Автореферат и диссертация по медицине (14.00.31) на тему:Взаимодействие новых полусинтетических производных антрациклиновых антибиотиков с чувствительными и резистентными опухолевыми клетками IN VITRO

РГ6 од

2 9 МАЙ 1995

на правах рукописи

ЛЕОНТЬЕВА Ольга Владимировна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НОВЫХ ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДНЫХ

АНТРАЦНКЛИНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ С ЧУВСТВИТЕЛЬНЫМИ И РЕЗИСТЕНТНЫМИ ОПУХОЛЕВЫМИ КЛЕТКАМИ IN VITRO.

14.00.31. - химиотерапия и антибиотики

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена в Научно-исследовательской институте по изыскания новых антибиотиков РАМН, Москва и в Центре противораковых препаратов ах. Грэйс, Буффало, США.

Научный руководитель: доктор медицинских наук В.М. Еухнан.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Т.А. Богуш

доктор биологических наук Л. Б. Горбачёва

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт

канцерогенеза ОНЦ РАМН

Защита диссертации состоится " лЛ&'РгЛ--- 1995 г.

в IУчас. на заседании Диссертационного совета Д. 001.03.01 при НИИ по изысканию новых антибиотиков РАМН, по адресу: 119867, Москва, ул. Б.Пироговская, д. 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИНА РАМН.

Автореферат разослан " —-- 1ддз г

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук (/ Т. А. Успенская

^СЩ-^ч^

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Практика онкологяи доказала эффективность химиотерапии доксорубицинон, даунорубицином и кармяноницинон, относящийся к группе антрациклиновых антибиотиков, в лечении ряда диссемэнхрованных опухолей, линфосарком я лейкозов (Блохян я Переводчиков», 1934; ОеУ1Ъа, 1985; Вооаег и Ног^.оЬаду1, 1994). Благодаря своему широкому спектру противоопухолевой активности доксорубицин входит в схемы хиниотерапии как многих солидных опухолей, так и лейкозов. Даунорубицин и карминоницин преимущественно используются при лечении некоторых типов лейкозов. Однако, некоторые типы раковых опухолей, например, немелко-клеточный рак легкого, раки прямой кишки и почек, злокачественная меланома, с самого начала слабо реагируют на химиотерапию, что часто связало с так называемой «врожденной» лекарственной устойчивостью опухолзвых клеток. Кроме этого, в популяции клеток многих исходно чувствительных к антрациклннам опухолей, в процессе проведения терапии преимущественно размножаются резистентные к этим препаратаи клетки. Так например, лечение доксорубицинон может увеличить продолжительность жизни больных, страдающих раком молочной железы, у которых в момент установления диагноза не обнаруживаются отдалённые метастазы, но, однако, существует статистическая вероятность рецидива из уже распространившихся в организме, хотя и недиагностируемых раковых клеток (ОеУ1Ьа, 1985). К сожалению, в современной клинической практике случаи длительного выживания больных, получавших химиотерапевтическое лечение, составляют всего 5-10 %.

Две взаимосвязанных причины ограничивают возможности современной противоопухолевой химиотерапия. Это недостаточные эффективность и избирательность действия современных химяотерапевтических препаратов (цитостатиков), в том числе и антрацпклинов.

Основной причиной недостаточной противоопухолевой Эффективности цитостатиков является резистентность.

«врождённая» ил* приобретенная, опухолевых клеток к цитогоксическому действию препаратов.

Как правило, приобретённая или «врождённая» устойчивость опухолевых клеток к антрациклиновын препаратан носит характер множественной лекарственной устойчивости, а именно, резистентности ко многим другим структурно неродственным противоопухолевым соединениям.

Из сказанного ясна актуальность проблемы изучения механизмов лекарственной устойчивости опухолевых клеток к антрациклинам и разработки путей её преодоления.

Одним из стратегически важных подходов к преодолению лекарственной устойчивости опухолей является разработка новых эффективных производных широко используемых в клинической практике противораковых препаратов, в частности, антрациклннов. В многочисленных исследованиях убедительно продемонстрировано, что различные химические модификации антрациклиновых антибиотиков могут привести к созданию соединений, потенциально активных в отношении опухолевых клеток, проявляющих множественную лекарственную устойчивость (НаЪапаЬе еС а1, 1988; Со1еу ег а1, 1989; Рг1еЬе и Рогвг-8о1ег, 1993). Поэтому дальнейший поиск новых полусинтетических производных антрациклиновых антибиотиков, активных на резистентных опухолевых моделях, и выявление положительных с этой точки зрения структурных модификаций молекул антрациклннов является актуальной проблемой.

Несмотря на широкий спектр противоопухолевой активности, доксорубицин мало или не эффективен при лечении некоторых солидных опухолей, например, карциноме толстого кишечника, яичника и раке предстательной железы. Другие природные антрациклины: даунорубицин и аклацинокицин А - обладают узким спектром противоопухолевой активности, что ограничивает их применение в клинике лечением лейкозов. Поэтому важным остается и изучение взаимоотношений «структура - активность», позволяющее определить перспективные кодификации молекул антрациклиновых антибиотиков, которые могут привести к созданию потенциально эффективных в отношении различных типов злокачественных образований производных с расширенным спектром противоопухолевой активности.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Цель» настоящей работы был первичный отбор перспективных противоопухолевых препаратов среди вновь синтезированных а НИИНА РАМН полусинтетическях производных антрацикляновых антибиотиков доксорубицина, даунорубицина и карминомицина.

