого рецептора, MICA, секретируемого опухолью

• Продемонстрирована возможность получения аутологичных WT1-специфичных Т лимфоцитов, обладающих противоопухолевой активностью, у больных с WT1-позитивной опухолью для проведения противоопухолевой иммунотерапии

Научно-практическое значение.

Разработанные виды антиген-презентирующих клеток позволяют создать универсальный банк различных АПК, экспрессирующих один или несколько наиболее распространенных HLA аллелей и заблаговременно прошедших все необходимые тесты, позволяющий при первой необходимости использовать эти клетки для производства клинически применимых эффекторных клеток адоптивной иммунотерапии, таким образом экономя время и средства, затрачиваемые для получения конечного продукта. Кроме того, такие АПК могут путем соотвествующей генной модификации селективно представлять низкоиммуногенные опухолевые или вирусные эпитопы, такие как LMP1, которые зачастую являются единственными потенциальными мишенями для ЦТЛ (например, при ЭБВ+

9

Ходжкинской лимфоме, ЭБВ+ леомиосаркоме, ЭБВ+ назофарингеальной карциноме), но в силу своей низкой иммуногенности могут вызывать Т клеточный ответ только в случае обеспечения им преимущественной экспрессии на АПК. Дифференциальное использование различных АПК позволяет также проводить направленную стимуляцию Т лимфоцитов с заданной НЬА рестрикцией и эпитоп-специфичностью в зависимости от вида патологии, степени гистосовместимости донора и реципиента и запланированных сроков проведения клеточной иммунокоррекции.

Выбор иммуногенных эпитопов для экстракорпоральной стимуляции опухоле- или вирусспецифических Т клеток проводился до настоящего времени, как правило, с помощью компьютеризированной системы прогнозирования вероятности связывания и скорости диссоциации той или иной аминокислотной последовательности в отношении наиболее распространенных НЬА аллелей. Метод идентификации новых опухоле- или вирусспецифических эпитопов с помощью пулирования перекрывающихся пентадекапептидов, кодирующих полную белковую последовательность выбранного антигена позволяет выявить индивидуальный иммунодоминантный эпитоп для Т клеток любого донора вне зависимости от его НЬА типа. Благодаря такому подходу предоставляется возможность синтезировать противоопухолевые или противовирусные ЦТЛ не только для реципиентов, экспрессирующих наиболее распространенные НЬА аллели, но и для большой группы больных, имеющих более редкий тип НЬА. Кроме того, наши исследования показали, что определяемые с помощью пулированных пентадекапептидов эпитопы часто являются более значимыми с точки зрения противоопухолевого ответа эффекторных клеток, чем последовательности, выбранные на основании компьютерного алгоритма.

Разработанный метод экстракорпоральной стимуляции антиген-специфических ЦТЛ после предварительной селекции Т лимфоцитов позволяет на ранних этапах культивирования обогащать Т клеточную популяцию антиген-специфичными эффекторными клетками путем негативной селекции неспецифических аллореактивных лимфоцитов. Благодаря такому подходу предоставляется возможность в короткие сроки производить необходимое количество противоопухолевых или противовирусных ЦТЛ для проведения адоптивной клеточной иммунотерапии без риска развития РТПХ. Сокращение сроков получения таких ЦТЛ критически необходимо при лечении больных с ЦМВ в раннем посттрансплантационном периоде и с фульминантными формами ЭБВ-ЛПЗ, приводящими к летальному исходу в течении 21 дня в отсутствии специфической терапии. Кроме того, деплеция аллореактивных Т лимфоцитов необходима для проведения адоптивной иммунотерапии ЭБВ-ЛПЗ аллогенными Т клетками больным с длительной иммуносуппрессией после пересадки органов экстрамедулярной локализации, при которой с одной стороны сохраняется собственная гемопоэтическая система реципиента, а с другой стороны присутствует трансплантат второго

10

донора. Таким образом, при проведении адоптивной клеточной иммунотерапии Т лимфоцитами, содержащими аллореактивную популяцию, повышается риск не только РТПХ, но и отторжения пересаженного органа. Предотвратить подобные осложнения можно путем изначальной деплеции аллореактивных Т клеток, предложенной в данном исследовании.

Проведенные исследования по мониторированию миграции, персистенции и пролиферации адоптивно введенных Т и НК клеток в условях живого организма позволяют рассчитать дозу и режим введения клеточных препаратов, а также дополнительно использовать компоненты, повышающие экспрессию ключевых молекул взаимодействия эффекторных клеток с их специфическими мишенями. Кроме того, понимание роли различных субпопуляций Т клеток в противоопухолевом ответе способствует разработке критериев качественного контроля вводимых больному ЦТЛ и методов их экстракорпоральной активации.

Идентификация на опухолевых клетках эпителиального происхождения специфического лиганда (MICA), вступающего во взаимодействие с активирующим рецептором на НК клетках (NKG2D), а также описание механизмов их ингибирования позволило разработать адоптивную клеточную терапию с помощью активироватх НК клеток для опухолей, не экспрессирующих HLAI и П класса и, соответственно, резистентных к цитотоксическому действию Т клеток.

Изучение типа ЭБВ-специфичного Т клеточного ответа у больных после ТКМ с различными режимами кондиционирования выявило ожидаемый тип рестрикции антиген-специфических ЦТЛ, развивающихся в организме больного в зависимости от химеризма циркулирующих антиген-презентирующих клеток, что с высокой вероятностью может использоваться при планировании профилактической адоптивной клеточной иммунотерапии, выборе донора Т клеток и необходимости дифференцированного применения вразличных видов АПК при экстракорпоральной стимуляции клеток-эффекторов для получения ЦТЛ, способных распознавать клетки-мишени генетической природы донора или реципиента в контексте соответствующих HLA аллелей.

Проведенные клинические исследования адоптивной иммунотерапии ЭБВ-ЛПЗ продемонстрировали эффективность и безопасность этого метода лечения для различных групп больных, включая пациентов после пересадки костного мозга и органов. Выявленные случаи резистентности к терапии ЦТЛ способствовали выявлению факторов, отрицательно влияющих на терапевтический эффект ЦТЛ, что позволит проводить их коррекцию в будущем

Проведенная в данном исследовании характеристика групп онкологических и онкогематологических больных в зависимости от уровня экспрессии WT1 и различных ко-стимуляторных молекул позволила разработать прогностические критерии

11

чувствительности к Т клеточной терапии этих патологий для набора групп пациентов при проведении клинических исследований по изучению эффективности и безопасности лечения \УТ1-реактивными ЦТЛ.

Благодаря проведенным исследованиям по выращиванию противоопухолевых Т клеток из образцов МКПК больных с опухолями, экспрессирующими \\ГГ1, представляется возможным проводить лечение таких пациентов аутологичными Т клетками, которые могут циркулировать в организме дольше чем аллогенные ЦТЛ, и обеспечивать более длительную противоопухолевую защиту, и, одновременно, не создают риск развития РТПХ.

Внедрение в практику:

Разработанный метод определения частоты предшественников антиген-специфических Т клеток с помощью измерения уровня продукции ИФНу широко применяется для характеристики интенсивности специфического ответа различных Т клеточных популяций как на этапах разработки новых подходов к клеточной иммунотерапии, так и для оценки Т клеточного ответа у больных, получающих адоптивную терапию по поводу ЭБВ-ЛПЗ и ЦМВ в МСКОЦ и Пресбитерианском Нью-Йоркском Госпитале .

Метод стимуляции пулом перекрещивающихся пентадекапептидов применятся в лаборатории АКИТ МСКОЦ для определения типа антигенного ответа отдельного взятого донора и его характеристики.

Стадию клинического внедрения прошли ряд методов, разработанных в ходе описанных ниже исследований:

Клинические испытания адоптивной клеточной иммунотерапии с применением Т клеток, полученных из фракционированных МКПК путем экстракорпоральной активации аутологичными В-ЛКЛ при лечении больных с ЭБВ-ЛПЗ после ТКМ и пересадки органов проводится на базе МСКОЦ. На данный момент ЭБВ-специфичные Т клетки были введены 25 больным с клинико-морфологическими и лабораторными признаками ЭБВ-ЛПЗ.

Адоптивная терапия ЦМВ специфичными Т клетками, полученными путем экстракорпоральной стимуляции Т лимфоцитов пулом пентадекапептидов, кодирующих полную последовательность рр65 - иммуногенного белка ЦМВ -, проводилась в рамках ограниченных клинических испытаний 4 больным после пересадки костного мозга на базе МСКОЦ и Пресвитерианского Госпиталя в Нью-Йорка. Результаты, полученные в ходе данных исследований, легли в основу клинического протокола, подготовленного и одобренного для лечения аналогичной группы больных на базе МСКОЦ.

Результаты исследований по анализу Н1А рестрикции Т клеток донора, развивающихся в микроокружении организма реципиента после гаплотип-вдентичной пересадки костного

12

мозга, проведенные на группе из 22 больных на базе МСКОЦ были использованы для разработки клинического протокола по применению искусственных антиген-презентирующих клеток для экстракорпоральной активации опухоле- и вирус-специфических Т клеток, одобренного к клиническому применению в МСКОЦ.

Разработанная система генетической модификации антиген-специфичных Т клеток путем внедрения ретровирусного вектора, кодирующего тимидин киназу вируса герпеса в качестве «суицидального», визуализирующего и «селектирующего» маркера на образцах от 30 доноров, позволила внедрить методы ускоренной селекции и размножения антиген-специфичных Т клеток для лечения больных с фульминантной формой ЭБВ-ЛПЗ. На основании проведенных исследований совместно со службой молекулярной визуализации МСКОЦ внедрены методы биологической оценки и визуализации эффективности Т клеточной терапии путем неинвазивного мониторирования адоптивно введенных Т клеток при лечении ЭБВ-ЛПЗ, рака толстого кишечника, рака яичников, ОМЛ, и ОЛЛ на основе молекулярного анализа.

Данные, полученные в ходе динамического наблюдения за миграцией и персистенцией адоптивно введенных компонентов Т клеточной терапии, положены в основу доз и режимов клинических протоколов адоптивной клеточной иммунотерапии, проводимой на базе МСКОЦ и Уэйльского Корнельского Университета.

Благодаря данным, полученным в ходе исследований факторов, необходимых для взаимодействия эффекторных клеток с клетками-мишенями, разработана система повышения экспрессии ключевых молекул этого процесса, которая применяется при оценке опухолеспецифической цитотоксичности ЦТЛ к клеткам рака яичника, рака толстого кишечника, рабдомиосаркомы.

На основании результатов исследований по экстракорпоральной активации \УТ1-специфичных Т лимфоцитов и изучению механизмов их действия были подготовлены и одобрены к применению клинические протоколы 1-2 фазы по лечению ОМЛ, ОЛЛ, ХМЛ, и рака яичников на базе МСКОЦ и Пресвитерианского Нью-Йоркского Госпиталя

Результаты, полученные в ходе оценки прогностической значимости фенотипической характеристики злокачественных клеток в отношении эффективности адоптивной иммунотерапии и прогноза заболевания были внедрены в создание скрининговой системы, позволяющей в ходе анализа полученных при заборе образцов тканей и клеток устанавливать чувствительность опухоли к цитотоксическому воздействию Т клеток, вероятность их миграции и персистенции в опухоли, а также степень опухолевой активности по подавлению их действия и прогноз течения заболевания в целом.

Благодаря проведенным исследованиям по изучению механизмов ингибирования активности НК клеток у больных с раком эпителиального происхождения разработан и

13

внедрена в практику методика активации НК клеток для проведения адоптивной иммунотерапии опухолей со сниженной экспрессией HLA молекул I класса с одновременным блокированием растворимой формы MICA.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Дифференциальное использование антигенпрезентирующих клеток позволяет осуществлять направленную экстракорпоральную активацию антиген-специфических Т клеток с управляемой рестрикцией по заданному HLA аллелю с целью их последующего использования для проведения адоптивной клеточной иммунотерапии опухолевых и вирусных заболеваний.

2. Трансдукция антиген-специфичных Т лимфоцитов, ретровирусным вектором, кодирующим тимидинкиназу вируса простого герпеса, осуществленная после специфической антигенной экстракорпоральной стимуляции на ранних сроках культивирования обеспечивает быструю селекцию высокоспецифичных ЦТЛ, не имеющих аллореактивности против здоровых тканей больного, и контролируемых при введении пациентам с помощью «сиуцидальной» функции данного вектора.

3. Неинвазивное мониторирование адоптивно введенных иммунных клеток позволяет изучить механизм и динамику клеточного ответа при проведении клеточной иммунотерапии, коррегировать ее дозово-временной режим в масштабе реального времени и изучать и коррегировать факторы опухолевой резистентности и функциональные особенности вводимых клеточных субпопуляций, снижающие эффективность проводимого лечения.

4. Экстракорпоральная активация Т клеток пулом перекрещивающихся по аминокислотным поледовательностям пентадекапептидов дает возможность идентифицировать новые наиболее иммуногенные эпитопы, имеющие наибольшее функциональное значение в противовирусном и противоопухолевом Т клеточном ответе каждого отдельно взятого донора, для проведения более эффективной адоптивной клеточной иммунотерапии этих заболеваний у широкого спектра больных вне зависимости от их HLA типа.

5. Активация аутологичных НК клеток больных с опухолями эпителиального происхождения путем блокирования подавляющих их активность растворимых молекул, выявленных в данном исследовании, предоставляет эффективный инструмент направленной клеточной иммунокоррекции для лечения опухолей со сниженной экспрессией HLA молекул 1 класса и, следовательно,

14

резистентных к HLA-зависимой Т клеточной противоопухолевой цитотоксичности.

6. Изучение типов HLA рестрикции и доминантных эпитопов ЭБВ-специфического Т клеточного ответа, формирующегося у больных после ТКМ на фоне различных видов химеризма и выявляемого для Т клеток той же генетической природы, развивающихся в организме донора, подтверждает необходимость применения разработанного выше метода экстракорпоральной стимуляции Т клеток с управляемой рестрикцией по заданному HLA аллелю и антигенному эпитопу.

7. Адоптивная Т клеточная терапия ЭБВ-ЛПЗ является эффективным и безопасным методом направленной имунокоррекции для лечения этих состояний у больных с длительными иммуносуппрессивными состояниями после пересадки костного мозга и органов.

8 Экстракорпоральная активация Т лимфоцитов с помощью пула перекрещивающихся пентадекапептидов, кодирующих полную последовательность белка рр65, позволяет проводить эффективную иммунотерапию тяжелых форм ЦМВ инфекции, развивающейся у больных после ТКМ и резистентной к терапии ганцикловиром.

9. Фенотипический анализ опухолевых клеток, характеризующий экспрессию опухолеспецифического антигена WT1 и ко-стимуляторных молекул, необходимых для эффективного взаимодействия ЦТЛ с клетками-мишенями, позволяет прогнозировать терапевтическую эффективность планируемой клеточной иммунокоррекции и течение заболевания в целом.

10. Выявление WT1 специфичных Т лимфоцитов в крови онкологических больных с новобразованиями, экспрессирующими белок-онкоген WT1, делает возможным проведение опухолеспецифической адоптивной клеточной иммунотерапии у этой группы больных с использованием аутологичных Т клеток, активированных экстракорпорально.

11. Характеристика НК-клеточного ответа у больных с опухолями эпителиального происхождения, экспрессирующими MICA/B, и определение уровня растворимого MICA может, являеться показанием к проведению терапии активированными аутологичными НК клетками в сочетании с антителами, связывающими MICA молекулу.

Место выполнения работы.

Экспериментально-теоретическая часть выполнена на базе Мемориал Слоан-Кеттеринг Онкологического Центра, Нью-Йорк, США. Исследования проводились в отделениях педиатрии, гинекологии, гастроэнтерологии, трансплантации костного мозга, радиологии, ядерной медицины и терапии.

Клиническая часть работы, включая ретроспективный анализ популяций онкологических и гематологических пациентов и клинические испытания, проводилась на базе отделений педиатрии МСКОЦ, Пресвитерианского Нью-Йоркского госпиталя и Корнельского Университета, отделений гинекологии, гастроэнтерологии, трансплантации костного мозга и терапии МСКОЦ, и научно-клинического отделов ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава, Москва, РФ.

Апробаиия работы

Материалы и основные положения работы доложены на VI, VII и VIII Всероссийских Конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2000, 2001, 2002 и 2003гг.), на ежегодных конференциях Американского Общества Гематологов (Майами, 1998; Сан-Франциско, 2000; Филадельфия, 2001, 2002, 2003), Американского общества детских гематологов/онкологов (Чикаго, 1998), Международного общества гематологов (Амстердам, 1998), Сероно симпозиум (США, 1999), Международного общества клеточной терапии (Сан-Диего, 2000; Барселона, 2002), Американского общества Трансплантации костного мозга (Майами, 2002; Колорадо, 2003; Орландо, 2004; Колорадо, 2005; Гонолулу, 2006), Общества Ядерной Медицины (Орландо, 2002; Новый Орлеан, 2003); Общества Молекулярной Визуализации (Сан-Франциско, 2003).

Структура и объем диссеутаиии.

Диссертация состоит из следующих частей: введения (включающее цели и задачи диссертации, актуальность, практическое значение и внедрение); главы 1. Обзор научной литературы: Адоптивная клеточная иммунотерапия в онкологии и гематологии..; главы 2. Материалы и методы.; части, описывающей результаты исследований в составе: главы 3. Антиген-презентирующие клетки: дифференцированное использование для управляемой стимуляции Т лимфоцитов; главы 4: Обогащенные антиген-специфичные Т лимфоциты, методы ранней селекции; главы 5. Новые иммуногенные эпитопы вирусов и опухолевых клеток как специфичные антигены для Т клеточного ответа при адоптивной иммунотерапии онкогематологических;иммунных и вирусных заболеваний; главы 6. Факторы, влияющие на эффективность Т клеточной адоптивной иммунотерапии; главы 7: Активированные НК клетки онкологических больных как эффективный компонент НЬА-независимой

16

аутологичной клеточной иммунной терапии солидных опухолей; главы 8. Характеристика типа рестрикции Т клеточного ответа к ЭБВ у больных после различных протоколов ТКМ.; 9. Терапевтическая эффективность и безопасность специфической адоптивной клеточной иммунокоррекции у иммунокомпрометированных больных с ЭБВ-ЛПЗ и ЦМВ; главы 10: Определение прогностических факторов эффективности \\Т1 -специфичной противоопухолевой клеточной терапии и прогностической значимости экспрессии А^Т1 для прогноза течения заболевания в целом.; главы 11: Особенности противоопухолевого клеточного иммунного ответа у онкологических больных и возможности проведения адоптивной противоопухолевой иммунотерапии аутологичными эффекторными клетками, и Заключения, содержащего обсуждение результатов, Выводов исследований и Практических рекомендаций. Прилагется список использованной литературы и сокращений. Общий объем

диссертации составляет_страниц печатного текста и_страниц списка

литературы, сопровождаемых_иллюстрациями и_таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Экспериментально теоретические исследования.

Клеточные культуры.

Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) были выделены из образцов крови пациентов с онкологическими и онкогематологическими заболеваниями и здоровых доноров. Письменное согласие было получено в соответствии с протоколом клинических исследований, одобренным Комитетом по Исследованиям МСКОЦ.

В-ЛКЛ - В-лимфобластоидные клеточные линии - были получены в результате ЭБВ-трансформации путем культивирования МКПК в присутствии ЭБВ-содержащего супернатанта, собранного с материнской линии В95.8.

ДК - дендритические клетки - выращивались из адгезивной моноцитарной популяции МКПК в присутствии 0.4|ig/ml GM-CSF, 0.35ng/ml IL-4 и 10ng/ml TNFa.

ИАПК - искусственные антиген-презентируюшие клетки - были получены при генетической модификации комерческой клеточной линии мышиных фибробластов (ЗТЗ) путем ретровирусной трансфекции векторов, кодирующих костимуляторные молекулы 02-микроглобулин (Р2-МГ), ICAM-1, LFA-3, В7.1, выбранный HLA-A0201 аллель основного комплекса гистосовместимости человека и представленный в контексте этого аллеля нонамер, кодирующий аминокислотную последовательность пептида YLLEMLWRL (L1),

17

являющуюся одной из наиболее иммуногенных последовательностей LMP1, связывающихся с HLA-A0201 аллелем.

ЦТЛ - цитотоксические Т лимфоциты - выращивались экстракорпорально путем повторной стимуляции фракции МКПК, очищенных от моноцитов и НК-клеток, антиген-презентирукяцими клетками (АПК), несущими стимулирующий антиген, в присутствии 10-20 Ед/мл интерлейкина-2 (IL-2).

НК клетки - клетки натуральные (естественные) киллеры активировались в присутствии IL-2 и аутологичных В-ЛКЛ из фракции очищенных CD56+CD3' НК клеток онкологических больных и здоровых доноров.

Генная модификация эффекторных клеток - проводилась через 24 часа после антиген-специфической ре-стимуляции путем инкубирования Т клеток, предварительно активированных в течение 7 дней в присутствии специфического антигена (ЭБВ), с ретровирусным супернатантом, содержащим вектор, кодирующий «суицидальный» и визуализирующий гены. Клетки в последствии были отобраны с помощью флоуцитометрического сортинга или в присутствии неомицина.

Генные конструкции:

ВПГ-ТК - тимидин киназа вируса простого герпеса

ТК-ЗФП - ВПГ-ТК в комбинации с зеленьм флуоресценным протеином.

чНАТ - человеческий норадреналиновый транпортер

чНАТ- ЗФП - чНАТ в комбинации с ЗФП

Люк -Нео - люцифераза в комбинации с неомицин-резистентным геном.

Пептиды. Пептидные последовательности были синтезированы комерчески (Invitrogen, USA) в соответствии с требованиями GMP (good manufacturing practice - хорошая производственная практика) - стандартами производственного процесса для получения клинически применимых биологических компонентов в США.

9-меры - аминокислотные последовательности из 9 аминокислот, выбранные в качестве наиболее иммуногенных высокосвязывакяцихся с заданным HLA аллелем последовательностей WT1 (RMFPNALPYL, SLGEQQYSV, RVPGVAPTL) И LMP1 (YLLEMLWRL) протеинов в соответствии с прогностическим компьютерным алгоритмом В IM AS и SYFPEITHI, предсказывающим скорость диссоциации и степень связывания пептида с выбранным аллелем.

15-меры - пентадекапептиды, перекрывающиеся (перекрещивающиеся) по 10 или 11 аминокислотным последовательностям и представляющие в комплексе всю аминокислотную последовательность целого WT1 или рр65 ЦМВ протеина, представляющие соотвественно 113 или 141 пептид (для WT1 белка) и 138 пептидов (для рр65 ЦМВ белка)

Метод картирования пептидов Пентадекапептиды смешивались по 10-12 пептидов в мини-пулы в соответствии с сеткой-картой, где все пептиды были расположены по порядку один задругам, образуя от 22 до 24 мини-пулов по горизонтали и вертикали соответственно 10- или И-аминокислотным перекрестам. Один и тот же пентадекапептид содержался в двух взаимноперпендикулярных мини-пулах. Для стимуляции Т клеток использовался общий пул, включающий в себя все пентадекапептиды. При последующем анализе для выявления иммуногенных эпитопов проводилась вторичная стимуляция Т клеток мини-пулами, результат активации оценивался по уровню продуции нитерферона-гамма (ИФНу). Пересекающиеся взаимно-перпендикулярные пулы, дающие наибольшую стимуцляцию Т клеток, позволяли выявить иммуногенный зшпоп для Т клеток данного больного.

Измерение продукции внутриклеточного ИФНу Предварительно экстракорпорально активированные в присутствии специфического антигена Т клетки стимулировались вторично специфическим антигеном в течении 16 часов. Окрашивание с помощью флюоресцентно-меченных анти-ИФНу антител проводилось после пермеабилизации клеточной мембраны. Результаты окрашивания считывались на флоуцитометре.

Определение специфической цитотоксичности Т клеток и идентификация рестриктирующего доминантного НЬА аллеля. Исследуемые Т клетки инкубировались в течение 4 часов с предварительно меченными 51Сг мишенями, экспрессирующими один из НЬА аллелей, представленных на Т клетках, и несущими специфический и неспецифический антиген. Уровень выделенного в результате цитотоксического действия Т клеток радиоизотопа из лизированных клеток-мишеней измерялся в гамма-счетчике.

