Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Роль оксида азота в регулировании пролиферации и апоптоза опухолевых клеток

На правах рукописи

КАКУРИНА Гелена Валерьевна

РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

14.00.14 - онкология 14.00.16. - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ТОМСК2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте онкологии Томского научного

центра СО РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

кандидат медицинских наук

Чойнзонов Евгений Лхамацыренович Коцдакова Ирина Викторовна

Официальные оппоненты:

доктор мед. наук, профессор доктор мед. наук, профессор

Пашинский Виталий Глебович Серебров Владимир Юрьевич

Ведущая организация:

Российский онкологический научный центр РАМН им. Блохина Н.Н., г. Москва.

Защита состоится «_

2004 г. в

час. на заседании диссертационного

совета Д-001.032.01 при ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (634009, г. Томск, пер. Кооперативный, 5)

»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета доктор медицинских наук

Евтушенко В.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из наиболее важных направлений современной онкологии и патофизиологии является выяснение молекулярных механизмов, регулирующих пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток. Нарушение этих процессов может определять прогрессирование опухолевого заболевания и являться одной из причин множественной лекарственной резистентности.

Одной из существенных проблем в терапии рака является развитие резистентности опухолевых клеток к химио- и лучевой терапии, механизм действия которых имеет в своей основе свободно-радикальные процессы. Известно, что применение антибиотиков антрациклинового ряда и фотодинамической терапии (ФДТ) сопровождается образованием супероксидного радикала, синглетного кислорода и других высокоактивных молекул [Гаузе Г.Ф., 1987; Соколов В.В., 1995; Луценко СВ., 2001; Girotti A. W., 1990]. Появление устойчивых к окислительному повреждению опухолевых клеток представляет собой сложный биологический процесс, зависящий от совокупности биохимических и физиологических свойств клеток неоплазмы. Поэтому поиск химиопрепаратов, способных усиливать окислительное повреждение и индуцировать апоптоз опухолевых клеток, представляет собой важное направление в лечении онкозаболеваний.

Для усиления интенсивности свободно-радикального воздействия на опухолевые клетки было предложено использование его в сочетании с соединениями, генерирующими оксид азота (N0). Оксид азота (N0) обладает широким спектром биологического действия, как на системном, так и на клеточном уровнях. Исследования последних лет показали, что N0 участвует в регуляции пролиферации различных клеток, в том числе и опухолевых [Реутов В.П., 1998; Ambs S., 1997; Gansauge S., 1997]. Соединения, генерирующие оксид азота или ферменты, участвующие в его синтезе (NO-синтазы), ингибируют пролиферацию клеток и индуцируют апоптоз [Gansauge S.,1997; Gkxkzin S., 1999]. Механизм антипролиферативного действия NO изучен не достаточно. Считается, что N0 может усиливать цитотоксичность свободных радикалов. Одним из механизмов такого влияния является продукт взаимодействия N0 и супероксидного радикала -пероксинитрит, который может повреждать ДНК и вызывать ковалентные модификации белков в клетке, инициируя тем самым апоптоз [Зайчик А.Ш., 1999; Kim Y.M., 2000].

В то же время существуют противоположные литературные данные об эффекте увеличения клеточной пролиферации оксидом азота [Gansauge S., 1997]. Увеличение продукции оксида азота приводит к ингибированию апоптоза [Mannick J. В., 1994] и усилению жизнеспособности клеток лимфомы Nb2 [Dodd F., 2000]. Эти эффекты, вероятно, связаны с антиоксидантными свойствами N0, которые обусловлены его способностью связывать мембранные и внутриклеточные комплексы железа, ингибировать разложение перекисей, перехватывать свободные радикалы и гасить, таким образом, цепные реакции свободно-радикального окисления [Меньшикова Е.Б.,1994; Каплет J., 1991; JuckettM.B., 1996].

Таким образом, существование противоречивых литературных данных о механизме действия оксида азота на функциональное состояние опухолевых клеток и отсутствие конкретных результатов его применения в качестве модулятора опухолетоксического действия свободно-радикальных агентов затрудняет оценку соединений, генерирующих N0, в плане перспективного использования в терапевтических целях.

В представленной работе впервые было исследовано влияние широкого спектра концентраций доноров оксида азота, свободных радикалов и их комбинации на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток. В данной работе получены результаты, показывающие принципиальную возможность развития направления по использованию доноров оксида азота для усиления терапевтической эффективности доксорубицина и ФДТ. Работа включает изучение влияния доноров оксида азота на процессы, регулирующие метаболическую активность опухолевьй »®

БИБЛИОТЕКА

з

«

регуляции пролиферации и апоптоза, таких как метаболизм арахидонат-содержащих липидов, митохондриальнос дыхание и базовый уровень свободно-радикальных реакций. Проведена оценка влияния доноров N0 на противоопухолевую эффективность доксорубицина и фотодинамической терапии на экспериментальных моделях in vivo.

Целью настоящей работы являлось изучение роли оксида азота в регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток.

Задачи исследования:

1. Исследовать влияние доноров оксида азота в различных концентрациях на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток.

2. Изучить влияние доноров оксида азота на интенсивность свободно-радикальных процессов, метаболизм фосфолипидов мембран, функциональное состояние митохондрий опухолевых клеток.

3. Изучить сочетанное действие доноров оксида азота и пероксидных радикалов на пролиферативную активность опухолевых клеток

4. Изучить роль доноров оксида азота в регуляции апоптоза опухолевых клеток, индуцированного свободными радикалами.

5. Оценить влияние доноров оксида азота на опухолетоксическое действие доксорубицина in vitro.

6. Оценить возможность применения доноров оксида азота для усиления терапевтической эффективности антибиотиков антрациклинового ряда и фотодинамической терапии.

Научная новизна.

Впервые в эксперименте изучено действие широкого спектра концентраций доноров оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток. Впервые дана оценка интенсивности свободно-радикальных процессов под влиянием оксида азота в опухолевых клетках. Впервые изучена возможность использования доноров оксида азота для усиления опухолетоксического действия свободных радикалов и увеличения противоопухолевой эффективности антибиотиков антрациклинового ряда и фотодинамической терапии.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическую и практическую значимость проведешюй работы определяют новые данные о механизмах регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток соединениями, генерирующими оксид азота, а также новые сведения о механизмах формирования резистентности опухолевых клеток к свободно-радикальному повреждению. Полученные данные позволяют оценить принципиальную возможность использования соединений, генерирующих оксид азота, в качестве модуляторов свободно-радикального воздействия на опухолевые клетки. Показана целесообразность и обоснованность применения доноров оксида азота для усиления терапевтической эффективности доксорубицина и фотодинамической терапии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Доноры оксида азота регулируют пролиферативную активность и апоптоз опухолевых клеток, причем существует концентрационная зависимость влияпия на эти процессы.

