Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Механизмы гибели клеток при действии новых производных нафтоиндолдионов

На правах рукописи

ооз4оеоеI

Глазунова Валерия Александровна

МЕХАНИЗМЫ ГИБЕЛИ КЛЕТОК ПРИ ДЕЙСТВИИ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ НАФТОИНДОЛДИОНОВ

14.00.14 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о ДЕК 2009

Москва 2009

003488061

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре имени Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Научный руководитель

доктор медицинских наук А. А. Штиль

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Богуш Т. А. доктор биологических наук, профессор Горбачева Л. Б.

Ведущее учреждение: Московская медицинская академия имени И.М.Сеченова.

Защита диссертации состоится г. на заседании

Диссертационного ученого совета Д.О01.017.01 при РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОЩ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Ученый секретарь специализи "' "

доктор медицинских наук

профессор

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Антрациклиновые антибиотики, их синтетические производные и аналоги принадлежат к числу ведущих классов современных противоопухолевых препаратов. Адриамицин (доксорубицин), рубомицин, даунорубицин и др. широко применяются в химиотерапии опухолевых заболеваний. Однако антрациклины имеют ряд недостатков - высокая кумулятивная токсичность, мутагенность, кардиотоксичность, миело- и иммунодепрессивное действие. Химические модификации антрациклиновых антибиотиков, направленные на создание препаратов с улучшенными терапевтическими свойствами - актуальная задача ряда научных дисциплин, в частности, биоорганической химии и молекулярной онкологии.

Особенно важным требованием к новым производным антрациклинов является способность преодолевать множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток. Молекулярные транспортеры, например, Р-гликопротеин, способны уменьшать концентрацию антрациклинов и их производных в опухолевых клетках и снижать терапевтический эффект. К началу настоящего исследования были созданы препараты нового поколения -производные нафто- [2,3 -/¡индол-5,10-диона с повышенной цитотоксичностью для клеток с МЛУ (БЬсЬекойкЫп е1 а1., 2006). Следовательно, дальнейшая оптимизация соединений этого химического класса перспективна. Однако транспорт из клеток — не единственный механизм ограничения цитотоксичности химических соединений. Взаимодействие с внутриклеточными мишенями обусловливает многообразие путей реализации гибели клеток при действии производных нафтоиндолдионов. Эти соединения способны интеркалировать в ДНК и нарушать структуру дуплекса, следствием чего являются нарушения репликации, транскрипции, ингибирование топоизомераз I и II. Поэтому механизмы гибели клеток при действии

нафтоиндолдионов обусловлены повреждениями ДНК.

Важнейший сенсор повреждений ДНК - белок р53. Активация его многочисленных функций в ответ на повреждение ДНК приводит к нарушениям клеточного цикла и программированной гибели (апоптозу) клеток. Делеции и мутации р53 - наиболее часто встречающиеся генетические нарушения в злокачественных опухолях. Дисфункция р53, приводящая к инактивации или ограничению р53-зависимого апоптоза, может обусловить недостаточную выраженность цитотоксического сигналинга, запускаемого противоопухолевым препаратом, позволяя клетке пережить воздействие. Требуется идентификация внутриклеточной мишени новых производных нафтоиндолдионов и выяснение механизмов гибели - регулируемых р53 и независимых от этого фактора - в ответ на действие новых соединений. Таким механизмом может быть митохондриальный путь апоптоза: инактивация анти-апоптотических генов семейства Вс1-2, гиперэкспрессия PUMA, NOXA и др.

Таким образом, актуальность проблемы обусловлена необходимостью углубления знаний о молекулярных механизмах цитотоксичности новых химических соединений - производных нафтоиндолдионов как представителей класса, перспективного для создания новых эффективных противоопухолевых препаратов.

Цель исследования - установить механизмы гибели опухолевых клеток человека при действии новых производных нафтоиндолдионов.

Задачи:

1) из химической библиотеки новых производных нафтоиндолдионов отобрать соединения, токсичные для клеток с экспрессией Р-гликопротеина и нефункционирующим р53, и определить диапазон концентраций, в которых делеция р53 приводит к выживанию клеток;

2) исследовать взаимодействие наиболее активного соединения с возможной внутриклеточной мишенью - ДНК: тип связывания, константа равновесия комплексообразованиия;

3) изучить основные механизмы гибели клеток при действии отобранного нового производного нафтоиндолдионов.

Положения, выносимые на защиту:

1) Делеция р53 обеспечивает выживание опухолевых клеток в ответ на действие новых производных нафтоиндолдионов.

2) Новые производные нафтоиндолдионов вызывают апоптоз с участием митохондриальных механизмов.

Научная новизна

• впервые исследованы новые оригинальные производные нафтоиндолдионов, вызывающие гибель опухолевых клеток, в том числе клеток с молекулярными детерминантами лекарственной устойчивости - Р-гликопротеином и нефункционирующим р53;

• впервые идентифицирована внутриклеточная мишень наиболее активного нового соединения - З-аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-_/]индол-5,10-диона, отобранного по данным скрининга химической мини-библиотеки;

• впервые установлены отдельные механизмы передачи внутриклеточных сигналов, регулирующих выживание и гибель клеток при действии З-аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона;

• исследована роль р53 и отдельных механизмов митохондриального пути гибели в цитотоксичности избранного соединения.

Научно-практическая значимость исследования

Изучение механизмов цитотоксического действия новых производных нафтоиндолдионов с оптимизированными свойствами позволит обосновать использование этого класса противоопухолевых препаратов для лечения онкологических заболеваний.

Апробация работы

Диссертация обсуждена 3 июня 2009 г. на совместной конференции лабораторий механизмов гибели опухолевых клеток, молекулярной эндокринологии, регуляции клеточных и вирусных. онкогенов, механизмов регуляции иммунитета, биохимии опухолей, канцерогенных веществ, вирусного канцерогенеза, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, биохимической фармакологии, медицинской химии, лаборатории электронной микроскопии отдела патологической анатомии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 4 журнальных статьи и тезисы 7 конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена страницах машинописи и состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы исследования", "Результаты исследования", заключения и выводов. Работа содержит (!{рисунков и У. таблиц. Библиографический материал включает ссылки на..'"источников литературы.

Материалы и методы исследования

Линии клеток, культивирование и исследуемые соединения

В экспериментах использованы линии клеток человека: К562 (лейкоз) и сублиния K562i/S9 с конститутивной экспрессией Р-гликопротеина (предоставлены I.Roninson, Университет штата Иллинойс, Чикаго, США), НСТ116 (рак толстой кишки), НСТ116 р53КО (сублиния с делецией обеих аллелей гена р53; получена В.Vogelstein в Johns Hopkins University и предоставлена Б.П.Копниным, РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН) и НСТ116 WafConALacZ (сублиния с стабильной экспрессией конструкции, несущей химерный р53-зависимый промотор и ген-репортер бета-галактозидазу; получена и предоставлена П.М.Чумаковым, Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН). Клетки культивировали в модифицированной Дальбекко среде Игла с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С, 5% С02. В экспериментах использовали культуры в логарифмической фазе роста. Новые производные нафтоиндолдионов синтезированы в лаборатории химической трансформации антибиотиков (серия JIXTA) НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН. Соединения растворяли в диметилсульфоксиде. N-ацетилцистеин растворяли в воде непосредственно перед экспериментами. Использовали реактивы фирмы Sigma кроме специально оговоренных случаев.