Определение уровня предшественников антиген-спепифичных ЦТЛ ШТЛп1 с помощью метода ограниченных разведений Исследуемая популяция с эффекторными клетками распределялась в 96-луночный планшет в 8 разведениях и инкубировалась со специфическим антигеном, предтавленным на АПК, в течение 2 недель. Для определения количества специфических ЦТЛп полученные эффекторные клетки инкубировались со специфическими и аллогенными мишенями. Специфическая цитотоксичность измерялась по высвобождению 51Сг. Лунки с позитивной цитотоксичностью регистрировались и анализировались с помощью специальной статистической программы, которая определяла абсолютное число антиген-специфичных ЦТЛп в изначальной клеточной популяции.

Производство тетрамеров. Тетрамеры были получен по ранее опубликованной методике, в соответствии с которой мономерные комплексы НЬА аллеля, р2-мг и выбранного пептида биотинилировались и затем тетрамеризовались вокруг молекулы стрептавидина, связанного с флюоресцентным фикоэритрином (РЕ).

Первичные опухолевые клетки - были выделены из первичных образцов опухолевых тканей, крови и костного мозга больных с онкологическими или онкогематологическими патологиями.

Клеточные линии - обессмерченные опухолевые, лимфомные и лейкемические клеточные линии были получены путем повторных пересевов в иммунодефицитных животных.

, Вирус-продицируюшие клеточные линии: для получения ретровирус-содержащих супернатантов использовались комерчески доступные линии Н-29 (предоставленная лабораторией д-ра Саделайна (МСКОЦ) и PG-13 (АТСС), основанная на модификации ГАЛВ (вирус лейкоза обезьян-гиббонов). Клетки культивировались в инкубаторе при тепературе 37°С в 5% СОг в клеточных средах (Gibco)

Молекулярно-биологические методы

Выделение мРНК. ДНК Приготовление образцов клеточных культур проводилось путем трипсинизации в течение 5 мин с последующей нейтрализацией средой с сывороткой и отмыванием. Выделение РНК проводилось стандртным набором РНЕази (Квиаген).

Полимеразная цепная реакция проводилась согласно стандартному протоколу с предварительным нагревом до 95°С для денатурации ДНК и игибирования ферментов за исключением термостабильной полимеразы (Так). После инициации первой цепи в течение около 5 мин проводилось циклическое нагревание/охлаждение образцов с целью прерывания синтеза и его инициации путем выстраивания праймеров комплиментарно к специфическому участку. Температура выравнивания подбиралась соответственно компьютерному дизайну и спецификациям праймеров. Обратная реакция ставилась в 2 этапа с предварительным нагревом по методу, описанному компанией-производителем Амбион с преапаратами из набора РТ (Амбион).

Вестерн блот: Проводился с использованием электрофореза в стандартном денатурирующем буфере в акриламидном геле с полужидкостным переносом на мембрану на установке Биорад. Проявка мембран после окрашивания специфическими первичными и видоспецифичесскими вторичными антителами осуществлялась наборами Вектор Елайт с люминисцентной окраской.

ELISA Проводилась с использованием стандартных протоколов, первичных антител к определяемым антигенам (Santa Cruz Biotechnology; R&D Systems, MN), вторичных антител, связанных с пероксидазой хрена, и стандартных комерческих наборов. Результаты считывались при длине волны 450нм и 570 нм .

Иммуногистохимический анализ. Образцы опухоли, зафиксированные в формалине, были депарафинизированы после парафинизации и окрашены первичными и вторичными биотинилированными антителами при последующей ко-инкубиции со стрептавидином,

20

коньюгированным с пероксидазой хрена. Для исследования внутритканевых коньюгатов эффекторных клеток и клеток-мишеней с помощью флюоресцентной микроскопии препараты, подготовленные, как было описано выше, и зафиксированные в 3% параформальдегиде, были окрашены первичными антителами в 0.01% растворе сапонина/0.25% рстворе желатина/0.02% NaN3 и затем вторичными антителами в течение 1 часа. Препараты анализировались с помощью обратной микроскопии с использованием компьютерной программы ShdeBook (Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado)

Экспериментальные модели опухолей

Подкожные опухоли. Подкожные опухоли создавались путем введения в кожную складку различной локализации 106-107 опухолевых или лейкемических клеток в зависимости от проводимых исследований.

Линии животных. Для проведения экспериментов использовались SCID и NOD/SICD линии иммунодефицитных мышей, не имеющих собственных Т и НК клеток, с целью создания наиболеее благоприятных условий для приживления человеческих клеток как опухолевой природы, так и эффекторных клеток, при моделировании адоптивной противоопухолевой иммунотерапии.

Для изучения эффективности, механизмов действия, персистенции и направленности перемещения эффекторных клеток при адоптивной клеточной иммунотерапии ЦТЛ и НК клетки вводились внутривенно через пенальную вену под общей анестезией.

Для определения терапевтических доз эффекторных клеток применялась разработанная д-ром Дубровиным М.М. методика подсчета абсолютного числа введенных Т клеток, экспрессирующих ТК-ЗФП в результате генетической модификации, которая позволила определить минимальную дозу антиген-специфических ЦТЛ, достаточную для ингибирования роста опухоли. Для этого, Т клетки, меченные с помощью репортерных генов, вводились в разных дозах внутрь специфической опухоли. Интенсивность сигнала измерялась с помощью позитронно-эмиссионной томографии. Размеры опухоли определялись каждые 3 дня путем вычисления объема подкожного узла, полученного в результате измерения двух наибольших диаметров, по формуле: V (cm3) =7iD3/6, где D - это средний диаметр.

Образцы тканей и жидких сред животных собирались посмертно.

Аппаратура.

Микроскопия. Пороговая микроскопия осуществлялась с фазовым контрастным фильтром на инвертированных микроскопах Найкон Эклипс ТС-100 и ЕС-50 с применением фотооптической регистрации изображения и обработкой программами НТИ-имидж 1юЗ и М-кит 6.0.

Флуоресцентная микроскопия проводилась на микроскопе Найкон Эклипс ТС-100 с наборами светофильтров для ФИТСИ (480нм.525нм) и Родамина (535нм.580нм).

Конфокальная микроскопия проводилась на микроскопе Цейс Аксиоверт-100 и Цейс Аксиоверт-200М с установкой глубины 3-стака в 150мкм.

Флоуцитометрия. Анализ проводился на машинах ФАКСКалибур (Бектон-Диюсенсон).

Сортировка осуществлялась на аппарате МоФло (ЦитоНейшн) с использованием до 3 лазеров.

Флоури-/люмино-/спектро-/Фотометрия. Фотооптический анализ проводился на машинах Термолюкс/Атари/Шимадзу соответственно.

ЭпиФлюоресценпия Кодак - осуществлялась на универсальном имиджинговом центре Кодак Р-2000 в режимах флюоресценции, биолиминесценции и сцинтиграфии.

Биолюминисценция. Для регистрации сигнала биолюминисцентных репортерных систем (люциферазы) использовался аппарат ИВИС (Ксеноген) с люцифериновым субстратом ХР-0001 той же компании.

Гамма камеры. Использовались клинические гамма-камеры Филипс-Адак Форте и Аксиоверт. Обработка изображений осуществлялась на стандартном компьютерном обеспечении камер.

ПЭТ. Дженерал Электрик РЕТ-Ас1уапсе использовался для ранних исследований, а также для получения изображений больших групп животных одновременно, позволяя повышать статистическую значимость получаемых результатов исследований.

МикроПЭТ Проводился на аппарате МикроПЭТ (конкорд биосистемс).

Компьютерный томограф одиночных фотонов (СПЕКТ). Проводился на аппрате Х-СПЕКТ компании Авиа Медика.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР1. Для проведения ЯМР использовались аппараты Дженерал Электрик ЗТ и 4.7Т для визуализации животных с большим разрешением.

Электронное совмещение изображений. Осуществлялось программным обеспечением Кобра и Амира 5.0

Гамма-счетчик. Подсчет гамма частиц в Люмафильтрах при проведении определения цитотоксичности методом высвобождения 51Сг из клеток-мишеней проводился в гамма-счетчике компании ПеркинЭлмер.

Клинические исследования.

Общая характеристика больных.

Основу клинической части работы составляет анализ данных, полученных при проведении различных видов адоптивной клеточной иммунотерапии в ходе клинических испытаний 1-2

фазы и ретроспективных исследований, проведенных на 305 пациентах и 420 здоровых донорах.

В состав исследований входили: изучение типа рестрикции Т клеточного ответа, формирующегося у больных после различных режимов ТКМ; оценка терапевтической эффективности антиген-специфичной клеточной иммунотерапии по сравнению с инфузией неспецифических донорских лейкоцитов; выявление прогностических факторов эффективности адоптивной иммунотерапии и роли WT1 как прогностического фактора течения заболевания; изучение собственного -специфичного противоопухолевого клеточного иммунитета у онкологических больных и разработка методологии аутологичной клеточной иммунотерапии для лечения больных с опухолями, не экспрессирующими молекулы основного комплекса гистосовместимости.

В исследовании были проанализированы больные с различными онкогематологическими нозологиями, представленными в таблице 1. Таблица 1. Распределение больных по нозологиям.

НОЗОЛОГИЯ КОЛИЧЕСТВО БОЛЬНЫХ

Рабдомиосаркома 11

Мезотелиома 14

Нейробластома 11

Саркома Юинга 10

Панкреатобластома 1

Остеогенная саркома 7

Опухоль Вильмса 2

Острый лимфобластный лейкоз 28

Острый миелобластный лейкоз 37

Неходжкинская лимфома 8

Миелодиспластический синдром 6

Хронический миелолейкоз 87

Лимфосаркома 1

Рак толстого кишечника 15

Рак яичников 10

ЭБВ-ассоциированные лимфопролиферативные заболевания 47

Тяжелая комбинированная иммунологическая недостаточность (ТКИН) 10

Всего больных 305

В демографической характеристике больных преобладали больные в возрасте до 18 лет (74%). Распределение по признаку пола было относительно равномерным , включая 163 мужчины и 142 женщины (р>0.1). Было проанализировано 305 историй болезни пациентов, находившихся на лечении в МСКОЦ и Пресбитерианском Нью-Йоркском госпитале (Таблица 1), включая 81 пациент с солидными опухолями, такими как рабдомиосаркома, нейробластома, мезотелиома, саркома Юинга, панкреатоблстома, остеогенная саркома, опухоль Вильмса, рак толстого кишечника, рак яичников, 167 больных с онкогематологической патологией, включая острые лимфо- и миелолейкозы, неходжкинские лимфомы, миелодиспластические синдромы (МДС), хронический миелолейкоз (XMJI), а также 47 больных с ЭБВ-ЛПЗ и 10 больных, перенесших ТКМ по поводу тяжелой комбинированной иммунной недостаточности (ТКИН) (SCID - severe combined immunodeficiency)).

Адоптивная клеточная иммунотерапия проводилась на основании клинических протоколов, утвержденных комитетом МСКОЦ для проведения 1-2 фазы клиничских испытаний. Клеточные компоненты для проведения терапии производились в лаборатории адоптивной иммунной клеточной терапии МСКОЦ, сертифицированной для производства клинически применимых клеточных продуктов, с применением протоколов, одобренных FDA (Food and Drug Administration, USA).

Клинические испытания:

Изучение рестрикции Т клеточного ответа. Формирующегося у больных после пересадки костного мозга.

Исследование проводилось на 10 больных с ТКИН спустя 20 лет после пересадки костного мозга с SBA'E' деплецией Т клеток от одного из родителей, совместимого с реципиентом по HLA гаплотипу. У всех больных отмечался длительный период после приживления трансплантата и полное или частичное восстановление функции Т клеток. Предтрансплантационная подготовка у 3 из обследованных больных не включала никакой циторедукции, двое пациентов получали циклофосфамид и 5 пациентов получали бусульфан и циклофосфан в соответствии со стандартными протоколами лечения. Тип химеризма после проведенной ТКМ определялся по HLA типированию на основании анализа ДНК образцов нефракционированных МКПК, Т клеток и В клеток, полученных из образцов крови больных через 20 лет после ТКМ. B-JIKJI были трансформированы из МКПК, выделенных из образцов крови больных, собранных до ТКМ и через 20 лет после ТКМ, а также из клеток донора костного мозга. Т клеточные линии, специфичные к ЭБВ, были получены путем экстракорпоральной стимуляции Т клеток донора костного мозга,

24

больного до и через 20 лет после ТКМ с помощью В-ЛКЛ донора и больного. Клетки культивировались 27 дней в присутствии 11,-2. Иммунофенотип полученных Т клеточных линий, а также выделенных из них клонов, определялся с помощью флоуцитометрического окрашивания специфичными антителами и ФАКС анализа. Специфичность и НЬА рестрикция Т клеток донора и больного до и после ТКМ определялась по их цитотоксическому действию на клетки-мишени, меченные 51Сг, в стандартном методе по высвобождению радиоизотопа из лизированных Т лимфоцитами клеток.

Исследование терапевтической эффективности адоптивной клеточной иммунотерапии у больных с онкогематологическими заболеваниями

В исследование по изучению клинической эффективности и безопасности адоптивной терапии с помощью инфузии неселектированных лейкоцитов донора было включено 135 больных (Таблица 3). Пациентам внутривенно вводились возрастающие дозы неселектированных лейкоцитов донора костного мозга из расчета О.ЗхЮ7,1.0х107,10х107, 50x107 СОЗ+ Т клеток на 1кг массы тела с повторными инфузиями от 4 до 20 недель. Пациенты обследовались через 2-4 недели после каждого введения. Введение лейкоцитов прекращались при наличии признаков нарушения гематологических показателей, изменений в показателях лейкоцитов, а также их молекулярных и цитологических характеристик, развитии РТПХ, изменении химеризма Т клеток и гранулоцитов. Исследование терапевтической эффективности адоптивной клеточной иммунотерапии ЭБВ-ЛПЗ у больных с длительной иммуносуппрессией.

В исследование было включено 47 больных (Таблица 4) с ЭБВ-ассоциированными лимфопролиферативными заболеваниями, развившимися на фоне длительной иммуносуппрессии после пересадки костного мозга (п=41), пересадки органов (п=5), ВИЧ (п—1).

Из них 22 больных, развивших ЭБВ-ЛПЗ после ТКМ, получали ДЛИ, а ЭБВ-специфичные ЦТЛ вводились 19 больным с ЭБВ-ЛПД после пересадки костного мозга, 5 больным после пересадки органов и 1 больному с ЭБВ-ЛПЗ на фоне ВИЧ инфекции.

В двух случаях после ТКМ ЭБВ-пораженные В клетки имели смешанную генетическую природу донора и реципиента, у остальных 39 больных с ЭБВ-ЛПЗ после пересадки костного мозга лимфопролиферация была обусловлена ЭБВ-пораженными клетками донора. У всех больных с пересадкой органов ЭБВ-ЛПЗ было представлено клетками реципиента. В 75% случаев ЭБВ-ЛПЗ было выявлена моноклональность, би- и поликлональные характеристики отмечались у 7% и 14% больных соответственно.

Таблица 2. Группа больны! с тяжелыми комбинированными иммунодефицитами.

№ Вид дефекта при SCID Вид цигоредукции ДатаТКМ Донор костного мозга Patient HLA type Bone Marrow donor HLA type

1. «Capping» Бусульфан/цнклофосфан 07/26/84 Мать А0205 B490I C070I DRB^Ol DOBjp201 A2402 B4001 C0304 DRB.0103 DQB,0303 A2402 B4001 C0304 DRB.0103 DQB,0303

2. «Capping» Бусульфан/цнклофосфан 03/22/89 Мать A2402 B1501 C0401 DRB,0701 DQB.0303 A2402 B4001 C0304 DRB.0103 DQB,0303

3 «Capping» Бусульфан/цнклофосфан 08/02/84 Мать A030I B1501 C0303 DRB11101 РОВ^ЗО! A2402 B3501 C0401 DRB,I30I DQB.0603 A0301 B3501 C0401 DRB^lOl DOBjOiOl A2402 B3501 C0401 DRB.1301 DQB,0603

4. АДА Бусульфан/цнклофосфан 09/28/87 Мать A0201 B4001 C0304DRB,1302DC>Bl0604 A3201 B0701 C0702DRB.1501 DQB,0602 A0201 B0702 C0702DRBJ0701 DOB,0201 A3201 B1302C0602DRB,1501 DQB,0602

5 В клеточный Не проводилась 04/15/82 Отец A0101 B0702 C0702 DRBjOlOl DOB,0501 A2402 B1501 CO 102 DRB,1301 DQB,0603 A0201 B0702 C0702 DRBjOIOl DOBjCEOl A0101 B0801 C0701 DRB.0301 DQB,0501

б. АДА Бусульфан/цнклофосфан 09/23/87 Маггь A3201 B0702 C0702 DRB,1501 DQB,0602 A0201 B0702 C0702DRB11501 DOB|0602 A3201 B1302C0602DRB.070I DQB,0201

7 АДА Не проводилась 07/14/82 Мать Д0201 B1501 СОЗОЗ DRBi1301 ТОВ^З A6802 B3901 C0702 DRB.0407 DQB.0301 A010I B0801 C0702DRB11501 DOBJ0602 A6802 B3901 C0701 DRB,0407 DQB,0301

8. В клеточный Х-связвнный Не проводилась 10/20/88 Мать A0201 B3501 C0401 DRB)0404 ГЮВ^ЗОг A0301 B5301 C0401 DRB]1602 DQB.0502 A740I B5301 C0401 DRB,1602 DQB,0502

9. Х-связаиный «Capping» Циклофосфан 01/28/81 Мать A3201 B0801 C070I DRBj0301 A0201 B4402 C050I DRB.040I A0201 B4402 C0501 DRBj0401 A0201 B4402 C0501 DRB,040I

10. Х-свяэанный «Capping» Циклофосфан 02/25/84 Мать A3201 B0801 C0701 DRBjOJOl A0201 B4402 C0501 DRB,0401 A0201 B4402 C0501 DRBJ0401 A0201 B4402 C0501 DRB.0401

Таблица 3. Пациенты, получавшие адоптивную клеточную терапию ДЛИ.

Нозология Количество больных

ХМЛ: Цитогенетический рецедив 17

Гематологический рецидив 53

Фаза трансформации 14

Полицитемия 1

ОМЛ 23

мдс 5

ОЛЛ 22

Всего 135

Таблица 4. Группа больных, получивших адоптивную клеточную терапию по поводу ЭБВ-ЛПЗ после трансплантации.

Вид Число больных, Генетическая природа ЭБВ-

трансплантации получавших поралсенных клеток пациентов с

АКИТ ЭБВ-ЛПЗ, развившимся в пост-

трансплантационном периоде

ЦТЛ ДЛИ пациент донор Донор и пациент

ТКМ/ТД/НРС 4 3 0 7 0

ТКМЛГД/НРНС 9 2 0 11 0

ТКМЯД/РС 1 10 0 9 2

ТКМ/ТД/РНС 5 7 0 12 0

Пересадка 2 0 2 0 0

печени

Переадка сердца 1 0 1 0 0

Пересадка почки 2 0 2 0 0

ВИЧ 1 1 0 0

Всего 25 22 6 39 2

ТКМ /ТД/НРС - ТКМ с деплецией Т клеток от неродственного НЬА совместимого донора ТКМ/ГД/НРНС - ТКМ с деплецией Т клеток от неродственного НЬА несовместимого донора ТКМ/ТД/РС - ТКМ с деплецией Т клеток от родственного НЬА совместимого донора ТКМ/ГД/РНС - ТКМ с деплецией Т клеток от родственного НЬА несовместимого донора

Критерием дл проведения адоптивной клеточной иммунотерапии являлось повышение ЭБВ-ДНК в крови больных, определяемое в течение трех последовательных измерений в течение двух недель, наличие увеличенных лимфоузлов, низкий уровень предшественников ЭБВ-специфичных Т клеток (ЦТЛп), определяемый с помощью метода ограниченных разведений в периферической крови больных, окрашиванию тетрамерами и уровню продукции ИФНу при 16-часовой стимуляции ЭБВ-трансформированными В-ЛКЛ. ДЛИ вводились внутривенно в дозе 0.2-1.3х106 СБЗ+Т клеток /кг. Ответ на терапию регистрировался по динамике уровня ЭБВ-ДНК с помощью количественного метода ПЦР в масштабе реального времени, ЭБВ-специфичных ЦТЛп и клиническим показателям.

Адоптированная клеточная терапия ЭБВ-специфичными ЦТЛ, не проявляющими аллореакгивности по отношению к здоровым тканям пациента и донора Т клеток, проводилась 25 пациентам с ЭБВ-ЛПЗ. ЦТЛ вводились по специальному разрешению директора лаборатории адоптивной клеточной иммунотерапии при соответствии клеточного продукта стандартам контрольных тестов качества, установленным протоколом. ЦТЛ вводились внутривенно в дозе 1х106 ЦТЛ/кг в течение трех последовательных недель с интервалом 7 дней. Результат терапии оценивался каждые 7 дней по уровню ЭБВ-ДНК, ЦТЛп и клиническим показателям. В случае отсутствия ответа на терапию в течение трех недель после окончания первого курса лечения проводился повторный курс лечения с эскалацией дозы до 5x106 ЦТЛ/кг.

Критерием для прекращения адоптивной клеточной терапии являлось проявление гиперреакгивности больного, требующее интенсивной терапии, признаки РТПХ и органной недостаточности.

Адоптивная терапия ЦМВ в пост-трансплантационном периоде проводилась 4 больным с повышенным уровнем ЦМВ и клиническими признаками текущей инфекции, не поддающейся терапии ганцикловиром. Т клетки донора костного мозга производились путем экстракорпоральной стимуляции аутологичными ДС, «нагруженными» пулом пентадекапептидов, кодирующих полную последовательность иммуногенного белка ЦМВ - рр65. Т клетки были протестированы на специфическую цитотоксичность. Иммуногенный эпитоп Т клеточной реактивности и рестриктирующий НЬА аллель были выявлены с помощью тестирования мини-пулов пентадекапептидов. Т клетки вводились в дозе 0.5x106/кг внутривенно еженедельно в течение 3 недель. Ответ на проводимую терапию оценивался по уровню анти-ЦМВ ЦТЛп, определяемому при окраске на специфические тетрамеры и на ИФНу. Критерием прекращения лечения было проявление РТПХ и органной токсичности.

Определение значимости фенотипических характеристик злокачественных клеток для прогнозирования эффективности адоптивной клточной иммунотерапии.

Для выявления прогностически значимых характеристик опухолей в отношении их чувтствительности к антиген-специфичной противоопухолевой клеточной иммунотерапии первичные образцы опухолевых клеток собирались у больных на разных стадиях заболевания, в исследование был включен 81 пациент с солидными опухолями (Таблица 1) и 83 больных с онкогематологической патологией. WT1 (Wilms' tumor protein 1 - белок опухоли Вильмса 1) был выбран в качестве специфического опухолевого маркера, являющегося потенциальной мишенью для планируемой Т клеточной терапии. Процент злокачественых клеток, экспрессирующих WT1, определялся с помощью внутриклеточного окрашивания флуоресцентно меченными моноклональными антителами к WT1 и ФАКС анализа. Другие важные ко-стимуляторные молекулы, предопределяющие прочность связывания эффекторных клеток с клетками-мишенями, а также вероятность и степень проявления их цитотоксического действия, измерялись с помощью антител, специфичных к HLA I, HLA II, CD18, CD54, CD80, CD86 и флоуцигометрического анализа. Охарактеризованные таким образом опухолевые клетки были использованы в качестве мишеней в стандартном методе по определению цитотоксичности предварительно приготовленных WT1 специфичных Т клеток с высвобождением !1Сг. Степень корреляции между пропорцией клеток, экспрессирующих WT1, и их цитолизом WT1-специфичными Т лимфоцитами определялся с помощью Кендел Тау статистического анализа. Изучение особенностей противоопухолевого клеточного ответа у больных с онкологическими заболеваниями

Противоопухолевый клеточный ответ изучался на группе из 30 онкологических и онкогематологических больных.