2. Влияние доноров оксида азота на опухолетоксическое действие пероксидных радикалов и доксорубицина неоднозначно и зависит от химической структуры и концентрации используемых соединений.

3. При сочетанном применении фотодинамической терапии с использованием лазера

на парах золота и доноров N0 усиливается апоптоз опухолевых клеток. Публикации

Результаты исследований опубликованы в 21 печатной работе. Апробация работы

Основные результаты работы представлены: на конференциях молодых ученых НИИ Онкологии ТНЦ РАМН (Томск, 1999-2001гг); на молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины», (Новосибирск, 2000г.); на международном конгрессе «Научная молодежь на пороге XXI века» (Томск, 2000т); 7th ESACP Congress «Analitical and cellular pathology» (Caen, France, 2001г); 7th International Conferrence "Eicosanoids and other bioactive lipids in cancer, inflammation and related diseases" (Nashville, USA, 200lr); на VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002г); на VI международном конгрессе «Импульсные лазеры на переходах атомов и молекул» (Томск, 2003); па молодежной научно-технической конференции «Лазеры на парах металлов и их применение» (Томск, 2003г.).

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на. 137 страницах и иллюстрирована 23 рисунками и 10 таблицами. Библиография включает 164 литературных источника, из которых 32 отечественных и 132 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперимент был проведен на 230 мышах линий C-57B1/6J и DBA/2JY. Животных получали из питомника НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертифицирован) и содержали в стандартных виварных условиях при 20-22 градусах с контролируемым световым периодом (12 ч/сутки). В опытах использовали мышей-самцов весом 18-23 грамма.

Экспериментальные опухоли

В работе использовали штаммы опухолей аденокарциномы Эрлих а и мастоцитомы Р815, поддерживаемые in vivo на мышах 2-4-месячного возраста. Все клеточные линии получены из банка опухолевых штаммов ОНЦ РАМН (г. Москва). Асцитные опухоли поддерживались путем еженедельной Вйутрибрюшишюй перевивки по 5х106 клеток в 0,5 мл среды 199 на одну мышь.

Моделирование противоопухолевого действия свободных радикалов, оксида азота и доксорубицина,

Свободно-радикальное воздействие на опухолевые клетки проводили с использованием гидропероксида третичного бутила (ГПТБ) (Merck) и 2,2'азо-бис(2-амидинопропана) (АБАП). ГПТБ при взаимодействии с внутриклеточными ионами переменной валентности, главным образом железа и меди, распадается с образованием пероксирадикалов. АБАП при термическом разложении (t = 37°C) также образует пероксирадикалы [Lissi E., 1992]. В эксперименте использовался антибиотик антрациклинового ряда - доксорубицин (Pharmacia&Upjohn S .P.A-Italy). Донорами NO были нитропруссид натрия (SNP), нитрит натрия (NaNOj) (Sigma), который в ходе циклических реакций превращается в оксид азота [Реутов В.П., 1998] и нитрозогуанидин (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG)) (Fluka) [Babich MA, 1989]. Для эндогенной генерации NO в опухолевых клетках применяли L-аргинин (отечественного производства марки х.ч.). Активность NO-синтазы ингибировали с помощью метилового эфира нитроаргинина (L-NAME) (Sigma).

Определение синтеза ДНК в опухолевых клетках.

Определение уровня синтеза ДНК в опухолевых клетках при действии различных концентраций окислителей, доноров N0 и их комбинации измеряли по включению в клетки меченого радионуклидами предшественника синтеза нуклеиновых кислот [3Н]-тимидина ("Изотоп", Россия).

Подсчет количества включенной радиоактивной метки проводили на жидкостном сцинтилляциошюм счетчике Маж-Ш (Тгасог Analytic) в сцинтилляторе Lumax (Lumac systems inc., США). Изменение скорости синтеза ДНК вычисляли по формуле:

©

(1)

где О - количество импульсов в опытных лунках; К - количество импульсов в лунках, содержащих контрольные клетки.

Методы регистрация апоптоза.

Индукцию апоптоза в опухолевых клетках регистрировали методом С.Н. Орлова [Orlov S.N., 1996] по анализу фрагментации ДНК. Анализ фрагментации хроматина проводили по формуле:

1,5х(Ап-Аш) xî00%> A2 + A)t-1,5A,0

где - радиоактивность в супернатанте (фрагменты ДНК клеток подвергшихся апоптозу), А2- радиоактивность в осадке (нефрагментированные ДНК), А10 - контроль.

Морфологическое исследование индукции апоптоза проводили по методу Kim Min в пашей модификации [Kim Min., 2002]. Для выявления апоптотических клеток использовали ДНК-тропный краситель бисбензимид (Hoechst 33342) (AppliChem GmbH), который соединяется в местах A-G-nap поврежденной ДНК. Анализ препаратов проводили в иммерсионной системе под микроскопом Neovar 2 (Австрия) (синий фильтр). Уровень апоптоза выражали как процент окрашенных (апоптотически умерших) клеток от общего количества подсчитанных клеток.

Исследование интенсивности свободно-радикальных реакций.

Исследование интенсивности свободно-радикальных реакций в опухолевых клетках проводилось по методу Hong Wang and James A. Joseph [Wang Hong., 1999]. Принцип метода DCF-флюоресценции основан на окислении не флюоресцирующего соединения DCFH-DA (2,7 - дихлорфлюоресцин диацетат) (Sigma) во флюоресцирующее производное 2,7 -DCF (дихлорфлюоресцеин). Увеличение флюоресценции отражает усиление окислительного стресса в клетках. Спекгрофлюориметрические измерения проводили через каждые 30 минут при = 488 нм, Х^ = 525 им на флюориметре Hitachi (Япония).

Определение включения Г1-С<41арахидоновой кислоты в клетки и выхода П-С1арахидоновой кислоты из клеток асцитной карциномы Эрлиха.