Исследование выживания клеток

Для изучения цитотоксичности новых соединений использован метод оценки жизнеспособности клеток по восстановлению дегидрогеназами 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) в формазан. Клетки рассевали в 96-луночные планшеты (104 в 190 мкл среды). Через 16 часов в лунки вносили исследуемые соединения, растворенные немедленно перед внесением. Каждую концентрацию соединений изучали в 2-3

повторностях. Культуры инкубировали при 37°С, 5% СОг 72 часа, затем добавляли 50 мкг МТТ и инкубировали 2 часа и растворяли формазан в диметилсульфоксиде. Оптическую плотность раствора формазана определяли спектрофотометрически при длине волны возбуждения 540 нм. Оптическую плотность в контрольных (без нафтоиндолдионов) лунках принимали за 100%. Показатели оптической плотности в лунках с каждой концентрацией испытуемых препаратов усредняли и вычисляли процент выживших клеток при той или иной концентрации. Цитотоксичность новых соединений выражали как концентрацию, вызывавшую гибель 50% клеток (IC50).

Для изучения долговременного выживания в присутствии соединений серии JIXTA клетки линий HCTI16 и НСТ116р53КО рассеивали в 6-луночные планшеты, вносили соединения в увеличивающихся концентрациях или оставляли необработанными (контроль). Инкубировали при 37°С, 5% С02 72 часа, затем сменили культуральную среду на свежую (без препарата). Культуры наблюдали 11 суток, отмечая восстановление логарифмического роста или гибель. В первые 5 суток после удаления препарата проводили ежедневный подсчет выживших клеток методом исключения трипанового синего.

Внутриклеточное накопление производных нафтоиндолдионов Клетки НСТ116 и НСТ116р53КО обрабатывали ЛХТА-1116 1-24 час., снимали с подложки и измеряли флуоресценцию клеток на проточном цитофлуориметре FACSCalibur™ (Becton Dickinson, США) (5000-10000 событий для каждого образца).

Расчет константы связывания производных нафтоиндолдионов с ДНК Константу связывания с ДНК определяли по Скэтчарду как изменение интенсивности флуоресценции ЛХТА-1116 при добавлении ДНК: 0/[ДНК] = 1/К3-9/Ка; [ДНК]СВ0б.=[ДНК]1-[ДНК]Ь=[ДНК]1-[веществ0]^(1-10У(1тах-10);

[вещество]СВОб =[вещество]1*(1гаах-1)/(1тах-10); [вещество]СВЯз=[вещество]1*(1-1оУОтах-1о); 6=[ вещество] С8Яз./[вещество]1=[ДНК]СВЯз./[вещество]1. В данных

уравнениях Ка - константа связывания, lo, Imax, I - значения интенсивности флуоресценции, минимальной, максимальной и текущей соответственно, [вещество] и [DNA] - концентрации исследуемого соединения и ДНК, индексы связ. и своб. - концентрации соединения, связанного с ДНК и свободного.

Активность репортера бета-галактозидазы

Экспрессия гена бета-галактозидазы в векторе, интегрированном в репортерной сублинии НСТ116WafConALacZ, регулируется областью, содержащей минимальный промотор цитомегаловируса и р53-респонсивный элемент (Sablina et al., 1998). Клетки НСТ116WafConALacZ обрабатывали ЛХТА-1116 или оставляли необработанными (контроль), лизировали в буфере, содержащем субстрат бета-галактозидазы - О-нитрофенил-бета-D-галактопиранозид и инкубировали 20 мин. при 37°С. Измеряли оптическую плотность при 414 нм и 690 нм. Разность измерений нормировали на общее количество белка в образцах.

Исследование клеточного цикла

К клеткам линии НСТ116 добавляли JIXTA-1116 или оставляли необработанными (контроль). После окончания инкубации клетки лизировали в буфере, содержащем 0,1% цитрата Na, 0,3% NP-40, 100 мкг/мл РНКазы А и 50 мкг/мл пропидия иодида. Флуоресценцию исследовали на проточном цитофлуориметре.

Определение экспрессии генов методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Клетки помещали в 6-луночные планшеты (105 клеток в 3 мл среды на лунку) и добавляли JIXTA-1116, как описано в разделе "Результаты исследования". После окончания инкубации клетки лизировали реагентом TRIzol (Invitrogen, США). Тотальную РЖ выделяли фенол-хлороформной экстракцией. Обратную транскрипцию и ПЦР проводили, используя реактивы Fermentas (Литва). К образцу тотальной РНК добавляли 50 нг "случайных"

(random) гексамеров и 10 мкМ смеси 4-х дезоксинуклеотидтрифосфатов, инкубировали 10 мин. при 65°С, затем вносили в пробу ингредиенты до следующих конечных концентраций: 1хбуфер для обратной транскрипции, 5 мМ MgCb, 10 мМ дитиотрейтола, 5 ЕД обратной транскриптазы. Пробы инкубировали 10 мин. при комнатной температуре, затем 50 мин. при 42°С и 15 мин. при 70°С. Полученную кДНК растворяли в воде и хранили при -20°С.

ПЦР проводили следующим образом: на 25 мкл (общий объем пробы) вносили: 3 мкл водного раствора кДНК, 2,5 мкл 10х буфера для ПЦР, 0,2 мМ смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, 1,5 мМ MgCI2, 1 ЕД Taq-

полимеразы. Для амплификации использовали следующие праймеры:

Ген Последовательность праймеров Кол-во циклов

SLUG 5'-GCC ТСС AAA AAG CCA AAC TA-3' 5'-CAC AGT GAT GGG GCT GAT G -3' 35

Snail 5'-CCC AAT CGG AAG CCT AAC TAC AG-3' 5'-CAG GTG GGC CTG GCT GTA-3' 35

NOXA 5'-GTG CCC TTG GAA ACG GAA GA-3' 5'-CCA GCC GCC CAG TCT AAT CA-3' 27

PUMA 5'- CAG ACT GTG AAT CCT GTG CT-3' 5'-АСА GTA TCT TAC AGG CTG GG-3' 27

ß2-MUKpoZno6ynUH 5'-ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-3' 5'-АТС TTC AAA CCT CCA TGA TG-3' ' 24

ß-актин 5'-GGC АТС GTG ATG GAC TCC G-3' 5'-GCT GGA AGG TGG АСА GCG A-3' 24

Длительность и температурный режим циклов ПЦР: денатурация для 1-го цикла - 1 минута (94°С), для каждого последующего - 10 сек. (94°С), отжиг праймеров - 10 сек. (60°С), элонгация - 30 сек. (72°С). Для SLUG и SNAIL температура отжига 52°С. Электрофорез продуктов ПЦР проводили в 1% агарозном геле. Продукты реакции выявляли в ультрафиолетовом свете после окрашивания гелей бромистым этидием (0,5 мкг/мл).