В работе использовали следующие производные: З'-Л-трифторацетильные производные доксорубицина, даунорубицина и карминомицина; 14-0-гениадипинаты и 14-0-гемипинелаты доксорубицина и 14-гидроксикармнноницина, а также 14-0-геми-эфиры соответствующих Н-трифторацетилированных антибиотиков; 13-(4-метилпиперазин-1-ил)имино гидразоны N-тркфторацетилиро-ванных карминомицина и дауно^уби^ина; морфолиновые производные карминомицина и . ци^нонорфолинокарминомицин.

Для достижения поставлэнной цели решались следующие задачи:

1) В цитотоксическом тесте на панели, состоящей из 4 линий' клеток солидных опухолей человека и 1 линии мышиного Т-клеточного лямфолейкоза, в той или иной мере чувствительных к антрациклинам, а также 2 сублиний опухолевых клеток (молочной железы человека и мышиного Т-клеточного лямфолейкоза), устойчивых к доксорубицину, сравнили способность новых производных и их исходных соединений угнетать рост опухолевых клеток in vitro. Отобраны кандидаты, перспективные для последующего изучения. Кроме того, сделаны выводы о взаимосвязи между структурой и цитотоксической активностью изученных соединений.

2) Для выявления значения клеточной фармакокинетики в механизме чувствительности и резистентности клеток к антрациклинам проведено сравнительное изучение клеточной фармакокинетики- 14-0-гемиадипината доксорубицина и доксорубицина на чувствительных я резистентных опухолевых клетках in vitro.

3) Для выявления значения внутриклеточного распределения в механизме чувствительности и резистентности клеток к антрациклинам проведено сравнительное изучение внутриклеточного распределения' 14-0-гемиадипината доксорубицина и доксорубицина в- чувствительных и резистентных опухолевых клетках in vitro.

4) С целью изучить влияние химической трансформации

антрациклинов в их соответствующие 14-0-гемиадипинаты на характер воздействия полученных производных на клеточный цикл было проведено исследование эффектов отобранных в цитотоксическои тесте новых 14-0-гемиадипннатов доксорубицина и 14-гидрокснкармннокицина на прохождение клеточного цикла культурами опухолевых клеток в сравнении с исходными препаратами.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.

Впервые с использованием панели чувствительных и - резистентных линий опухолевых клеток человека и мыши изучена цитотоксическая активность 16 новых полусинтетических производных антрациклиновых антибиотиков. Полученные результаты обосновывают перспективность дальнейшего изучения 14-0-гемиэфиров доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина, морфолино-14-гидроксикарминомицина, морфолино- и циано-норфолинокарминомицина. В то же время, хотя остальные соединения не имели преимуществ перед исходныни антибиотиками, они проявляли достаточно высокую активность в цитотоксическои тесте и для определения перспективности их дальнейшего изучения необходима оценка . их токсичности в отношении нормальных тканей.

Выявлено, что 14-0-гемиэфиры 14-гидроксикарминомицина. обладающие лучшей растворимостью, чек исходный антибиотик, оказались по активности близкими к 14-гидроксикарминомицину, детальное изучение которого ранее было затруднено крайне плохой растворимостью.

Продемонстрировано, что введение отрицательного заряда в виде ионизованной карбокси группы в агликон доксорубицина оказало положительное влияние на цитотоксическую активность Полученных производных в отношении резистентных клеток.

Впервые обнаружена корреляция между повышенной активностью 14-0-гемиадипината доксорубицина в отношении резистентных клеток и увеличением внутриклеточного накопления и удержания этого производного в устойчивых клетках по сравнению с исходным доксорубицином.

Впервые установлено, что профиль внутриклеточного распределения 14-0-гемиадипината доксорубицина отличается от профиля исходного антибиотика как в чувствительных, так и в

резистентных опухолевых клетках.

Полученные данные представляют основу для дальнейшего поиска, антрациклиновых аналогов, потенциально активных в отношении резистентных опухолей, среди полярных производных, в частности, содержащих легко ионизируемые карбокси группы.

З'-Н-трифторацетильные производные карминомицина и даунорубицина, преодолевающие резистентность опухолевых клеток, но крайне плохо растворяющиеся в воде, могут служить в качестве исходных препаратов для синтеза новых производных, сочетающих высокую активность в отношении устойчивых опузсолевйх клеток и хорошую растворимость в физиологических растворителях.

АПРОбАЦИЯ РАбОТЫ. Основные результаты работы доложены на:

- На научном семинаре Пэнтра противораковых препаратов имонн Грэйс. Противораковый институт имени Развелл. Парк, Буффало, США, сентябрь 1904;

г На 86 ежегодной конференции Американской ассоциации по' исследованию рака, Торонто, Канада, март 1995;

' - На II Российском национальном' конгрессе «Человек и лекарство», Носква, апрель 1995.