Метаболизм фосфолипидов мембран опухолевых клеток под действием доноров оксида азота изучали по включению [1-С14]арахидоновой кислоты в изолированные клетки (0,05MKCI на 106 клеток) и выходу [1-С ]арахидоновой кислоты в водную фазу. Радиоактивность измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике Магк-Ш (Тгасог Analytic, USA) в сцинтилляторе Lumax (Lumac systems inc., США).

Определение функционального состояния митохондрий с использованием МТТ-

Функциональное состояние митохонрий под действием доноров оксида азота оценивали спектрофотометрически по методу Mosmann Т. [Mosmann Т., 1983]. МТТ-тест ((4,5-dimethyl-2-thiazyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) (Sigma Chemical) является чувствительным маркером жизнеспособности клеток, характеризующим функциональное состояние митохондрий [Meletiadis J., 2000]. Измерение оптической плотности проводили

на планшеточном ридере при Х=570 нм против Х=690 нм. Результаты высчитывали по формуле:

где ODj - оптическая плотность в лунках обработанных NO-донорами, OD2 - оптическая плотность в контрольных лунках.

Оценка противоопухолевого эффекта доксорубишна и фотодинамической терапии.

Доксорубицин (10мг/кг) и донор оксида азота N-methyl-N'-nitro- N-nitrosoguanidine (MNNG) (2,5мг/кг) вводили внутрибрюшинно на 4 сутки после перевивки. опухоли. Противоопухолевый эффект препаратов оценивали на 3 сутки по уменьшению объема асцита и по общему числу клеток асцита. Суммарный объем асцита выражали в см3. Число клеток асцита подсчитывали с использованием красителя трепанового синего. Во всех асцитных опухолях оценивали уровень апоптоза и некроза. Результаты выражали в процентах по отношению к контролю.

При ФДТ донор оксида азота MNNG (2,5мг/кг) и сенсибилизатор фотогем (ООО «Фотогем», серия № 151201) (10мг/кг) вводили внутрибрюпшшю на 4 сутки после перевивки опухоли. Через 24 часа после введения препаратов животных подвергали облучению лазером на парах золота (P=300mV, >.=633,8 , время экспозиции 1 мин.) путем введения фотода внутрибрюшинно. На 3 сутки после облучения опухолевые клетки забирали из брюшной полости для дальнейших исследований. Противоопухолевый эффект оценивали по уменьшению объема асцита и по общему числу клеток асцита. Также оценивали уровень апоптоза и некроза в опытной группе по отношению к контрольной.

Статистическая обработка результатов.

Статистическую обработку результатов исследования проводили на нерсональном компьютере с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 5.O. Проверку на достоверные различия между группами проводили с помощью пепараметрического критерия Вилькоксона-Манна Уйитни. Для каждого анализируемого показателя вычисляли среднее (X), ошибку среднего (m), среднеквадратичное отклонение. Статистически значимыми считались различия при р<0,05. Результаты экспериментов приведены в таблицах в виде X ± т.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние оксида азота на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток

В соответствии с поставленными задачами в работе исследовалось влияние широкого спектра концентраций NO-генерирующих соединений на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток. В исследованиях использовались соединения, зкзогеино генерирующие NO: SNP, NaNO2, MNNG в широком диапазоне концентраций от 10"3 М до 10'* М, эндогенный источник N0: L-аргинин (5хЮ"3М), который является субстратом в NO-синтазной реакции, и ингибитор NO-синтазной реакции NAME (5xlO'JM).

В результате проведенных исследований было установлено, что действие доноров N0 на пролиферацию опухолевых клеток носило дозозависимый характер. Высокие концентрации NO-доноров SNP и NaNO2 (10'JM) снижали скорость включения [3Н]-тимидина в ДНК опухолевых клеток на 22% и 34% соответственно. С уменьшением-концентраций NO-доноров, начиная с 10ЛМ в среде инкубации, наблюдалась стимуляция пролиферативной активности опухолевых клеток, которая при концентрации 10'8М увеличивалась на 39% для SNP и на 26% для NaNO2 относительно контрольного уровня. В противоположность этому, использование MNNG во всех изучаемых концентрациях

(3)

приводило к угнетению пролиферативной активности клеток карциномы Эрлиха в 2-3 раза по отношению к контрольному уровню (Рис. 1).

Включение [Н3]-тимидина, % к контролю 175

150 ■

125 ■

100 ■

75

50

25 •

0 4-1-1-1-.-1-

ю-1 10"7 10"* 10"® Ю"4 10"' Концентрация, М

Рис. 1. Влияние NO-генерируюших соединений (2 - нитропруссид натрия, 3 - нитрит натрия, 4-нитрозо1уанвдина) на включение [5Н]- тимцдина в ДНК клеток карциномы Эрлиха по сравнению с контролем (1)

L-аргинин увеличивал синтез ДНК в клетках мастоцитомы Р-815 и карциномы Эрлиха на 10-15 % относительно контроля. Ингибирование NO-синтазной реакции NAME не оказывало достоверного влияния на скорость синтеза ДНК в клетках мастоцитомы Р-815 и снижало показатель пролиферативной активности клеток карциномы Эрлиха в 2 раза относительно контроля.

Таким образом, оксид азота, синтезируемый из различных источников, может изменять пролиферативную активность опухолевых клеток. Сопоставление данных с результатами влияния ингибитора NO-синтазы на пролиферацию клеток мастоцитомы Р-815 и карциномы Эрлиха дает основание предполагать различную степень участия оксида, азота в регуляции пролиферации разных типов опухолевых клеток.

Исследование влияния оксида азота на индукцию апоптоза в опухолевых клетках карциномы Эрлиха методом анализа фрагментации ДНК показало, что активация этого процесса наблюдалась при применении NaN02 и SNP в концентрации 10'3 М. Снижение концентрации этих соединений до 10ЛМ приводило к ингибированию запуска апоптотической программы. L- аргинин увеличивал число апоптотически погибших клеток в 1,5 раза (Рис. 2).

Таким образом, при анализе полученных экспериментальных данных была выявлена концентрационная зависимость действия доноров N0 на пролиферацию и индукцию апоптоза опухолевых клеток. Высокие концентрации доноров N0 угнетали пролиферацию и индуцировали апоптоз опухолевых клеток. Снижение концентрации

действующих агентов в среде инкубации приводило к увеличению пролиферации опухолевых клеток и снижению процесса запуска программируемой клеточной смерти.