Электронная микроскопия

Клетки НСТ116 и НСТ116р53КО рассеивали в 6-луночные планшеты, вносили ЛХТА-1116 или оставляли необработанными (контроль). Клетки инкубировали при 37°С, 5% СОг 24 часа, открепляли от подложки и фиксировали 1% раствором глутаральдегида. Дальнейшие стадии (проводка в спиртах, добавление 1% 0з04, дегидратация, заключение в эЭпон-812, приготовление ультратонких срезов, контрастирование ацетатом свинца) выполняли в лаборатории электронной микроскопии и гистохимии РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН (Н.А.Филиппова). Препараты просматривали на электронном микроскопе 1ЕМ-1200 ЕХ-11 (Япония).

Результаты исследования

В работе изучены 113 новых производных нафтоиндолдионов. Для решения вопроса о способности новых соединений преодолевать МЛУ, опосредованную Р-гликопротеином, сравнивали цитотоксичность соединений для клеток линии К562 (дикий тип) и Р-гликопротеин-положительной сублинии К5621/89. Экспрессия Р-гликопротеина в указанной сублинии достигнута без селекции на выживание в присутствии токсического агента. Это позволяет утверждать, что механизмом лекарственной устойчивости клеток К5621/Б9 является Р-гликопротеин, а не иные факторы, возможно, сопутствующие процессу селекции. Более 70 новых соединений оказались токсичны для клеток К562;/59 в концентрациях <10 мкМ. Эти соединения отобраны для следующего этапа исследования, в котором критерием ответа на токсическое воздействие являлся статус р53.

Сравнение выживаемости клеток НСТ116 и НСТ116р53КО в присутствии наиболее активных производных выявило четко выраженное «окно эффекта р53» в диапазоне 0,4-3,2 мкМ. Окно эффекта р53 - диапазон концентраций препарата, для которых статус р53 клеток (дикий тип или нефункционирующий белок) определял

и

выживаемость. Из исследованных соединений выбрано для углубленного изучения 10 наиболее активных с ГС50 < 2 мкМ. Затем количество исследуемых новых производных нафтоиндолдионов было сокращено до 4-х соединений из одного модификационного ряда 3-аминометил-производных 4,11-дигидроксинафто^З-^индол-ЗЛО-диона. Для всех соединений, подвергнутых скринингу, отмечена закономерность: в определенном диапазоне ("окне") концентраций токсичность препаратов для клеток рака толстой кишки с нефункционирующим р53 (сублиния НСТ116р53КО) была достоверно ниже, чем для клеток с диким типом р53 (НСТ116).

Рнс.1. Структура ЛХТА-1116.

/ \

ш

Для детального анализа механизмов

гибели клеток выбрано 3-аминометилпроизводное 4,11-дигидроксинафто[2,3-/)индол-5,10-диона (ЛХТА-1116; рис.1). Этот выбор обусловлен тем, что 1) ЛХТА-1116 вызывал гибель клеток всех исследуемых клеточных линий в субмикромолярных концентрациях, 2) соединение стабильно при длительном хранении, что позволило получать высоко воспроизводимые результаты, 3) испытания на перевивных опухолях лабораторных мышей показали перспективность ЛХТА-1116 как одного из наиболее эффективных и, предположительно, пригодных для внедрения в практику соединений из серии новых нафтоиндолдионов.

На следующем этапе исследования предстояло установить, обусловливает ли инактивация р53 не просто отсроченную гибель, а позволяет клеткам пережить токсическое воздействие и восстановить рост популяции.

Для этого изучили долговременную выживаемость клеток с диким типом р53

(НСТ116) и сублинии с нефункционирующим р53 (НСТ116р53КО) (рис. 2, 3).

Рис.2. Выживаемость клеток НСТ116 после 24-часовой инкубации с JIXTA-1116.

Рис. 3. Выживаемость клеток

НСТ116р53КО после 24-часовой инкубации с JIXTA-1116.

Оказалось, что клетки HCT 116, инкубированные 24 часа с 0,4-1,6 мкМ 'ЛХТА-1116, погибли уже после 5 сут. инкубации в среде без соединения, тогда как клетки НСТ116р53КО пережили воздействие, и к 11-м суткам отмечен логарифмический рост популяции этих клеток.

□ контроль

в 0,4 мкМ

шо,8мкМ

дни подсчета клеток

□ контроль ■ 0,4 мкМ аШ,8мкМ 01,6 мкМ

120 - --

7 3

дни подсчета клеток

Таким образом, мы установили, что инактивация р53 обусловливает н^ просто отсроченную гибель, а позволяет клеткам пережить однократно»?

токсическое воздействие и восстановить пролиферативный потенциал!

(

Следовательно, р53 принадлежит существенная роль в регуляции баланса "выживание-гибель" при действии ЛХТА-1116. |

Не исключено, что повышение выживаемости клеток НСТ116р53КО 1= присутствии ЛХТА-1116 может быть связано с уменьшением внутриклеточного накопления этого соединения. Однако достоверных различий накопления ЛХТА1 1116 в этих клетках и в линии НСТ116 не установлено. Максимум накоплена препарата в клетках обеих линий приходился на 1,5 часа после внесени) препарата, затем несколько снижался и стабилизировался по крайней мере до 1 (

Рис. 4.

Внутриклеточной накопление ЛХТА-1116.

I

При измерена^ флуоресценции

I

поглощения свет

ЛХТА-1116 ¡;

I

комплексе ¡>

I

двухцепочечно^

ДНК установлено, что данное соединение является интеркалятором. Констант^-

I

равновесия комплексообразования и плотность посадки молекул ЛХТА-1116 й

I

дуплекс зависят от концентрации лиганда. Для относительно малы} концентраций ЛХТА-1116 по отношению к концентрации ДНК константа равновесия комплексообразования составила 1x10 М'1, одна молекул? связанного препарата приходится на 48 пар нуклеотидов. При увеличени:?

концентрации ЛХТА-1116 константа равновесия комплексообразования увеличилась до 7,7x107 М"', одна молекула связанного препарата приходится на 11 пар нуклеотидов.

Таким образом, ЛХТА-1116 - ДНК-интеркалатор и, следовательно, вызывает повреждение ДНК. Сенсор повреждений ДНК - транскрипционный фактор р53. Для изучения трансактивации гена-репортера бета-галактозидазы клетки НСТ1 l6'WafConALacZ инкубировали с ЛХТА-1116. Соединение вызывало активацию репортера в концентрациях 3,2 мкМ и 6,4 мкМ (рис. 5).

ЛХТА-1116, мкМ

Рис. 5. Р53-зависимая активация гена-репортера в клетках НСТ116WafConALacZ при действии ЛХТА-1116.

Таким образом, в цитотоксических концентрациях ЛХТА-1116 активирует р53-зависимую транскрипцию гена-репортера. Это позволяет утверждать, что роль р53 в гибели клеток, вызываемой новыми производными нафтоиндолдионов, связана с регуляцией генной транскрипции. Возникает вопрос о том, какие именно гены активируются посредством р53 в ответ на действие ЛХТА-1116. Ответ на это вопрос может быть получен после выяснения типа гибели клеток.