Для исследования особенностей Т клеточного противоопухолевого ответа пациентов в исследование были включены 10 больных с раком яичников и 5 больных с OMJI с подтвержденной иммуногистохимически экспрессией WT1 на первичных опухолевых клетках. Уровень противоопухолевых Т клеток оценивался путем окрашивания на тетрамеры, кодирующие иммуногенные последовательности WT1, представленные в контексте наиболее распространенных HLA аллелей А0201, А2402 и А0301. Фенотип антиген-специфичных противоопухолевых Т клеток, связывающихся со специфическими тетрамерами и продуцирующими ИФНу в ответ на специфическую стимуляцию, характеризовался с помощью окрашивания флюоресцентно-меченными антителами к маркерам эффекторных, регуляторных и наивных Т клеток. Возможность внедрения в практику методов аутологичной адоптивной

противоопухолевой терапии оценивалась по возможности экстракорпоральной активации функционально полноценных Т клеток, полученных от пациентов с WTl-экспрессирующими опухолями, способных проявлять опухолеспецифическую цитотоксичность в отношении аутологичной опухоли. Клеточный ответ периферических Т лимфоцитов сравнивался по аналогичным параметрам с функциональной активностью Т клеток, выделенных из опухолей тех же больных.

Клеточный противоопухолевый иммунитет больных с опухолями, не экспрессируклцими HLA молекулы на клеточной поверхности, оценивался по функциональному состоянию НК клеток, выделенных из МКПК 15 больных с раком толстого кишечника. Противоопухолевая активность этой клеточной популяции характеризовалась по экспрессии рецептора NKG2D, активирующего опухолеспецифичную цитотоксичность НК клеток больного против аутологичной опухоли эпителиального происхождения, экспрессирующей специфичный лиганд для NKG2D - MICA/B. Для выяснения причин подавления активности НК клеток у этой группы больных и способов ее коррекции определялся уровень растворимого MICA/B с помощью ELISA. Ж клетки больных и здоровых доноров подвергались воздействию сред, содержащих повышенные уровни растворимого MICA/B. Механизм подавления экспрессии NKG2D и сопряженных с ним других функционально важных активирующих рецепторов изучался на внутриклеточном уровне с помощью флюоресцентной микроскопии. Коррекция активации аутологичных НК клеток больных раком толстого кишечника проводилась путем добавления антител, специфически связывающих растворимые молекулы MICA/B.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ:

1. Антиген-презентируюшие клетки: дифференцированное использование для управляемой стимуляции Тлимфоцитов.

Аутологичные ЭБВ-В-ЛКЛ (ЭБВ-В-ЛЮР являются высокоэффективными антиген-презентирукяцими клетками. В данном исследовании нами была разработана методика получения Т клеток для проведения противоопухолевой адоптивной клеточной терапии, направленной против низкоиммуногенного опухолеспецифичного протеина WT1, который при этом одновременно является так называемым аутопротеином, экспрессирующимся в следовых количествах в здоровых тканях организма человека.

Стимуляция МКПК доноров, экспрессирующих Ш-А-А0201 аллель, аутологичными ЭБВ-В-ЛКЛ, нагруженными нонамерами ЯМБ и Б1ЛЗ, которые, согласно компьютерному алгоритму прогнозирования аффинности пептидов к НЬА аллелям, связываются с высокой вероятностью с НХА-А0201, позволяла получать Т клетки двойной специфичности: к ЭБВ и к ЩЧ(Рисунок 1 А,Б)

А.

g g. 100

1 1

2 о.

3 | ю

м —

5 °

аз (S

о о I

1

е < «j

§5 01

ЭБВ-ЦТЛ

WTI/ЭБВ- WTI/ДК-

0 0f

Ул

ЦТЛ

t* л

г. §

. .О

ЦТЛ

дк-цтл

Б.

О я 100" 10"

EBNA3C BZLF1 BMLF1 LMP2 LMP1

О О.

х а

08 £

2 Й

О

$

а _

о<

1

0.1-

¡->

001

ЙО

:V Ф

•• •

Рисунок 1. Сравнительная характеристика популяционных пропорций ЭБВ и WT1 специфичных Т клеток:

А. Процентное содержание WTl-специфичных CD8* Т лимцофитов, способных связываться с тетрамером, несущим специфический WT1 пептид и представляющий его HLA-A0201 аллель, в культурах ЦТЛ, полученных путем экстракорпоральной стимуляции аутологичными ЭБВ-В-ЛКЛ (ЭБВ-ЦТЛ), ЭБВ-В-ЛКЛ, нагруженными WTl-пептидом (WTl/ЭБВ-ЩЛ), аутологичными деадрнтическими клетками, нагруженными тем же WT1 пептидом (WTl/ДК-ЦТЛ) и дендритическими клетками без пептида (ДК/ЦТЛ) Б. Процентное содержание ЭБВ-специфичных Т клеток в ЭБВ-ЦТЛ, связывающихся с тетрамерами, несущими ЭБВ эпитопы (EBNA3C, BZLF1, BMLF1, LMP2, LMP1) в контексте презентирующего их HLA-A0201 аллеля.

При этом полученные Т клеточные лиши содержали сравнимые популяции ЭБВ и WT1 специфичных эффекторных клеток, которые со сравнимой аффинностью связывались со специфичными HLA/пептид тетрамерами и содержали большое абсолютное количество WT1 специфичных Т клеток, в то время как Т клетки, стимулированные ДК, нагруженными теми же пептидами, проявляли меньшую пролиферативную активность и содержали значительно меньше WT1 специфичных Т клеток в абсолютном количестве (Рисунок 2 А и Б).

А. ФАКС анализ профиля связывания ЭБВ и УУТ1 специфичных Т клеток с ЭБВ-и НМР/Н1_А-А0201 тетрамерами

ЭБВ-ЦТЛ |

2 и

№Т1/ЭБВ-

ЦТЛ

2 а

УЛЧ/ДК-ЦТЛ

032 %

■У 14% ч» г

ш ■Ш

Сй8 Р1ТС

ю8

С08 Р1ТС

10 20 30 Дни культиирования

Рисунок 2.

А. Сравнительная оценка аффинности ЭБВ и \УТ1 специфичных Т клеток,

способных связываться с тетрамером,несущим соответствующий специфичный эпигоп (ЕВКАЗС или ИМР) в контексте общего доминантного Ш.А-А0201 аллеля.

Б Пролиферативная активность \УТ1 специфичных ЦТЛ, полученных путем стимуляции аутологичными ДК (пунктирная линия) или ЭБВ-В-ЛКЛ (сплошная линия), нагруженными одним и тем же WT1 пептидом. Пролиферативная активность оценивалась по общему числу Т клеток в культуре (графики с квадратным символом) и по абсолютному числу тетрамер-связывающихся клеток (графики с треугольным символом).

*90 .-80 О 70 О ЯМР/ . дк-цтл [МШ ЭБВ-ЦТЛ гат ДК- ЦТЛ ГОШ ЭБВ-ЦТЛ ИИИ ДК- ЦТЛ КПП ЭБВ-ЦТЛ ЯМИ дк- ЦТЛ тя ЭБВ-ЦТЛ ИИИ ДК. ЦТЛ км» ЭБВ-ЦТЛ Ш1 ЭБВ. ЦТЛ

1 50 .2 40 О £ 30 20 10 -,1 -л

«»л •• VI* А *"

С034*-Костный мозг Пуповиннаякровь ф|"Абласты ЭБВ-В-ЛКЛ Лейкемии Солидные олух

Рисунок 3. Опухолеспецифичнан токсичность \УТ1 стимулированных Т клеток,

выраженная в % убитых клеток-мишеней, представленных вдоль горизонтальной оси, цитотоксическими Т лимфоцитами, полученными путем экстракорпоральной ствимуляции аутологичными ДК или ЭБВ-В-ЛКЛ, нагруженными ЛИР-пептидом \УТ1 (ШР/ДК-ЦТЛи ШР/ЭБВ-ЦТЛ соответственно).

Полученные Т клетки эффективно лизировали опухолевые и лейкемические клетки, экспрессирующие высокий уровень \"/Т1, и не оказывали цитотоксического действия на здоровые гемопоэтические клетки, включая клетки костного мозга, пуповинной крови и ФГА стимулированные бласты (Рисунок 3)

В экспериментальной модели адоптивной клеточной противоопухолевой иммунотерапии СОЗ+ЦТЛ специфически инфильтрировали ^УТ!1" лейкемическую опухоль, ингибировали ее рост (Рисунок 4 А,В) и не влияли на рост ШТ1"НЬА-А0201+ лейкемической опухоли (Рисунок 4Б). При этом также не отмечалось инфильтрации этой опухоли СОЗ+Т клетками (Рисунок 4Г)

А. Динамика роста подкожной ШТНЬА-АОгОГ В-ОЛЛ опухоли Б. Динамика роста подкожной \УТГША-А020Г В-ОЛЛ опухоли

s- 25

Е Т-.

~ 2' ЦТЛ / J-p=0.I5

5 15- № 'Г

». ' 16x10* I г J . Г

° 1J ЦТЛ î 1 h1*001

°0 12345678 Недели после подгажнога введения олукопевых клеток

Недели после подкожного введения опухолевых клеток

■ ■ Группа, получавшая только И-2 — ™ » Группа, получавшая терапию Т клетками,

стимулированными аутологачными ЭБВ-В-ЛКЛ

— Гругега, получавшая repáralo Т клетками, стимулированными аутояопиными ЭБВ-В-ЛКЛ, нагруженными WT1 пептидом RM связывающимся с Н1А-А0201 аллелем

СШ - сшистнчкги ииначимо

В Иммуногнстохимия УГ1*ША-А0201*В-ОЛЛ

Окраска на СОЗ клеточный Экспрессия WT1 маркер Т лимфоцитов

Г. Иммуногнстохимия WT1 ША-А()2(тВ-ОЛЛ

Окраска на СОЗ Экспрессия WM клеточный маркер Т

лимфоцитов

¡A"

Рисунок 4. \УТ1 специфичный противоопухолевый ответ Т клеток, полученных путем экстракорпоральной стимуляция, в экспериментальной модели адоптивной иммунотерапии \УТ1+ и \VT1~ лейкемических подкожных инфильтратов. А. Рост \\ТГНЬА-А020Г В-ОЛЛ и Б. ОТГНЬА-А020Г В-ОЛЛ при лечении ЦТЛ, специфичными к \\Т1/ЭБВ, в сравнении с ростом тех же опухолей при лечении ЦТЛ, специфичных к ЭБВ только или в отсутствии АКИТ.

Таким образом, аутологичные В-ЛКЛ являются эффективными АПК для презентации

низкоиммуногенных опухолеспецифических антигенов при экстракорпоральной активации Т

клеток для проведения адоптивной противоопухолевой иммунотерапии.

Аллогенные гомозиготные В-ЛКЛ. При экстракорпорально активации ЭБВ специфичных

ЦТЛ используются аутологичные ЭБВ-трансформированные В-ЛКЛ, для производства

Таблица 5. НЬА рестрикция ЭБВ-специфичного Т клеточного ответа донора, не совместимого по НЬА типу с реципиентом.

НЬА тип донора: А0101 А1101 В0801 В5201 С0701 С1201 ОКВ,0101 1404 ОС>В,05011X513,0502 НЬАтип : А0101 А0201 В0801 В5101 С0701 С1402 ОИВ^Ю! ОКВ,1101 ГХ)В,0501 1Х2В,0301

Клетки- мишени % цитотоксичности

Аутологичные ЭБВ-В-ЛКЛ 46

НЬА несовместимые ЭБВ-ЛКЛ 7

НЬА-АПОГ ЭБВ-В-ЛКЛ 44

Н1А-А010Г ЭБВ-В-ЛКЛ 8

НЬА-В0801+ ЭБВ-В-ЛКЛ 10

НЬА-В520Г ЭБВ-В-ЛКЛ 12

Н1АЛЖВ1 1 ЮГ ЭБВ-В-ЛКЛ 9

Таблица б.Модификация естественной НЬА рестрикции ЭБВ специфичных ЦТЛ донора при стимуляции гомозиготными аллогенными ЭБВ-В-ЛКЛ, совместимыми по гаполотипу, несущему общие с реципиентом НЬА аллели.

Донор НЬА рестриктирующие элементы ЭБВ-специфичных ЦТЛ, стимулированных:

Аутологичными ЭБВ-В-ЛКЛ Аллогенными гомозиготными ЭБВ-В-ЛКЛ, совместимыми по гаплотипу с НЬА донора

1. Н1А-А2601 НЬА-А2601

2. Н1А-В1302 НЬА-ОКВ10701

3. Н1А-В5701 Н1А-С0501 НЬА-ОЯВ, 0301

4. НЬА-А0301 НЬА-В1801 НЬА-С0501

5. НЬА-А2601 НЬА-В5001 Н1А-А2601 НЬА-В3801 НЬА-ОЯВ, 0402

6. НЬА-В5301 НЬА-ОЯВ, 0701 Ш.А-В1302 НЬД-ОИВ, 0701

7. НЬА-В3801 НЬА-С0501 НЬА-В1801 НЬА-С0501

8. НЬА-В3801 НЬА-С0501 Н1А-В3801 НЬА-ОКВ, 0301

9. НЬ А-А0201 НЬА-С0304 Н1А-В4402 НЬА-ОЯВ, 0101

которых требуется 4-6 недель. Анализ НЬА рестрикции ЭБВ-специфичных ЦТЛ доноров и их активности против ЭБВ-ЛПЗ НЬА несовместимых реципиентов показал, что получаемые

34

таким образом Т клетки могут бьггь рестриктированы по аллелям, представленным только в HLA типе донора, и, в связи с этим, могут не распознавать ЭБВ-ЛПЗ в контексте HLA больного (Таблица 5).

Разработанная методика экстракорпоральной стимуляции Т клеток аллогенными ЭБВ-В-ЛКЛ, гомозиготными по одному из гаплотипов, экспрессирующихся на клетках донора, позволила модифицировать изначальную рестрикцию Т клеток по наиболее иммуногенному HLA аллелю и производить ЦТЛ с заданной HLA рестрикцией (Таблица 6). Такие ЦТЛ специфично узнавали как ЭБВ-В-ЛКЛ донора, так и потенциального реципиента, не проявляя при этом аллореактивности против здоровых клеток больного.

Искусственные антиген-презентируюшие клетки. При наличии панели антигенов, презентируемых для клеток-эффекторов на пораженных отдельно взятой патологией клетках, часть из них является более иммуногенными и более активно участвует в формировании Т клеточного ответа, преимущественно стимулируя специфичные к ним ЦТЛ. При этом формирование ответа к менее иммуногенным эпитопам оказывается невозможным при стимуляции неселектированными антигенами. Так, в случае ЭБВ-ассоциированных злокачественных новообразований ряд из них экспрессирует лишь один или два ЭБВ антигена, такие как LMP1, обладающий низкой иммуногенностью по сравнению с другими ЭБВ эпитопами. Экстракорпоральная активация LMP1 специфичных Т клеток с помощью ЭБВ-В-ЛКЛ невозможна. Созданные из мышиных фибробластов путем генной модификации искусственные антиген-презетирующие клетки (ИАПК) экспрессировали человеческие костимуляторные молекулы (ICAM-1 LFA-3, hß2m, В7.1) , HLA-A0201 аллель и иммуногенный пептид, кодирующий участок LMP1 протеина. Т клетки, стимулированные такими ИАПК, содержали высокий процент популяции, связывающейся со специфическими тетрамерами, сравнимый с ответом, получаемым при стимуляции ИАПК, которые презентируют высокоиммуногенный пептид вируса гриппа ((Flu) (Рисунок 5-А). Кроме того эти клетки проявляли специфичную цитотоксичность против ЭБВ-В-ЛКЛ (Рисунок 5-В) и ЭБВ-негативных клеток В-ОЛЛ, нагруженных стимулирующим LMP1 пептидом (Рисунок 5-Б), рестриктированную по HLA-A0201 аллелю. При этом стимуляция аутологичными ЭБВ-В-ЛКЛ не приводила к стимуляции LMP1 специфичной популяции Т клеток.

Полученные путем стимуляции с ИАПК Т клетки ингибировали рост опухоли ЭБВ-негативного В-ОЛЛ, эксрессирующего LMP1 в результате генетической модификации (Рисунок 6-Б, квадраты открытый и закрытый), но не влияли на рост той же опухоли, не экспрессирующей LMP1 (Рисунок 6-А, квадраты открытый и закрытый) по сравнению с группами животных, леченых Т клетками, стимулированными аутологичными ЭБВ-В-ЛКЛ

35

ИАЛК«-""ЦТЛ ИАПК«ЧЦГЛ ЭЕВ-В-ЛКЛ-ЦГЛ паи*—с.ь рБВ-В-ЛКЛ-ЦТЛ

Рисунок 5. Сравнительная характеристика Т клеток*, полученных путем экстракорпоральной стимуляции аутологичными В-ЛКЛ и ИАПК.

А. Антиген-специфичное связывание Т клеток с Н1А-А0201 тетрамером, несущим ЬМР1 пептид (Ы/А2) или пептид вируса гриппа ( Р1и/А2) Б.Цитотоксичиость Т клеток против клеток НЬА-А020ГЬМРГ В-ОЛЛ, нагруженных ЬМР1 петидом (1Л/В-ОЛЛ) или пептидом вируса гриппа(Р1и/В-ОЛЛ).В. Цитотоксичность Т клеток против аутологичных ЭБВ-В-ЛКЛ. * - Т клетки были получены путем экстракорпоральной стимуляции аутологичными ЭБВ-В-ЛКЛ (ЭБ-В-ЛКЛ-ЦГЛ), исукусстаенными антиген-презентирующими клетками, трансдушрованными геном пептида ЬМР1(ИАПКа2 ,ГТГГ1 гриппа (ИАПК ** ЦТЛ)

ЦТЛ) или ируса

Su g

Su

«04

ЦТЛ

ЦТЛ ЦТЛ 50x10« 50x10« 50*10' t/в *

7 14 21 28 35 42 ДНИ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

Б L1 -тоансдупнрованный ЭВВНЬА-АОЗОГ В-ОЛЛ

ЦТЛ 1ГГП ЧТЛ 50x10'

50x10« ,/, 50xW

0 7 14 21 2» 33 42 ДНИ ПОСЛЕ ВВВДЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

Рисунок 6. Противоопухолевый эффект Ll-специфичных Т клеток в экспериментальной модели адоптивной терапии LMPl-экспрессирующей опухоли. Т клетки, полученные путем стимуляции ИАПК, трансдуцироанных LMP1 петидом (ИАПК-"") (график с символом квадратов) , и аутологичных ЭБВ-В-ЛКЛ (график с закрытым кругом) были ведены животным с подкожными опухолями ЭБВ-негативного В-ОЛЛ (Б) и того же В-ОЛЛ, трансдуцироанного LMP1 пептидом (А).

; (Рисунок 6 А и Б, линия с закрытым кругом) или не получавшими Т клеток (Рисунок 6 А и Б, линия с открытым кругом).

Таким образом, создание банка антиген презентирующих клеток, избирательно экспрессирующих антигенные эпитопы и Н1А аллели позволяет, с одной стороны, сокращать время, затрачиваемое на получение аутологичных ЭБВ-В-ЛКЛ, а, с другой стороны, получать Т клетки заданной специфичности и НЬА рестрикции для проведения клеточной иммунотерапии больным от НЬА несовместимого донора при лечении заболеваний, экспрессирующих низкоиммуногенные эпитопы для Т клеточного ответа.

2. Обогащенные антиген-спеиифичные Тлимфоциты: методы ранней селекции Для предотвращения риска развития РТПХ при проведении адоптивной клеточной иммунотерапии опухолевых и вирусных заболеваний в данном исследовании были разработаны методы селекции специфических Т клеток, позволяющие на ранних этапах культивирования эффективно удалять фракцию аллореактивных Т лимфоцитов, проявляющих неспецифическую цитотоксичность в отношении здоровых тканей больного или самого донора.

Деплепия НК клеток.

При анализе данных цитотоксического действия ЭБВ-стимулированных Т клеток, полученных путем экстракорпоральной активации нефракционированных МКПК 86 здоровых доноров в присутствии аутологичных ЭБВ-В-ЛКЛ в течение 28 дней, в 46 случаях выявлялась активность НК клеток, проявляющаяся в цитотоксичности против специфической мишени НК клеток, К562, и содержали до 20% С056-экспрессирующих НК клеток. При этом в 20% случаев такие НК-реактивные лимфоциты не оказывали цитотоксического действия на аутологичные ЭБВ-В-ЛКЛ, а в 44% случаев проявляли активность против полностью НЬА несовместимых аллогенных В-ЛКЛ и/или фетогемагглютинин-стимулированных (ФГА бласты) Т клеток потенциального реципиента Т клеток или самого донора. Такие НК-содержащие Т лифоциты не способны были подавлять рост опухоли аутологичной ЭБВ-лимофмы, подсаженной подкожно иммунодифицитным животным, но оказывали неспецифический ингибирующий эффект на рост аллогенной опухоли, полученной из НЬА-несовместимых ЭБВ-В-ЛКЛ. Проведение адоптивной клеточной иммунотерапии такими НК-содержащими донорскими лифоцитами сопряжено с высоким риском развития РТПХ. Разработанный в даном исследовании метод деплеции НК клеток из МКПК перед началом экстракорпоральной стимуляции позволил получить ЭБВ-специфичные ЦТЛ в 100% случаев от 334 здоровых доноров. Эти ЦТЛ после 28 дней культивирования не содержали СЛ56-экспрессирующих НК клеток, специфично убивали

аутологичныеЭБВ-В-ЛКЛ и не оказывали цитотоксического действия на К562, ФГА бласты донора Т клеток и реципиента, аллогенные несовместимые ЭБВ-В-ЛКЛ. При изучении терапевтического действия таких Т лимфоцитов на животной модели адмпивной иммунотерапии ЭБВ-лимфомы наблюдалось ингибирование роста аутологичной подкожно пересаженной ЭБВ-В-ЛКЛ опухоли при отсутствии какого-либо влияния на рост аллогенной несовместимой по НЬА ЭБВ-В-ЛКЛ.

Такми образом, деплеция НК клеток из МКПК с последующей экстракорпоральной антиген-стимуляцией позволяет получить популяцию антиген-специфичных ЦТЛ, не проявляющих ашюреактивности, клинически применимых для адоптивной иммунотерапии без риска развития РТПХ.

Ретоовирус-обусловленная гячрупия антиген-специфичных Т клеток

Длительное культивирование очищенных от НК клеток ЦТЛ донора позволяет деплетировать популяцию аллореактивных Т лимфоцитов путем преимущественной стимуляции антиген-специфичных Т клеток в присутствии специфического антигена при отсутствии неспецифических пролиферативных стимулов. Однако, в связи с фульминантным течением заболевания нередко требуется сократить сроки, затраченные на получение специфической Т клеточной популяции. В связи с этим была предложена методика ранней селекции антиген-специфичных лимфоцитов путем трансдукции ретровирусным вектором, кодирующим рецептор фактора роста нейронов (рФРН) и тимидин киназу вируса простого герпеса на 8 день культивирования через 24 часа после второй антиген-специфичной стимуляции. Частота антиген-специфичных предшествеников ЦТЛ в популяции, содержащей в результате сортировки более чем 95% рФРН экспрессирукяцих клеток, составляла 29%-35% и 16%-24% (Рисунок 7) по окрашиванию с помощью тетрамеров и продукции ПТЧу соответственно, что соответствовало частоте антиген-специфических предшественников в популяции Т клеток, культивированных в течение 28 дней. В то же время частота аллореактивных Т клеток, определяемая по продукции ИФНу, в рФРН-сортированвой популяции была в среднем в 7-8 раз меньше, чем в немодифицированной культуре лимфоцитов на том же этапе культивирования и соответствовала уровню аллореактивности, определяемому в ЦТЛ, культивированных в течение 28 дней.

Наличие «суицидного» гена, кодирующего тимидин киназу вируса герпеса, позволяло вызывать 100% ингибирование пролиферации трансфецированных клеток и лишь 10% нетрансфецироваяных клеток при добавлении 0.1 цМ ганцикловира (Таблица 7).

А.

5

•ê >

¿.'ИД itmytfTr il.....I

немодифициро ванные

-т

NIT трансдуцированные До сортировки

7ое%

—¿а

NIT негативная фракция После сортировки

Б.