% расщепления хроматина к контролю

EJSNP BNaN02

21 • 18151296-

QL-аргинин □ контроль

1т

I, п,

0,01 0,1

1

5 контроль Концентрация, тМ

Рис. 2. Расщепление хроматина в клетках карциномы Эрлиха при воздействии N0-генерирующих соединений

Исследование влияния оксида азота на механизмы регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток.

Клеточные механизмы регуляции пролиферации и апоптоза имеют несколько общих характеристик, включающих функционирование внутриклеточных сигнальных путей. Одним из важных компонентов, передающих ростмодулирующий сигнал, являются арахидоновая кислота и ее метаболиты. Состояние митохондриалыюго дыхания играет важную роль в энергетическом обеспечении митотического цикла и выступает в качестве одного из определяющих звеньев в цепи реализации программы размножения клеток. С другой стороны митохондрии являются одним из главных действующих компонентов апоптоза [Kim Y.M.,2000; Mannick J. В., 2001]. Поскольку N0 является свободно-радикальной молекулой, то его биологические эффекты связаны с влиянием на окислительно-восстановительный гомеостаз клеток. Исследование механизмов регуляции оксидом азота пролиферации и апоптоза включало исследование метаболизма арахидонат-содержащих фосфолипидов, исследование функции митохондрий и влияния NO на интенсивность внутриклеточных свободно-радикальных реакций.

Исследование влияния N0 на метаболизм арахидонат-содержащих фосфолипидов по выходу [1-С14] арахидоновой кислоты из мембран клеток мастоцитомы Р-815 показало изменение содержания свободной жирной кислоты в среде инкубации. NaNOj увеличивал выход арахидоновой кислоты из мембран фосфолипидов в среднем на 36 % относительно контрольного уровня. В тоже время L-аргинин в концентрациях 1 шМ и 5 тМ не оказывал активирующего действия на этот процесс (Рис. 3).

Исследование включения арахидоновой кислоты в фосфолипиды мембран показало, что добавление в среду инкубации клеток мастоцитомы Р-815 NaNO2 (10" М) приводило к ингибированию этого процесса (Рис. 3), что вероятно связанно с мембранотоксическим действием оксида азота на опухолевые клетки [Реутов В.П., 1998; Рябов ГА., 2001; Kim Y.M., 2000].

Увеличение выхода арахидоновой кислоты может приводить к накоплению ее внутриклеточного содержания, что может являться одной из причин усиления пролиферации опухолевых клеток. Если выход арахидоновой кислоты из клеток

значительно преобладает над ее включением, то повышается проницаемость мембран вследствие образования лизофосфолипидов [Кондакова И.В., 1991], что может быть одним из факторов индукции апоптоза. Арахидоновая кислота является важным медиатором апоптоза в различных клетках, в том числе и опухолевых [Alan R., 2001; GarridoR.,2001].

Таким образом, оксид азота, в зависимости от концентрации может регулировать степень выхода арахидоновой кислоты из мембранных фосфолипидов, что определяет прохождение клеткой двух альтернативных путей — пролиферации и апоптоза Участие арахидоновой кислоты в том и другом процессе доказывает существование универсальных внутриклеточных механизмов передачи сигнала.

Исследование состояния митохондриальной функции опухолевых клеток показало, что добавление в среду инкубации доноров оксида азота — NaN02 и SNP в концентрации (10'3М) приводило к снижению показателя МТГ-теста относительно контрольного уровня на 11-22% соответственво (Рис. 4). Таким образом, все используемые нами доноры N0 угнетали митохондриальное дыхание опухолевых клеток, что, вероятно, связано со способностью N0 обратимо ингибировать этот процесс. Такой эффект может достигаться вследствие снижения поглощения О, разобщения окислительного фосфолирирования в митохондриях и конкуренции между О2 и N0 в реакции, катализируемой цитохромоксидазой [Реутов В.П., 1998].

Это может вести к развитию энергодефицитных состояний в клетке, результатом чего является снижение пролиферативных процессов [Yabuki M.,1997; Mills J.C., 1998]. Нужно отметить, что при действии низких концентраций NaN02 (10"6 М) наблюдалась тенденция к усилению митохондриального дыхания: на 9 %. Кроме того, в этой

коицетрации также наблюдалось увеличение пролиферативной активности опухолевых клеток.

%

60'

50 -(-1-(-(

Ю"6 105 10 10"3

Концентрация, М

Рис. 4. Влияние доноров N0 на функциональное состояние митохондрий в клетках мастоцитомы Р-815.1 - контроль; 2 - нитрит натрия; 3 - нитропруссид натрия

Исследование интенсивности свободно-радикальных процессов в клетках карциномы Эрлиха под действием NO-генерируюишх соединений показало усиление образования АКМ. Добавление L-аргинина приводило к увеличению интенсивности свободно-радикальных процессов на 30% относительно контроля. SNP не оказывал влияния на уровень базового окислительно-восстановительного гомеостаза в опухолевых клетках, однако незначительно усиливал окислительные процессы, индуцированные гидроперекисью третичного бутила (ГПТБ). Ранее показано, что оксид азота способен вступать в реакцию с органическими пероксильными радикалами (RO2), образующимися в результате индукции свободно-радикальными агентами цепных реакций, с последующим формированием органических пероксинитритов (ROONO-), которые являются более мощными оксидантами [Padmaja S.,1993].

Таким образом, оксид азота оказывал существенное влияние на механизмы, регулирующие пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток, что даст основание использовать его для усиления эффективности противоопухолевых соединений.

Сравнительная оценка влияния оксида азота, пероксидиых радикалов и их комбинации на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток.

Известно, что многие классические методы лечения онкологических заболеваний (химио-, лучевая и фотодинамическая терапия) имеют в своей основе свободно-радикальный механизм. Поэтому следующим этапом наших исследований было изучение сочетанного действия оксида азота и пероксидных радикалов на пролиферацию в апоптоз опухолевых клеток на модельной системе in vitro.

Предварительные исследования показали концентрационную зависимость влияния пероксидов на пролиферативную активность опухолевых клеток, что выражалось в ипгибировании синтеза ДНК высокими концентрациями и стимуляции этого процесса выше контрольных значений низкими дозами используемых соединений.