Чтобы определить, является ли гибель клеток при действии ЛХТА-1116 апоптотической, использованы два экспериментальных подхода. Во-первых, исследована целостность ДНК под действием ЛХТА-1116. Анализ плоидности при действии 1,6-6,4 мкМ ЛХТА-1116 на клетки НСТ116 выявил нарушение целостности (деградацию) ДНК. Так, при действии 6,4 мкМ ЛХТА-1116 24 часа ~

50% ядер обнаружены в суб-С1 области, что свидетельствует о фрагментации ДНК - признаке апоптоза (рис. 6).

«

К

Й ю о о

О

е

0 и

¡г1 К

1

интенсивности флуоресценции

Рис. 6.

Распределение фаз цикла клеток НСТ116 при действии ЛХТА-1116 (6,4 мкМ, 24 часа), а, контроль; б, ЛХТА-1116.

Во-вторых, при

действии 1,6 мкМ| ЛХТА-1116 24 часа обнаружены клетки с фрагментацией ядра, характерной для

апоптоза. При

действии 6,4 мкМ ЛХТА-1116 нами выявлены ультраструктурные признаки некроза (рис. 7). В обоих случаях

обнаружены вакуоли лизосомального типа, возможно, содержащие ЛХТА-1116.

А Б В

Рис. 7. Ультраструктурные нарушения при действии ЛХТА-1116.

А, интактные клетки, Б, клетки через 24 часа после добавления 1,6 мкМ ЛХТА-1116 (стрелками показана фрагментация ядер и вакуоли), В, клетки через 24 часа после добавления 6,4 мкМ JIXTA-1116 (некроз как исход апоптоза).

На основе приведенных данных можно утверждать, что алоптоз -ведущий механизм гибели клеток при действии JIXTA-1116.

Изучение сочетанного действия ЛХТА-1116 с другими соединениями показало, что комбинация ЛХТА-1116 с ингибитором поли(АДФ-рибозо)полимеразы ЕВ-47 и пан-каспазным ингибитором z-VAD-FMC не вызвала изменений выживания клеток. Эти результаты указывают, что гибель клеток при действии ЛХТА-116 не связана с активацией каспазозависимых сигнальных каскадов. Напротив, комбинация ЛХТА-1116 с антиоксидантом N-ацетил-Ь-цистеином потенцировала гибель клеток. Этот эффект проявляется независимо от статуса р53.

Мы предположили участие митохондриального пути гибели клеток в ответ на действие ЛХТА-1116. Первоначально кандидатами выбраны PUMA и

NOXA - гены проапоптотических белков семейства Вс1-2, для которых р53 является важнейшим транскрипционным регулятором (Yu and Zhang, 2008). Индукцию этих генов, а также генов р53 и р21 анализировали при действии 1,6 мкМ JIXTA-i 116. В качестве внутреннего контроля ПЦР использовали к ДНК актина и р2-микроглобулина. Существенных отличий в уровнях мРНК указанных генов в клетках с р53 дикого типа и нокаутом р53 не было. Следующим объектом исследования стали гены SLUG и SNAIL, играющие важную роль в апоптотических каскадах, инициируемых повреждением ДНК (Wu и соавт., 2005). Мы установили, что в клетках с р53 дикого типа мРНК SLUG практически отсутствует. Напротив, активация SLUG выражена в клетках с инактивированным р53 в ответ на JIXTA-1116 через 1-12 час. после внесения препарата (рис. 8).

К 1 3 6 12 24 час

шш **** тцдмдцу- НСГ116 ¡истин

НСТ116 SLUG

НСТ11бр53КО

frrumjt SLUG

НСТ11бр53КО

. \ • - J . ... . mssa* а,гпш

Рис. 8. Экспрессия SLUG при действии 1,6 мкМ JIXTA-1116.

Таким образом, наиболее вероятным механизмом защиты клеток с нефункционирующим р53 от апоптоза, индуцируемого новым производным нафтоиндолдионов ЛХТА-1116, является продукт анти-апоптотического гена

SLUG, играющий важную роль как в нормальном онтогенезе, так и в опухолевой трансформации. В клетках с интактным р53 экспрессия SLUG, вероятно, репрессирована посредством р53, тем самым отменяя ограничивающее действие белка SLUG на проапоптотические гены (например, PUMA и ВАХ). В этих условиях митохондриальный путь апоптоза, индуцированный повреждением ДНК, функционирует. В клетках же с нефункционирующим р53 в ответ на повреждение ДНК, помимо р53-независимых путей гибели, активируется (дерепрессируется) ген SLUG, продукт которого способен блокировать митохондриальный апоптоз, обусловливая долговременное выживание опухолевых клеток.

Результаты исследования позволяют утверждать, что новые производные нафтоиндолдионов перспективны для дальнейших предклинических испытаний. Выявление молекулярных механизмов гибели опухолевых клеток при действии наиболее активных соединений этого химического класса важно как практически ориентированное фундаментальное исследование в молекулярной и клеточной онкологии.

Выводы

1. Среди производных нафтоиндолдионов выявлены соединения, вызывающие гибель культивируемых опухолевых клеток человека, в том числе клеток с молекулярными детерминантами лекарственной устойчивости - экспрессией Р-гликопротеина и нефункционирующим р53.

2. Одной из внутриклеточных мишеней, важных для цитотоксичности 3-аминометил-производного 4,11 -дигидроксинафто [2,3 -/] индол-5,10-диона, является двухцепочечная ДНК, с которой соединение образует высокоаффинные интеркаляционные комплексы. Константа равновесия комплексообразования и количество мест связывания определяются соотношением концентраций соединения и ДНК.

3. З-Аминометил-производное 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона микромолярных концентрациях вызывает апоптоз клеток с диким типом р5 Делеция р53 обусловливает долговременное выживание клеток после воздейств субтоксических концентраций соединения; при более высоких концентрация гибель клеток осуществляется независимо от статуса р53.

4. Молекулярный механизм ограничения апоптоза в клетках с делецией р53 связан с увеличением экспрессии гена SLUG.

5. Антиоксидант N-ацетилцистеин потенцирует гибель клеток при действии 3-аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона независимо от статуса р53.

Автор выражает благодарность доктору химических наук А.Е.Щекотихину и профессору М.ЬШреображенской за предоставление новых производных нафтоиндолдионов.

Публикации по теме диссертации

1. А.Е. Shchekotikhin, L.G. Dezhenkova, O.Yu. Susova, V.A. Glazunova, A.A. Shtil, M.N. Naphtho[2,3-_/]indole-5,10-dione derived analogues of tryptamine, the new type of cytotoxic topo I inhibitors. Proceedings of 3d International Symposium on Targeted Anticancer Therapies. Amsterdam, The Netherlands. 2005. P.48-49.

2. A. E. Shchekotikhin, V. A. Glazunova, Y. N. Luzikov, V. N. Buyanov, 0. Y. Susova, A. A. Shtil, M. N. Preobrazhenskaya. Synthesis and structure-activity relationship studies of 4,1 l-diaminonaphtho[2,3-y]indole-5,10-diones. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 2006. V.14. P.5241-5251.

3. V.A. Glazunova, A.A.Shtil. The role of p53 in cytotoxicity of new analogues of mitoxantrone. Problems in Oncology. 2006. V. 52. P. 11.