5.27V. Г

тт.,

(«модифицированные

57% ' f-

Немодифициро ванные ЭБВ специфичные ЦГЛ, 14 день культивирования

NIT трансдуцированные До сортировки -»-магнитные шарики

I j- 2» 1 m . .. -W ^'..iV-èf;

■ ---

NIT позитивная фракция После сортироки

CD8 FITC

NIT+ ЭБВ-специфичные ЦГЛ, 14 день культивирования

10" 10' 10^ 10

4.43%

10й 101 102 103 ю4

ИФНу FITC

Рисунок 7. Обогащение ЭБВ специфичной Т клеточной популяции с помощью сортировки по рФРН белку, кодируемому ретровирусным вектором NIT. А.

Флоуцитометрический анализ ЭБВ-специфичных Т клеток, способных связываться с тетрамером, кодирующим ЭБВ эпитоп в контексте доминантного аллеля, трансдуцированных на ранних сроках культивирования ретровирусным вектором NIT и сортированных по экспрессии кодируемого им белка. Содержание тетрамер-связывающейся популяции оценивалось до трансдукции (немодифицироанные ЦТЛ), после трансдукции до сортировки (NTT трансдуцированные ЦТЛ до сортировки), после сортировки позитивной и негативной фракции. В позитивной фракции после сортировки отмечалось повышение содержания тетрамер-позитивной популяции ЭБВ-специфичных Т клеток. Б. Анализ продукции интерферона-гамма в ответ на специфическую стимуляцию аутологичными ЭБВ-В-ЛКЛ и аллогенными ЭБВ-В-ЛКЛ в ^модифицированных ЦГЛ и в ЦТЛ, сортированных по NIT, показал более выкое содержание ЭБВ-специфичных ЦГЛ, продуцирующих интерферон-гамма (ИФНу), при более низком содержании аллореактивных Т клеток в Nu ' сортироанных ЦТЛ

Таблица 7. Процент снижения пролиферации NIT модифицированных и немоднфицированных клеток в присутствии возрастающих

Вид клеток Дозы ганцикловира

ЮОцМ ЮцМ 1цМ 0.1 цМ 0 01цМ 0

Неспецифичные Т-клетки NTP 100% 15% 5% 0% 0% 9%

Неспецифичные Т-клетки NIT 100% 100% 91% 91% 87% 0%

Анти-ЭБВ ^модифицированные Тклетки 100% 23% 10% 10% 0% 0%

Анти-ЭБВ NIT Т клетки 100% 100% 100% 100% 95% 0%

При моделировании адоптивной Т клеточной трапии на животных, несущих аутологичные опухоли ЭБВ лимфомы, лечение ганцикловиром предотвращало терапевтическое действие Т клеток, трансдуцированных ЖГ вектором, кодирующим ТК-ВПГ (Рисунок 8).

^ 1.£

0.5

р<0.01 для групп V и VI р=0 89 для групп V и II

Недели после введения опухоли

i

—группа I: В-ЛКЛ 1

-«••■■ группа II: В-ЛКЛ+ганцикловир+И-2 | 1 * группа III: В-ЛКЛ+ЦТЛ немодифицированные+11_2+плацево

--х- труппа IV. В-ЛКЛ+ЦТЛ немодифицироанные+11.2+ганцикловир

-группа V: В-ЛКЛ+ЦТЛ-М1Т+11_2+ганцикловир

• • ■ группа VI: В-ЛКЛ+ЦТЛ-М1Т+11_2+плацебо

Рисунок 8. Влияние ганцикловира на противоопухолевый эффект ЭБВ специфичных Т клеток, экспрессирующих ТК-ВПГ, кодируемого NIT

вектором (ЦТЛ-МТ) в результате генной модификации, на модели адоптивной иммунотерапии ЭБВ лимфомы (В-ЛКЛ).

Таким образом, траисдукция Т клеток после вторичной антигенной стимуляции на ранних стадиях культивирования с помощью ретровирусного вектора, кодирующего маркерный белок рФРН и «суицидальный» ген герпес вирусной тимидин киназы, позволяет проводить селективную генетическую модификацию антиген-специфичных Т лимфоцитов с последующей сортировкой по маркерному белку и, таким образом, получать в течение короткого времени обогащенную по антиген-специфическим и деплетированную по аллореактивным Т лимфоцитам популяцию ЦТЛ, которую возможно применять клинически без риска развития неконтролируемого РТПХ.

3. Новые иммуногенные эпитопы вирусов и опухолевых клеток как специфичные антигены для Т клеточного ответа при адоптивной иммунотерапии онкогематологических;иммунных и вирусных заболеваний: Для расширения спектра заболеваний, подлежащих лечению с помощью адоптивной клеточной иммунотерапии, и популяции потенциальных реципиентов этого метода лечения не зависимо от их НЬА типа нами была разработана методика идентификации новых иммуногенных эшггопов с помощью перекрывающихся 15-аминокислотных последовательностей, кодирующих полные опухолевые или вирусные антигенные протеины. Стимуляция Т клеток полным пулом перекрывающихся пентадекапептидов позволяла производить \\Т1 специфичные ЦТЛ от доноров с различным НЬА типом. Полученные ЦТЛ продуцировали ИФНу в ответ на вторичную стимуляцию и лизировали как мишени, нагруженные пулом \\Т1 пептидов (Рисунок 9А), так и лейкемические клетки, экспрессирующие \\Т1 протеин естественным образом (Рисунок 9Б).

Благодаря разработанной методике нами были идентифицированы новые иммуногенные эпитопы \*/Т1 для экстракорпоральной стимуляции противоопухолевых Т клеток и НЬА аллели, в контексте которых они были представлены (Таблица 8). Эти Т клетки проявляли \УТ1 специфическую цитотоксичность к злокачественным клеткам, экспрессирующим \УТ1 и рестриктирующий НЬА аллель.

Аналогичным образом нами были идентифицированы новые иммуногенные эпитопы рр65 - белка ЦМВ (таблица 9).

А. Продукция ИФНу в ответ на вторичную стимуляцию

20

е

5

I в.

■ ■■

1 ■

1 ■

1 ■ щ

! ^Ми, ■»

Б. Цитотоксичность против УУТГ апй \УТГ мишеней

х 806

МКПК только МКПК+ WT1 полный пул Вторичные стимуляторы

; 60-1

1

! ; ■

•

н •

! ■

1 1 ■ ■

• ■

■ и.

■■ • ■■■

ФГА

ФГА/ WTI полный пул

Мишени

УгТГ лейкемия

Рисунок 9. Т клеточный ответ на экстракорпоральную стимуляцию ЦТЛ полным пулом перекрывающихся 15-аминокислотных последовательностей, кодирующих полную последовательность \\ГГ1.

Таблица 8. Новые эпитопы \¥Т1 , определенные методом картирования мини-пулов перекрывающихся пентадекапептидов, кодирующих полную последовательность \УТ1 протеина и анализом НЬА рестриктирующих элементов полученных Т клеток. \

Эпитоп НЬА рестриктирующий аллель Цитотоксичность

ФГ А/пептид ЮТ1°лейкемические клетки

ШРАРРОАЭкита Н1АА0201 67% 36%

СМТУ/ЫОММЬзи« Н1А А0201 45% 34%

АШ>АУР81.1№« ША А0201 70% 90%

АШетРУЭмолв НЬА В0801 58% -

РМРРМАРУ|.1»-13< ША А0301 43% 28%

эоиовНЭРКНЕОРМ ША В3501,С04хх 50% 45%

чя-.юАУРЗСЫК!?*' НЬА В3501, С0401 36% 38%

LDFAPPGASAYGii4.tr! Н1А 01*В(0402 78% -

СУЕЗОШТТРИССАэ9б-410 Н1АйКВ10301 78% -

СМТУМОММЬСАП-КСдм« НЦАОР(В|1104 63% -

Таблица 9. Новые эпитопы ЦМВ, определенные методом картирования перекрывающихся мини-пулов пеитадекпептидов, кодирующих полную последовательность рр65 протеина и анализом НЬА рестриктирующих элементов полученных Т клеток.

Эпитоп HLA рестриктирукяций аллель

NLVPMVATV«5-603 HLA A0201

QYDPVAALFmi-M HLA A2402

NLVPMVATV495-603 HLAA0206

HERNGFTVL267-J75 HLA B4001

HERNGFTVLaMrs HLA B4002

RPHERNGFTVL2ee-27s HLA B4201

EHPTFTSQYRUiMa HLA-DRBi1101

RPHERNGFTVaKWM HLA-B0702

FFWDANDIYRUiwh HIA-DRB|1301

FFWDANDIYRI5IM23 HLA-DQB1O5XX

Таким образом, полученные данные позволили разработать подход к экстракорпоральной стимуляции WT1 и ЦМВ специфичных Т клеток для проведения адоптивной клеточной иммунотерапии широго круга больных без ограничений, связанных с HLA типом больного. Кроме того стимуляция полным пулом пентадекапептидов приводит к генерации не только CD8+, но и CD4+ Т клеток, рестриктированных по HLA аллелям П класса основного комплекса гистосовместимостн, что позволяет создавать полноценный Т клеточный ответ, поддерживаемый хелперными клетками и способствующий более эффективному и долгосрочному терапевтическому эффекту ЦТЛ.

4. Факторы, влияющие на эффективность Т клеточной адоптивной иммунотерапии.

4.1. Изучение специфичности миграции и персистенции ЦТЛ при проведении адоптивной клеточной иммунотерапии.

Эффективность проводимой адоптивной иммунотерапии зависит от способности вводимых Т клеток специфически мигрировать в опухоль, пролиферировать и персистировать в ней в течение достаточно долгого времени, достаточного для осуществления ее цитолиза. Зачастую наиболее злокачественные новобразования развивают способность избегать Т клеточного ответа путем ингибирования экспрессии ключевых молекул и механизмов, вовлеченных во взаимодействие эффекгорных клеток и клеток-мишеней. Выявление таких механизмов позволит разрабатывать методы их коррекции для повышения эффективности проводимой иммунотерапии.

До недавнего времени вопрос об активности миграции адоптивно вводимых атиген-специфичных Т клеток оставался открытым. Предполагалась возможность их стохастического перераспределения в зависимости от васкуляризации по ходу сосудов, что не исключало риск инфильтрации здоровых органов и тканей и, соответственно, риск развития признаков РТПХ. В связи с отсутствием возможности прижизненного повторного мониторинга введенных клеток в условиях живого организма оставался неясным вопрос о скорости противоопухолевого/противовирусного Т клеточного ответа после их введения, значимости степени инфильтрации опухоли для ее эффективного удаления, длительности наведенного Т клеточного ответа и его уровня, необходимого и достаточного для осуществления устойчивого и эффективного иммунного контроля над заболеванием. Благодаря методикам молекулярной визуализации адоптивно введенных клеток иммунной системы, мы провели ряд исследований, описывающих динамику поведения Т клеток в условиях живого организма после их адоптивного трансфера. I

НЬА-зависимая и антиген-опосредованная миграция Т клеток При введении ЭБВ-специфичных экстракорпорально активированных ЦТЛ, экспрессирующих в результате генетической модификации химерный белок ТК-ЗФП, в экспериментальной модели, несущей четыре различные опухоли В-клеточной природы, в результате введения [|241]ИАи и ПЭТ было выявлено, что Т клетки специфически мигрировали только в'аутологичную ЭБВ+ опухоль (Т1) и в аллогенную ЭБВ+ опухоль, экспрессирующую иммунодоминантный Н1А-А0201 аллель (Т2) (Рисунок 10, А), и не обнаруживались в ЭБВ" опухоли НЬА-А0201"'ТЗ-ОЛЛ (Т4) и в полностью НЬА-несовместимый ЭБВ+ опухоли (ТЗ) (Рисунок 10, А). При этом ПЭТ-сигнал наблюдался в специфичной опухоли уже через 4 часа после введения Т клеток и регистрировался в течении трех последовательных наблюдений, проведенных с интервалом в 7 дней Более того,

I

интенсивность сигнала в специфических опухолях, несущих антиген и иммунодоминантный аллель, наростала с течением времени, предполагая возможную пролиферацию антиген-специфичных Т клеток в опухоли-мишени. Инфильтрация тканей Т клетками подтверждалась морфологическим исследованием образцов на наличие ЗФП (Рисунок 10, Б). Специфическая локализация ЦТЛ в опухолях Т1 и Т2 обуславливала их цитолитическое действие на эти опухоли, ингибируя их рост, в отличии от двух других неспецифических опухолей ТЗ и Т4, рост которых не меняся (Рисунок 10, В). |

в.

Рисунок 10. Динамика НЬА-зависнмой н антнген-спенифичной миграции ЭЬВ-реактнвных Г клеток, транслуцирокаиных век-сором ТК-ЗФП, в условии! живого организма. А.

ПЭТ имиджи животного через 8 и 15 дней после введения ЭБВ-специфичных ЦТЛ, траксдуциро ванных вектором, кодирующим герпес-вирусную тимидшкиназу, Накопление изотопа отмечалось только в опухолях Т1 и Т2 (левая панель - плечевой срез) и не выявлялось в опухолях ТЗ и Т 4 (правая панель - срез на уровне бедер). Б.Флюоресцентная микроскопия срезов опухолей выявила наличие свечения ЗФП в опухолях Т1 и Т 2. В. Мониторирование размеров опухолей показал о ингибирование роста только опухолей Т1 (аутологичне ЭБВ-В-ЛЮ1) и Г2 (Н1А-А020!*ЭБВ-В-ЛКЛ).

4 часа

24 часа

Часы после введения [|2)1]Р1Л11 24 часа 4 часа

АутО/Пи ичнме ЭБВ В-ЛКЛ

о .. ч Т г

НЬА-А0201+ ЭБВ В-ЛКЛ

Н ЬА-и ссо в мест и м ы с НЬД-А02О1" ЭЕВ В-ЛКЛ ЭБВ В-ОЛЛ

тз

А

. -■> Г"11-р|ди . .

Недела после введения опухоли

Справедливость данных, полученных для ЭЬВ лимф омы, была подтверждена н для не связанных с ЭЕВ опухолей (Рисунок 11). При проведении ПЭТ после введения (1:!Р]РЕАи на фоне терапии ГК-ЗЬФ транедуцировзнными Т клетками, специфичными к опухолевому антигену WT1. была выявлена их ранняя (в течение 1 дня) локализация в опухолях, сформированных из

День 1 День 8 День 15

плеч»

бедра

Рисунок 11. Динамика миграции \УТЮБВ специфичных ТК-ЗФП ЦТЛ и условиях живого орг анизма Визуализация с помощью ПЭТ: на лень I я К после введедния ЦТЛ накопление радиоизотопа наблюдается и опухолях Т1 [ Щ,А-А0201*ТКТГ рабдомиосаркома) и Т2 (Ш.А-А02Ц] '\\'ТГ В-ОЛЛ), привитых в области плеч, и отсутствует в опухолях 13 (НЬА-АОЮги'Т!" рвбдонйосаркома) и Т 4 (НЬА-А0201 ЧЛГВ-ОЛЛ), привитых в области бедер.

клеток В-ОЛЛ (Т2) и рабдомиосаркомы (Т1), имеющих высокую поверхностную экспрессию и м м унодоминаитного Н1.А-А0201 аллели и специфического антигена \¥Т1 (Рисунок 12). В то же время введенные ЦТЛ не были обаружены в НЬА-Д0201+\\Т1 "В-ОЛЛ опухоли (Т4) и в опухоли рабдомиосаркомы, имеющей высокий уровень экспрессии 1УТ1, но не представляющей на своей поверхности йммунодоминантный НР.А-А0201 аллель, определяемый в этих клетках генетически. Следует также заметить, что. в отличии от ЭБВ-ЛПЗ, инфильтрации Т клеток в опухолях Т1 и Т2 на 15 день после их введения выявлено не было, что предполагает отсутствие способности опухолевых ( в отличии от вирусных) мишеней поддерживать персистенцию и пролиферацию ЦТЛ, и. в свою очередь, может отчасти объяснять описэнньей в литературе феномен временного опухоль-и н гиб и ру гошего эффекта специфической адоптивной Т клеточной терапии, диктуя разработку ее режимов. Предполагающих повторные введения ЦТЛ для поддержания их

после введения ЦТЛ после введения ЦТЛ после введения ЦТ*

шш и ш

дршя ШШшШт

терапевтической концентрации в течение всего периода времени, требуемого для эффективного подавления опухоли.

Таким образом представленные данные позволяют заключить, что противоопухолевый ответ Т клеток зависит от интенсивности экспрессии иммунодоминантного Н1Л аллеля и специфического антигена. Миграция и персистенция ЦТЛ в опухолях-мишенях является ША-зависимой и антиген-специфичной и коррелирует с эффективностью их противоопухолевого ответа . Сниженная экспрессия одного из этих компонентов предотвращает инфильтрацию опухоли Т клетками, снижая их терапевтическую эфективность. Коррекция режимов адоптивной Т клеточной терапии, основанная на выявлении недостаточной экспрессии указанных факторов, позволит повысить ее эффективность.

4.2. Роль хемокиновыхрецепторов в антиген-специфическом Т клеточном ответе.

Миграция Т клеток в опухоль-мишень также зависит от экспрессии ко-стимуляторных факторов и хемокиновых миграционных рецепторов. В экспериментальной модели адоптивной Т клеточной терапии ЭБВ лимфомы было выявлено, что внутривенное введение антител, блокирующих один из наиболее важных хемокиновых рецепторов ССЮ приводило к предотвращению инфильтрации аутологичной и аллогенной НЪА-А0201+ опухоли ЭБВ-ЛПЗ ЭБВ специфичными Т клетками, ресгрикгированньми по иммунодоминантному НЬА-А0201 аплелю, что определялось по визуализации ТК-ЗФП модифицированных ЦТЛ с помощью гамма-камеры после введения [ш1]ПАи и по уровню накопления этого радиоизотопа в тканях и опухолях (Рисунок 12).Аналогичным эффектом обладали антитела, блокирующие ко-стимуляторную молекулу ЬРА1 (Рисунок 12).

4.3. Определение терапевтической дозы ЦТЛ.

Эффективность противоопухолевого эффекта Т клеточной терапии и сроки его проявления в том числе определяются количеством вводимых антиген-специфичных Т клеток. При введении в аутологичную ЭБВ-ЛПЗ опухоль ЭБВ-специфичных чНАТ-ЗФП трансдуцированных ЦТЛ, содержащих 4.4% ЭБВ специфичных Т клеток, продуцирующих 1Жу в ответ на вторичную тимуляцию ЭБВ, было выявлено, что наибольший терапевтический эффект наблюдался при введении 5x106 , содержащих 0.22x106 ЭБВ реактивных Т клеток (Рисунок 13). Визуализационный сигнал, зарегистрированный на микроПЭТ, усиливался к 21 дню после введения ЦТЛ, подтверждая нашу гипотезу о способности к пролиферации Т клеток в опухоли-

Аутологачный В-ЛКЛ Аллогенная В-ЛКП А2*

ША несовместимые В-ЛКЛ И И

ЭБВА2* В-ОЛЛ в 1 !

Селезни ■

Плазма ' 1

Мышцы | 1 Печень к

Желудок ■ 'я

Дуоденун щв

Толстый кишечник! ■■ и I Л II I I Г I

Е

I. _1 I. I. I .П I I I О 01 02 0.3 04 05 06 0 01 02 03 0.4 05 06 0 01 02 03 04 05 06

%дозы/грамм %дозы/грамм %дозы/фамм %дозы/фамм %дозы/фамм

1

- 'ш

1

1

1 1 ь р

к 1 к

1 1

н н

Г 1 Л. 1 1 1 1 ^ 1 Л М- 1 1

0 01 02 03 04 05 06 0 01 02 03 04 05 06

ЭБВ-специфичные ЦТЛ,

трансдуцированные ВПГ-ТК

ЭБВ-специфичные ЭБВ-специфичные ЭБВ-специфичные ЭБВ-специфичные

ЦТЛ, ЦТЛ, ЦТЛ, ЦТЛ,

трансдуцированные трансдуцированные трансдуцированные трансдуцированные

ВПГ-ТК ВПГ-ТК ВПГ-ТК ВПГ-ТК

—+анти-СхСМ- -+ анти- СС1*5— —+анти-С(Ж7--- — + анти-У А1

блокирующие антитела блокирующие антитела блокирующие антитела блокирующие антитела

Рисунок 12. Накопление [13|1]-Е1Аи Т клетками, несущими ген ВПГ-ТК, в органах и тканях в экспериментальной модели адоптивной терапии ЭБВ-ЛПЗ, созданной путем прививания подкожной опухоли ЭБВ-ЛПЗ, под воздействием различных агентов, блокирующих наиболее важные компоненты, влияющие на специфическую миграцию Т клеток в опухоль-мишень и длительность ее инфильтрации. Накопление изотопа (горизонтальная ось) определялось в различных тканях и органах (вертикальная ось) после введения ЭБВ-специфичных ЦТЛ изолировано (первый слева график) и ЭБВ-ЦТЛ в присутствии антител, блокирующих костимуляторные молекулы и хемокиновые рецепторы (СхСИ, ССЯ5, ССЛ7, ЬБА-!).

г

и

к' с; о

X

с о

г

(В

А ю О

Введение ЦТЛ

■Только\12

0 эе

-I-ш——

7 14 21 35

Дни после введения опухоли

—ж— ю4 '—10® ^ю6

-а-5x106

■ : ■

вв

шш

День О

День 7

День 28

Рисунок 13. ИнГибйрованнй подножной опухоли аутологичиой ЭБВ-ЛШ различными дозами }ЕВ специфичных чНАТ-ЗФП ЦТЛ, введенных внутрь опухоли График представляем объем подкожно привитой опухоли ЭБВ-ЛГО (вертикальная ось) в течение 53 дней от момента введедния клеток (горизонтальная ось). Повторное мони-Орироаание накопления радиоактивного сигнала с помощью СПЕКТ представлено в виде иинджинговых срезов через область рпухоли, полученных при визуализации на день 0, 7, 21 и 24 после введения известных указаны* Выше доз Т клеток в опухоль.

мишени, и затем уменьшился в виду уменьшения объема опухоли, соответственно, приведшему к уменьшений антигенной стимулирующей нагрузки. Однако, сравнимый по эффективности терапевтический эффект наблюдался и при введении I О* и 105 чНАТ-ЗФП ЭБВ-ЦТЛ, содержащих 0.044x10' и 0.0044x10' специфичных ЭБ В-реактивных Т клеток соответственно (Рисунок 13) с максимумом пролиферации к 21 дню после введения. Введение 10 чНАТ-ЗФП ЭБВ-ЦТЛ, содержащих 440ЭБВ-реактивных Т клеток, не позволило эффективно ннгибировать рост опухоли

в течение 4 недель после введения, но при этом наибольший сигнал регистрировался на 28 день после введения ЦТЛ, предполагая активизацию пролиферации Т клеток в опухоли к этом моменту.

Таким образом, наименьшая доза специфичных антиген-реактивных ЦТЛ, позволяющая эффективно ингибировать рост специфической опухоли, составляет 0.0044х106 Т клеток на 1см3 опухолевой массы, что необходимо учитывать припроведении адоптивной клеточной иммунотерапии.

4.4 Роль CD4+ и CD8+ субпопуляций Тклеток в противоопухолевом/противовирусном ответе

антиген-специфичных ЦТЛ.