Исследование сочетанного действия доноров N0 и субтоксичных концентраций пероксирадикалов показало увеличение включения [31!]-тимидина в ДНК по сравнению с контрольной популяцией опухолевых клеток, инкубированных только с источниками

пероксидных радикалов, либо отсутствие влияния на этот процесс комбинацией выше указанных соединений (Табл. 1).

Таблица 1

Сочетанное действие доноров оксида азота и субтоксических доз пероксидных радикалов на включение [3Н]-тимидина в клетки карциномы Эрлиха

Контроль SNPOO-'M) NaN02(10"M) Ьарг.,(5хЮ°М)

Контроль 100 155Д±27,1 183Д±30,0 164,9±33

АБАП(10'гМ) 47,31:103 52,6± 12,1* 43,5±7,1 88,5± 2.3*

АБАЩЮ'М) 57,6± 4,2 70,8± 12,6* 42± 9,8* 140±30,6*

ГТГЩЮ"* М) 106,6± 5,1 83Д± 19,1 36,8±7,3* 122,3± 39,4*

ГПТБ (10 6М) 42,6± 0,9 190±283* 35,4± 11,2 98,5± 32,6*

Примечание: Достоверное изменение по сравнению с действием АБАП и Г1ГГБ, соответственно: * р < 0,05. Результаты выражены в % по отношению к контролю.

Полученные нами результаты демонстрируют выраженное цитопротекторное действие оксида азота в случае его комбинации с пероксирадикалами в субтоксических концентрациях. Такой эффект можно объяснить антиоксидантными свойствами N0, обусловленными его способностью гасить цепные реакции свободно-радикального окисления [Меньшикова Е.Б.,1994; Kanner J.,1991; Juckett M.B.,1996]. Применение низкотоксичных концентраций доноров N0 и низких концентраций пероксирадикалов может приводить к усиленной пролиферации опухолевых клеток. Из всех NO-доноров L-аргинин обладал наибольшей активностью в плане подавления противоопухолевого действия пероксидкых радикалов. Эффект потенцирования цитотоксического действия ГПТБ (10"8М) проявлял только NaNО2 в концентрации 10'9М. Комбинация доноров N0 с цитотоксическими дозами ГПТБ и АБАП, угнетающих синтез ДНК более чем на 75%, приводила, чаше всего, к снижению антипролиферативного действия свободных радикалов (Табл. 2). В то же время наблюдалось потенцирование свободно-радикального воздействия ГПТБ на опухолевые клетки при использовании SNP (103 М), NaN02 (10's М) и L-аргинина.

Таблица 2

Влияние доноров оксида азота на токсический эффект пероксидных радикалов в клетках карциномы Эрлиха

Контроль L-арппшн 5х10"3М SNP (М) NaNOj (М)

10 ю-5 10J 10

Контроль 100 185,6±23,8 52,4± 8,5 132,1± 25,9 79,6± 193 1483± 24,8

ЛВАП (2х10'2М) 25,1± 2,3 693± 14.6* 36,8± 8,9 118ДУ5.3* 57,4± 10,9* 73,5± 15,7*

ПГГБ(Ю5М) 7,3± 1,7 3,4t 1,5* 1,8±0,6* 8,7± 1,1 20,б±53* 4,6± 2,6*

Примечание: Достоверное изменение по сравнению с действием АБАП и ГПТБ, соответсвенно: * р <0,05. Результаты выражены в % по отношению к контролю.

Наибольший эффект достигался при использовании токсичных доз ГПТБ (10"5М) в сочетании с (10 М), что приводило к синергичному воздействию повреждающих агентов и к стойкому снижению пролиферативной активности опухолевых клеток.

Таким образом, в наших экспериментах показано, что оксид азота не только может усиливать цитотоксичность свободно-радикальных агентов, но и защищать опухолевые клетки от их повреждающего действия. Нужно отметить немаловажность выбора концентраций используемых соединений для достижения желаемого результата. Результаты, полученные в этой работе, согласуются с данными [ОогЪипоу К.У., 1997; Уа1одасЬ ТС., 1999], показывающими, что взаимодействие оксида азота с пероксидными радикалами не всегда приводит к образованию цитотоксических продуктов.

Изучение сочетанного действия N0 и свободных радикалов на индукцию апоптоза в клетках карциномы Эрлиха показало активацию этого процесса при комбинированном применении №N02 (10* М) и АБАП (10ЛМ) в 1,4 раза и Ь-аргишша (5х10"3М) и АБАП (10ЛМ) в 1,6 раза по отношению к уровню апоптоза, индуцированного только пероксирадикалами. При использовании ГПТБ и доноров оксида азота наблюдалось снижение уровня апоптотической гибели опухолевых клеток, индуцированной свободными радикалами, или отсутствие влияния на этот процесс (Табл. 3).

Таблица 3

Сочетаиное действие оксида азота и свободных радикалов на индукцию апоптоза клеток карциномы Эрлиха _______

ЫаЫОг.Ш'М вИРЛО5 М Ь-арг.,5хЮ"'М Контроль

АБАП(Ю"М) 5,1± 1,2* 2,96± 1^* 5,6± 0,9* 3,66± 0,7

ГОТБ(10"'М) 5,36± 1,7 3,96± 1,06* 3,0± 1,02* 5,1 ±0,97

Контроль 1,4±0,7 2,78±0,96 6,6± 1,1 3,4± 1,2

Примечание: Достоверное изменение по сравнению с действием АБАП и ГПТБ, соответственно: • р < 0,05

Полученные результаты дают основание заключить, что сочетанное применение доноров N0 и свободно-радикальных агентов может приводить к неоднозначному влиянию на индукцию апоптоза опухолевых клеток, что зависит от химической структуры и концентрации используемых соединений.