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 4 печатных работах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на /66 страницах машинописного текста, включает 7 таблиц, 18 рисунков, 10 фотографий и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований. обсуждения результатов и выводов. Библиография содержит 2С£ наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовал* 15 новых полусинтетических производных антрациклиновых антибиотиков, даунорубицин, карминомицин ч 14-гидроксикарминомицин, полученные в НИИНА РАМН в виде порошков и препарат производства фирмы "Adria" (США) - адриамицин (доксорубицян).

Исследования проводили в культурах перевиваемых опухолевых клеток человека и животных in vitro.

Для оценки ингибирующей рост опухолевых клеток активности антрациклиновых производных использовали панель опухолевых клеточных линий, состоящую из 4 линий клеток, происходящих из солидных опухолей человека: рака яичника Л121, немелко-клеточного рака легкого Л549, рака молочной железы KCF7 и рака толстого кишечника НТ29; 1 линии Т-клеточного лейкоза мыши Р388 и 2 доксорубицин-устойчивых сублиний -MCF7/DOX и P388/DOX, гиперпродуцмрующих Р-гликопротеин и проявляющих фенотип HDR.

В монослойных культурах А121, А549, MCF7, MCF7/DOX, НТ29 активность препаратов определяли с помощью колориметрического метода окраски белка сульфородамином В (SRB). После 72 часовой инкубации с препаратами в 96-луночных планшетах клетки фиксировали 50t ТХУ в теч. 1 часа, затем окрашивали 0.4% SRB в 1% уксусной кислоте. Связанный с клеточными белками SRB экстрагировали ЮтМ- раствором основания Трис. Оптическую плотность полученных в лунках растворов измеряли на ридере Bio-Tech при X-S70HM. По снижению оптической плотности по сравнению с контролем судили о степени подавления роста клеток.

Оценку активности препаратов в суспензионных культурах Р388 и P388/Dox проводили в 24-луночных планшетах. После 48 часовой инкубации с препаратами степень подавления роста определяли путем прямого подсчета клеток на счетчике клеток Coulter Counter.

Результаты опытов представлены в виде 1С10, концентраций препаратов, подавляющих рост клеток на 50%, представляющих средние значения 3-5 независимых экспериментов + sd (стандартное отклонение).

Накопление и удержание доксорубицина и его

14-0-гемиадипнната d чувствительных и резистентных клетках Р388 определяла с помощью метода проточкой цитометрии. 2x10« клеток P388/S или P388/DOX предварительно инкубировали с 20цЯ доксорубицина или- 14-0-гемиадипината в присутствии или отсутствии 5дг/мл циклоспорина А (CsA) в теч. 2 часов. После отмывания образцов от антибиотиков путем центрифугирования при 500д (5мин) в ростовой среде 1.5x10« клеток из каждого образца анализировали на проточном цитометра FACScan (Becton Dickinson). Красная флюоресценция антрациклинов возбуждалась при А=488нм, для регистрации флюоресценции использовали фильтр 630 нм. ' Для оценки способности клеток P388/S и P388/DOX удерживать исследуемые антибиотики культуры клеток предварительно нагружали препаратами в присутствии CsA. После отмывания клеточных образцов от антибиотиков, как описано выше, часть клеточных образцов P388/S и P388/Dox далее инкубировали в ростовой среде без соответствующего антибиотика в присутствии CsA, а другую часть культур - без CsA, в теч. 12 часов и затем обрабатывали и анализировали на цитометре FACScan, _ как описано выше. Величины средней интенсивности флюоресценции клеток в клеточных образцах в каждом эксперименте исправлены с учетом фоновой нэспецифической флюоресценции соответствующих' контрольных культур к представлены в виде средней интенсивности флюоресценции, приходящейся на одну клетку в каждом образце, вычисленную на основе данных 3-5 независимых экспериментов +sd. х

Локализацию доксорубицина и его 14-0-гениадипината в клетках P388/S и P388/Dox исследовали с помощью метода конфокальной микроскопии. Клетки P338/S я Р388/Оох инкубировали с 20дН препаратов в присутствии или отсутствии 5дг/мл CsA, отмывали от препаратов центрифугированием при ЗООд (10мин) в холодном фосфатно-буферном растворо рН 7.4 (PBS), клеточный осадок ресуспендировали в малом количестве PBS f»* 500цл). Каплю клеточной суспензии наносили на покровное стекло, покрытое Alcian Blue. После прикрепления клеток к стеклу покровные стекла, с клеточным* культурами помешали на предметные стекла клетками вниз и анализировали на лазерном сканирующем микроскопе MRC 600, соединенном с обычным неинвертированным микроскопом "Optiphot" (Hicon, Япония). Для

возбуждения флюоресценции антрациклинов использовался аргоновый лазер (15&Н).

