Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Сравнительное изучение взаимодействия альфа-фетопротеина и моноклональных антител к рецептору альфа-фетопротеина с опухолевыми клетками in vitro

Об ЯНВ 2004

Ницветов Михаил Борисович

Сравнительное изучение взаимодействия альфа-фетопротеина и моноклональных антител к рецептору альфа-фетопротеина с опухолевыми клетками in vitro

14.00.36 - Аллергология и клиническая иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2003 г.

Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И.М.Сечеш и Московском научно-исследовательском институте медицинской эколог;

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Александр Викторович Караулов; доктор биологических наук Елизавета Юрьевна Москалева

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Станислав Степанович Афанасьев; доктор медицинских наук Иван Генрихович Козлов

Ведущая организация: ГНЦ - Институт иммунологии

Минздрава Российской Федерации

Защита состоится 20 января 2004 года в часов на заседании Диссертационно]

Совета Д. 208.040.08 при Медицинской академии им. И.М.Сеченова по адрес

119992, Москва, ул. Б. Пироговская, д. 2, стр. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им. И.М.Сеченова г

адресу. 117998, Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан декабря 2003 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета // у

доктор медицинских наук, доцент п \jfwv -Андрей Юрьевич Мироно

зоба

Pll

Актуальность проблемы. В настоящее время злокачественным новообразования^ шнадлежит второе место в структуре заболеваний, приводящих к летальному исходу, ерспективы излечения данной патологии связаны с разработкой эффективных методов иней диагностики, иммунопрофилактики и терапии. В связи с этим, весьма актуальным .лястся изучение специфических белков опухолевых клеток. С этой точки зрения ибольший интерес вызывают универсальные опухолеспецифические маркеры, которые спрессируются на большей части типов опухолей, но отсутствуют на нормальных клетках, таим из таких маркеров может оказаться рецептор онкофетального бежа альфа-яшротеина (РеАФП). АФП является основным белком сыворотки крови плода, главная дшция которого заключается в транспорте жирных кислот внутрь пролиферирующей етки. Известно несколько различных белков, способных связывать АФП. РеАФП — это 1>П-связывающий белок, встроенный в поверхностную мембрану клеток. Впервые «дположение о существовании специфического РеАФП было сделано R. Moro в 1981 году я объяснения поглощения АФП растущими клетками (Moro R. et al., 1981). К настоящему емени известно, что: 1) РеАФП представляет собой трансмембранный гликопротеин (Suzuki et al., 1992; Moro R. et al., 1993; Severin S.E., et al. 1994; Kanevsky V.Yu. et al., 1997); 2) АФП обеспечивает перенос АФП внутрь клетки по механизму рецептор-опосредованного доцитоза (M.J.Villacampa et al., 1984); 3) В сыворотке крови больных раком достоверно ®ышен уровень антител к РеАФП по сравнению со здоровыми людьми (Астахов Д.В. и др., 99). Исходя из того, что различные культивируемые in vitro опухолевые клетки и [бриональные клетки, в отличие от нормальных, способны накапливать АФП (Uriel J. et al., 79), было сформулировано представление о РеАФП как об универсальном онкофетальном лке и опухолевом маркере (Uriel J. et al., 1984; Moro R. et al., 1984). РеАФП был обнаружен мембране некоторых культивируемых in vitro опухолевых клеток, моноцитах и имулированных in vitro лимфоцитах периферической крови человека, причем уровень его спрессии на опухолевых клетках был выше, чем на моноцитах и стимулированных мфоцитах (Mizejewski G.J., 2001). Данные об уровне и характере экспрессии РеАФП в етках опухолей человека в сравнении с экспрессией этого белка в нормальных тканях сьма ограничены и противоречивы (Moro R. et al., 1993; Laderoute M. et al., 1994; аршутина H.B. и др., 2001). Необходимым инструментом для проведения таких следований являются моноклональные антитела (МоАт). Кроме того, МоАт к РеАФП или ; фрагменты, по-видимому, могут бьггь использованы в качестве векторных молекул для здания методов направленной терапии и новых методов диагностики опухолей.