4. А. Е. Shchekotikhin, L. G. Dezhenkova, О. Y.Susova, V. A. Glazunova. Y. N. Luzikov, Y. N. Sinkevich, V. N. Buyanov, A. A. Shtil, M. N. Preobra-zhenskaya. Naphthoindole-based analogues of tryptophan and tryptamine: synthesis and cytotoxic properties. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 2007. V.15.P. 2651-2659.

5. V.A. Glazunova. A.A.Shtil. The role of p53 in cytotoxicity of new derivatives of naphthoindolediones. Materials of VIII International Conference of Young Oncologists. Kiev. 2007. P. 15.

6. L.G. Dezhenkova, O.Yu. Susova, V.A. Glazunova. A.E. Shchekotikhin, A.A. Shtil, M.N. Preobrazhenskaya. Naphtoindolediones, new class of topoisomeraze I inhibitors. Russian Journal of Biotherapy. 2007. № 1. P.45.

7. Глазунова B.A., Штиль A.A. Митохондриальные механизмы апоптоза в ответ на повреждение ДНК. Молекулярная биология. 2008. Т. 42. № 5. С. 765-771.

8. Shchekotikhin А.Е., Dezhenkova L.G., Susova O.Y., Glazunova V.A., Shtil A.A., Preobrazhenskaya M.N., Huang H.-S. Novel naphthoindoledione derived topoisomerase I inhibitors potent for multidrug resistant tumor cells. Proceedings of 6th International Symposium on Targeted Anticancer Therapies. Bethesda, USA. 2008. P. 42.

9. Щекотихин A.E., Глазунова B.A., Деженкова Л.Г., Штиль А.А., Преображенская М.Н. Новые нафтоиндолдионы, вызывающие гибель опухолевых клеток с множественной лекарственной устойчивостью. Российский биотерапевтический журнал. 2008. Т.7. № 1. с. 55-56.

lO.Shchekotikhin А.Е., Dezhenkova L.G., Susova O.Y., Glazunova V.A., Shtil A.A., Preobrazhenskaya M.N., Huang H.-S. Novel naphthoindoledione derived topoisomerase I inhibitors potent for multidrug resistant tumor cell. Annals of Oncology. 2008. V.19. P. vii 28.

1 l.Shchekotikhin A. E., Glazunova V. A., Dezhenkova L. G., Luzikov Y. N., Sinkevich Y., Kovalenko L. V., Buyanov V. N., Balzarini J., Huang F.-C., Lin J.-J., Huang H.-S., Shtil A. A., Preobrazhenskaya M. N. Synthesis and cytotoxic properties of 4,ll-bis[(aminoethyI)amino]anthra-[2,3-6]thiophene-5,10-diones, novel analogues of antitumor anthracene-9,10-diones. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 2009. V.17. № 5. P. 1861-1869.

Подписано в печать 03.ll.09 Формат 60x84/16. Бумага офсетная.

_Заказ № 8 8 8 Тираж 100 экз.__

Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Актуальность проблемы.

Антрациклины и близкие по структуре соединения - ведущий класс современных противоопухолевых препаратов. Антрацпклиновые антибиотики даунорубицин и доксорубицин широко применяются в современной химиотерапии опухолевых заболеваний человека. Однако антрациклины имеют ряд недостатков, основным из которых является кардиотоксичность. Кроме того, антрациклиновые антибиотики обладают высокой кумулятивной токсичностью, мутагенностью, канцерогенностью, миело- и иммунодепрессивным действием [71, 89]. Так, оригинальный антибиотик антрациклиновой группы - карминомицин, структурно схожий с доксорубицином, открыт в НИИ по изысканию новых антибиотиков АМН СССР и внедрен в практику отечественного здравоохранения. Карминомицин проявил высокую эффективность как препарат для лечения сарком мягких тканей и лейкозов. Его отличает от других производных антрациклинов меньшая кардиотоксичность, способность тормозить рост опухолей, устойчивых к доксорубицину и возможность перорального применения благодаря всасыванию в желудочно-кишечном тракте. Указанный пример подтверждает, что химическая модификация антрациклиновых антибиотиков, направленная на поиск препаратов с улучшенными химиотерапевтическими свойствами, главным образом, активных для опухолевых клеток с множественной лекарственной устойчивостью, является актуальной задачей онкологии [34, 89, 99].

Антрациклиновые препараты обладают множественным действием. Антрахиноны и их синтетические аналоги (аминоэтиламинантрахиноны) обладают способностью интеркалировать с ДНК, таким образом вмешиваясь в репликацию и транскрипцию. [9496]. Антрациклины также способны ингибировать топоизомеразу II. Присутствие индольного компонента в молекуле может снизить образование семихинонов и свободных радикалов, определяющих кумулятивную кардиотоксичность антрациклинов.

Антрациклиновые антибиотики, особенно доксорубицин, широко используются в клинике, однако их использование ограничено кардиотоксичностью и образованием множественной лекарственной устойчивости опухолей. С целью преодоление МЛУ были синтезированы антрациклиновые препараты нового поколения - производные нафто-[2,3-У]индол-5,10-диона, обладающие повышенной активностью против клеток с МЛУ. Они не являются субстратом для Pgp-опосредованного транспорта и, в то же время, способны запускать р53-независимые механизмы клеточной гибели и взаимодействовать с ДНК-зависимыми ферментами, топоизомеразами и теломеразой[95, 96].

Целью разработки синтетических аналогов антрациклинов является получение препаратов со сниженной органной токсичностью и сохранением цитотоксичности, сравнимой с цитотоксичностью митоксантрона и аминантрона — представителей много обещающего класса противоопухолевых препаратов, производных антрацен-5,10-дионов. Аминантрон не является источником свободных радикалов и даже обладает некторой антиоксидантной активностью. Отдельные гетероциклические аналоги аминоалкиламиноантрахинонов, такие как аналог аминантрона пиксантрон, пиразолантроны и пиразолакрадины, показывают высокую противоопухолевую активность при практически нулевой кардиотоксичности [94].

МЛУ часто является причиной неудач в терапии антрациклинами, но это явление прямо связано с химической структурой антрациклинов [34, 96, 99]. Во-первых, эти соединения могут выводиться из клетки молекулярными транспортерами (например, Pgp). Во-вторых, антрациклиновые кольца интеркалируют с ДНК, запуская клеточный ответ на повреждение ДНК, в котором р53 является основным регулятором. Гиперэкспрессия Pgp и утрата белком р53 проапоптотических функций — основные причины устойчивости опухолевых клеток к антрациклинам. Таким образом, оптимизация химической структуры препаратов предполагает, что синтетические аналоги антрациклинов нового поколения должны быть о неподходящим субстратом для выведения при помощи Pgp, и в то же время должны запускать р53-независимые пути апоптоза. Последнее можно воплотить за счет способности антрациклинов взаимодействовать с ДНК-зависимыми ферментами, такими, как топоизомеразы и теломераза [95, 96].

Некоторые производные нафто[2,3-/]индол-5,10-дионов показали заметную цитотоксичность в отношении культур клеток рака человека и большую, чем у доксорубицина и митоксантрона, способность убивать опухолевые клетки с МЛУ. Вероятно, дополнительный гетероциклический компонент может существенно увеличить связывание аналогов аминантрона с их внутриклеточными мишенями, а кольцо А доксорубицина важно для формирования третичной структиры, включающей препарат, дуплекс ДНК и топоизомеразу И.