Эффект доксорубицина и 14-гндроксикарминомицина к их 14-0-гемиадипинатов на прохождение клеточного цикла опухолевыми клетками рака молочной железы MCF7/S исследовали с помощью проточно цитометрического анализа распределения содержания ДНК в ядрах, выделенных из клеток этих культур и окрашенных флюоресцентным маркером ДНК - пропидий иодидом (PI). В культуры, находящиеся в логарифмической фазе роста, добавляли препараты в концентрациях 2xXCsg или 5х1С10. После 24 часов инкубации клетки трипсинизировали к собирали в виде суспензий единичных клеток. 2x10* клеток из каждого образца промывали*центрифугированием в следующем растворе: 0.1 % NaN,, 0.5% БСА в PBS - при 500д (Юмин), фиксировали в 70% этаноле в теч. 18 часов при,4°С. За 3 часа до анализа на цитонетрв образцы промывали в PBS, инкубировали с 25дл раствора РНКазы (2мг/мл в диет, воде) в теч. 30 мин при 37°С. Затем окрашенные раствором пропидий иодида (50/аг/мл в 0. 1% р-ре тринатрий цитрата) клеточные образцы анализировали на цитометре FACScon. Флюоресценция PI возбуждалась при Х«4В8нк, красную эмиссию PZ регистрировали через фильтр 600 км. В работе представлены результаты анализов эффектов антрациклиновых антибиотиков на клеточный цикл, полученные в одном из 2 независимых экспериментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЯДЕНИЕ ПЕРВИЧНАЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА IN VITRO АНТРАЦИКЛИНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ.

Сравнительное изучение ингибируюоей клеточный рост активности антрацнклииовых антибиотиков на панели опухолевых клоточпызе линяй человека и животных показало, что исходные антибиотики доксорубнцнн, даунорубяцин, карниноннцин и его полусинтетическое производное 14-гидроксикарминомицин проявляют сходные спектры биологической активности in vitro. По уровню лекарственной чувствительности к исходным антрациклинам использованные опухолевые линии были разделены на три группы: 1) природно-чувствятольные - культуры клеток рака яичника человека А121, немелко-клеточного рака легкого человека А549, рака молочной железы человека MCF7/S, Т-клеточного лейкоза мыши P388/S; 2) природно-устойчивые - клетки рака толстого кивечника НТ29, в г-» 6 раз ненее чувствительные, чем клетки первой группы; 3) клетки с индуцированным фенотипом MDR: рака молочной железы MCF7/DOX и Т-клеточного лейкоза кыак P388/Dox, высоко устойчивые к селектирующему агенту доксорубицину (в 168 н 382 раза по сравнению с. клетками соответствующего исходного типа) и перекрестно-устойчивые к другим использованным антрациклиновым антибиотикам.

Ннгиблруещая клеточный рост активность карннномицина и 14-гадроксикарминокицина.и их производных была в несколько раз выше активности доксорубицина и даунорубицина и их соответствующих производных на клеточных линиях всех типов чувствительности.:

Сравнительное изучение ряда новых производных антрациклиновых антибиотиков: доксорубицина, даунорубицина, кармнномицина и 14-гидроксикарминомицина, модифицированных по положению с-14 агликона и/или по атому азота в положении 3' показало, что введение остатков адипиновой или пимелиновой кислот в С-14 агликона доксорубицина или 14-гидрок=икарми-номицина либо не изменяло, либо, уменьшало ингибирующую активность полученных производных в отношении чувствительных и природно-устойчивых опухолевых линий в зависимости от типа клеток. При этом 14-О-гениэфиры доксорубицина проявляли большую, чем доксорубицйн, активность в отношении клеток с индуцированным фенотипом MDR. Активность аналогичных 14-С-гемиэфиров

14-гидроксикарминомицина на резистентных клеточных линиях, в целом, • была сравнима с активностью исходного препарата.

N-трифторацетилирование аминогруппы даунозамина, р целом, привело к снижению ингибируюшей рост опухолевых клеток активности полученных производных, что согласуется с имеющимися в литературе данными (Israel et al, 1985). Однако, в то время как трифторацетилирование доксорубицина привело хотя и в разной степени к снижению активности на' всех использованных клеточных линиях, включая устойчивые, активность таких производных даунорубицина и каркиномицина в. культурах клеток с индуцированным фенотипом MDR оказалась либо близкой, либо выше активности исходных препаратов.

Таким образом, аналогичная химическая трансформация доксорубицина, даунорубицина и карминокицина неодинаково изменила профиль биологической активности полученных прэчзводных.

Изучение цитотоксической активности замещенных гкдразонов Н-трифторацетилированных ■антрациклиновых антибиотиков

обнаружило, что одновременное введение трифторацетильной группы в З'-Н даунозамина и 1-амино-4-метилпиперазикильного заместителя в С-13 агликона молекулы даунорубицина привело к снижению ингибирующей активности относительно чувствительных, но не повлияло или увеличило активность относительно клеток, с различными. видами устойчивости. Аналогичная трансформация карминомицина привела к снижению активности в отношении всех использованных клеточных линий с разными типами лекарственной чувствительности.

Улучшенная растворимость замещенных гкдразонов N-трифтор-ацетилированиых даунорубицина и карминомицина по сравнению с трудно растворимыми исходными З'-Н-трифторацетилированными даунорубицинон и кармикокицином и наличие заместителя с химически лабильной связью дают основание рассматривать эти производные как потенциальные депо-форкы плохо растворимых ■сходных антибиотиков. Аналогично, 14-0-гемиэфиры

14-гидроксикарминомицина, лучше растворимые в воде, чем исходный 14-гидроксикарминомицин, могут служить в качестве пролекарства последнего.