В связи с этим целью работы явилась характеристика МоАт к РеАФП в сравнении с АФП по их взаимодействию с культивируемыми in vitro опухолевыми клетками и исследование экспрессии РеАФП в образцах солидных опухолей человека с помощью охарактеризованного клона МоАт к РеАФП.

В соответствии с целью исследования были сформулированы следующие задачи:

1.) Количественная характеристика связывания МоАт к РеАФП в сравнении с АФП по их взаимодействию с культивируемыми in vitro опухолевыми и нормальными клетками человека.

2.) Количественная характеристика уровня эндоцитоза МоАт к РеАФП и АФП для культивируемых in vitro опухолевых клеток.

3.) Исследование влияния МоАт к РеАФП на выживаемость опухолевых клеток и на их чувствительность к действию цитотоксических лимфоцитов.

4.) Исследование экспрессии РеАФП опухолевыми клетками солидных опухолей человека с помощью МоАт к РеАФП.

Научная новизна работы.

В данной работе впервые показано, что количество сайтов связывания для МоАт к РеАФП 4-х клонов и для АФП при взаимодействии этих лигаядов с культивируемыми in vitro опухолевыми клетками примерно одинаково, при этом связывание МоАт к РеАФП отличается более высокой аффинностью, чем связывание АФП. В то же время ни МоАт к РеАФП ни АФП не взаимодействовали с нормальными свежевыделенными лимфоцитами периферической крови человека. Показано, что МоАт клона 2В8 связываются с АФП-узнающим сайтом РеАФП, поэтому этот клон МоАт был отобран для иммуногистохимических исследований.

Обнаружено, что количество рецепторов АФП на клетках аденокарцияомы молочной железы линии MCF-7Adr и карциномы яичника SKVLB, характеризующихся множественной лекарственной устойчивостью, превышает количество таких рецепторов на чувствительных клетках аденокарциномы молочной железы линии MCF-7*1 и карциномы яичника SKOV3, соответственно. Для резистентных опухолевых линий MCF-7Adl и SKVLB обнаружена также более высокая скорость рецептор-опосредованного эндоцитоза РеАФП, чем для чувствительных клеток МСР-7м и SK.OV3.

Впервые показано, что МоАт к РеАФП в концентрации 500 нМ способны повышать цитотоксическую активность цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) in vitro, а в более высокой концентрации - ее ингибировать.

С помощью МоАт к РеАФП клона 2В8 обнаружен высокий уровень экспрессии рецептора АФП на опухолевых клетках солидных опухолей и опухолевых клетках

доброкачественной опухоли, имеющей эмбриональное происхождение, и отсутствие его экспрессии на клетках нормальных тканей и доброкачественных опухолей.

Практическая значимость исследований.

Обнаруженная высокая специфичность взаимодействия МоАт к РеАФП с опухолевыми клетками позволяет использовать эти антитела для иммуногистохимической диагностики злокачественных новообразований и делает возможным использование изученных МоАт для создания иммуносцинтиграфических методов диагностики онкологических заболеваний и создания на их основе противоопухолевых препаратов направленного действия.

Положения выносимые на защиту.

1.) МоАт к РеАФП человека клонов 5С6, 2В8 и 2Е1 специфически связываются с РеАФП на поверхности опухолевых клеток in vitro и интенсивно эндоцитируются опухолевыми клетками. МоАт клона 2В8 специфически связываются с АФП-узнающим участком РеАФП.

2.) МоАт к РеАФП клона 2В8 пригодны для иммуногистохимического исследования экспрессии РеАФП на срезах тканей как замороженных, так и залитых в парафин.