Множественная лекарственная устойчивость злокачественных новообразований — сохранение клетками жизнеспособности в ответ на воздействие различных лекарственных веществ [34, 89, 94]. Одной из важнейших причин МЛУ является пониженное накопление токсинов в клетке, обусловленное их активным выведением в межклеточную среду. Такой транспорт осуществляется интегральным белком плазматической мембраны^ Р-гликопротеином (Pgp, масса 140-170 кДа) за счет энергии гидролиза АТФ. У человека Pgp кодируется геном MDRX (multidrug resistance 1), локализованным в хромосоме 7. Pgp -трансмембранный белок с молекулярной массой -170 кДа, состоящий из двух одинаковых частей, каждая из которых включает шесть гидрофобных трансмембранных участков. Молекула Pgp имеет два сайта связывания с АТР, что свидетельствует об энергозависимости функционирования белка. Р-гликопротеин - это очень консервативный белок. Он имеет гомологию с многочисленными бактериальными и эукариотическими транспортными белками. Показано, что семейство генов pgp принадлежит к суперсемейству генов, которые кодируют АТФ-связывающие мембранные транспортные системы в филогенетически далеких видах.

Трансмембранный Р-гликопротенд (кодируется геном АВСВХ ), транспортирующий лекарственные препараты из клетки, обеспечивает активное выведение цнтостатиков , в частности антрациклинов , что способствует при его экспрессии возникновению полирезистентности к противоопухолевым средствам . Р-гликопротеин - белок-переносчик с широкой специфичностью. Исследования in vitro показали, что спектр субстратов Pgp включает не только противоопухолевые препараты, но и препараты, используемые для реверсии МЛУ, флуоресцентные красители, стероидные гормоны. Увеличение количества иРНК MDRX и Pgp служит фактором устойчивости многих типов опухолей к лечению и, следовательно, связано с клинической агрессивностью заболевания. Причина клинической МЛУ — гиперэкспрессия MDRX и Pgp при неизменной копийности гена, что обусловлено возможностью индукции гена MDRX внеклеточными стимулами — эпигенетической активацией гена. Ген MDR1 может транскрибироваться с двух промоторов — дистального и проксимального. Функциональная роль дистального промотора невелика, подавляющее количество иРНК MDRX транскрибируется с проксимального промотора. В промоторе гена MDRX имеются несколько сайтов, опосредующих срочную активацию транскрипции в ответ на экзогенные стимулы. Следствием такой "вырожденности" является множественность участвующих в этом феномене транскрипционных факторов. Регуляция гена MDR\ осуществляется на многих уровнях; возможны "обходы" сигналов, если тот или иной механизм не функционирует. Такая взаимозаменяемость механизмов надежно обеспечивает развитие резистентности при действии лекарств.

Антрациклиновые антибиотики (адриамицин, даунорубицин), винкаалкалоиды (винкристин, винбластин), таксаны (таксол, таксотер), митоксантрон, ингибиторы топоизомераз (этопозид) — вот неполный перечень групп противоопухолевых препаратов, устойчивость к которым обусловлена Pgp-опосредованным транспортом [34, 89,94, 95].

Дисфункция р53, приводящая к инактивации или ограничению р53-зависимого апоптоза, может обусловить недостаточную выраженность цитотоксического сигналинга, запускаемого противоопухолевым препаратом, позволяя клетке пережить воздействие [70, 95, 127]. Требуется идентификация внутриклеточной мишени новых соединений и выяснение механизмов гибели - регулируемых р53 и независимых от этого фактора - в ответ на действие новых производных нафтоиндолдионов. Такими механизмами могут быть митохондриальный путь апоптоза: активация генов PUMA, Noxa, инактивация анти-апоптотических генов семейства Вс1-2. Эти механизмы могут быть сбалансированы активацией продуктов анти-апоптотических генов. Так, вероятно участие ядерного фактора каппа В (NFkB) - регулятора выживания клеток, активирующего, в частности, гены семейства IAP (inhibitor of apoptosis) в ответ на действие ряда противоопухолевых препаратов.

Таким образом, актуальность проблемы обусловлена необходимостью углубления знаний о молекулярных механизмах цитотоксичности химических соединений для создания новых противоопухолевых препаратов, преодоления резистентности опухолевых клеток и повышения эффективности противоопухолевой терапии.

Научная новизна

• впервые исследованы новые оригинальные производные нафтоиндолдионов, вызывающие гибель опухолевых клеток, в том числе клеток с молекулярными детерминантами лекарственной устойчивости - Р-гликопротеином и нефункционирующим р53;

• впервые идентифицирована внутриклеточная мишень наиболее активного нового соединения - 3-аминометил-производного 4,11 -дигидроксинафто[2,3-/]шгдол-5,10-диона, отобранного по данным скрининга химической мини-библиотеки;

• впервые установлены отдельные механизмы передачи внутриклеточных сигналов, регулирующих выживание и гибель клеток при действии 3-аминометил-производного 4,11 - диг и д роксинафто [2.3:/] индол-5,10-диона;

• исследована роль р53 и отдельных механизмов митохондриального пути гибели в цитотоксичности избранного соединения.

Научно-практическая значимость исследования

Изучение механизмов цитотоксического действия новых производных нафтоиндолдионов с оптимизированными свойствами позволит обосновать использование этого класса противоопухолевых препаратов для лечения онкологических заболеваний.

Цель исследования - установить механизмы гибели опухолевых клеток человека при действии новых производных нафтоиндолдионов.

Задачи:

1) из химической библиотеки новых производных нафтоиндолдионов отобрать соединения, токсичные для клеток с экспрессией Р-гликопротеина и нефункционирующим р53, и определить диапазон концентраций, в которых деления р53 приводит к выживанию клеток;

2) исследовать взаимодействие наиболее активного соединения с возможной внутриклеточной мишенью — ДНК: тип связывания, константа равновесия комплексообразованиия;

3) изучить основные механизмы гибели клеток при действии отобранного нового производного нафтоиндолдионов.

Глава 5. ВЫВОДЫ

1. Среди производных нафтоиндолдионов выявлены соединения, вызывающие гибель культивируемых опухолевых клеток человека, в том числе клеток с молекулярными детерминантами лекарственной устойчивости - экспрессией Р-гликопротеина и нефункционирующим р53.

2. Одной из внутриклеточных мишеней, важных для цитотоксичности 3-аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/)индол-5,10-диона, является двухцепочечная ДНК, с которой соединение образует высокоаффинные интеркаляционные комплексы. Константа равновесия комплексообразования и количество мест связывания определяются соотношением концентраций соединения и ДНК.

3. З-Аминометил-производное 4,11 -дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона в микромолярных концентрациях вызывает апоптоз клеток с диким типом р53. Делеция р53 обусловливает долговременное выживание клеток после воздействия субтоксических концентраций соединения; при более высоких концентрациях гибель клеток осуществляется независимо от статуса р53.

4. Молекулярный механизм ограничения апоптоза в клетках с делецией р53 связан с увеличением экспрессии гена SLUG.