Таблица 4

Сочетала ое действие доксорубицина и доноров оксида азота на включение [}1Г] тимндина (% по отношению к контролю) в клетки карциномы Эрлиха (М ± т)_

Контроль Оох(Ю"5М) 0ох(10"'м) Оох(Ю-'М)

Контроль 100 47,82± 6,7 73±7,5 128±1и

№N02 10"3М 64,3± 4,7 33,3±43 60,3±11,3 97,6± 7,9*

Ю^М 78,5± 7,5 30,3± 6,7 68± 7,3 145± 9,4*

10°М 137,3± 11,7 184,5± 8,9* 135,1±8,9* 144,6± 11,7*

БЫР 10° М 44,7± 3,5 53,6± 9,91 57,3±! 1,7 67,4± 5,7*

ю-'м 89,6±5,7 43,5± 7,95 64,5± 8,97 145±7,9*

Ю'М 153,6± 10,5 134± 123* 181± 11,4* 171,3± 12,3*

Ь-аргинин- 5x10 5М 131,6± 9,3 84± 7,9* 146± 9,7* 160,7± 9,8*

Примечание: *- Р£ 0,05 - показатель достоверности различий в сравнении с доксорубицином в соответствующих концентрациях

Одним из частных случаев свободно-радикалыюго воздействия на опухолевые клетки является химиотерапия лекарственными препаратами, в частности, антрациклиновыми антибиотиками. Предварительные исследования воздействия доксорубицина на клетки карциномы Эрлиха показали концентрационную зависимость влияния препарата на процесс синтеза ДНК. Доксорубицин в концентрации 10* М и выше проявлял выраженное ингибирующее действие на включение [3Н]-тимидина в ДНК.

Комбинация доноров N0 с доксорубицином достоверно увеличивала синтез ДНК в клетках карциномы Эрлиха. Исключение составило усиление цитотоксичносга доксорубицина при добавлении NN02 и SNP в концентрации 10"3М (Табл. 4). Ь-аргинии снижал противоопухолевую активность антибиотика во всех изучаемых нами концентрациях.

Исследование влияния нитрозогуанидина (М№ТО) в спектре концентраций (10' -в сочетании с доксорубицином также показало неоднозначный эффект на пролиферацию опухолевых клеток (Рис. 5).

Комбинация MNNG (Ю^М) с доксорубицином усиливала противоопухолевую активность антибиотика в 2 раза, в то время как концентрации 103М и не приводили к такому результату.

Полученные результаты показывают наличие сложной закономерности при сочетанном воздействии различных комбинаций доз доксорубицина и доноров N0 на пролиферативную активность опухолевых клеток in vitro. Доноры оксида азота имеют неоднозначное действие на антипролиферативный эффект доксорубицина, что зависит от химического строения и концентрации используемых соединений. На основании полученных результатов можно предположить, что оксид азота может являться одним из факторов, способствующим появлению клонов опухолевых клеток, устойчивых к доксорубицину и обладающих повышенной пролиферативной активностью.

Предварительные исследования влияния доксорубицина па апоптоз опухолевых клеток показали, что степень расщепления хроматина не превышала 10% от его общего

количества Это доказывает достаточно высокую устойчивость клеток карциномы Эрлиха к индукции апоптоза доксорубицином.

Добавление в инкубационную среду доноров оксида азота значительно снижало апоптотическую гибель клеток карциномы Эрлиха, индуцированную доксорубицином (Табл. 5).

Таблица 5

Расщепление хроматина в клетках карциномы Эрлиха при сочетанном действии доксорубицина и МО-генерируюших соединений (М±т)

NO-доноры К Доксорубицин

10"5М 10"'М 10"'М

К 4,2 10,7± 1,6* 6,3±0,7 5Д±1Д

NaN02,10sM 2,6± 03 4,8±0,7** 3,5± 0,4** 5,4± 2,1

SNP.IO'M 2,4± 0,5 2,9*0,2** 1,9±0,3** 4,5± 1,9

L-аргинин, 5xl0"JM 4,6±1Д 2,7 ±0,3** 1,8±0,2** 3,3*1,2

Примечание: *- Р< 0,05 - показатель достоверности различий по сравнению с контролем. **• Р< 0,05 - показатель достоверности различий по сравнению с колонкой "Доксорубицин" в соответствующих концентрациях.

Полученные нами данные ясно показывают, что реализация опухолетоксического эффекта доксорубицина осуществляется как через ингибирование пролиферативных процессов, так и через индукцию апоптоза. Доноры N0 заметно снижали антипролиферативный эффект доксорубицина и индукцию апоптоза в опухолевых клетках in vitro. Важно отметить, что действие NO-доноров не зависело от способа образования оксида азота в клетках. Вещества, химически генерирующие оксид азота - SNP и NaN02, обладали сходным эффектом с L-аргинином - субстратом NO-синтазной реакции.

Таким образом, полученные в настояшей работе данные свидетельствуют о том, что N0 может являться фактором, защищающим ДНК опухолевых клеток от повреждающего действия доксорубицина, и может вносить свой вклад в развитие резистентности опухолей к антрациклиновым антибиотикам. 0днако стоит отметить, что в некоторых ситуациях наблюдалось потенцирование повреждающего действия доксорубицина В итоге конечный результат комбинированного действия оксида азота и свободных радикалов зависит от многих факторов: от концентрации действующих агентов, их химической структуры, от типа клеток и др.

Модулирующее действие оксида азота на противоопухолевую активность доксорубицина in vivo.

Для более полной оценки роли доноров оксида азота в модуляции противоопухолевого действия доксорубицина было проведено исследование in vivo. Основанием служили результаты экспериментов проведенных в условиях in vitro. Для экспериментов in vivo был выбран нитрозогуанидин - соединение, обладающее наиболее выраженными опухолетоксическими свойствами. Противоопухолевое действие доксорубицина - выражалось в уменьшении объема асцита в 10 раз (Табл. 6), что сопровождалось значительным увеличением числа некротических клеток, тогда как уровень апоптоза опухолевых клеток не изменялся. MNNG обладал незначительным противоопухолевым эффектом, что сопровождалось уменьшением числа клеток асцита и стимуляцией некротических процессов в карциноме Эрлиха.

Совместное введение мышам с карциномой Эрлиха доксорубицина и MNNG приводило к повышению противоопухолевого эффекта, которое выражалось в

уменьшении размера опухоли в 3,6 раза, снижении общего числа клеток асцита в 2 раза по сравнению с животными, получавшими только доксорубицин. Такое усиление терапевтической эффективности доксорубицина, вероятно, связано с увеличением индукции апоптоза опухолевых клеток в 5,6 раза и некроза в 1,6 раза.