3.) МоАт к РеАФП способны индуцировать цитотоксическую активность лимфоцитов в этношении опухолевых клеток.

i.) МоАт к РеАФП способны выявлять опухолевые клетки злокачественных опухолей и эпухолевые клетки доброкачественных опухолей эмбрионального происхождения на гистологических срезах тканей человека.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на 1-м съезде иммунологов России (Сочи, сентябрь 1999), на 27-м Съезде международного >бщества по изучению онкофетальной биологии и медицины (ISOBM, Киото, октябрь-ноябрь 1999), на Второй международной ассамблее Аптека 2000 "Новые медицинские технологии" Москва, октябрь 2000), на 3-й конференции центрально-европейских стран по опухолевым 1аркерам человека (Карловы Вары, февраль 2001), на П Российской конференции молодых 'ченых с международным участием (Москва, 24-27 апреля 2001), на 5-м Конгрессе РААКИ Современные проблемы аллергологии, иммупологии и иммунофармакологии" (Москва, >ктябрь 2002), на конференции "Клиническая иммунология и клиническая медицина" Москва, май 2003), на 3 научной конференции и школе-семинаре для молодых ученых Белки-маркеры патологических состояний" (Астрахань-Москва, сентябрь 2003).

Апробация работы состоялась на совместной научно-методической конференции афедры клинической иммунологии и аллергологии ФППО ММА им. И.М. Сеченова и аборатории клеточной биохимии Московского НИИ медицинской экологии 3 ноября 2003 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 118 страница; машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, указател! литературы, содержащий ссылки на 195 источника. Диссертация иллюстрирована 2( рисунками, содержит 9 таблиц.

Материалы и методы исследования.

Получение МоАт к РеАФП. МоАт к РеАФП были получены при использованш РеАФП, выделенного из аденокарциномы молочной железы человека в отделе биотехнологш Всероссийского научного центра медицинской диагностики и лечения (зав. отделов В.К.Сологуб). Были изучены четыре клона МоАт: 5Е1 (IgG2a), 2Е1 (IgG2a), 2В8 (IgGi»), 5С( (IgA).

Культивирование клеток. Клетки Т-клеточной лямфомы человека линии Jurkat, В-клеточной лимфомы человека линий Namalva и Raji и лимфолейкоза мыши линии P38S культивировали в пластиковых флаконах (Costar) в среде RPM1 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 50 мкг/мл гентамицияа, а линии клеток карциномы шейки матки человека HeLa, гепатокарциномы человека HepG2, чувствительные и резистентные к антрациклиновым антибиотикам линии аденокарциномы молочной железы MCF-7"-1 и MCF-7Mr и аденокарциномы яичника SKOV3 и SKVLB, соответственно, меланомы мыши линии В16 - в среде DMEM с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина при температуре 37°С в С02 инкубаторе при содержании С02 5% в увлажненной атмосфере.

Получение АФП человека. АФП выделяли из пуповинной крови, как описано ранее (Severin S.E. et al., 1996). Полученный препарат АФП характеризовали по электрофоретической подвижности в ПААГ и иммунохимической активности.

Получение ФИТЦ-меченных препаратов АФП и моноклональиых антител. Флуоресцеинизотиоцианаг (ФИТЦ) вводили в молекулы антител и АФП с использованием 10% ФИТЦ на целлите по методике (Uriel J. et al., 1983). Соотношение ФИТЦ:МоАт и ФИТЦ:АФП для различных препаратов варьировало от 1:1 до 4.7:1. Иммунохимическая активность ФИТЦ меченного АФП не отличалась от исходного АФП.

Выделение мононуклсарных лейкоцитов периферической крови (МЛПК) человека. Лимфоциты периферической крови выделяли с помощью центрифугирования крови через градиент раствора фиколл-пак по методу Воушп (Воушп А., 1968) и суспендировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) в концентрации 1 млн/мл.

Оценка связывания МоАт и АФП с РеАФП методом проточной цитофлуорнметрии. Для анализа связывания исследуемые клоны антител и АФП, меченные ФИТЦ, разводили в ФСБ в диапазоне концентраций 50 - 4000 нМ в 50 или 100 мкл и добавляли к суспензии клеток на холоду. Затем клетки инкубировали с МоАт при 4°С в течение 1 часа. После отмывания клеток ФСБ их фиксировали с помощью 1% иараформальдегида и интенсивность флуоресценции измеряли на проточном дитофлуориметре ЕРЮЭ-С. Количество рецепторов АФП на клетках определяли с ^пользованием метода Скэтчарда как описано в работе РЬ. Вои1еЛег (ВоШеШсг РЬ.Р.Ье. е! а!., 1983). Среднее количество РеАФП с усредненным значением Ка рассчитывали как описано >ерзофски Д. А. и Берковер А. Дж. (Берзофски Д. А., Берковер А. Дж., 1989).