5. Антиоксидант N-ацетилцистеин потенцирует гибель клеток при действии 3-аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона независимо от статуса р53.

Автор выражает благодарность доктору химических наук А.Е.Щекотихину и профессору М.Н.Преображенской за предоставление новых производных нафтоиндолдионов.

Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Антибиотики антрациклинового ряда, в частности, доксорубицин и сходные по структуре карминомицин, рубомицин, идарубицин и др., широко используются в онкологической клинике как эффективные препараты при лечении солидных и мезенхимальных опухолей. Вместе с тем, их клиническое применение ограничено органной токсичностью и развитием лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Второе обстоятельство еще более важно, чем общерезорбтивная токсичность: существующие меры борьбы с органной токсичностью так или иначе позволяют уменьшить это неблагоприятное, однако, вероятно, неизбежное побочное действие противоопухолевых препаратов. Лекарственная же устойчивость нередко становится множественной, т.е. клетки опухоли выживают при действии нескольких лекарств. Среди фенотипов множественной лекарственной устойчивости экспрессия трансмембранного АТФ-зависимого транспортера Р-гликопротеина и родственных белков признана одним из ведущих. Действительно, указанные белки, выводя из клетки молекулы многих ксенобиотиков, уменьшают их внутриклеточную концентрацию, снижая возможность индукции клеточной гибели. Однако активация трансмембранного транспорта - не единственная возможность опухолевой клетки избежать гибели. Внутриклеточные механизмы ограничения гибели являются "следующим барьером". Среди таких механизмов - белок р53, участие которого в анти-апоптотическом сигналинге многообразно. Таким образом, создание и исследование механизмов действия новых лекарств, способных преодолевать указанный барьер, т.е. вызывать гибель опухолевых клеток, устойчивых к другим препаратам (и, шире, другим противоопухолевым воздействиям) является актуальной задачей на стыке медицинской химии природных соединений, клеточной и молекулярной онкологии.

Химические модификации антрациклиновых антибиотиков включают, в частности, изменения гетероциклических колец фармакофора и боковых цепей. В НИИ по изысканию новых антибиотиков им.Г.Ф.Гаузе РАМН проводится многолетняя работа по химической трансформации природных и полусинтетических производных доксорубицина, митоксантрона и других соединений. В настоящей работе нам была предоставлена серия новых уникальных производных нафто-[2,3-/]индол-5,10-диона, синтезированных А.Е.Щекотихиным в указанном институте под руководством М.Н.Преображенской. Эти соединения являются прототипами противоопухолевых препаратов нового поколения - более активных для клеток с механизмами лекарственной устойчивости.

На первом этапе исследования мы провели скрининг серий новых производных нафто-[2,3-/]индол-5,10-диона на способность вызывать гибель культивируемых опухолевых клеток человека. Для решения вопроса о способности новых соединений преодолевать Р-гликопротеин-зависимый активный транспорт, сравнивали цитотоксичность соединений для клеток линии лейкоза К562 (дикий тип) и изогенной сублинии K562i/S9 с экспрессией Р-гликопротеина, достигаемой после введения в клетки дикого типа ретровирусной конструкции, несущей полноразмерный ген этого белка. Такая модель позволяет вычленить роль одного механизма - Р-гликопротеина - в выживаемости клеток, что важно, поскольку ступенчатый отбор устойчивых к лекарствам потомков может сохранить и другие факторы выживания. Нам удалось выявить соединения, вызывающие гибель клеток дикого типа и инфектантов в субмикромолярных концентрациях.

После этого возникла необходимость идентификации внутриклеточной мишени новых соединений и выяснения механизмов гибели, регулируемых р53 и независимых от этого фактора, в ответ на действие новых производных нафтоиндолдионов для структурной оптимизации препаратов и отбора из модификационных рядов веществ, перспективных для клинического применения.

На модели клеток рака толстой кишки (линия НСТ116 с диким типом р53) и сублинии НСТ116р53КО с генетической инактивацией этого белка нами установлено, что р53-негативные клетки получают преимущество в выживании при инкубации с каждым соединением из анализируемого модификационного ряда. Возник закономерный вопрос, действительно ли отсутствие в клетках р53 позволяет им пережить воздействие препарата или просто обеспечивает отсроченную гибель обработанных клеток? В следующем эксперименте мы установили, что отсутствие р53 действительно дает клеткам возможность пережить однократное воздействие препарата и восстановить логарифмический рост культуры. Был сделан вывод, что р53 принадлежит существенная роль в регуляции баланса "выживание-гибель" при действии ЛХТА-1116 (аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона). Это соединение было выбрано для изучения из-за достаточно высокой цитотоксичности и явно выраженного окна эффекта р-53, что было важно для изучения механизмов влияния р53 на гибель клеток от препаратов данного модификационного ряда.

Чтобы убедиться, что различия в выживаемости клеток не связаны с разницей во внутриклеточном накоплении препарата, мы изучили накопление препарата в клетках НСТ116 и НСТ116р53КО при помощи проточной цитофлутриметрии. Как и ожидалось, различий в накоплении препарата клетками с разным статусом р53 не установлено.

Следующим этапом исследования стало выявление внутриклеточной мишени аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/|индол-5,10-диона. По аналогии с антрациклинами, чей механизм действия уже изучен, мы предположили, что это соединение может взаимодействовать с ДНК.

Методом проточной цитофлуориметрии исследована деградация ДНК под воздействием аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-1]индол-5,10-диона. Оказалось, что в клетках НСТ-116 дикого типа аминометил-производное 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона вызывает деградацию ДНК, тогда как в сублинии НСТ116р53КО этот важный механизм клеточной гибели отсутствует. Таким образом, наличие р53 в клетке предотвращает деградацию ДНК при воздействии J1XTA-1116.

С помощью измерения флуоресценции и поглощения свечения соединения в комплексе с двухцепочечной ДНК установлено, что JIXTA-l 16 является интеркалятором, причем константа диссоциации и плотность посадки молекул этого препарата на двухцепочечную ДНК зависят от его концентрации.

Рассчитанные константы равновесия комплексообразования в микромолярном диапазоне указывают на то, что аминометил-производное 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона образует "сильные" (высокоаффинные) комплексы с двухцепочечной ДНК в условиях, близких к физиологическим. Одно интеркаляционное событие приходится на один завиток спирали макромолекулы. Эти расчеты важны для утверждения о том, что ДНК является мишенью (возможно, не единственной), с которой аминометил-производное 4,1 Ьдигидроксинафто^З-^индол-ЗЛО-диона может взаимодействовать внутри клетки. В дальнейшем изучении механизмов гибели клеток при действии аминометил-производное 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона мы исходили из повреждения структуры ДНК этим соединением как пускового события в индукции гибели клеток.

Важнейший элемент ответа клетки на повреждение ДНК - нарушение конформации дуплекса и/или самой структуры макромолекулы (изменения нуклеотидной последовательности) - активация р53-зависимых процессов. Для того чтобы выяснить, вызывает ли аминометил-производное 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона транскрипционную активацию р53, мы использовали модель трансактивации р53-зависимого промотора в клетках, обработанных исследуемым соединением. Было установлено, что воздействие аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона вызывает транскрипционную активацию р53, что подтвердило гипотезу об участии р53 в гибели или выживании клеток при обработке их аминометил-производным 4,11-дигидроксинафто[2,3-/|индол-5,10-диона.