В последнее время результаты проводимой адоптивной Т клеточной терапии позволяют

предположить, что ее эффективность определяется популяционным составом ЦТЛ. В частности,

до сих пор остается невыясненной роль CD4 ' и CD8 субпопуляций Т клеток в

противовирусном/противоопухолевом ответе. В проведенных нами исследованиях по изучению

динамики миграции, персистенции и противоопухолевого ответа субпопуляций чНАТ-ЗФП CD4+

и ТК-ЗФП CD8+ Т клеток, полученных путем селекции из ЭБВ стимулированных ЦТЛ, в

экспериментальной модели адоптивной иммунотерапии ЭБВ-ЛПЗ с использованием

молекулярной визуализации с наложением изображений было выявлено, что в каждом случае Т

клетки изначально инфильтрировали аллогенную ЭБВ+ опухоль, несущую иммунодоминантный

рестриктирующий HLA аллель (Т1 - Н1А-А0201+ЭБВ+ - !для CD8+ ЦТЛ (Б) и ТЗ -DRBi070r3BB+

. I

- для CD4 Т клеток (В)) и аутологичные ЭБВ-В-ЛКЛ (Т2), в то время как нефрагментированная

популяция ЦТЛ (А) инфильтрировала все три опухоли (Рисунок 14). Несовместимая по HLA

опухоль (Т4) изначально не была инфильтрирована ни одной из клеточных популяций. При

предварительном тестировании исследумых Т клеточных популяций CD8+ ЦТЛ проявляли ЭБВ-

специфичную цитот'оксичность по отношению к клеткам' опухолей Т1 и Т2, CD4+ Т лимфоциты

специфически лизировали клетки опухоли Т2 и ТЗ, а нефрагментированные ЦТЛ проявляли ЭБВ

специфическую цитотоксичносгь против клеток опухолей Tl, Т2 и ТЗ. При дальнейшем

наблюдении за введенными популяциями Т клеток, несущими дифференциальные

визуализирующие гены чНАТ (CD4+ и нефрагментированные ЦТЛ) и ТК-ЗФП (CD8+ ЦТЛ),

позволяющими одновременно проводить их дифференцированный имиджинг в одном организме

Б.

[Ш1]ПА1! ПЭТ CDS' ТК-ЗФП

В.

(plJMIEG ИЗТ СШ'чНЛТ

1. [,:3I]M1BG OIFKT С D4'4 НЛ T-i-C D8TK- 3 Ф11

Т4

j,yI]MIBG ПЭТ

вефрвкиЕюннрпвзинме

чНАТ ЦТЛ

День. О

День? День 21 День 28

Т1 Т4

2. [11JI]F1AU ПЭТ Т СО^чНАТ+СИвТК-ЗФЛ Т4

Т2 Т1 ТЗ Т4

иск 14. Динамическая визуализация миграции CD4 и CD8 ЭБВ-специфнчиы х Т клеток и экспериментальной адон тинной иммунотерапии ЭБВ-ЛПЗ. Субпдауляции ЗБВ-спешвфичлых Т клеток были раздельно транедуциронаны лекторами, кодирующими ТК-3<15П(;С08т кяеггки) и чНАТ {CD4* клетки и нефракционированные ЦТЛ), и вводились внутривенно животами, несущим подкожные опухоли аутологичной ЭБВ-ЛГ]3(Т2), алдогенной HLA-A0201 совместимой ЭБВ-В-ЛКЛ (Т1), алдогепиой HLA-DRB,0701 совместимую ЭБВ-Вг ЛКЛ (ТЗ) И несовместимой ЭВБ-В-ЛКЛ (Т4). Внзуализаиия проводилась с помощью СПЕКТ и ['"ijefifflto для чНАТ ЦТЛ при одновременной визуализации ЦТЛ, несущих ТК-ЗФП, ПЭТ и ['"IJFIAU - для ТК-ЗФП ЦТЛ и ПЭТ и ¡'"IJMEG -для чНАТЦГЛ изолировано.

Группа 1: получившая адоптивную терапию СМ* ,сортированными из ЭБВ-спащфичной пиши Т теток

^ I щ Группа, получавшая СЕМ* Т клетки ^^Ьч ■ * - Контрольная груши

!« 2 ч *

S* о ■

В J5

Дни после введения Т клеток

„ 2 3 4 5 6 Недели после введения опухоли

Группа П: подучившая адоптивную трапию CDS* Т клетками, сортированными изЭЕВ<пщифичной линии Т клеток

1 - А . I.,

-CD8* ; ,«j

г. Ч

Л 1

5 и

* еГ S? «Л

■ о 08-

£ * 4 е 04-

S и -

<5 0 -

2 ■ 8 ,, 15 Дни после введения Т клеток

„г J < i б 7 Недели после введения опухоли

Группа Ш: получившая адоптивную терапию двумя раздельно выращенными субпопуляциями Т клеток (СМ* и CDF),

Группа, получавшая СБ!* Т слеш Контрольная группа ЦГЛ ЗхЮ^клсгок

I

is180

i е 14 0

so 100

в; U 60 о ©

;S 20

к 0

веденными одновременно

г

I4]

о

* 2 *

О 1

о

2 8 15 21

Дни после введения Т клеток

Группа IV: получившая адоптивную терапию нефракционированными ЦТЛ

.Группа, получавшая смесь

мотам* и гхютагтыпок ■ Контрольная группа ЦГЛ МхЗО^клетак

„2 J 4 5 ( Недели после введения опухоли

г s«

W и

, Нефракционироягнные ЭБВ спетяфичныв ЦТЛ

1 „ ' ,■ 15 Дни после введения Т клеток

Рисунок 15. Корреляция между числом Т клеток, инфильтрирующих опухоль, и эффективностью подавления роста опухоли ЭБВ-В-ЛКЛ. Число клеток определялось по уровню сигнала, регистрируемого с помощью неинвазивной визуализации, в корреляции с объемом подкожной опухоли

с помощью радиоактивно-меченого МПЮ и ИАЦ «¡ответственно было выявлено, что нефракционированные ЦТЛ устойчиво персистировали в опухолях Т1, Т2, и ТЗ вплоть до 28 дня наблюдения после введения Т клеток (Риунок 15,А). При этом отмечалось увеличение абсолютного числа Т клеток, инфильтрирующих опухоль, что коррелировало с эффективным

подавлением роста аутологичной опухоли Т2 (Рисунок 15, группа IV). При введении сортированных CD8+ Т клеток наблюдалась аналогичная динамика накопления радиоизотопа в специфичных Т1 и Т2 опухолях (Рисунок 14, Б). При этом наростание абсолютного числа Т клеток в опухоли было несколько отсрочено по сравнению с нефракционированной Т клеточной популяцией, что совпадало с отсроченным, но стабильным и эффективным подавлением роста аутологичной ЭБВ-В-ЛКЛ (Рисунок 15, группа П). Однако, мониторирование динамики накопления CD4+ Т клеток, сортированных из ЭБВ-специфичной линии ЦТЛ, показало изначальное накопление радиоактивности Т клетками, несущими чНАТ ген, регистрировалось в аутологичной ЭБВ-В-ЛКЛ (Т2) и в аплогенной DRBi0701+ ЭБВ-В-ЛКЛ (Рисунок 14, В). В течение первой недели после введения Т лимфоцитов абсолютное число клеток наростало (Рисунок 15, группа I), сдерживая частично рост аутологичной опухоли ЭБВ-В-ЛКЛ. Однако, в дальнейшем число инфильтрирующих опухоль клеток уменьшилось, что коррелировало с продолжившимся ростом опухоли. При одновременном введении CD4+ и CD8+ клеток, селектированных из ЭБВ-специфичной линии ЦТЛ и изолировано размноженных в культуральных условиях, в количествах, повторяющих пропорции, выявленные в материнской Т клеточной линии, первая из введенных субпопуляций также изначально накапливалась в аутологичной ЭБВ-В-ЛКЛ (Рисунок 14, Г-1; Рисунок 15, группа Ш), с последующим снижением абсолютного числа CD4+ Т лимфоцитов. Количество клеток CD8+ субпопуляции в труппе Ш не наростало, в отличии от группы II, где те же CD8+ клетки вводились изолированно, а постепенно снижалось (Рисунок 14, Г-2; Рисунок 15, группа III). При этом рост аутологичной опухоли не замедлялся по сравнению с контрольной группой, которая получала только IL2. Фенотипическая характеристика изолированно культивированных CD4+ клеток отличалась от фенотипической характеристики CD4* клеток, содержащихся в нефрагментированной материнской ЭБВ-специфичной линии ЦТЛ и была представлена в большей степени регуляторными клетками и наивными Т клетками.

Таким образом, CD4+ Т клетки, выделенные из ЭБВ-специфичной линии ЦТЛ и подвергшиеся

изолированной экстракорпоральной стимуляции, не оказывают эффективного ингибирующего

воздействия на рост аутологичной ЭБВ+опухоли и способны подавлять противоопухолевый

эффект изолированно выращенных CD8+ ЦТЛ. Противоопухолевое воздействие CD8+ Т клеток

сравнимо по своей эффективности с противоопухолевым ответом, наблюдаемым при введении

нефрагментированных ЭБВ-специфичных ЦТЛ, однако при отсутствии CD4+ популяции

хелперных клеток антиген-стимулированная пролиферация и активация CD8+ ЦТЛ наступает

позднее. Полученные данные позволяют сделать вывод о предпочтительности использования

смешанной неклональной популяции антиген-специфичных Т клеток, в которой содержатся как

53

CD4+, так и CD8+ Т лимфоциты, оказывающие кумулятивное цитолитическое воздействие на опухоль благодаря лизису, осуществляемому как через антигены, представленные в контексте ШАалелей как I класса, так и П класса.

5. Активированные НК клетки онкологических больных как эффективный компонент

HLA-независимой аутологичной клеточной иммунной терапии солидных опухолей.

Для проведения адоптивной клеточной иммунотерапии опухолей, не имеющих поверхностной экспрессии HLA молекул, нами разработан метод активации аутологичных НК клеток, способных связываться с HLA-подобной молекулой MICA/B на клетках-мишенях с помощью ее лигавда NKG2D, представленного на активированных цитотоксичных НК клетках. В результате экстракорпоральной активации НК клеток, полученных от больных раком толстого кишечника, в присутствии IL-2 и аутологичных ЭБВ-В-ЛКЛ происходило повышение уровня экспрессии NKG2D, которое приводило к повышению цитотоксичности НК клеток больных против аутологичных опухолей толстого кишечника (Таблица 10). Активация NKG2D коррелировала с уровнем экспрессии ключевых хемокиновых рецепторов, таких как CXCR1, CXCR5, CXCR7, отвечающих за миграцию НК клеток в опухоль. Культивирование НК клеток в присутствии сыворотки с повышенным содержанием растворимой формы MICA/B не обеспечивало активацию экспрессии NKG2D и сопутствующих ему хемокиновых рецепторов. Добавление к среде культивирования антител, связывающих растворимый MICA/B,

восстанавливало активацию экспрессии NKG2D и хемокиновых рецепторов.

. I

Активированные подобным образом NKG2D НК клетки, оказывали специфическое цитотоксическое действие на клетки аутологичной аденокарциномы толстого кишечника (Рисунок 16), экспрессирующие MICA/B. Уровень специфической цитотоксичности был сравним с неспецифической цитотоксичностью НК клеток по отношению к их стандартной мишени - клеточной линии К562, не экспрессирующей молекул HLA I класса. В то же время аутологичные В-ЛКЛ, не имеющие поверхностной j экспрессии MICA/B, но при этом экспрессирующие высокие уровни молекул HLA I, предотвращающие цитотоксический эффект НК клеток против собственных нормальных тканей, оставались интакпш. Следует заметить, что неактивированные НК клетки, способные адекватно лизировать К562, не проявляли цитотоксичности как в отношении аутологичной М1САЛЗ"НЬА-ГВ-ЛКЛ, так и в отношении М1СА/ВЧ~НЬА-Г аденокарциномы толстого кишечника, что коррелировало с отсутствием экспресии на них NKG2D рецептора.

Таблица 10. Экспрессия 1ЧКХ320 и хемокиповых рецепторов на НК клетках в зависимости от условий экстракорпоральной стимуляции

Экспрессия активирующих и хемокиновых рецепторов НК клеток, % Протокол А Протокол Б Протокол Е Протокол Г Протокол Д

НК клетки пациентов НК клетки доноров НК клетки пациентов НК клетки доноров НК клетки пациентов НК клетки доноров НК клетки пациентов НК клетки пациентов

ыквго 2+0 8 63±3.3 55.3+9.8 82±2 5.3+6 12±4.5 65.6+11.6 5.3+4

СХСЯ1 8.3±2.8 58±8 72±18.8 85±5 4 11.3±3.3 6±2.2 78±11 9.7±4.2

ССЯ5 3.3±1.7 4.3±2 6б±2б 3.7±2 3±1.4 0 23.3±8.5 0.7±0.2

ССЯ7 1.&Ы.5 2.3±0.5 53±3.7 45±6 9.3±4.6 2±0.8 53±1.2 8.7±2.6

1ЧКр44 4.8±3.1 2.3±0.94 8б±5.7 62±11 8.3±4.2 2.3±1.2 55±9.5 5±4.3

МСр46 2.5±1.47 67±8.3 88±9 82±3.7 66.3±19 36±19 71±13 76.3±11

Протокол А - Очищенные НК клетки (нестимулированные)

Протокол Б - Очищенные НК клетки, стимулированные в течение 21 дня в присутствии ИЛ-2 и сыворотки здоровых доноров Протокол Е - Очищенные НК клетки стимулированные в течение 21 дня в присутствии аутологичной сыворотки больных, полученной

в момент певичной диагностики и рецидиве. Протокол Г - Очищенные НК клетки, стимулированные в присутствии аутологичной сыворотки больных, полученной при диагностике

и рецидиве, и антителами к М1СА/В Протокол Д -Очищенные НК клетки, стимулированные в присутствии аутологичной сыворотки больных, полученной при диагностике и рецидиве, и анти-!^ антителами

; 1 N><320 негативный клон НК клеток ^^ МКС2й позитивный клон НК клеток

1.6 %

1 ....Г

80 ■ 70 ' 60 ■ 50 • 40 ■ 30 20 10 О

1ЧК(;21>

з! 82% :

1МКС2Б

Аутологичные К562 клетки - Клетки аутологичной опухоли ЭБВ-В-ЛЮ1 Мишени НК клеток Ранз толстой кишки

Рису и и к 16. Цптотоксичность !ЧКС2П" и N КС 2IV аутологичыых НК клеток, активированных в присутствии П -2

Активированные НК клетки большого с раком толстого кишечника, способные

лидировать аугологичную М1СА/В'' опухоль в цитотокеической исследовании, специфически инфильтрировали эту опухоль в экспериментальной модели адоптивной имунотерапин аденокарциномы толстого кишечника (Рисунок 17, Б-В) и приводили к ее регрессии (Рисунок 17. А),: Наблюдаемое противоопухолевое действие активированных ПК клеток было строго направлено на опухолевые клетки, экспедирующие специфический лиганд для ЫКС2 О рецептора, п не проявлялось в отношении ЭБВ-В-ЛКЛ той же генетической природы, не имеющих этого ли га ила (Рисунок ¡7 А-В).

2 1.5

НК клетки в/а

О

т ^ ***

>1.....

- -Г.--'1

р=0.08 р=0.01

(п=7)

11 21 28 15

Дни после сведения опухоли

¿V

<1%

*

и

П.1-Н

... к 1.5%

При введении 11.-2

10" Ю' 10* ю" ю Ри-н

При введении Ж021>*- НК клеток

М1СА/В+адс!!ок8ри!шома толстого кишечника

■ ■■ - Т.. .

10 10' 10' 10" 14.1 >н

При введении МКС21}-11* НК клеток ШСА/Е Аутолошчные ЭКВ-В-ЛЮ!

Яифнлыроцпя НК клетками

При терапии >1КСЮ+ НК клетками

ш

Нет «ифильтрации НК

клетками

При терапии ГУКС2В НК клетками

При терапии МКС2|>* НК клетками

Группа, получавшая ЙКСЯЫРНК клетки

Группа, получавшая ■ • Группа, получавшая только Лг1 Жб20-К- НК клетки

Рисунок 17. Специфический «рот и во опухолевый эффект активированных \KGZD-R" НК клеток па экс пери ментальной модели адоптивной иммунотерапии аден »карциномы толстого кишечника, А. Динамика объема опухоли аденокарциномы толстого кишечника на фоне терапии НК клетками больного. Б. Инфильтрация опухоли СО56' НК клетками - аналнз суспензии клеток опухолевой ткани. В. Иммуногнстохимнческая окраска ткани опухолей анти-СШб антителами.

Таким образом разработанная методика экстракорпоральной активации НК клеток позволяет производить аутологичные НК клетки больных в аутологичной системе стимуляции для проведения адоптивной направленной иммунотерапии опухолей эндотелиального происхождения, экспрессирующих НЬА-подобную стрессовую молекулу М1СА/В, являющихся нечувствительными к адоптивной терапии ЦТЛ в связи с отсутствием экспрессии молекул основного комплекса гистосовместимости. Аутологичная система активации НК клеток позволяет избежать неспецифической цитотоксической реакции против здоровых тканей больного.

6. Характеристика типа рестрикции Т клеточного ответа к ЭБВ р больных после различных протоколов ТКМ

Адоптивная Т клеточная иммунотерапия проводится для коррекции дефицита антиген-специфичных Т клеток, развивающегося, в частности, у больных после пересадки костного мозга, при лечении ЭБВ-ЛПЗ и ЦМВ в первые б месяцев после ТКМ. Состоятельность Т клеточного ответа, развивающегося в позднем посттрансплантационном периоде, определяется не только функциональной активностью циркулирующих Т клеток, но специфичностью их ответа на конкретный антиген, не оказывающего цитотоксического действия на здоровые ткани организма пациента. Т клетки, развивающиеся в ответ на ЭБВ инфекцию, обычно выбирают доминантные ЭБВ эпитопы, представленные ограниченным числом НЬА аллелей, представленных на пораженных клетках. Выбор МНС детерминант, которые 1иогут служить в качестве специфических структур распознавания пораженных клеток, может определяться во многом микроокружением, а не только Т клеточным генотипом. При успешной реконституции после гаплотип-совместимой ТКМ с деплецией Т клеток может происходить модификация МНС рестрикции антигенного распознавания Т клетками донора в микроокружении пациента. Вариабельность генотипа формирующихся при этом антиген-презентирующих клеток обуславливает восстановление Т клеток, которые должны быть способны распознавать! антиген на циркулирующих антиген-презентирующих клетках ( В клетки, дендритические клетки и т.д.), которые могут быть генетически клетками как донора, так и больного.

Определение доминантных НЬА-рестриктирующих элементов Т клеток, развивающихся из костного мозга донора в микроокружении реципиента после НЬА гаплотип-идентичной ТКМ, и факторов, влияющих на выбор этих МНС детерминант, может помочь в прогнозировании способности Т клеток формировать антиген-специфичный ответ против опухолевых/вирусных

антигенов, представленных в контексте НЬА аллелей донора и больного, и, в соответствии с этим, планировать необходимость и вид проведения адоптивной терапии.

При изучении типа химеризма, развившегося у 10 больных после Т деплетярованной пересадки костного мозга по поводу ТКИН от гаплотип-идентичных родственных доноров, было выявлено, что у 3 больных отмечался полный химеризм, где Т и В клетки происходили из костного мозга донора; у трех больных был частично смешанный химеризм с Т клетками, происходящими из костного мозга донора, а в популяции В клеток выявлялись как В лимфоциты, являющиеся генетическими донорскими, так и В лимфоциты, являющиеся по происхождению клетками больного (Таблица 11). Однако, у четырех больных выявлялся абсолютный смешанный химеризм с Т клетками донора и В клетками реципиента. При этом такой смешанный химеризм сочетался либо с отсутствием какого-либо режима кондиционирования при проведении ТКМ, либо выявлялся после кондиционирования одним компонентом, циклофосфаном (Таблица 2). У пяти больных с полным или частично смешанным химеризмом по донорскому типу проводилось кондиционирование с использованием комбинации циклофосфана и бусульфана (Таблица 2, Таблица 11).

При изучении НЬА рестрикции ЭБВ-специфичных Т клеток, полученных из МКПК доноров костного мозга путем стимуляции аутологичными ЭБВ-В-ЛКЛ, было выявлено, что у 9 из 10 обследованных доноров Т клетки узнавали ЭБВ антигены в контексте общих для ША типа донора и больного аллелей, в то время как у одного донора Т клеточный ответ был рестрикгирован иммунодоминантым аллелем, предсталенным исключительно в НЬА типе донора (Таблица 11).

В дальнейшем при стимуляции Т клеток, полученных из МКПК реципиентов костного мозга через 15-20 лет после ТКМ, ЭБВ-В-ЛКЛ донора или реципиента было выявлено, что Т клетки, развивающиеся в микроокружении организма больного, в 9 из 10 случаев поменяли тип НЬА рестрикции по сравнению с рестрикгирующими элементами, определенными для Т клеток той же генетической природы, развивающихся в организме донора (Таблица 11). При этом стимуляция В-ЛКЛ реципиента позволяла выявить Т клеточную популяцию, распознающую ЭБВ в контексте Н1А аллелей больного, не совместимых с Н1А типом донора (Таблица 11), у трех из 10 пациентов. Все они получали облегченный режим кондиционирования и имели собственные циркулирующие антиген-презентирующие клетки, не происходящие из костного мозга больного. У двух больных при стимуляции ЭБВ-В-ЛКЛ донора выявлялись Т клетки, распознающие ЭБВ в контексте аллелей, представленных исключительно в Н1А типе донора (Таблица 11). В остальных случаях новые рестриктирующие элементы являлись общими для

Таблица 11. Н1Л рестрикция ЭБВ-специфичных Т клеток, развивающихся у пациентов со ТКИН после ТКМ с _деплецией'Т клеток от НЬА несовместимого донора*. _

№ Вид химеризма после ТКМ Доминантные HLA ресгрнстирующие аллели Т клеток донора Доминантные ШЛ ресфиктарующие аллели Т клеток пациента после ТКМ

HLA аллели донора только Совместимые с HLA аллелями реципиента HLA аллели донора только Совместимые с HLA аллелями реципиента Ш*А аллели пациента только

1 Т- и В-клетки донора А2402 B40Q1 DRB,0701 А2402 С0304 DQB, 0303

2. Т- и В-клепси донора А2402 В4001 DRB, 0701 А2402 C04Q1 DRB,07Q1

3. Т- и В-клетки донора А0301 A030I

4. Т клетки донор; В клетки донора и реципиента А0201 DRB, 1501 DQB,0602 A3201DRB,1501 DQB,0602

5. Т клетки донора; В клетки донора и реципиента В0702 С0702 DRB,0101 DQB,0501 А0201 А0101

6. Т клетки донора В клетки реципиента A0201 DRB,1501 DQB,0602 A3201 DRB, 1501 DQB,0602 ОЛВ, 1302 006,0604

7. Т клетки донора В клетки реципиента A0301 B3501 DRB, 1602 DQB, 0502 B3501 DRB,1602 DQB, 0502 А0201 ОЯВ, 0404 ООВ, 0302

8. Т клетки донора В клетки реципиента DRBt 1501 DQB, 0602 A6802 B3901 DRB, 0407 А0101 В0801 B3901 DRB, 0407 А0201 В1501 С0303

9. Т клетки донора В клегпси реципиента A0201 A0201 DRB, 0401

10. Т клетки донора В клетки реципиента A0201 A0201 DRB, 0401

В таблице приведены варианты доминантных НЬА аллелей, выявленных для ЭБВ-специфичных Т клеток, полученных путем экстракорпоральной активации Т лимофцитов,которые были выделенны из МКПК доноров костного мозга и реципиентов в пост-трансплантационном периоде. Развивающиеся "при этом в организме реципиента Т клетки, являющиеся по своему генетическому происхождению клетками донора, в микроокружении организма больного могут распознавать ЭБВ в контексте доминантных НЬА аллелей, отличных от таковых, определяемых для Т клеток донора, развивающихся в микроокружении организма донора. У большинства пар «донор-реципиент» доминантные аллели в посттрансплантационном периоде отличались от доминантных аллелей, определяемых до трансплантации, но, в большинстве случаев, относились к группе аллелей, представленных как в НЬА генотипе донора, так и больного, позволяя Т клеткам, таким образом, распознавать антигены как на клетках-мишенях донора, так и больного.

Н1А типа донора и больного. Следует отметить, что ни в одном случае полученные ЭБВ-специфичные Т клетки не лизировали нормальные гемопоэтические клетки донора или больного, не несущие ЭБВ,

Таким образом, Т клетки, циркулирующие в организме больного после пересадки костного мозга, содержат антиген-специфичные ЭБВ-реактивные Т лимоциты, не имеют аллореактивности против тканей донора или больного, являются Н1А рестрикгированными. НЬА аллели, и потенциально, ЭБВ эпитопы, выбранные в качестве иммунодоминантных циркулирующими после ТКМ Т клетками, отличаются от иммунодоминантных эпитопов и аллелей Т клеток, полученных из МКПК донора, что может влиять на их способность распознавать наиболее иммуногенный и патогенетически значимый антиген, представленный на пораженных клетках. При этом выбираемые аллели являются преимущественно общими для Н1А типа донора или больного, или только больного. Тип НЬА рестрикции коррелирует с типом химеризма и, в соответствии с этим, с видом режима кондиционирования.