Оценка эндоцитоза МоАт и АФП методом проточной цитофлуориметрии. В кспериментах использовали опухолевые клетки линий МСГ-7"', МСР-7А'|г, ЗКОУЗ, БКУЬВ, 1ерС2, КатаН'а, Дш-ка!, Raji, НеЬа. Перед проведением опыта клетки инкубировали 30 мин в реде без сыворотки. Для анализа скорости эндоцитоза меченные ФИТЦ МоАт и АФП в азличных концентрациях инкубировали при 4°С и при 37°С в течение 1 часа. После вухкратного отмывания клеток ФСБ их фиксировали с помощью 1% параформальдегида и нтенсивность флуоресценции измеряли на проточном цитофлуориметре ЕРГСБ-С. ассчитывали количество связавшихся и эндоцитировавяшхея и только связавшихся лигандов по разности этих показателей оценивали скорость эндоцитоза.

Исследование выживаемости клеток. Выживаемость клеток после инкубации в «личных условиях оценивали с помощью МТТ-теста по методу Мсвтапп (Мовтапп Т., 383).

Изучение влияния МоАТ к РеАФП на чувствительность опухолевых клеток к ¡йствию цитотокснческих лимфоцитов. Опухолевые клетки линии ЭКОУЗ высевали в 96-'ночный планшет по 5 тысяч клеток в лунку в бессывороточной среде и вносили МоАт ¡следуемых клонов в нужной концентрации. Через 30 мин инкубации добавляли суспензию ЛПК человека (или спленоцитов мыши) в таких концентрациях, чтобы соотношение клетки-ппени : клепш-эффекторы составляло от 1:10 до 1:80. Через 72 часа инкубации [тотоксическую активность лимфоцитов человека (или спленоцитов мыши) определяли по гживаемости соответствующих опухолевых клеток-мишеней и рассчитывали по формуле:

ГА= [(А(мйшен1,+эффекгор)"А(эффекгор)): А(МИшень)ЗхЮ0%, ГДО А^щснь+зфф^^ор), Ага*|фсктор) И А(мищень) "

тическая плотность при 540 нм после окрашивания МТТ проб, где инкубировались ухолевые клетки-мишени с клетками-эффекторами, клетки-эффекторы и только клетки-шени, соответственно. Аналогичные эксперименты были проведены на клетках мыши. Для

б

этого спленоциты выделяли из селезёнки мышей линии C57BIack для опытов с клеткал меланомы мыши линии В-16 и мышей линии DBA/2 для опытов с клетками лямфолейко мыши линии Р388 с помощью центрифугирования суспензии клеток через градиент раство] фиколл-пак.

Методика иммуноцитохимнческого окрашивания. Окрашивание клеток проводило! с помощью непрямого стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с использованием Мо/ к РеАФП. Исследуемые клетки предварительно высаживали на стекла в 1 мл культуральнс среды в 24-х луночную плашку и оставляли на ночь для прикрепления. Затем среду меняли i бессывороточную и оставляли на час. После отмывания ФСБ клетки фиксировали 4' параформальдегидом, отмывали и исследовали с помощью стрептавидин-биотш пероксидазной системы DAKO LSABR 2 System, HRP (DAB). Для контрокрашивания яде использовали гематоксилин Майера в течение 15-20 сек. Для получения отрицательно! контроля первичные антитела из схемы эксперимента исключали. После заключения клеток мавеол или раствор глицерина стекла исследовали при световой микроскопии при увеличени х200. Результаты фиксировали при помощи Digital camera DXM 1200 ("NIKON").