Таблица 6

Сочетанное действие доксорубицина и доноров оксида азота на опухолевые клетки карциномы Эрлиха in vivo

Объем опухоли, Число клеток Некроз, Апоптоз,

мл асцита, млн. % %

Контроль 0,44±0,04 68,5±10 2,99± 0,3 7±0,5

Dox, Юмг/кг 0,048±0,005* 13,4±2,5 * 9,8±2,6* 3,5 9± ОД*

MNNG 2,5mg/kg 0,342±0,06* 12,7±2,1* 18,2±3,2* 6,9±0,54*

MNNG+Dox 0,013±0,002** 6,8±1,3 ** 15,8±3,1** 19,6± 3,7**

Примечание: *• Р< 0,05 - показатель достоверности различий по сравнению с контролем.

**- Р< 0,05 - показатель достоверности различий по сравнению с колонкой "Доксорубицин" в

соответствующих концентрациях.

Таким образом, при комбинации доноров N0 и доксорубицина в используемых нами концентрациях наблюдалось потенцирующее действие противоопухолевой эффективности антибиотика. Ранее показано, что противоопухолевая эффективность циклофосфана повышалась при его комбинации с донором N0 по отношению к клеткам лейкемии Р-388 [Коновалова Н.П., 2003]. Сопоставляя эти факты можно сделать заключение о целесообразности применения доноров N0 для повышения эффективности используемых в клинике химиотсрапевтических агентов. Существенным вкладом в повышение противоопухолевой эффективности доксорубицина оксидом азота является усиление иммунного ответа по отношению к злокачественным новообразованиям [Park K.G.M., 1991; Martin J.H.,1993; Nussler K. Andreas., 1993].

Другим направлением, позволяющим расширить круг применения доноров оксида азота, может быть их использование для повышения противоопухолевой активности фотодинамической терапии. Принцип ФДТ основан на способности фотосенсибилизатора накапливаться в опухолевых тканях и при лазерном облучении генерировать образование свободных радикалов [Соколов В.В., 1995], которые обладают цитотоксическим эффектом и индуцируют апоптоз опухолевых клеток. В результате проведенных экспериментов с использованием мышиной асцитной карциномы Эрлиха был показан противоопухолевый эффект ФДТ, который выражался в снижении объема опухоли на 30% (Таб. 7).

Таблица 7

Влияние оксида азота на противоопухолевую эффективность фотодинамической терапии in vivo

Объем опухоли, Число клеток, асцита, Некроз апоптоз

мл млн. % %

контроль 032± 0,05 52,68± 7,8 4,4± 1,02 5,3± 1,8

MNNG 025± 0,037* 29,95±4,2* 16,8±3,7* 7,4±2,3*

MNNG+лазер 0,022± 0,007** 13,8±2,1** 25± 4,3* 6,8± 1,7

ФДТ 0Д2± 0,06* 25,7± 3,7* 29,4±6,3* 9,4±2,1*

MNNO+ФДТ 0,22± 0,09 31,5±6,4* 26,3± 4,9* 13,1± 2,1**

Примечание: *- Р< 0,01 - показатель достоверности различий по сравнению с контролем. **- Р< 0,01 - показатель достоверности различий по сравнению с колонкой "ФДТ".

В то же время проведение ФДТ уменьшало число клеток асцита в 2 раза, увеличивало некротическую гибель опухолевых клеток в 6,6 раза, апоптотическую в 1,7 раза по сравнению с контролем.

При одновременном введении мышам с карциномой Эрлиха фотогема (10 мг/кг) и MNNG (2,5 мг/кг) перед облучением не отмечалось увеличения противоопухолевого эффекта по сравнению с группой животных получавших только ФДТ. Однако, следует отметить, что комбинация фотогема с MNNG приводила к усилению апоптотической гибели опухолевых клеток на 28 %. Обращает на себя внимание интересный факт усиления противоопухолевого действия лазерного облучения с применением MNNG без фотогема, о чем свидетельствует уменьшение объема опухоли в 14,5 раза и общего количества клеток асцита в 3,8 раза, увеличение некротической гибели в 5,6 раза по сравнению с контролем.

Полученные в нашей работе данные могут служить основой для поиска соединений, генерирующих оксид азота, в тех концентрациях, которые за счет усиления индукции апоптоза опухолевых клеток могли бы приводить к увеличению противоопухолевой эффективности ФДТ.

Таким образом, в данной работе получены результаты, показывающие принципиальную возможность развития направления по использованию доноров N0 для усиления терапевтической эффективности доксорубицина и ФДТ. В то же время следует отметить, что доноры NO могут оказывать неоднозначное действие на процессы пролиферации и апоптоза опухолевых клеток. Поэтому требуются дополнительные исследования для окончательных выводов о клиническом применении доноров N0. По нашему мнению, это откроет перспективу их использования в сочетании с классическими методами противоопухолевой терапии, и будет способствовать развитию новых подходов к лечению злокачественных заболеваний.

ВЫВОДЫ

1.Установлена концентрационная зависимость действия доноров оксида азота на пролиферацию и апоптоз клеток мастоцитомы Р-815 и асцитной карциномы Эрлиха. Стимуляция пролиферации наблюдалась при воздействии на клетки низких концентраций доноров оксида азота (10'5М и менее). Антипролиферативный эффект и индукция апоптоза достигались высокими дозами (10'3М). 2Доноры оксида азота в низких концентрациях усиливают функциональную активность митохондрий, стимулируют образование свободных радикалов в физиологических пределах и повышают выход арахидоновой кислоты из мембран, не влияя на се включение. И, наоборот, в высоких концентрациях они угнетают митоходриальное дыхание, ингибируют включение арахидоновой кислоты и активируют ее выход.

3.Комбинация доноров оксида азота и окислителей (ГПТБ, АБАП) в нетоксичных концентрациях приводила к стимуляции пролиферации опухолевых клеток по сравнению с контролем, а в опухолетоксичных дозах - к снижению их повреждающего действия на синтез ДНК.

4.Влияние оксида азота на индукцию апоптоза свободными радикалами в опухолевых клетках неоднозначно и зависит от концентрации и химической структуры используемых соединений.

5.В экспериментах in vitro сочетанное использование доксорубицина и доноров оксида азота в концентрациях КГМоЛМ увеличивало пролиферативную активность опухолевых клеток и ингибировало индукцию апоптоза. Высокие дозы нитрита натрия и нитропруссида натрия (10'3М) и шггрозогуанидин (10"4М) усиливали опухолетоксическое действие доксорубицина.