Также методом изучения цитотоксичности аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона в комбинации с антиоксидантом показано, что антиоксидант М-ацетил-Ь-цистеин потенцирует гибель клеток. Этот эффект проявляется в клетках независимо от статуса р53. Эксперимент на сублинии НСТ-116ConALacZ подтвердил, что добавление N-ацетил-Ь-цистеина не влияет на транскрипционную активность р53. Было выдвинуто предположение, что смещение редокс-баланса снимает анти-апоптотическую активность NFkB и контролируемых этим фактором генов.

Обработка клеток ингибитором поли(АДФ-рибозо)полимеразы (PARP) ЕВ-47 и пан-каспазным ингибитором z-VAD-FMC не вызвала снижения цитотоксичности аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-Диндол-5,10-диона и также не влияла на потенцирующее действие 1Ч-ацетил-Ь-цистеина. Это может указывать на то, что цитотоксическое действие JIXTA-116 непосредственно не связано с активацией каспазозависимых каскадов.

Чтобы определить, является ли гибель клеток при действии аминометил-производного 4,11 -дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона действительно апоптотической, были использованы три метода. Анализ межнуклеосомной фрагментации ДНК оказался отрицательным, но при исследовании обработанных препаратом в течение суток клеток с помощью электронной микроскопии для концентрация 1,6 мкМ аминометил-производного 4,11 -дигидроксинафто[2,3-1]индол-5,10-диона обнаружены клетки с фрагментацией ядра, характерной для апоптоза. При воздействии 6,4 мкМ/мл клетки оказывались некротизированными. В обоих случаях на фотографии были видны вакуоли лизосомального типа, предположительно содержащие аминометил-производное 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона. Для исследования нарушения фаз клеточного цикла в ответ на действие аминометилпроизводного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона проведен анализ распределения плоидности ДНК методом проточной цитофлуориметрии. Было установлено, что ареста клеточного цикла не происходит, тогда как в раннее время воздействия появляется sub-Gl пик, свидетельствующий о наличии апоптоза.

На основе этих данных был сделан вывод, что при малых концентрациях препарата гибель клеток идет по механизмам апоптоза, а при дальнейшем повышении концентрации препарата переходит в некроз либо завершается по некротическому типу.

Далее требовалось выяснить, на каком уровне происходит регуляция гибели и выживания обработанных препаратом клеток. В качестве основной рабочей гипотезы мы приняли возможность митохондриального пути клеточной гибели.

Наиболее интересными кандидатами на роль механизмов гибели могли быть PUMA и NOXA - гены проапоптотических белков семейства Bcl-2, для которых р53 является важнейшим активатором. Их индукцию в культурах клеток с различным статусом р53 мы проверяли методом ПЦР после обратной транскрипции, анализируя воздействие препарата в концентрации 1,6 мкМ/мл на клетки при разном времени воздействия.

Однако существенных отличий в экспрессионном профиле изогенных культур клеток с р53 дикого типа и нокаутным р53 на предшествующем этапе не было, и следующим объектом исследования стали гены SLUG и SNAIL, играющие важную роль в апоптотическом каскаде, запускаемом повреждением ДНК.

Изучение мРНК SLUG показало как практически полное ее отсутствие в клетках с р53 дикого типа, так и явную активацию SLUG в культуре с нокаутным р53 в ответ на воздействие аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона в период до 12 часов после внесения препарата, с некоторым падением уровня мРНК через 3 часа воздействия. В необработанной культуре, как и через 24 часа после внесения аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона, экспрессия SLUG оказался слабой. Эти результаты позволили сделать вывод, что отсутствие SLUG является ключевым элементом выживания клеток с инактивацией р53. В дальнейшем планируется более точное количественное сравнение экспрессии SLUG при разном времени воздействия аминометил-производного 4,11 -дигидроксинафто[2,3^индол-5,10-диона.

Таким образом, проанализированы возможные механизмы действия препаратов, преодолевающих трансмембранный барьер, что важно для их дальнейшего практического применения в терапии опухолей. Экспериментально установлена зависимость эффективности действия препаратов от р53-статуса опухолевых клеток, причем предварительно выявлен возможный механизм, обуславливающий р53-зависимую устойчивость опухолевых клеток к химиотерапии. Уточнение и преодоление этого механизма может способствовать появлению и внедрению в практику новых, более эффективных противоопухолевых препаратов.

Индукция апоптоза в опухолевых клетках - одно из перспективных направлений поиска химиотерапевтических препаратов. Однако, р53-независимый апоптоз существенно замедлен по сравнению с р53-зависимой гибелью, а опухоли в делецией р53 встречаются весьма часто. По результатам нашего исследования, наиболее вероятным механизмом защиты клеток с нефункционирующим р53 от индуцируемого противоопухолевыми препаратами апоптоза является антиапоптотический ген SLUG, играющий важную роль как в нормальном онтогенезе, так и в опухолевой трансформации. В клетках с нормальным р53 SLUG, вероятно, экспрессия этого гена репрессирована посредством р53, блокируя действие SLUG на проапоптотические гены {PUMA, ВАХ), и функционирует путь митохондриального апоптоза, индуцированного повреждением ДНК. В клетках же с нефункционирующим р53 в ответ на повреждение ДНК, помимо р53-независимых апоптотических путей, активируется и SLUG, продукт которого способен блокировать митохондриальный апоптоз. Увеличение концентрации препарата в экспериментальных условиях ведет к некротической гибели клетки независимо от р53 статуса, но так как на практике высокие концентрации препаратов использовать нельзя, целесообразно применять апоптогенные концентрации препаратов в комбинации с воздействием на SLUG.

Результаты настоящего исследования открывают дальнейшие направления исследования механизмов гибели опухолевых клеток при действии новых производных нафтоиндолдионов и, шире, ДНК-повреждающих противоопухолевых соединений. Предстоит выявить прямую роль экспрессии SLUG в клетках с разным статусом р53, используя антисмысловые конструкции. Исследование регуляции экспрессии SLUG на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях позволит обнаружить низкомолекуляриые соединения, взаимодействующие с промоторными областями и ингибирующие транскрипцию. Регуляция SLUG на уровне белка является новым направлением в молекулярной онкологии. С практических позиций требуется подобрать комбинации современных противоопухолевых лекарств и способы инактивации SLUG с целью повышения эффективности гибели клеток.

Возможно, выявленные механизмы гибели клеток, индуцируемые новыми производными нафтоиндолдионов - не единственные. Требуются дальнейшие усилия по установлению роли других событий, как регулируемых р53, так и независимых от этого механизма. Важен механизм взаимопереключения апоптоза и некроза. Однако наше исследование позволяет утверждать, что данный класс химических соединений перспективен для использования в клинике, молекулярные механизмы гибели опухолевых клеток при действии наиболее активных производных нафтоиндолдионов имеют своеобразие, и их изучение важно как пример практически ориентированного экспериментального исследования в молекулярной и клеточной онкологии.