Включение атома азота даунозамина в морфолиновое кольцо в молекулах карминомицина или 14-гидооксикарниномицина привело к снижению ингибирующей активности в отношении чувствительных и

увеличению активности. в отношении резистентных

Р-гликопротеин-положительных опухолевых клеток.

Введение, цианогруппы в положение 4 морфолинового кольца дало самое эффективное из всех исследованных в настоящее работе соединение с активностью, превышающей таковую карниномицина я на чувствительных, и на устойчивых клетках.

Резистентные сублинии MCF7/Dox и P388/Dox, обладающие Р-гликопротеин-опосредованным фенотипом MDR, проявили меньшую перекрестную устойчивость, выраженную в виде - индексов резистентности, к исследованным в данной работе новым производным доксорубицина, даунорубицпна и карниномицина, чем к нсходнын антибиотикам (табл. 1). Устойчивые клетки P388/Dox также проявили меньшую перекрестную устойчивость к производным 14-гкдроксикарминомицнна в то время, как резистентные культуры MCF7/DOX оказались более устойчивы к новым производным 14-гидроксикарниномицина, за исключением 14-0-гемиадипината З'-И-трифторацетил-14-гидроксикарминомицина, чен к исходному 14-гидроксикарминомицину. Наименьшие индексы резястонтности для обеих использованных пар чувствительных/устойчивых линий показали морфолиновые производные карниномицина и 14-гидроксикарниномицина; 3'-N-трифторацетильные производные даунорубицина я карниномицина и 14-0-гемиадипинат доксорубицина. Цианоморфолинокаркиноницин, полностью преодолевая резистентность гспоток плотной опухоли MCF7/Dox, показал довольно высокий индекс резистентности для резистентных лейкозных клеток P388/Dox (табл. 1) •

Особый интерес в этом ряду . производных представляет 14-О-гекиадипннат доксорубицина. Индексы резистентности для этого производного были и 28 и 23 раз ниже, чем для доксорубицина для пар линий MCF7/S - MCF7/DOX и P388/S -P388/Dox, соответственно. Эти данные послужили основой для более детального изучения этого соединения.

Таблица 1. УРОВНИ ПЕРЕКРЕСТНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ РЕЗИСТЕНТНЫХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК К АНТРАЦИКЛИНОВЫМ ПРОИЗВОДНЫМ.

Индексы резистентности (ХС50резист. /1С50чувст.)

Соединение

КСТ7/Б - МСР7/0ох (рак нол. жел. чел. )

Р388/8 - Р388/0ох (Т-лимфоц. лейк. ныши)

Производные роксорубицика по С-14 и/или З'-М:

Доксорубицин 168 382

Доксорубяцин-14-0-гемиаднпинат б 15

Доксорубицин-14-0-гемипнмелат 43 1 55. .

3'-Ы-трифторацетил-доксорубицин 55 114

3'-Ы-трнфторацетил-доксорубицин-14-0-генипимелат 44 * ■ 67

Производные даунорубицина по С-13 И/ИЛИ З'-Н:

Даунорубицин 64 160

З'-Н-трифторацетил-даунорубицин 5 10

13-(4-кетилпиперазин-17ИЛ)*иино-Ы-трифтор-ац е т илдаунорубиц и н 14 21

Производные каркинокицина по С-13 Я/или З'-Ы:

Карниномицин 10 62 .

3'-Ы-тр ифт орацегил-карииноницин 2 4

13-(4-нетилпиперазин-1-ил)имино-Н-трифтораце-тил-карниномицин 4 31

морфолинокарминомицин 2 2

цианоморфолинокарми-нокицин 1 20

Продолжение таблицы 1. 1 2 .3

Производные 14-гидроксжкариинокицина по С-14 и/или З'-И: 14-Гкдроксикарминокнцин 13 225

14-Гндрокспкарипномицпп-14-

О-гемиадвпвнат 22 В1

14-Гндроксикарминокицик-14-0-генппикелат 38 20

3 '-11- трифторацетил- гвдрокснкарминоннцин- 14-0-гомпадйпитт б 63

З'-Н-трифторацотил-гвдроксикарканоииции-14-0-гемвпикёлат 50 35

иорфолвногвдроксв-карминоницпи " 2 3

ИЗУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ФАРМАКОКИНЕТИКИ ДОКСОРУБИЦИНА и

14-0-ГЕ1ШАДНПИНАТА ДОКСОРУБИЦИНА В ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ и

РЕЗИСТЕНТНЬИ КЛЕТКАХ МЬШНОГО ЛЕЙКОЗА РЗВ8.

Предыдущие. исследования установили корреляцию между цптотоксачностыэ противоопухолевых препаратов и параметрами их внутриклеточной фарнакокинетики. Один из этих параметров -способность клеток накапливать и удерживать эти цитотокснческие вещества. Согласно знающихся о литературе данным, устойчивость к антрацвклииовын антибиотикам, в в частности к доксорубицину, во многих случая:: обусловлена усилением ' активного выброса аитвбиотвков из клетки наружу, который осуществляется мембранным Р-гдикопротеином (Рдр). обнаруженным а повышенных количествах в клетках, отобрашгых по устойчивости к. антрациклинам. Это сввдэтольствуот о той, что природные антрациклины являются хорошими субстратаки Рдр'. Исследованные ранее антрациклиновые производные, оказавшиеся активными в отношении рез* : таит пых опухолевых клеток, лучио накапливались и удерживались в этих клетках, чей соотаатстэушщие исходило антибиотики. Поэтому мы предположили, что обнаруженная нани повышенная активность 14-0-гемпэфиров доксорубвцина з культурах резистентных Рдр-положнтельных клоток та:сяо коаэт быть связана с изменениями э клеточной фармакокянетзко этих производных а устойчивых

клетках.