6.Донор оксида азота - нитрозогуанидин повышал терапевтическую эффективность доксорубицина, что выражалось в уменьшении объема асцита. Противоопухолевый

эффект сочетанного воздействия сопровождался усилением индукции апоптоза опухолевых клеток в 5,4 раза и некроза в 1,6 раза, по сравнению с группой животных, получавших только доксорубшщн.

7.Применение ФДТ в комплексе с нитрозогуанидином приводило к усилению индукции апоптоза опухолевых клеток по сравнению с традиционной ФДТ.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Сочетанное действие оксида азота и пероксидных радикалов па пролиферативную активность опухолевых клеток. // Бюллетень СО РАМН. 2000. №2, стр. 59-63 (в соавторстве с И.В. Кондаковой)

2. Nitric oxide abates free-radical inhibition oftumor cells proIfration.//Analitical and cellular pathology, Abstract of7th ESACP Congress ,2001, V.22, N1-2, P. 31 (в соавторстве с И.В. Кондаковой, Малаховой Е.В.)

3. Arachidonic acid release from tumor cells under the action of nitric oxide generating compouns. // Abstract of 7th International Conference "Eicosanoids and other bioactive lipids in cancer, inflammation and related diseases", 2001, Nashville, USA, 2001, P. 143 (в соавторстве с И.В. Кондаковой)

4. Участие активных форм кислорода и антиоксидантных ферментов в регуляции пролиферации опухолевых клетокУ/Материалы 5 Всероссийского съезда онкологов «Высокие технологии в онкологии»-Казань,4-7 октябрь-2000г.-Т.1-С.217 (в соавторстве с И.В. Кондаковой, Смирновой Л.П.).

5. Регуляция пролиферации опухолевых клеток свободными радикаламиУ/Актуальные вопросы кардиологии-Томск-14-15 сентября-2000г.-С.253-254 (в соавторстве с И.В. Кондаковой, Смирновой Л. П.).

6. Модуляция опухолетоксического действия свободно-радикальных агентов NO-гснерирующими соединеииямиУ/ Материалы 5 Всероссийского съезда онкологов «Высокие технологии в онкологии»-Казага>,4-7 октябрь-2000г.-Т.1-С.155-156 (в соавторстве с И.В. Кондаковой)

7. Влияние оксида азота на эффективность опухолетоксического действия свободно-радикальных агентовУ/Сборник статей молодых ученых и специалистов.- Томск.-2000г.-С.99 (в соавторстве с И.В. Кондаковой).

8. Роль NO-генсрирующих соединений в модуляции опухолетоксического действия свободно-радикальных агентовУ/Второй Российский конгресс по патофизиологии "Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы."- Москва -2000r.-C.187 (в соавторстве с И.В. Кондаковой, В П. Реутовым).

9. Interactive effects ofperoxyl radicals and nitric oxide on tumor cell proIferation.//Teзисы докладов II съезда онкологов стран СНГ,-Киев.-23-26 маяДОООг.-Экспериментальная онкология-V 22-Supplment-№ 259 (в со-авторстве с Кондаковой И. В.)

10. Сочетанное действие оксида азота и свободно-радикальных агентов на опухолевые клеткиУ/ Материалы межрегиональной конференции «Актуальные вопросы клинической онкологии и преканцерогенеза.»- Якутск.-2000г.- С. 174-175 (в соавторстве с И.В. Кондаковой).

11. Участие свободных радикалов в регуляции пролиферации опухолевых клеток. // 4 ежегодная Российская онкологическая конференция. 21-23 ноября 2000. Москва. 4.2. С.82 (в соавторстве с И.В. Кондаковой, Л.П. Смирновой).

12. Эффективность противоопухолевого действия свободно-радикальных агентов в сочетании с оксидом азота. Материалы молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины», 25-26 мая 2000г.-Новосибирск

13. Модулирующее действие оксида азота на противоопухолевую активность свободных радикалов in vitro.// Актуальные вопросы онкологии 2001, Кызыл, стр. 60-61 (в соавторстве с И.В. Кондаковой).

14. Влияние комбинации потенциал опухолевых клеток в эксперимеше.//Фундамеитальные науки и прогресс клинической медицины: Материалы II Российской конференции молодых ученых России с международным участием. Москва.-24-28 апреля, 2001г.-М.,- 2001.-T.I.-C.427-428 (в соавторстве с И.В. Кондаковой).

15. Оксид азота как фактор защиты опухолевых клеток от свободно-радикального повреждения. VI Международная конференция Биоантиоксидант 16-19 апреля 2002г, Москва, стр. 286-287(в соавторстве с И.В. Кондаковой, В.П. Реутовым)

16. Модулирующее действие оксида азота на противоопухолевую активность свободных радикалов. Сборник трудов конференции «Современные аспекты онкологии и радиологии» 2002, Алматы, стр. 90-93 (в соавторстве с И.В. Кондаковой).

17. Сочетанное действие оксида азота и доксорубицина на индукцию апоптоза опухолевых клеток. Материалы IV Всероссийской коференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии», 10-12 сентября,2003 г., стр. 55-56 (в соавторстве с И.В. Кондаковой).

18. Влияние пероксидных радикалов и оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток. News of biomedical sciences, Вести национальной академии наук Белоруссии, №1,2003г., стр.77-82 (в соавторстве с Кондаковой И.В., Реутовым В.П.)

19. Photodynamic therapy of experimental tumors with au vapor laser. // Материалы VI международного конгресса «Atomic and molecular pulsed laser», 15-19 сентября, 2003г.,стр.79-80 (в соавторстве Евтушенко ВА, Солдатов АН., Кондакова И.В., Шумейко А. С.)

20. Противоопухолевая эффективность фотодинамической терапии с использованием лазера на парах золота в сочетании с оксидом азота.// Материалы молодежной научно-технической конференции «Лазеры на парах металлов и их применение», 29 декабря, 2ООЗг, стр.4-6. (в соавторстве Кондакова ИВ, Евтушенко ВА, Солдатов АН., Шумейко А. С, Чаусова Л.Н..)

21. Влияние оксида азота на противоопухолевую активность фотодинамической терапии// Тезисы VI конференции молодых онкологов Украины «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической онкологии», 4-5 декабря, 2003г., стр. 18-19 (в соавторстве Кондакова И.В., Евтушенко В.А.)

12-46

13

Тираж 100. Заказ 178. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники пр. Ленина, 40