7. Терапевтическая эффективность и безопасность специфической адоптивной клеточной иммунокоррекиии у иммунокомпрометированных больных с ЭБВ-ЛПЗ иЦМВ

7.1. Адоптивная иммунотерапия онкогематологических заболеваний неселекгированными лейкоцитами доноров. Введение неселектированных лейкоцитов здоровых доноров больным с рецидивом острого или хронического лейкоза, развившегося после ТКМ, в поздние сроки после пересадки костного мозга (более чем, через 6 месяцев) позволяло достигать полной ремиссии в основном у пациентов с цитогенетическим и гематологическим рецидивом ХМЛ (Таблица 12), имело меньший эффект у больных с ОМЛ и МДС, и не приводило к полной ремиссии у больных с ОЛЛ (Таблица 12).

Следует также отметить, что, в частности, при оценке эффективности и безопасности адоптивной терапии различными дозами неспецифических донорских лейкоцитов у больных с ХМЛ (Таблица 13) наибольший кумулятивный ответ наблюдался при кумулятивной дозе Т клеток больше, чем 1.6х108/кг, что приводило к развитию острой РТПХ 11-1У степени у 11% больных и хронической РТПХ у 27% больных. Введение меньших доз Т клеток (менее 1.0х107/кг) оказывало кумулятивный эффект лишь у половины больных и сопровождалось развитием РТПХ в 5% случаев.

61

Таблица 12. Терапевтическая эффективность введения ДЛИ при лечении хронических н острых лейкозов.

Диагноз Обследовано больных Включено в исследование Полная ремиссия (%)

ХМЛ

Цитогенетический рецидив 17 1 17 14(82)

Гематологический рецидив 53 1 50 39(78)

Фаза трансформации 14 1 8 1 (12.5)

Полицитемия 1 1 1 1 (100)

ОМЛ 23 1 17 5(29)

мдс 5 1 4 1(25)

ОЛЛ 22 1 12 0

Всего 135 ] 109 65 (56)

Таблица 13.Адоптивная клеточная терапия ХМЛ в поздние сроки после ТКМ (>6 месяцев).

Уровень дозы Общая доза Тклеток/кг Кумулятивный ответ по стадиям заболевания на момент терапии| Острая РТПХ Хронич РТПХ

Молекул. Цитогенст. Гематологич Асс/Вс И-У1 Огракич Выраж

3x10" 3x10' 57% 50% НИ НИ 3% 2% 0%

1x10' 1 0-20x10' 71% 58% 0% 1 НИ 0% 1% 2%

5x10' 6 0-8.3x10' 88% 67% 24% 40% 0% 9% 12%

1x10' 1 6-1 8x10" 94% 78% 41% 60% 11% 5% 22%

5x10* >5x10" НИ НИ 65% 60% 0% 0% 28%

Необходимо отметить, что введение 1x106 Т клеток чем через 6 месяцев после пересадки костного мозга] случаев

/кг в ранний период после ТКМ (ранее, приводит к развитию РТПХ в 2040%

7.2.Адоптивная иммунотерапия ЭБВ-ЛПЗ. развивающихся у больных после ТКМ. Для коррекции

I

дефицита ЭБВ-специфичных Т клеток у больных с ЭБВ-ЛПЗ после ТКМ проводилась терапия нефракционированными лейкоцитами донора костного мозга в дозе 0.2-1.3x10® Т клеток/кг. Результаты исследования показали, что ДЛИ приводило к полной ремиссии у 90% больных (Таблица 14). Долгосрочной выживаемости при этом удалось достичь у 50% больных. РТПХ развилось у 4 больных (18%), при том, что 90% больных включенных в это исследование, получали ДЛИ от МНС совместимых доноров.

Терапевтический эффект от введенных ДЛИ коррелировал с повышением уровня ЭБВ-специфичных Т клеток в крови больных, определенных с помощью окраски на тетрамеры, несущие ЭБВ эпитопы (Рисунок 18).

Максимальное число ЭБВ специфичных Т клеток в крови больных наблюдалось через 3 недели после введения ДЛИ, а через 16 недель после введедния ДЛИ их количество снизилось до уровня ЭБВ-специфичных Т клеток, сравнимом с МКПК донора. Эти показатели совпадали с динамикой предшественников ЭБВ-специфичных ЦТЛ в МКПК больных, определенной с помощью метода ограничивающих разведений (Рисунок 19). Уровень ЭБВ-ДНК снижался на фоне повышения ЭБВ-ЦТЛ, но уровень этот снизился до цифр, определенных до начала ДЛИ.

Таблица 14. Результаты введения нефракционированных лейкоцитов донора (0.2 - 1.3x10' <Л)3+ Т клеток/кг) больным с ЭБВ-ЛГО после ТКМ.

Пролечено пациентов 22

Включено в исследование 22

Полная ремиссия 20

Частичная ремиссия 1 (смерть на 9 день после ДЛИ)

Нет ответа 1 (смерть на 7 день после ДЛИ)

Прогрессия ЭБВ-ЛПЗ 3

Долгосрочная выживаемость 11

Причиная смерти

Прогрессия заболевания 1

Ранние осложнения ( 3 (острый респираторный дистресс синдром - 2, гематологич. -1)

Инфекции, связанные с РТПХ 3

Рецидив 3

Другие инфекции 1

§ 3%

1 2%

оа

2 &

1%

I в4

0%

—С08*£ЮТА Зс 284 -Э-СОГВМЬР12«0 -±-СП8*ЕВЯА 3*502

-*_СОГЕВКАЗа379 _Ж-С08*ЕВ^Зс881 ^ л

// Щ

^ 1 ' 1 " 1 , \ ■ А

МКПК донора

6 часов

2 дня

1 неделя 3 неделя

16 неделя

Время после ДЛИ

Рисунок 18. Иммунная реконституция С08+|тетрамер+ Т клеток пациента с НЬА-А*2+ / НЬА-В*^ после ДЛИ по поводу ЭБВ ЛПЗ.

х ДЛИ

§ КМ*

5 ДЛИ

0 27х106Лг

>20000 20000 2000-20000 200-2000 200 <200

отрицательный

1000

100

101

121

141

161

181

221

01

Дни после ТКМ

Рисунок 19. Динамика уровня ЭБВ-ДНК и ЭБВ-специфичных ЦТЛп в МКПК больных на фоне терапии ДЛИ.

Таким образом, проведение адоптивной иммунотерапии ДЛИ для лечения ЭБВ-ЛПЗ и онкогематологичееких заболеваний продемонстрировало эффективность коррекции дефицита Т клеток с помощью ДЛИ. Следовательно, такой подход является перспективным для проведения иммунокоррекции таких состояний. \\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\{\\\\\\\\\

7. 3. Адоптивная иммунная терапия с применением антиген-специфичных ЦТЛ в лечении ЭБВ-ЛПЗ. Учитывая эффективность адоптивного введения донорских Т клеток для повышения иммунного контроля, нами была продолжена разработка более специфичных методов иммунокоррекции Необходимо заметить, что иммунотерапия с помощью ДЛИ возможна только по истечении 6 месяцев после ТКМ для уменьшения риска развития РТПХ. При этом наибольший риск развития ЭБВ-ЛПЗ отмечается именно в ранний пост-трансплантационный период (от 2 до 6 месяцев после ТКМ) на фоне дефицита Т клеток. Кроме того, применение ДЛИ невозможно для лечения больных, у которых нет МНС совместимого донора, в связи с высоким риском развития РТПХ. В связи с вышесказанным нами было проведено клиническое иследование эффективности и безопасности применения ЭБВ-специфичных ЦТЛ для коррекции дефицита ЭБВ-реакгивных ЦТЛп.

При проведении адоптивной иммунотерапии ЭБВ-ЛПЗ больным после ТКМ полная ремиссия была достигнута у 75% больных, у 4 больных наблюдалась прогрессия заболевания и у одного больного отмечалась стабилизация процесса (Таблица 15). РТПХ не было выявлено ни у одного больного. Проведение терапии ЦТЛ не сопровождалось развитием каких-либо осложнений ни у одного больного в отличии от лечения ДЛИ (Таблица 15). Терапевтический эффект после введения ЭБВ-ЦТЛ наблюдался, начиная с 21 дня после введения Т клеток, что коррелировало со снижением ЭБВ-ДНК в крови больных и повышением частоты ЭБВ-специфичных ЦТЛп (Рисунок 20).

Таблица 15. Адоптивная клеточная иммунотерапия моноклональной ЭБВ+ В клеточной

лимфомы

Вид терапии Причина иммуно суппресии Лролече но больных Ответ Осгаря РТПХ П-ГУ Безрецидивная выживаемость

Полная ремиссия Частичная ремиссия Стабилизация заболевания Прогрессия заболевания

дли ТКМ 22 20 0 3 4 20/22

ЗЕВ-ИЛ! ТКМ 19 14 0 1 4 0 14/19

Пересадка органов 5 4 0 1 0 0 5/5

СПИД 1 0 0 0 1 0 0

Всего 25 19 0 2 5 0 19/25

е «

2

^ 2000-20000

во

5 20000

«

ж 1=с

отрицательным

ЭБВ-ЦТЛ явигтп 10б/кг

10»/»

Ьй

Рисунок 20. Динамика уровня ЭБВ-ДНК (левая вертикальная ось) и ЭБВ-спецнфичных ЦТЛп (правая вертикальная ось) в МКПК больных на фоне терапии ЭБВ-ЦТЛ

При лечении ЭБВ-ЛПЗ, развившегося у больных после пе эесадки органов, полная ремиссия была достигнута у 4 из 5 пролеченных больных (Таблица 15). Эти больные получали аутологичные ЦТЛ, стимулированные экстракорпорально в присутствии ЭБВ-В-ЛКЛ пациентов. В одном случае отмечалась стабилизация заболевания. При этом у данного больного терапия проводилась аллогенными Т клетками, которые не способны были персистировать в аллогенном микроокружении организма больного в течение долгого времени и не могли поддерживать терапевтически эффективный уровень ЭБВ-реактивных ^ клеток в организме больного. Важно отметить, что введенные ЭБВ-специфические ЦТЛ не проявляли никакой реактивности против ЭБВ-негативных здоровых тканей и не вызывали отторжение трансплантата у больных после пересадки органов от другого донора. Введение Т клеток донора больному с ЭБВ-ЛПЗ, развившейся в результате СПИДа, не позволило эффективно купировать заболевание, что объяснялось неспособностью этих ЦТЛ долго персистировать в организме реципиента.

Более высокая эффективность в достижении полной ремиссии при лечении ДЛИ по сравнению с ЦТЛ может быть объяснена несколькими ^факторами: во-первых ДЛИ содержат значительное количество аллореактивных Т клеток, которые могли элиминировать ЭБВ-

бб

Аугепогичные ЭБВ-В-ЛКЛ донора, трансформированные с помощью В95-8 ЭБВсупернатанта

ЭБВ-В-ЖЛ пациента, трансформированные спонтанно

НЬА несовместимые ЭБВ-В-ЖЛ

К562

Аутопогичные ФГА бласты донора ФГА бласты пациента

ЭБВ-ЦТЛ, вызвавшие терапевтический эффект при лечении ЭБВ-ЛПЗ

ЭБВ-ЦТЛ, не имевшие терапевтического эффекта при лечении ЭБВ-ЛПЗ

...... J — ( -... | .1 >|

О 10 20 30 40 О

Цитотоксичностъ,

10 20 30 Цитотоксичносп'Л

Рисунок 21. Цитотоксичнская активность ЭБВ-специфических Т клеток,использованных для лечения больных сЭБВ-ЛПЗ, исследованная in vitro против ЭБВ-В-ЛКЛ, полученных путем спонтанной трансформации опухолевых клеток больного

пораженные клетки из-за своей неспецифической аллореактивности; во-вторых популяции ДЛИ могли содержать более широкий спектр ЭБВ-реактивных Т клеток, не ограниченных в своей реактивности лабораторным штаммом ЭБВ, используемым для экстракорпоральной стимуляции Т клеток.

При проведении более детального обследования больных было выялено, что у одного из пациентов, получавших ЭБВ-ЦТЛ, введенная популяция Т клеток преимущественно содержала CD4+ лимфоциты, что, согласно проведенными нами лабораторным исследованиям по изучении роли Т клеточных субпопуляции в противоопухолевом и противовирусном ответе, может оказывать стимулирующее воздействие на рост аутологичной ЭБВ лимфомы.

Другим немаловажным фактором, влияющим на терапевтическую эффективность ЦТЛ, является спектр ЭБВ эпитопов, распознаваемых ЦТЛ, полученными в лабораторных условиях. При изучении цитотоксичности ЦТЛ, введенных больному с ЭБВ-ЛПЗ, и не ответившему на

67

проведенную адоптивную терапию, было выявлено, что Т клетки донора, стимулированные экстракорпорально в присутствии аутологичных ЭБВ-В-ЛКЛ, полученных из МКПК донора путем инкубации с супернатантом, полученным с В95-8 клеточной линии, эффективно убивают аутологичные В95-8 трансформированные ЭБВ-В-ЛКЛ, но не лизируют ЭБВ-В-ЛКЛ, полученные путем спонтанной транформации из опухолевых клеток больного (Рисунок 21).

При стимуляции ЦТЛ того же донора спонтанно трансформироваными ЭБВ-В-ЛКЛ пациента полученные Т клетки лизировали как В-ЛКЛ донора, так и спонтанные В-ЛКЛ больного (Рисунок 22).

ЦТЛ донора, стимулированные ¡^.ЭБВ-В-ЛКЛ

в95.рБВ-В-ЛКЛ донора Спонтанные ЭБВ-В-ЛКЛ больного НЬА несовместимые ЭБВ-В-ЛКЛ К562

ФГА бласты больного ФГА бласты донора | А0201 0<}В1 0502

| А0301,ЕКЭВ1 0201

В3501 С0401

В0801 С0701 С0401

оив, озо1 рсзв, 0201 БИВ, 0101 РОВ, 0501

т

та

ЦТЛ донора, стимулированные спонтанно трансформированными ЭБВ-В-ЛКЛ больного

■ I 11 I I I >

О 10 20 30 40 50 60 70

О 10 20 30 40 50 60 70 Цитотоксичность, %

Рисунок 22. Сравнительная цитотоксичность и НЬА рестрикция ЦТЛ, стимулированных аутологичными В95-8 трансформированными В-ЛКЛ, и ЦТЛ, стимулированных спонтанно трансформированными ЭБВ-В-ЛКЛ пациента.

Более того, эти Т клетки оказались рестриктированы но новому МНС элементу, отличному от иммунодоминантнаго аллсля, определяемого для тех же по генетической природе Т клеток, но Полученных при стимуляции а уто логичным и В-ЛКЛ (Рисунок 22), и преимущественно распознавали ЭБВ через другой ЭВВ-мштоп, как определялось при окраске различными тетрамерами, несущими ЭБВ эпигоны (Рисунок 23)

[ | ЦТЛ донора, егомупированные спонтанными ЭБВ-В-ЛКЛ больного

[Ш ЦТЛ донора, стимулированные аутологичными В95-8 трансформированными ЭБВ-В-ЯКП

I

ВО0О1-ЕВМАЗА В0а01-ЕВ!Ш) (ОАК)

А020- ЕВМАЗС А02Ш-ШР2 «1201-ВШР1 ВОвМ-БЛЛ

Тетрэмеры

Рисунок 23. Сравнительная оценка спектра ЭБВ эпнтопов, рас познаваемых ЭБВ-релктивными ЦТЛ, полученными путем экстракорпоральной стимуляции аутолощчиыми да^ЭЕВ-В-ЛКЛ или спонтанными ЭБВ-В-ЛКЛ пациента с помощью окраски на тстрамеры, содержащие ЭБВ-эпнтопы в контексте совместимых НЬА аллелей,

Следовательно, наблюдаемая у некоторых больных резистентность ЭБВ-ЛПЗ к проведению ЭБВ-специфичной адоптивной иммунотерапии ЭБВ-специфичными Т клетками может быть отчасти объяснена отличием штаммов ЭБВ, вызывающих заболевание, от лабораторного штамма, используемого для экстракорпоральной стимуляции ЦГЛ донора.

7.4. Адоптивная имунная терапия с применением антиген-специфичных ЦТЛ в лечении ЦМВ.

Больным с клиникой цитомегаловирусной инфекции в пост-трансплантационном периоде, резистентной к лечению ганцикловиром, проводилась терапия Т клетками, стимулированными аутологичными дендритическими клетками, нагруженными пулом пенгадекапептидов, кодирующих полную последовательность рр65 белка ЦМВ. При этом был определен иммунодоминантный эпитоп и представляющий его МНС аллель для каждого донора.

Введенные Т клетки приводили к снижению ¡уровня ЦМВ ДНК в крови больных и повышению ЦМВ специфичных ЦТЛп, определяемых с помощью ИФНу , что коррелировало с клиническим ответом. Терапевтический эффект таких ЦМВ-специфичных ЦТЛ наблюдался у 3 из 4 больных. Сроки регистрации терапевтического ответа ЦТЛ и его клинических проявлений зависели от сроков проведения адоптивной клеточной иммунотерапии по отношению к первичной диагностике заболевания.

Полученные в результате проведенного исследования данные подтверждают эффективность адоптивной специфической иммунотерапии в лечении опухолевых и вирусных заболеваний, основанной на специфической коррекции недостаточности Т клеточного контроля. Разработанная методика получения антиген-специфических Т клеток позволяет проводить специфическую иммунокоррекцию без риска развития РТПХ. Выявленные в некоторых случаях возможные причины недостаточной эффективности Т клеточной терапии позволяют скорректировать требования к качественным характеристикам вводимых Т клеток, модифицировать пути экстракорпоральной стимуляции с применением методик, разработанных в экспериментальной части этой работы, позволяющих модифицировать как МНС рестрикцию, так и антигенный эпитоп, распознаваемый Т клетками, в зависимости от индивидуальных особенностей экспрессии на клетках-мишенях.

Пул

Пул г

J i --

Ч

W

&

Ö

JT

-У Т? ^

1---- в.1%

if ,а' „*

Пеитадекагсептид

29.4%

ш

.V ЦП "л

>г>щии пул

\ 20.4%

(

Z3.t% j Ш

JFN-y

Пе}ггадехапег]тид 65 Пеитадекагсептид 66 Пеш-адекапегпнд 67 Пентадекапептид 68

03%

% "

0.3%

'ш 17.3%

......

В

[KN-y

RP11F.R NOFT

PIIF.RN C.FTV

HERNG FTVL

ш W 0.4%

ш 0.4% 1

Ii "*}__________ ________ "'1

jit' ' ~ ......

f\ "

г ь

[l ""l—Г^дь ~ l" 1 1 1

IFN-y

Е/Т — 20; 1

Рисунок 24. Выявление иммунодоминантного аллеля и рр65 эпитопа для ЦТЛ терапии больного с ЦМВ после ТКМ. А.

Флоуцитометри чески й анализ ЦМВ специфических Т лимфоцита после вторичной стимуляции под-пулами пентадекапептидов рр65 белка выявил преимущественный ИФНу ответ на мини-пулы б, 7,18. Б, Анализ ИФНу Т клеточного ответа на вторичную стимуляцию пентадекапегггндами, содержащимися в мини-пулах 6,7,'18. В. Анализ Т клеточного ответа на 9-меры, содержащиеся в 15-мерах Jte 66 и 67. Г. Определение доминантного HLA аллеля с помощью оценки цитотоксмчности ЦМВ-специфичных 1 клеток против В клеточных линий, совместимых с Т клетками по одному из HLA аллелей, нагруженных предварительно выявленным доминантным пептидом. Цитотоксическая активность осуществлялась чере В40 аллель.

8. Прогностические факторы эффективности 1¥Т1-специфичной

противоопухолевой клеточной терапии и прогностической значимости

экспрессии УУТ1 для прогноза течения заболевания в целом

Разработанная в экспериментальной части методика получения ЦТЛ, способных дифференцировано лизировать опухолевые клетки и не повреждать здоровые гемопоэтические клетки, основана на применении Т клеток, специфических к \УТ1 антигену. Учитывая, что \¥Т1 является собственным антигеном, представленным в следовых количествах в нормальных гемопоэтических клетках, мы провели исследование по выявлению прогностических факторов, предопределяющих чувствительность нормальных гемопоэтических клеток и клеток различной опухолевой этиологии к терапии У/Т1 -специфичными ЦТЛ.

А.

¡о 80 5 7СГ

'В-ЛКЛ

' Костный моз • ' Пуповинная | 60 ' * ФГА бласты

§ 50"

<ровь

* Лейкемия " Нейробластома

20

Kendall's Таи = 0.57; р<0.001

Б.

12%

М1

40

% \Л/Т1 + клеток 8.

60

80

100

52%

М1

ю"

94%

10' 10' 10" тч-вдмрггс

ю'

¥/Т1-вАМ ИТС

УУП-САМПТС

Рисунок 25. Корреляционная зависимость чувствительности злокачественных и нормальных клеток к цитотоксичности \УТ1 специфичных ЦТЛ от экспрессии \УТ1.

В результате проведенного обследования при флоуцитометрическом анализе внутриклеточной экспрессии WT1 было выявлено, что нормальные и опухолевые клетки различаются не по уровню экспрессии протеина (средняя интенсивность флюоресценции не различалась в клетках, чувствительных к Т клеточной цитотоксичности, и в клетках, устойчивых к лизису, вызываемому WT1 специфичными ЦТЛ) (Рисунок 25, Б).

При этом в обследованных образцах отмечалось различное содержание популяции клеток, экспрессирующих WT1 белок (Рисунок 25, А и Б). Чувствительность этих клеток к цитолизу WT1 специфичными ЦТЛ коррелировала с процентом клеток, экспрессирующих WT1, содержащихся в клетках-мишенях с коэффициентом корреляции, определенном с помощью индекса Kendall's Tau=0.57 и при р<0.001 (Рисунок 25, А). Здоровые гемопоэтические клетки, включая CD34+ стволовые клетки костного мозга и пуповинной крови и ФГА бласты , а также ЭБВ-В-ЛКЛ и другие злокачественные клетки различной природы, содержавшие менее чем 20% WT1+ клеток, не были эффекта вно лизированы WT1-реактивными Т клетками. В тоже время экспрессия WT1 выше 20% отмечалась только в злокачественных клетках, и только такие злокачественные клетки были эффективно лизированы WT1 специфичными ЦТЛ (Рисунок 25, А).

При исследовании экспрессии ко-стимуляторных молекул и молекул МНС было выявлено, что молекулы I класса HLA экспрессируются на большинстве лейкемических клеток, клеток неробластомы, мезотелиомы, и вариабельно представлены на поверхности клеток рабдомиосаркомы, рака яичников и толстого кишечника. Недостаточность экспрессии этих молекул предотвращает цитолиз таких клеток мишеней HLA-рестриктированными WT1-специфичными Т клетками. Корреляции между экспрессией других костимуляторных молекул на клетках-мишенях и их чувствительности к цитолизу Т клетками выявлено не было.

Таким образом, определение размера популяции злокачественных клеток, экспрессирующих WT1, может являться прогностическим признаком чувствительности данного вида злокачественных клеток к планируемой антиген-специфичной Т клеточной терапии, что может являться одним из определяющих факторов вовлечения больных в терапевтический протокол по применению WT1 специфичных ЦТЛ. Недостаточность экспрессии молекул основного комплекса гистосовместимости I класса может явиться препятствием к эффективному цитолизу злокачественных клеток антиген-специфическими Т лимфоцитами и является показанием к проведению терапии по усилению этой экспрессии.

9. Особенности противоопухолевого клеточного иммунного ответа у онкологических и онкогематологических больных и возможности проведения адоптивной противоопухолевой иммунотерапии аутологичными эффекторными клетками.

Для проведения адоптивной клеточной иммунотерапии больным, которым по различным причинам не проводилась пересадка костного, представляется необходимым разработать подходы к проведению такой терапии аутологичными экстракорпорально активированными иммунными клетками, способными специфично распознавать и

элиминировать злокачественные клетки из

организма больного. С этой целью мы

изучали наличие в организме больных с различными злокачественными патологиями предшественников эффекторных клеток иммунной системы, способных при экстракорпоральной активации в специальных уловиях привести к формированию цитотоксической противоопухолевой популяции эффекторных клеток, применимых в клинчисеких условиях.