Проведенное с целью проверять это предположение сравнительное изучение накопления и удержания доксорубнцина' (DOX) и 14-0темиадипината доксорубнцина * (DOX-AD) в чувствительных и резистентных клетках Р388 выявило корреляцию кежду повышенной цитртоксической активностью OOX-AD в отношении устойчивых клеток P388/Dox и повышенным уровнем накопления препарата в этих клетках по сравнению с DOX.

Устойчивые клетки P388/Dox накапливали в S раз меньше DOX, чем чувствительные P388/S. Однако, уровень накопления DOX-AD в резистентных P388/DOX был' меньше такового в чувствительных клетках P388/S всего в 1.5 раза (рис. 1). Ингибитор функции Рдр - циклоспорин A (CsA) не оказывал влияния на накопление обоях препаратов чувствительными клетками, но увеличивал внутриклеточное содержание как DOX, так я DOX-AD в их резистентных вариантах. При этом, вызывая 6-кратное увеличение поступления DOX в устойчивые клетки P388/Dox, CsA -увеличивал накопление DOX-AD в этих клетках всего лишь-, в 1.6 раза (рис. 2А).

Поскольку устойчивые клетки практически не накапливали обнаружимого использованным в нашей работе методом количества DOX, для исследования влияния Сек на удержание препаратов чувствительные и резистентные культуры Р388 предварительно «нагружаяи> препаратами в присутствии CsA. В результате устойчивые клетки P388/Dox накапливали практически одинаковое с чувствительными клетками P388/S количество1 препаратов. Дальнейшая инкубация нагруженных DOX или DOX-AD клеточных культур в среде, не содгржшцей антибиотиков, обнаружила, что CsA не влиял на удержание обоих препаратов чувствительными клетками. Однако, присутствие этого блокатора Рдр оказалось существенным для удержания DOX резистентными клетками. Удаление CsA из инкубационной среды привело- к разделению популяции устойчивых клеток, - нагруженных DOX. на две' различные субпопуляции по способности удерживать антибиотик. Около 40% клеток в такой образце утрачивали г» 70% DOX, остальные 60% клеток - 11% по сравнению С'клетками, инкубированными в присутствии CsA (рис. 2Б).

ДОКСОРШЩИК- (ДОХ)

14-о-таилдашнАТ донсорубивдна (н-дох)

| I щи^Ч И"Ч> .......

СОДЕРНАНИЕ ПРЕПАРАТА (У.Е.)

СОДЕРЖАНИЕ ПРЕПАРАТА (УЛ.)

Рисунок I. НАКОПЛЕНИЕ АНТРАЦШИНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ! (Р38^5)

И РЕЗИСТЕНТНЫМИ (Р38а/Д0Х) КЛЕТКА1М У.Е. - условные единицы; аи(оАиогезсепсв . наспецнфическая флюоресценция контрольных клеток

X. ВЛИЯНИЕ CSA НА НАКОПЛЕНИЕ ДОКСОРУБИЩНА (ДОХ) И 14-О-ГЕШАДШШНАТА ДОКСОРУБИЦША (Н-ДОХ) РЕЗИСТЕНТНЫМИ КЛЕТКАМИ Р388/ЛМ:

Б. ВЛИЯНИЕ CSA НА УДЕРЖАНИЕ ДОХ И Н-ДОХ РЕЗИСТЕНТНЫМИ КЛЕТКАМИ Р388/ДОХ

Рисунок 2 А, Е: У.Е. - условныа единтщ; with или without 05А в присутствии или отсутствии CSA

В то же вреня поглощенный устойчивым* клетками РЗВв/Dox в присутствии CsA DOX-AD хорошо удерживался этими клетками независимо от наличия блокатора Рдр в инкубационной среде (рис. 2Б).

Таким ' образом, введение в агликон доксорубнцина заместителя, несущего ионизованную карбоксильную группу, оказалось положительной кодификацией с точки зрения способности соединения проникать м удерживаться в устойчивых клетках, вероятно, из-за сниженного сродства к мембранному Р-глнко-протеину. Небольшое увеличение уровня накопления DOX-AD в клетках P388/Dox (в 1.8 раза) в присутствии СзА свидетельствует о том, что DOX-AD также является субстратом Рдр, однако, с гораздо меньшим сродством, чек DOX.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ ДОКСОРУБНЦИНА И 14-О-ГЕНИАДИПИНАТА ДОКСОРУБИЦИНА В ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ И РЕЗИСТЕНТНЫХ КЛЕТКАХ Р388.

Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют, что устойчивость опухолевых клеток к антрациклннан может быть связана не только со сниженным уровнем накопления и удержания препаратов в клетке, но и с другим параметром клеточной фармакокинетики - измененным профилем их локализации в резистентной клетке, а именно, преимущественным распределением в цитоплазме и клеточных органеллах, а не в ядре, как в чувствительных клетках. Это обосновывает необходимость исследования указанного параметра клеточной фармакокинетики антрациклинов.

В нашем исследовании использование конфокальной микроскопии позволило обнаружить различия в профилях внутриклеточного распределения доксорубицина и 14-0-гемиадипината доксорубнцина, а также влияние CsA на локализацию этих препаратов. в чувствительных н устойчивых клетках мышиного лейкоза Р388. .

В клетках чувствительной линии P388/S флюоресценция обоих препаратов обнаруживалась как в ядре, так и в цитоплазме (фото 1). Однако, в то время как яркая дискретная ядерная флюоресценция DOX с четкой ядерной мембраной была значительно интенсивнее диффузной цитоплазматической флюоресценции, более однородная ядерная флюоресценция DOX-AD не отличалась по интенсивности от цитоплазматичоской (фото 3). В отличие от

Клетки Р388ХУ (Фото I, вверху) и клетки Р388/Д0Х (Фото 2, внизу) после инкубации, с 20 мкМ ДОХ

исходного ПЮХ. ООХ-АО обнаруживался в цитоплазме не только в виде диффузной, но и а виде яркой точечной флюоресценции, соответствующей, вероятно, содержащим препарат цитоплазматичес-ким органеллам. Цитоплазматическая мембрана, невидимая в клетках РЗвв/в, содержащих ООХ, была хорошо различима в этих клетках, содержащих ООХ-АО.

В резистентных клетках ядерная флюоресценция ООХ не обнаруживалась, отдельные клетки можно было различить по бледным контуран ядерных оболочек (фото 2). Напротив, флюоресценция ООХ-АО в клетках Р38В/Оох. хотя и значительно более бледная, чем соответствующая флюоресценция в чувствительных клетках, обнаруживалась в виде достаточно интенсивной однородной ядерной и цитоплазматической флюоресценции (фото 4). Однако, точечные флюоресцирующие структуры. наблюдаемые ■ клетках РЭвв/8. содержащих ООХ-АО. отсутствовали в клетках Р388/0ох.

Таким образом, 14-0-гемиадипинат доксорубицина в отличие от доксорубицина локализовался как в ядрах, так и в цитоплазме устойчивых клеток, что также коррелирует с повышенной активностью 14-0-гемиадипинат доксорубицина в отношении резистентных клеток.

СаА, не изменяя внутриклеточной локализации ООХ в чувствительных клетках ' Р388/Э, вызывал перераспределение внутриклеточной флюоресценции ООХ-АО в этих клетках, а именно, увеличение интенсивности ядерной и исчезновение точечной цитоплазматической флюоресценции. Так, что профиль распределения ООХ-АО в клетках РЗЭв/Б в присутствии СзА оказался похожим на соответствующий профиль ООХ в этих клетках.

Присутствие СаА в инкубационной среде приводило к увеличению интенсивности флюоресценции клеток Р388/0ох, . содержащих как ООХ, так и ООХ-АО. При этом СеА вызывал такое изменение профилей внутриклеточного распределения флюоресценции как ООХ, так и ООХ-АО в клетках Р388/Оох, что локализация обоих препаратов в резистентных клетках в присутствии СвА качественно не отличалась от локализации этих антрациклк><ов в соответствующих чувствительных клетках.

Таким образом, введение остатка адипиновой кислоты, несущего ионизованнуа карбокси группу, в С-14 агликона доксорубицина изменило характер распределения полученного 14-0-геми-адипината как в чувствительных, так и а резистентных Рдр-поло-

жительных клетках. В чувствительных клетках 14-0-гениадипинат доксорубяцина обнаружял повышенную менбранотропность, в отличяе от нуклеотропности неходкого антибиотика.

Ранее установлено, что DOX вызывает дозозавясякые нарушения клеточного цикла опухолевых клеток с блоком в фазе Ga. С.целью изучить влияние химической трансформации антрациклинов в ях соответствующие 14-0-гекиадипинаты на характер воздействий полученных производных на клеточный цикл, в заключительной части работы проведено сравнительное исследование эффектов 14-0-гемиадипинатов доксорубяцина и 14-гидроксикарминомжцина на прохождение клеточного цикла клетками рака молочной железы человека HCF7/S.

Существенно отличаясь по уровню цитотоксической активности доксорубицин - и 14-гидроксякаркиномицнн в эквятоксических концентрациях оказывали качественно и количественно сходные эффекты на клеточный цикл культуры клеток MCF7/S: вызывали блок в G, с последующей остановкой клеток и в Gt. 14-0-Гениадипинаты доксорубяцина и 14-гидроксикарминоницина так же. как и исходные антибиотики, вызывали задержку клеточного цикла в Ga, однако, количественно ингибирующий эффект этих производных на клеточный цикл MCF7/S был слабее эффектов исходных препаратов.