9.1. Оценка состоятельности У/Т1 специфичных Т клеток, циркулирующих в организме больных с \УТ1+ опухолями. При обследовании больных с раком яичников было выявлено, что у 6 из 10 больных отмечалась отмечалась экспрессия \\Т1 опухолевыми клетками при иммуногистохимическом исследовании. При этом также выявлялась инфильтрация опухолевой ткани Т лимфоцитами, среди которых преобладали С1Э4+ Т клетки. Эти Т клетки активно пролиферировали в лабораторных

условиях в присутствии бОООЕд/мл 11,-2, стимуляцию в течение 16 часов общим

но не продуцировали ИФНу в ответ на пулом пентадекапептидов, кодирующих

полную последовательность \УТ1 протеина. Дополнительная стимуляция

аутологичными

дендритическими

клетками,

нагруженными

пулом

пентадекапептидов, кодирующих полную последовательность \УТ1, не приводила к повышению ИФНу-продуцирующей активности Т клеток, инфильтрирующих опухоль.

При окраске на тетрамеры было выявлено, что МКПК больных с \УТ1+ раком

яичников содержится популяция Т клеток

способных связываться с тетрамерами,

несущими НЬА-А0201 и связывающийся с ним пептид (Таблица 16).

Стимуляция Т клеток таких больных

74

аутологичными ЭБВ-В-ЛКЛ больного,

нагруженными НЬА-А0201 связывающимся пептидом \УГ1 - КМР - позволяла получить популяцию Т клеток, обогащенную \УТ1 реактивными ЦТЛ (2.05% теграмер-связывающихся клеток). Эта популяция была тем больше, чем больше была изначальная популяция Т лимфоцитов, связывающихся с тетрамером.

Такие клетки проявляли опухолеспецифическую цитотоксичность против клеток, экспрессирующих \\П"1, сравнимую с цитотоксичностью против ЭБВ-В-ЛКЛ, определенную для ЭБВ-специфичной популяции клеток, содержащихся в той же Т клеточной линии (Таблица 16). Количество тетрамер-позитивных клеток в линии Т клеток, определяемых после экстракорпоральной стимуляции, и их цитолитическое действие предопределяются наличием специфической Т клеточной популяции в МКПК больных. Так, процент тетрамер-связывающихся \УТ1 специфичных Т клеток в МКПК больного №3 был несколько ниже (Таблица 16), в результате чего в полученной ЦТЛ с тетрамером связывалось лишь 0.81% Т клеток, а наблюдаемая цитотоксичность против \¥Т1+ В-ОЛЛ была значительно ниже, хотя аутологичные ФГА бласты, нагруженные стимулирующим \УТ1 пептидом 1ШР, были эффективно лизированы этими ЦТЛ (Таблица 16).

Таблица 16. WT1 специфичный Т клеточный ответ у больных с раком яичников (РЯ).

№ HLA WTI WT1-RMF Цитотоксичность,%

Б- го аллель экспрессия на опух клетках* Тетрамер'клетки, % Эс (мишении) 30.1 >фекторьгМишени

МКПК ЦТЛ WT1* OvCar WT1+ в- ОЛЛ ФГА/ RMF ФГА в- лкл

1. А0201 - 0 03 0.3 5 17 2 1 1

2 А0201 ++ 0.13 2.05 70 87 45 3 40

3. А0201 + 0 08 0.81 15 19 48 5 82

4. А0201 ++ 0.17 7.2 66 63 71 2 64

5. А2402 ++ НИ НИ 35 43 36 9 51

6. А0201 - 0 02 0.06 3 16 13 4 21

7. А0201 - 0.06 0.11 7 8 5 1 25

8. А0201 ++ 0.09 0.92 15 37 48 10 37

9. А0201 - 0.01 0.35 9 18 15 3 2

10. А0201 ++ 0.23 64 53 43 59 3 53

* - экспрессия WT1 определялалсь с помощью иммуногистохимии.

Получить ЦТЛ от больного с WT1- опухолью яичника не представлялось возможным, такие Т клетки не были выявлены в МКПК больного Xsl, не связывались

75

со специфичным тетрамером после экстракорпоральной специфической стимуляции и не лизировали \УТ1+ мишени (Таблица 16)

Т клетки, полученные путем экстракорпоральной стимуляции из МКПК больных с \ЛГГ1+ раком яичника ингибировали рост опухоли этой же этиологии в

экспериментальной модели адоптивной иммунотерапии рака яичника.

9.2 Получение \УТ1 специфичных ЦТЛ у больных с раком толстого кишечника. При изучении Т клеточного ответа к антигену у больных с аденохарциномой толстого кишечника было выявлено, что у 4 из 5 больных \МТ1 экспрессировался в большинстве опухолевых клеток (результаты флоуцитометрии были подтверждены данными иммуногистохимического исследования) (Таблица 17).

Таблица 17. Получение \УТ1 специфичных Т клеток из МКПК больных с раком

толстого кишечника.

№ больного НЬА аллель % \УТ1+ опухолевых клеток* Тетр спец кле амер+ \\Т1 ифичные Т гки в ЦТЛ Цитотоксичность,% 30:1 эффекторы:мишени

\УТ+ клетки \УТ1" клетки

1. А0201 57% 2.5% 34% 3%

2. А2402 63% ] ' 45% 1%

3. А0201 3% ¡0.17% 13% 4%

4. А2402 46% | ' 37% 9%

5. А0201 35% 13.2% 48% 12%

* - экспрессия с помощью флоуцитометрии; тетрамер для А2402 аллеля получить не удалось.

результате экстракорпоральной стимуляции Т клеток больных аутологичными ЭБВ-В-ЛКЛ, нагруженными ШП пептидом, связывающимся с НЬА-А0201 (1ШР) или НЬА-А2402 (ЯУР) аллелем, специфичные Т клетки были получены у 4 из 5 больных. Эти Т клетки связывались со специфичным тетрамером (Таблица 17) (Н1А-А2402 тетрамер получить не представилось возможным) и лизировали \УТ1+ мишени. Т клетки одного из пациентов, адоптивно введенные в экспериментальной модели аденокарциномы толстого кишечника, ингибировали рост аутологичной \\ПГ1+ опухоли (Рисунок 26).

Лизирование опухоли происходило только в присутствии ИФНу, стимулирующего поверхностную экспрессию МНС молекул на опухолевых клетках.

ЦТЛ (ЗОхЮ6 в/в)

,1Ь-2 (2000Ед) + 1га-у \УТ1 -ЦТЛ +1Ь-2 (2000и Ед) +

12 3 4

Недели после введении опухоли

Рисунок 26. Влияние аутологичных \¥Т1-специфичных ЦТЛ на рост опухоль адеиокарцнномы толстого кишечника

Таким образом \\Т1 специфичные Т клетки могут быть получены из МКПК больных с \УТ1+ солидными опухолями. Эти Т клетки могут эффективно ингибировать рост аутологичной опухоли и использоваться для адоптивной терапии подобных пациентов

9.3. Изучение особенностей функциональной активности НК клеток больных с М1СА/В+ злокачественными новобразованиями Как было показано в экспериментальной части этой работы, НК клетки, экспрессирующие №С020-рецептор, способны специфически связываться с его лигандом М1СА/В на опухолевых клетках и вызывать их лизис. Мы предположили, что М1СА/В экспрессирующие опухолевые клетки способны вырабатывать факторы, например, растворимую форму М1СА/В, приводящие к ингибированию экспрессии МКС2Б-Р

При динамическом обследовании больных с раком толстого кишечника на разных стадиях заболевания (при первичной диагностике, ремиссии и рецидиве) было выявлено, что отсутствие экспрессии >ПС020-Р выявлялось у больных с активным опухолевым процессом (Рисунок 27).

к ч

ч р

О «

5

6 08

•в = й?

1 0.6

£

Я

о.

о

» 0.4

я О.

а о

О

0.2

0'

о

0 Г]

0 -ЖС20-Р у больных с раком толстого кишечника -в активной стадии заболевания

♦ - Ж02Б-Р у больных с раком толстого кишечника в ремиссии О - ККХйБ-Р у здоровых доноров

20 40 60

% N«320 позитивных НК клеток

80

Рисунок 27. Корреляция экспрессии 1ЧКС2Б-Р на НК клетках и уровня растворимого М1СА/В в сыворотке крови больных с М1СА/В* аденокарциномой толстого кишечника и здоровых доноров

При ремиссии Ж020-Р у больных определялся в той же пропорции клеток, что и у здоровых доноров. Исследование образцов сыворотки крови больных показало, что при первичной диагностике и рецидиве заболевания уровень растворимой формы М1СА/В повышен по сравнению с таковым у здоровых доноров. Это коррелирует со снижением экспрессии №С02В-Р на НК клетках, а в ремиссии уровень растворимого М1СА/В снижается, приводя к повышению экспрессии ЫК02В-Р (Рисунок 27). При изучении

механизма йягнбирования экспрессии ЫКСЗёШ-Р было выявлено, что высокие концентрации М1СА.'В способствуют интернализании рецептора (Рисунок 28, А) с его последующей локализацией в цитоплазме НК клеток (Рисунок 28, Б) и деградацией (Рисунок 28, В). Добавление антител, блокирующих М1СА/В, позволяло предотвратить этот процесс

А- Б. И.

Рисунок 28. Процесс интерна л изацни ГЧКС21.)-Р при высоких концентрациях растворимого М1САУВ. Л. Интернализааия №020-Р. Б, Локализация рецептора в цитоплазме. К. Деградация рецептора, красное окрашивание соответствует локализации рецептора.

и поддерживать поверхностную экспрессию МКй20-Р на НК клетках.

Таким образом при проведении адоптивной иммунотерапии аутологичными экстракорпорально активированными активированными НК клетками больным с адспокарни номой толстого кишечника, секрстирующей растворимые молекулы М1СА/В, необходимо одновременно планировать введение М1СА/В блокирующих антител.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Исследования, представленные к данной работе, объединены общей идеей разработки методов адоптивной иммунной клеточной терапии для лечения больных с онкогематологическими заболеваниями и инфекции иммунной системы. Широта спектра исследований отражает потребности современной иммунологии и он ко гематологи и в осуществлении подобных методов лечения у больных с различными видами гемопоэтических и солидных опухолей, а также вирусных инфекций у иммунокомпрометрованного хозяина, в зависимости от механизмов устойчивости к иммунному контролю, приобретенных пораженными клетками.

Возможности адоптивной клеточной иммунотерапии позволяют преодолевать устойчивость злокачественных клеток к токсическим методам химио- и лучевой терапи, пс 'затратоная, здоровы« ткани организм. Развитие шшх методов экстракорпоральной

79

стимуляции опухоле-специфических эффекторных клеток позволяет расширить контингент больных, подлежащих проведению такой терапии, и повысить ее экономическую эффективность путем создания банка антиген-презентирующих клеток, легко доступных для использования при стимуляции Т клеток требуемой МНС рестрикции. Таким образом внедрение методов адоптивной иммунотерапии доступно и внедряется в клиниках, осуществляющих лечение онкогематологических больных и аллогенную пересадку костного мозга.

Учитывая непосредственную направленность описываемого комплекса исследований на разработку клинически применимых методов лечения, метод адоптивной клеточной иммунотерапии приобретает особую значимость. Введение опухоле- и вирусспецифических эффекторных! клеток позволяет оказывать направленное цитотоксическое воздействие на пораженные клетки, несущие специфический антиген. Проведенные в данной работе исследования дают возможность проводить динамическое наблюдение за вводимыми клетками, оценивать их эффект и коррегировать терапевтический план в соотвествии с прогнозируемым ответом на терапию. Прогностические характеристики опухолевых клеток, описанные в данном исследовании, дают возможность заблаговременно оценить чувствительность пораженных клеток к цитолитическому действию эффекторных клеток и блокировать механизмы, позволяющие им избегать иммунного контроля со стороны вводимых эффекторных клеток. Применение методов адоптивной иммунотерапии позволит расширить терапевтические возможности современной онкологии и гематологии, улучшить результаты лечения при проведении ТКМ.

ВЫВОДЫ:

1. ЭБВ-В-ЛКЛ и ИАПК являются эффективными экстракорпоральными стимуляторами эпитоп-специфичного Т клеточного ответа, способными презентировать требуемые низко-иммуногенные опухолевые и вирусные антигены, такие как ЭБВ-антиген ЬМР1 и опухоле-специфичный антиген \УТ1, и представляют собой самовосполняющийся источник клинически применимых антиген-презентирующих

клеток, предварительно произведенных,

требуемое время в требуемых количествах для получения ЦТЛ с заданной Н1А-агшель связанной антиген-специфичностью с целью их использования в лечении больных с ЭБВ-ЛПЗ и \УТ1+ гемопоэтическими и солидными опухолями.

охарактеризованных и доступных в

2. Дифференцированное использование гомозиготных ЭБВ-В-ЛКЛ и ИАПК, экспрессирукяцих только НЬА аллели, совместимые с общими Н1А аллелями донора Т клеток и реципиента, является необходимым условием для получения антиген-специфичных Т клеток, способных узнавать опухолевые и вирусные эпитопы в контексте Н1А аллелей больного, от НЬА частично несовместимых доноров для лечения больных с ЭБВ-ЛГО, развившихся на фоне неятрогенного иммунодефицита и после пересадки органов, а также пациентов с солидными опухолями и гемобластозами, и позволяет проводить экстракорпоральную управляемую стимуляцию ЦТЛ с требуемой НЬА-рестрикцией и антиген-специфичностью.

3. Деплеция СБ56+ клеток из МКПК донора с последующей экстракорпоральной стимуляцией позволяет сократить содержание НК клеток или НК-подобных Т клеток в полученной Т клеточной культуре с 20% до <1% и в 100% случаев получать ЭБВ-специфичные ЦТЛ, не проявляющие аллореактивности по отношению к нормальным гемопоэтическим клеткам реципиента и аллогенным НЬА несовместимым ЭБВ^В-ЛКЛ. Такие ЦТЛ способны дифференцированно эффективно убивать клетки аутологичной ЭБВ-лимфомы в лабораторных условиях и в модели АКИТ и являются клинически применимыми для специфической иммунокоррекции у больных с пост-транплантационным ЭБВ-ЛПЗ.

4. Трансдукция ретровирусным вектором, кодирующим маркерный белок рФРН и «суицидальный» ген герпес-вирусной тимидин киназы, осуществляемая на Т клетках после вторичной стимуляции ЭБВ-В-ЛКЛ, приводит к преимущественной селективной генетической модификации ЭБВ-специфичных Т лимфоцитов, позволяющей осуществлять раннюю сортировку трансдуцированных клеток по маркерному белку, сокращая таким образом сроки культивирования с 28 до 10 дней, и, одновременно, получать клинически применимую популяцию ЦТЛ, обогащенную в 6 раз по ЭБВ-специфичным Т лимфоцитам и деплетированную в 8 раз по аллореактивным Т клеткам, что соответствует специфичности и безопасности 28-35-дневной культуры ЦТЛ. Наличие «суицидального» гена обеспечивает контроль за активностью введенных Т клеток и их эффективное удаление при наличии признаков РТПХ в результате АКИТ при ЭБВ-ЛПЗ и при других онкогематологических и вирусных заболеваниях

5. Метод картирования мини-пулов перекрывающихся пентадекапептидов при антиген-

специфичной стимуляции ЦТЛ позволяет идентифицировать новые специфические

вирусные или эпухолевые эпитопы, являющиеся иммуногенными функционально

81

значимыми доминантами в противовирусном или противоопухолевом Т клеточном ответе индивидуально подобранного донора эффекторных клеток и, таким образом, с наибольшей вероятностью производить ЦТЛ, обладающие противоопухолевой или противовирусной активностью, вне зависимости от НЬА типа донора и реципиента АКИТ для лечения больных с \УТ1+ злокачественными заболеваниями и пост-транспланационной ЦМВ инфекцией.

6. Полный пул перекрещивающихся пентадекапептидов, кодирующих полную аминокислотную последовательность онкогенного белка \¥Т1 или ЦМВ белка рр65, содержит эпитопы, способные стимулировать не только СВ8+, но и СГ>4+ Т клетки, приводя к формированию полноценного Т клеточного ответа, поддерживаемого хелперными клетками и способствующего более эффективному и долгосрочному терапевтическому эффекту вводимых больному ЦТЛ при лечении как гемобластозов, так и ЦМВ.

7. Наличие на клетках-мишенях экспрессии специфического антигена, презентирующего его иммунодоминантного НЬА аллеля и ко-стимуляторных молекул (ССЯ7 и ЬРА!) предопределяет способность ЦТЛ мигрировать и

персистировать в опухоли-мишени и

коррелирует с эффективностью их

противоопухолевого ответа: сниженная экспрессия одного из этих компонентов предотвращает инфильтрацию опухоли Т ; клетками, снижая их терапевтическую эффективность.

Эффективность противоопухолевого действия ЦТЛ зависит от соотношения количества антиген-специфичных Т клеток и размеров опухоли-мишени: наименьшая доза специфичных антиген-реактивных ЦТЛ, позволяющая эффективно ингибировать рост специфической опухоли, составляет 0.0044x106 Т клеток на 1см5 опухолевой массы, что необходимо учитывать при проведении адоптивной клеточной иммунотерапии.

Анализ противоопухолевой активности суб-популяций антиген-специфичных Т лимфоцитов продемонстрировал, что изолированно выращенные ЭБВ-специфичные лимфоциты способны оказывать эффективное, но отсроченное по времени ингибирующее воздействие на рост аутологичной ЭБВ-В-ЛКЛ при сравнении с действием нефрагментированных ЭБВ-специфичных ЦТЛ, в то время как изолированно выращенные СЮ4+ Т клетки не подавляют рост аутологичной опухоли ЭБВ-В-ЛКЛ, а, напротив, предотвращают противоопухолевую активность изолированно выращенных С08+ЦТЛ,

предполагая предпочтительность

использования смешанной неклональной популяции антиген-специфичных ЦТЛ, содержащей как CD4+, так и CD8+T клетки, оказывающие кумулятивное цитолитическое воздействие на опухоль благодаря лизису, осуществляемому через антигены, представленные в контексте HLA алелей I и II класса комплекса гистосовместимости, и хелперной активности CD4+T лимфоцитов.

10. Разработанная методика экстракорпоральной активации НК клеток в аутологичной системе дает возможность производить противоопухолевые НК клетки из МКПК больных со злокачественными опухолями эпителиального происхождения, такими как аденокарцинома толстого кишечника, экспрессирующими HLA-подобную стресс-активируемую молекулу MICA/B. Активированные таким образом НК клетки не проявляют неспецифической цитотоксической активности против здоровых тканей больного и способны: а) оказывать цитотоксическое противоопухолевое действие на аутологичные опухолевые клетки in vitro, б) мигрировать и персистировать в экспериментальной модели этой опухоли, в) подавлять ее рост в живом организме, что предполагает возможность их использования для проведения аутологичной направленной иммунотерапии таких опухолей, являющихся резистентными к адоптивной терапии ЦТЛ в связи с отсутствием экспрессии молекул основного комплекса гистосовместимости.

11. Вирус-специфичные Т клетки донора, развивающиеся из Т-деплетированного аллогенного костного мозга в микроокружении организма реципиента с ТКИН в результате приживления трансплантата от несовместимого по одному HLA гаплотипу родителя, содержат антиген-специфичные ЭБВ-реактивные Т лимфоциты, которые не имеют аллореактивности против здоровых тканей донора или реципиента и рестриктированы по ЭБВ эпитопам и HLA аллелям, принадлежащим либо к HLA типу реципиента, либо к общему гаплотипу донора и больного, но, в большинстве случаев, отличающимся от доминантных рестриктирующих элементов Т клеток самого донора.

12. Выбор иммунодоминантного рестриктирующего HLA аллеля антиген-специфичных Т клеток донора, развивающихся в контексте микроокружения реципиента, и, соответственно, способность Т клеток, узнавать антигены, представленные в контексте HLA типа донора или больного, зависит от генетической природы антиген-презентирующих клеток, циркулирующих в организме больного в посттрансплантационном периоде, которая коррелирует с интенсивностью

подготовительного миелоаблативного режима перед ТКМ.

83

13. Проведение адоптивной клеточной иммунотерапии неспецифическими лимфоцитами донора стволовых клеток больным с лейкозами и ЭБВ-ЛПЗ, развившимися после ТКМ является эффективным методом ^иммунокоррекции противоопухолевого и противовирусного иммунитета и позволяет получить полную ремиссию у 56% и 90% больных соответственно, приводя к развитию РТПХ у 18-27% больных. Введение 106 Т клеток/кг в ранний период после ТКМ Кб месяцев) обуславливает развитие РТПХ у 20-40% больных.

14. Адоптивная специфическая иммунотерапия ЭБВ- и ЦМВ-специфичными ЦТЛ осуществляет специфическую иммунокоррекцию путем повышения количества специфических ЦТЛ в крови больных, приводя к снижению уровней вирусной ДНК, что коррелирует с ремиссией заболевания у 75%. Признаков РТПХ при этом не выявлется в 100% случаев.

15. Наличие в популяции опухолевых клеток более чем 20% клеток, экспрессирующих \¥Т1, является прогностическим фактором^ чувствительности таких клеток-мишеней к лизису ^П-специфичными Т клетками.

16. Циркуляция АУТ! специфичных Т клеток у больных с раком яичников и толстой

кишки коррелирует с экспрессией этого

антигена на опухолевых клетках, которая

выявляется в 60% и 80% больных соответственно. В группе таких пациентов \\ГГ1 реактивные Т лимфоциты, связывающиеся со специфическим тетрамером, определяются у 67% больных с раком яичников и 80% - с аденокарциномой толстой кишки. Успешная экстракорпоральная активация полученных из МКПК пациентов ЦТЛ, специфичных к \УТ1 и обладающих цитолитической активностью против аутологичной \УТ1+ опухоли, осуществима для 80-90% больных с \¥Т1+ злокачественными новооборазованиями с целью последующего проведения аутологичной иммунокоррекции.

17. Несосотоятельность НК-клеточного ответа была выявлена у 100% больных с М1СА/В аденокарциномой толстого кишечника, обуславливалась высоким уровнем растворимого М1СА/В, секретируемого опухолевыми клетками, вызывая интернализацию и деградацию активирующего НК клетки рецептора №СС20, а также других важных хемокиновых молекул, таких как СХСЮ, блокируя эффективный противоопухолевыйответ аутологичных эффекторных клеток больного, подтвеждая необходимость их эффективной экстракорпоральной активации для последующей вутологичной иммунокоррекции.

18. Разработанные методы экстракорпоральной стимуляции эффекторных клеток позволяют производить аутологичные опухолеспецифические Т клетки и НК клетки из МКПК больных для проведения адоптивной иммунотерапии больным, не подлежащим проведению ТКМ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Для ускорения процесса получения антиген-специфических Т клеток и обеспечения динамического контроля за ними в организме больного рекомендуется использовать методику их быстрой экстракорпоральной селекции с помощью деплеции Ж клеток и моноцитов и ранней трансдукции ретровирусным вектором, кодирующим «суицидальный» и визуализирующий ген ВПГ-ТК.

2. При необходимости получения Т клеток, специфичных к низкоиммуногенным эпитопам, рекомендуется использовать ЭБВ-трансформированные В-ЛКЛ, нагруженные стимулирующим пептидом, что позволяет обеспечить самовосполняющийся источник антиген-презентирующих клеток, которые при этом приводят к наиболее быстрой и эффективной пролиферации антиген-специфичных ЦТЛ в количествах, достаточных для проведения адоптивной иммунотерапии в клинике

3. В случае отсутствие МНС совместимого донора Т клеток для проведения терапии состояний, обусловленных поражением клеток, являющихся генетически клетками пациента, в частности для лечения ЭБВ-ЛПЗ у больных после пересадки органов, рекомендуется создать банк гомозготных ЭБВ-В-ЛКЛ, являющихся быстро-доступным источником антигенной стимуляции и позволяющих селективно стимулировать Т клетки донора, способные распознавать ЭБВ-антигены в контексте МНС аллелей больного

4. Для осуществления направленной стимуляции клеток с заданной специфичностью к конкретному эпитопу, представленному в контексте определенного НЬА аллеля следует использовать искусственные антиген-презентирующие клетки, несущие в результате генетической модифицикации выбранный МНС аллель и антигенный эпитоп.