Локализация 14-0-гемиадипината доксорубяцина ворганеллах, обладающих мембранами, и в цитоплазматической мембране, свидетельствующая о повышенной сродстве этого производного к мембранам, я более слабый ингибирующий эффект 14-0-гемиадипинатов антрацнклииовых антибиотиков на клеточный цикл по сравнению с исходными , антибиотиками, позволяет предположить, что в механизм цитотоксического действия 14-0-гемиадипинатов существенный вклад можэт вносить мембраноопосрэдованныЙ механизм.

ВЫВОДЫ

1. Цитотоксичность in vitro природных антрациклинов и их полусинтетическях производных для культур опухолевых клеток определяется как структурой антибиотика, так и типом опухолевой клетки-мишени.

2. Из 15 новых полусинтетических производных антрациклино-вь1х антибиотиков только цианоморфолинокарминомицин проявляет повышенную цитотоксичность в культурах клеток рака молочной железы человека и Т-клеточного лейкоза ныши, чувствительных к

антрацвклкнан. Другие 1« производных показали сравнимую или пониженную активность в отношении чувствительных и природноустойчивых опухолевых клеток по 'сравнению с соответствующими исходными антибиотиками.

3. 7 новых производных демонстрируют повышенную цито-токсичкость против обладающих множественной лекарственной устойчивостью гвперэкспрассирующих Р-гликопротеин клеток рака 'молочной железы человека и лнмфолойкоза кыши. Еще 2 производных проявляют аналогичную активность только против резистентных мышиных клеток.

4. Опухолевые клетки с фенотипом И0Я проявили меньшую перекрестную устойчивость ко всем исследованным производным доксорубицина, даунорубнцяна и карминомицина, чом к исходным антибиотикам. Наименьшие индексы резистентности показали производные со сниженной основностью в положении С-3' даукозамина: норфолиновые производные карминомицина и 14-гидроксика^миномицина. цианоморфолинокарминомнции, З'-Н-три-фторацетильные производные карминомицина и даунорубицина. а также 14-0-геииадипинат доксорубицина.

3. Цнтотоксическая активность 14-0-гемиэфиров доксорубицина и 14-гидроксикарниномицина. морфолино-14-гидроксикармнномици-на, морфолино- и цианоморфолино- карминомицина в отношении устойчивых Р-гликопротеин-положительных опухолевых клеток обосновывает необходимость их дальнейшего изучения.

6. Повышенная цнтотоксическая активность 14-0-гемиадипина-та доксорубицина в отношении резистентных мышиных лейкозных клеток Р388/0ох прямо коррелирует с повышенным уровнем накопления и удержания препарата в этих резистентных клетках. <

7. Повышенная активность 14-0-гемиадипината доксорубицина в отношении резистентных клеток РЗВ8/Оох коррелирует с увеличенным накоплением препарата в ядрах устойчивых клеток. В чувствительных клетках, в отличие от доксорубицина, 14-0-гемиадипннат доксорубицина помимо ядра и цитоплазмы обнаруживается в цитоплазматической менбрь .е и цитоплазматических органеллах, обладающих мембраной.

8. В культуре клеток рака молочной железы НСЕ7/8 14-0-гемиаднпинаты доксорубицина и 14-гидроксикармнкомицина так же, как и соответствующие исходные антибиотики, вызывают блок клеточного цикла в фазе в2 с последующей остановкой

клеток я в Gi. Однако, ингибирующий эффект 14-О-гемнаднпинатов на клеточный цикл количественно был слабев эффектов исходных антибиотиков.

9. Локализация 14-О-гемиадипината Доксорубицина в органеллах, обладавших мембранами, и в 4 цитоплазматической мембране, свидетельствующая о повышенном сродстве этого производного к' мембранам, и более слабый эффект 14-О-гемнадипината на клеточный цикл опухолевых клеток по сравнению с доксорубицином дают основание предполагать, что о механизм цитотоксического действия 14-О-гемнадипината существенный вклад может вносить мембраноопосредованный механизм. Список публикаций по теме диссертации

1. Leontieva O.V., Povarov L.S., Preobrazhenskaya М.Н., Bernacki R.J. "Novol 14-O-henieeters of anthrocycline antibiotice circumvent multidrug résistance (HDR) connected with P-glycoprotein (Pgp)". - Proceedings of American Association Cor Cancer Research, vol. 36, March 1995 - Abst. 2335.

2. Леонтьева О.В., Поваров Л.С., Преображенская К.Н., Бернака Р. Дж. "Цитотоксичность, поглощение я удержание 14-О-гемнадипината доксорубицина в клетках мышиного лейкоза Р388, обладающих Р-глнкопротенн-опосредованным фенотипом множественной лекарственной устойчивости". - Тезисы докладов II Российского национального конгресса «Человек х лекарство» Москва, апрель, 1993 - с. 182.

3. Леонтьева О. В. "Молекулярные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолей" - Антибиотики а химиотерапия, 1995 (принята к печати).

4. Поваров Л. С., Леонтьева О.В., Бернаки Р. Дж., Олсуфьева Е. Н., Салимова Е.Н., Пера П., Преображенская M.Н. "14-0-гемиэфиры и 13-гидразоны антрациклиновых антибиотиков ряда даунорубицина. Синтез а изучение цнтостатической активности в отношении доксорубицин-чувствителькых и -устойчивых линий опухолевых цлеток". - Бноорганнческая химия, 1995 (принята к печати).