5. При адоптивной клеточной иммунотерапии больных с солидными опухолями, не имеющими поверхностной экспрессии НЬА молекул, но экспрессирующими стрессовую молекулу М1СА/В необходимо использовать активированные

экстракорпорально аутологичные НК клетки больного, имеющие на своей поверхности ИКШО-Р.

6 При проведении терапии активированными НК клетками необходимо определять уровень растворимой формы М1СА/В молекулы в сыворотке больных, и при его повышении проводить повторные введения Ж клеток на фоне мониторирования динамики популяции МК020-Р+ НК клеток в организме больного. При наличии клинически применимых антител, блокирующих ингибирующих эффект растворимой формы М1СА/В рекомендуется их сочетанное применение при проведении терапии НК клетками.

7. При назначении адоптивной иммунотерапии вводимые Т клетки должны быть представлены поликлональной популяцией и содержать как СБ8+ Т лимфоциты, так и С04+ Т лимфоциты.

8. При выявлении сниженной экспрессии ко-стимуляторных молекул или молекул МНС для повышения эффективности лечения 1ДТЛ рекомендуется вводить препараты, повышающие их экспрессию, в частности 1ИЧу.

9. Назначение антиген-специфичной противоопухолевой терапии больным с \"/Т1+ злокачествеными образованиями должно проводится на основании определения процентного содержания злокачественных клеток, экспрессирующих этот антиген.

10. Расчет дозы вводимых Т клеток должен! производится исходя из минимального необходимого числа антиген-специфичных! Т клеток (0.0044x106 Т клеток на 1см3 опухоли), инфильтрирующих опухоль после адоптивного введения, и процента клеток, мигрирующих в опухоль от общего числа введенных ЦТЛ (~1%).

11. При введении Т клеток, селектированных путем ретровирусной трансдукции и несущих ген ВПГ-ТК, необходимо проводить мониторинг адоптивно введенных ЦТЛ и при первых признаках развития РТПХ начать терапию ганцикловиром

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Koulova L.. Doubrovina ES. Kersten M.J., O'Reilly RJ. Altered selection of immunodominant HLA-restricted elements by EBV-specific donor-type T-cells developing in recepients of HLA-haplotype disperate SBA-E T-cell depleted marrow grafts. 40th American Society of Hematology Annual Meeting, Abstract #1095, Miami, FL, 1998.

2. Doubrovina E.S.. Kersten M.J., Heller G., Jagiello C., Bamett L., O'Reilly RJ. The evaluation of IGF-1 as a possible promoter for EBV lymphoma in vitro and in vivo. 11th Annual Meeting of American Society of Pediatric Hematology/Oncology, Chicago 1998, Abstract # 686.

3. Doubrovina E.S.. Barnett L., Jagliello C., O'Reilly RJ. The role of IGF-1 receptor in IGF-1 mfluence on malignant hemopoiesis in vivo and in vitro. ISH-EHA Combined hematology congress. Amsterdam 1998, Abstract P-0096.

4. Small TN, Doubrovina ES. O'Reilly RJ. Age related limitations to immune reconstitution following allogeneic marrow transplants: the host thymic environment as a critical determinant and as target for therapeutic intervention. SERONO Symposia USA "Growth Hormone in Immune Reconstitution", 1999.

5. Dubrovina ES. Barnett L, O'Reilly RJO and Rumiantzev AG. IGF-1 receptor as a restricting factor for IGF-1 effect on malignant hematopoiesis. VII National Congress "Human and Drugs", Moscow, Russia, April 2000, p.3-4.

6. Dubrovina ES. Kersten MJ, Kulova L, Rumiantsev AG, O'Reilly RJO. The role of host microenvironment in altered selection of HLA restricting elements by EBV specific donor type T cells after T cell depleted haploidentical Bone Marrow transplant. VII Congress "Human and Drugs", April, 2000, Moscow, Russia, p.4.

7. Dubrovina E.S, Kersten M., O'Reilly R.J., Rumiantsev A.G. The role of Insulin-Like Growth Factor-I in the development of EBV lymphoma. VII Russian Congress "Humand and Drugs", Moscow, Russia, 2000.

8. Doubrovina ES . T. Diaz-Barrientos, J.Guerrero, RJ.O'Reilly Advantages of the use of natural killer cell depleted peripheral blood lymphocytes as a source of EBV specific cytotoxic T cells cultured in vitro. ISHAGE meeting. June 14-18, 2000, San Diego, USA.

9. Doubrovina ES.. RJ.O'Reilly Rapid generation of Epstein-Barr virus (EBV) specific T lymphocytes (CTL) depleted of host-reactive T cells using allogeneic HLA homozygous haplotype matched EBV transformed В cells for in vitro sensitization. 42nd ASH Annual Meeting, San-Francisco, CA, 2000.

Ю.Дубровин MM, Дубровина E.C . Румянцев А.Г. Развитие иммунной системы плода.

«Педиатрия», 2001, #4, р 67-72.

11.Doubrovina E.S.. Doubrovin М.М., Во Dupont, Y.Vyas. The in vitro mediated up-regulation of NKG2D receptor allows for the tumor specific NK cell immune response against the autologous colon cancer tumor. 43rd ASH Annual Meeting, 2001.

12.Alpdogan O, Scmaltz C, Muriglan SJ, Doubrovina E S . Kappel B.J., Greenberg A, Rotolo J, van den Brink MRM. Insulin Growth factor-1 (IGF-1) can enhance lymphoid and myeloid reconstitution after allogeneic bone marrow transplantation in murine models. 43rd ASH Annual Meeting, 2001.

13.Dubrovina E.S.. O'Reilly R.J., Kersten M., Rumiantsev A.G. The selection of EBV specific cytotoxic T lymphocytes for the treatment of lymphoproliferative disease in patients after T cell depleted allogeneic Bone Marrow Transplant. VIII Russian Congress "Human and Drugs", Moscow, Russia, 2001, p.297-298.

14.Doubrovin M.M.. Doubrovina E S. Ponomarev V.B., Gelovani-Tjuvajev Yu.G. Evaluation of Long-term Cytotoxic T lymphocyte effect on EBV-transformed В cells with TK/GFP reporter gene. ASH, Annual Meeting, 2001.

15.Doubrovin M.M., Doubrovina E.S.. Ponomarev V.B., Ageyeva L,, Ivanova A.A., Balatoni J., Finn R., O'Reilly R., Blasberg R., Gelovani-Tjuvajev J. Dynamic in vivo imaging of specific cytotoxic T Cells targeting EBV-lymphoma. AACR, Conference "Molecular Imaging in Cancer", Orlando, FL, 2001.

16.Doubrovina E.S.. S.Lee, G.Koehne, M.Doubrovin, J.Guerrero, T.Diaz-Barrientos, RJ.O'Reilly. Peptide-loaded EBV transformed В cells are effective antigen presenting cells for rapid in vitro generation of HLA-restricted WT-1 specific cytotoxic T cells for antileukemia adoptive cell therapy. 2002 Tandem BMT Meetings, Orlando, FL, 2002.

17.Doubrovin M, Doubrovina E. Balatoni J, Ivanova I, Ponomarev V, O'Reilly R, Finn R, Blasberg R, Gelovani J. Long-term monitoring of antigen-specific in vivo labeled cytotoxic T lymphocytes (CTL).SNM Meeting, Orlando, FL, 2002. j

18.Doubrovin M.M., Doubrovina E.S.. Ponomarev V.B., Ageyeva L., Ivanova A.A., Balatoni J., Finn R., O'Reilly R., Blasberg R., Gelovani-Tjuvajev J. Dynamic in vivo imaging of specific cytotoxic T Cells targeting EBV-lymphoma. SNM Annual Meeting, Los Angelis, CA, 2002.

19.Doubrovina E.S. The mechanisms allowing the solicl tumors to escape cell immune response, Congress "Human and Drugs", 2002, Moscow, Russia.|

20.Doubrovina E. Doubrovin M, Guerrero J, Diaz-Barrientos T, Dupont B, Vyas Y. " Ex vivo up-regulation of NKG2D receptor (NKG2D-R) on the autologous NK cells (NK) as a new option for the immune cell therapy of the colon adenocarcinoma"!, 8th International Meeting of the ISCT May 25 to 28,2002. Barcelona, Spain [

21.Doubrovin M.M., Doubrovina E S- Ivanova A.A., Balatoni J., Finn R., Ponomarev V.B., Sadelein M., Blasberg R., O'Reilly R., Gelovani-Tjuvajev J. HLA restricted targeting of anti-EBV-CTL in vivo non-invasively monitored of over the duration of therapy. Abstract#142, International Society of Cellular therapy Meeting, Barcelona, Spain, 2002. j

22.Doubrovina E.. Doubrovin M., Ivanova A., Ageyeva L., Balatoni J, Beresten T., Finn R., Larson S., Sadelain M., Blasberg R., Gelovani Tjuvajev J. and O'Reilly R. Long-term in vivo monitoring of the tumor targeted migration of EBV specific cytotoxic T-cells transduced to express HSV-TK by PET scan following repeated in vivo labeling with [124I]FIAU. 44,h ASH Meeting, December 610,2002, Philadelphia, PA, USA. j

23.Doubrovina E. L. Koulova, M. Kersten, E. Sokolova, J Guerrero, T. Diaz-Barrientos, R.J. O'Reilly. Preparative Cytoreduction And Chimeric State Influence HLA Restriction Patterns Of Virus Specific Donor T Cells Developing Late After Haplotype Disparate T Cell Depleted (TCD) marrow Transplants For Severe Combined Immunodeficiency (SCID). 44th ASH Meeting, December 6-10,2002, Philadelphia, PA, USA

24.Doubrovina E, Guerrero J, Lee S.Y., Koehne G, Doubrovin M.,Diaz-Barrientos T., RJ.O'Reilly. Human lymphocytes sensitized to HLA A0201 and HliA A2402 binding WT-1 peptides loaded on autologous cytokine activated monocytes or EBV transformed B cells yield HLA restricted WT-1 peptide specific cytotoxic T cells that lyse primary \yT-l+ leukemic cells in vitro and, in vivo, home to and induced regression of WT-1+ leukemic xenografts bearing the restricting HLA alleles. 44th ASH Meeting, December 6-10,2002, Philadelphia! PA, USA

25.Doubrovina E.S.. M. M. Doubrovin, A. Ivanova, L. Ageyeva, J. Balatoni, T. Beresten, R. Finn, S. Larson, M. Sadelein, R. Blasberg, Y. Gelavani, R. J. O'Reilly. Long-Term In Vivo Monitoring of the Tumor Targeted Migration of EBV Specific Cytotoxic T-Cells Transduced To Express HSV-TK by PET Scan Following Repeated In Vivo Labeling with [124I]FIAU. Ist Annual Meeting of Society of Molecular Imaging. Boston, MA, 2002. Abstract # [819].

26.Doubrovin M., Doubrovina E.. A Ivanova, J Balatoni, R Blasberg, R Finn, V Ponomarev, M Sadelain, R O'Reilly, J Gelovani Tjuvajev. (CTL) Allows for Long-Term Monitoring of Their Migration. Abstract#1278. 5th ASGT Annual Meeting, boston, MA 2002.

27. Alpdogan O,, Muriglan SJ, Kappel BJ, Doubrovina E. Schmaltz C Schiro R,, Greenberg AS, Willis LM, Rotolo JA, O'Reilly RJ, van den Brink MRM. Insulin Growth Factor-I (IGF-I) enhances lymphoid and myeloid reconstitution after allogeneic bone marrow transplantation. -Transplantation 2003 June, 12(75):1977-1983.

28. G.Koehne*, M.Doubrovin*, E. Doubrovina*. P.Zanzonico, H. F.Gallardo, A.Ivanova, J.Balatoni, J. Teruya-Feldstein, G.Heller, C.May, V.Ponomarev, S.Ruan, R.G.Blasberg, W.Bornmann, I.Riviere, M.Sadelain, RJ.O'Reilly, S.M.Lasrson, J.G.Gelovani Tjuvajev. Serial in vivo imaging of the targeted migration of human HSV-TK-transduced antigen-specific lymphocytes. - Nature Biotechnol. 2003 Apr, 21 (4): 405-13.

29. Doubrovina E.S.. Doubrovin M.M., Vider E., Sisson R.B, O'Reilly RJ., Dupont B., Vyas Y. Evasion from NK Cell immunity by MHC Class I Chain-Related Molecules Expressing Colon Adenocarcinoma. - The Journal of immunology 2003, Dec 15; 171(12):6891-9.

3Q.Doubrovina E S . Latouche J-B.L., Lee, SY, Raab-Traub N.,Pamer E, Sadelain M., O'Reilly R.J.O. A novel strategy for generating LMP1 specific T cells utilizing artificial antigen presenting cells. 2003 Tandem BMT Meetings, January 30-February 3,2003, Keystone Resort, Colorado.

31.Mikhail Doubrovin, Ekaterina Doubrovina. Zanzonico P., Blasberg R.G. Monitoring Hunam Cytotoxic T-Lymphocytes Transfected with a Reporter Human Nor-Epinephrin Transporter Gene. SNM 50th Annual Meeting, June 2003, New Orlean, IL.

32.Mikhail Doubrovin, Ekaterina Doubrovina. Zanzonico P., Blasberg R.G. Use of Nor-Epinephrine transporter Gene as a Reporter for Non-Invasive Molecular Imaging. 2nd Annual Meeting of the Society for Molecular Imaging, August 15-18,2003, San Francisco, CA.

33.Rui Rong Yuan, Phillip Wong, Michael R. McDevitt, Christophe Antczak, Doubrovina Ekaterina. Ingrid Leiner, Christophe P. Borella, Patrick Guirnalda, Richard O'Reilly, William G. Bornmann, Eric G. Pamer, and David A. Scheinberg. Clonal Deletion of CD8+ T Cells by Alpha Emitting Alpha Emitting Suicide Peptide/MHC Tetramers. 55th Annual ASH Meeting, December 6-9,2003.

34. Yuan RR, Wong P, McDevitt MR, Doubrovina E. Leiner I, Bommann W, O'Reilly R, Pamer EG, Scheinberg DA. Targeted deletion of T-cell clones using alpha-emitting suicide MHC tetramers. Blood. 2004 Oct 15; 104(8):2397-402.

35. Doubrovina E S- Doubrovin M.M, Lee S.Y, Shieh J-H, Heller G„ Pamer E , O'Reilly RJ In vitro stimulation with WT1 peptide-loaded Epstein-Barr virus-positive B cells elicits high frequencies of WT1 peptide-specific T cells with in vitro and in vivo tumoricidal activity. Clin Cancer Res. 2004 Nov 1; 10(21) 7207-19.

36.Doubrovina E.S , Doubrovin M.M., Shieh J-H., Bierwiaczonek A., Heller G., Pamer E., O'Reilly RJ. Characterization of the Tumor-Specific Activity of WT1 Specific T Cells Generated In Vitro from Normal Individuals by Sensitization with WT1-Peptide Loaded Autologous EBV Transformed B Cells. 2004 Tandem BMT Meetings, February 13-17, 2004, Orlando, FL.

37.Doubrovin M.M.. Doubrovina E.S.. Pillarsetti N., O'Reilly R.J., Rumiantsev A.G. Quantitative assessment of the infiltration with cytotoxic lymphocytes in the alive organism using visualization methods. "Voprosi hematologii/oncologii i immunologii", 2004, vol.3, #4, p.99. [m Russian]

38.Doubrovin M.M., Doubrovina E S.. Pillarsetti N., O'Reilly R.J .Rumiantsev A.G. Differential visualization of clinical sub-populations of cytotoxic T lymphocytes in the experimental models. "Voprosi hematologii/oncologii i immunologii", 2004, vol.3, #4, p.99. [m Russian].

39 Doubrovina E.S.. Kanaeva E., Doubrovin M.M., O'Reilly RJ. The identification of New Immunogenic Epitopes of the Wilm's tumor antigen (WT1) as Targets for the Specific Antitumor Response of T lymphocytes in the Adoptive Cell Immune Therapy of the Oncohematologic diseases and Solid tumors. Russian National Congress "Humand and Drugs", 2005, Moscow, Russia.

40.Doubrovin M., Doubrovina ES„ L. Bidaut, RG Blasberg Combination of Imaging Modalities for Imaging Bone Marrow engraftment. 2005 ASMBT Annual Meeting, Keystone, CO.

41.Doubrovina E.S., Dupont J., Trivedi D., O'Reilly RJ. Identification of Novel WT1 Epitopes by Sensitization of Human T cells with overlapping Pentadecapeptides spanning the Wtl protein for the targeted Adoptive Immunotherapy of Leukemia. 2005 tandem BMT Meeting, February 2005, Colorado.

42.Doubrovina E.. Dupont J., Kanaeva E., O'Reilly R. Characterization of leukemia-reactive WT1-specific T cells generated in vitro by sensitization with the overlapping pentadecapeptides spanning the WT1 protein for the targeted Adoptive Immunotherapy of Leukemia. 2006

89

43.Zanzonico P, Koehne G, Gallardo HF, Doubrovin M, Doubrovina E. Finn R, Blasberg RG, Riviere I, O'reilly RJ, Sadelain M, Larson SM. [(131)I]FIAU labeling of genetically transduced, tumor-reactive lymphocytes: cell-level dosimetry and dose-dependent toxicity. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2006 Sep; 33(9):988-97. j

44. Serganova I., Ponomarev V., Mayer-Kuckuk P., Doubrovina E.. Doubrovin M., Blasberg R-. Imaging genes for Viral and Adoptive Therapies. Chapter 12 in the book "In vivo imaging of Cancer Therapy", (m press). j

45. Дубровина E.C., Дубровин M.M., Катаева E.B., Ли С.Ю., Ши Ж.Х., О'Райли Р.Дж., Румянцев А.Г. Цитотоксические Т лимфоциты, активированные экстракорпорально пептидами белка WT1, как опухолеспецифичные эффекторные клетки для адоптивной

клеточной иммунотерапии лейкозов и

солидных опухолей. Ж.»Вопросы

онкологии/гематологии и иммунопатологии в педиатрии», 2006.

46. Дубровина Е.С.. Дубровин М.М., Канаева E.B.J Румянцев А.Г. Мониторинг генетически модифицированных цитотоксических Т-лимфоцитов с помощью ПЭТ при адоптивной иммунотерапии ЭБВ-ассоциированных лимфом! Ж. «Вопросы онкологии/гематологии и иммунопатологии в педиатрии», 2006.

47. Doubrovina E.S.. La-Touche J.B., Lee S.Y., Heller G., Kanaeva E., Sadelein M., O'Reilly R.J. Artificial Antigen Presenting cells transduced to express LMP1 peptides are potent stimulators of LMP1 specific cytotoxic T cells for the Adoptive Immunotherapy of EBV related malignancies. Journal of Immunology (in review). j

48. Дубровин M.M., Дубровина E.C.. Румянцев А.Г. Современные подходы к медикаментозной терапии солидных опухолей у взрослых. Глава в книге:

«Сопроводительная терапия и контроль онкологических заболеваниях», Медпрактика-М,

инфекций при Москва, 2006.

гематологических и

Список сокращений:

АКИТ - адоптивная клеточная иммунотерапия АПК - антигенпрезентирующие клетки В-ЛКЛ - В лимфомные клеточные линии В-ОЛЛ - острый B-клеточный лимфолейкоз ВПГ-ТК - тимидин киназа вируса простого герпеса ДК - дендритические клетки ДК-ЦТЛ - ЦТЛ, стимулированные дендритическими ЗФП - зеленый флуоресцентный протеин ИАПК - искусственные антиген-презентирующие клетки ИАГПС А2-и - ИАПК, трансдуцированные вектором, кодирующим HLA-A0201 аллель I класса

и представленный на нем LI пептид I^lPl белка ИАПК A2'F|U - ИАПК, трансдуцированные вектором, ¡кодирующим HLA-A0201 аллель I класса

и представленный на нем Flu пептид вируса гриппа ИФНу - интерферон гамма j

Люк-Нео - вектор, кодирующий люциферазу и ген резистентности к неомицину МСКОЦ - Мемориал Слоан-Кеттеринг Онкологический Центр (MSKCC - Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)

МКПК - мононуклеарные клетки периферическоц крови

НК - натуральные киллеры

OJIJI - острый лимфолейкоз

ОМЛ - острый миелолейкоз

ПЭТ - позитронно-эмиссионная томография

РТПХ - реакция трансплантат против хозяина

рФНР - рецептор фактора роста нейронов

ТК-ЗФП - ретровирусный вектор, кодирующий тимцдин киназу герпес вируса и зеленый

флуоресцентный протеин ТКМ - трансплантация костного мозга

ТКМ/ТДОТС - трансплантация костного мозга с деплецией Т клеток от HLA совместимого неродственного донора

ТКМ/ТД/НРНС - трансплантация костного мозга с деплецией Т клеток от HLA

несовместимого неродственного донора ТКМ/ТД/РС - трансплантация костного мозга с деплецией Т клеток от HLA совместимого родственного донора

ТКМ/ТД/РНС - трансплантация костного мозга с деплецией Т клеток от HLA несовместимого

родственного донора ТПЛ - трансплантат против лейкемии ФАКС - флоуцитометрическое сканирование ФГА бласты - фетогемагппотининовые бласты XMJI - хронический миелолейкоз ЦМВ - цитомегаловирус ЦТЛ - цитотоксические Т лимфоциты ЦТЛп - предшественники ЦТЛ чНАТ - человеческий норадреналиновый транспортер чНАТ-ЗФП - вектор, кодирующий чНАТ и ЗФП ЭБВ - Эпштейн - Барр Вирус

ЭБВ-В-ЛКЛ - ЭБВ-трансфецированные В лимфоцитарные клеточные линии.

ЭБВ-ЛПЗ - ЭБВ-ассоциированное лимфопролиферативное заболевание

ЭБВ-ЦТЛ - ЭБВ специфичные цитотоксические Т лимфоциты

ЯМР - ядерно-магнигный резонанс

BZLF1 - ЭБВ антиген

BMLF1 - ЭБВ антиген

ß2-MT - Р2-макроглобулин

CCR5 - хемокиновый рецептор

CCR7 - хемокиновый рецептор

CXCR1 - хемокиновый рецептор

EBNA3C - ЭБВ антиген

FDA -Food and Drag Administration

GMP - Good Manufacturing Practices -регуляторный пакет документов по правилам

производства лечебных компонентов для применения в клинике GM-CSF- колониестимулирующий фактор роста гранулоцитов и макрофагов HLA - human leukocyte antigens - человеческие лейкоцитарные антигены HLA-A0201 - HLA аллель 1 класса IL2 - интерлейкин 2 IL4 - интерлейкин 4 [124f]FIAU [131I]FIAU [123I]MIBG

[124I]MIBG

LI - A0201-связывающийся пептид LMP1 белка

L1/A2 - тетрамер, несущий L1 пептид, представленный в контексте HLA-A0201 аллеля Flu/A2 - тетраме, несущий Flu пепти, представленный в контексте HLA-A0201 аллеля GCV - ганцикловир LFA1 - хемокиновый рецептор LMP2-3EB антиген LMP1 - ЭБВ антиген

MICA/B - стресс-индуцируемая HLAI класс-подобная молекула NIT - ретровирусный вектор, кодирующий рецептор фактора роста нейронов и тимвдин

киназу вируса простого герпеса NKG2D-P - рецептор на НК клетках TNFa - фактор некроза опухали RMF - пептид WT1

RMF/ДК-ЦТЛ - ЦТЛ, стимулированные дендритическими клетками, нагруженными RMF RMF/ЭБВ-ЦТЛ - ЦТЛ, стимулированные дендритическими клетками, нагруженными RMF SLG-WT1 пептид

WT1 - белок опухоли Вильмса (Wilm's tumor)

Wn/ЭБВ-ЦТЛ - ЦТЛ, стимулированные ЭБВ-В-ЖЛ, нагруженными пептидами WT1 WTI/ДК-ЦТЛ - ЦТЛ, стимулированные дендритическими клетками, нагруженными WT1

Заказ №571. Объем 2 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, уел. 250-92-06 4WW.postator.ru