Материал для иммуиогистохимического исследования. Материалом дл иммуногистохимического исследования экспрессии РеАФП служили фрагменты опухолей здоровых тканей, которые получали от пациентов с различными злокачественными доброкачественными опухолями в процессе хирургических операций. Были исследован] следующие типы тканей и опухолей: здоровая ткань яичника, серозная сосочкова цисгаденома яичника, серозная сосочковая цистаденома яичника погранично; злокачественности, серозная сосочковая цистаденкарцинома яичника; нормальная печень вн зоны опухоли, гепатоцеллюлярный рак, холангиоцеллюлярный рак; аденокарцином молочной железы; молодая скиррозная аденокарцинома желудка; аденокарцинома толстог кишечника; доброкачественный карциноид легкого; нормальный бифуркационны] лимфоузел; миксома сердца.

Приготовление криостатных срезов. Образцы тканей человека и мьппи замораживал] и хранили при -70°С. Криостатные срезы толщиной 7 мкм получали на микротоме при -20°( по стандартной методике. Для улучшения прикрепления срезов на предметное стекло последние обрабатывали адгезивом Histogrip согласно методике.

Приготовление срезов, залитых в парафин. Образцы тканей фиксировали дт сохранения антигенных свойств в 10% формалине на ФСБ, подвергали дегидратации i заливали в парафин по стандартной методике. Перед окрашиванием срезы депарафинироват

к дегидратировали. Для восстановления антигенных свойств срезы в ФСБ обрабатывали в микроволновой печи мощностью 720 ватт 2-3 мин.

Методика иммуногпстохимического окрашивания срезов. Окрашивание -истологических срезов проводили во влажной камере при комнатной температуре с томощью непрямого стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с использованием МоАт к 3еАФП. Криостатные срезы предварительно фиксировали 4% параформальдегидом. Все :резы инкубировали с 3% раствором перекиси водорода в течение 5 мин для блокирования «догеняой пероксидазной активности. На следующем этапе только срезы печени, ;аключенные в парафин, инкубировали с DAKO Biotin Blocking System для блокирования шдогенного биотина. После этого все срезы обрабатывали с помощью стрептавидин-биотин-¡ероксидазной системы DAKO LSABR 2 System, HRP (DAB). Для контрокрашивания ядер ютользовали гематоксилин Майера в течение 1-2 мин. Затем срезы обезвоживали и аключали в канадский бальзам. Для получения отрицательного контроля первичные антитела ¡3 схемы эксперимента исключали. Результаты исследовали с помощью световой шкроскопии при увеличении х250 и х400 и фиксировали при помощи Digital camera DXM 200 ("NIKON") и микрофотосъемки.

Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка результатов гроводилась по методу Стьюдента с использованием компьютерной программы Origin.

Результаты исследований и их обсуждение.

Характеристика различных клонов МоАт к РеАФП в сравнении с АФП по их 1заимодействик> с культивируемыми in vitro опухолевыми клетками. Для характеристики заимодействия МоАт к РеАФП были выбраны две опухолевые клеточные линии человека и 1ыши, культивируемые in vitro: Т - клеточная лимфома человека линии Jurkat и лимфолейкоз 1ыши линии Р388. В качестве отрицательного контроля были взяты свежевыделенные имфоциты периферической крови человека.

Для оценки эффективности связывания исследуемых клонов МоАт с клетками в равнении с АФП использовали метод проточной цитофлуориметрии. Показано, что все сследованные клоны МоАт к РеАФП, также как и АФП, эффективно связываются с пухолевыми клетками линии Jurkat и лишь в незначительной степени со свежевыделенными имфоцитами (Рис. 1). Подобные результаты получены для клеток мьпии линии Р388.

Для выяснения степени неспецифического взаимодействия МоАт с поверхностью клеток ыли проведены эксперименты, в которых к клеткам предварительно добавляли 10-кратный збыток IgG мыши для блокирования Fe рецепторов клеточной поверхности, через которые

ч

>ч У О

4 о

5

ff S

ч о bä

50 -

40 -

30

- 20 -

X «

S 10 н

в

300 400 500

Концентрация АФП и МоАт,

Рис.1. Связывание МоАт клонов 5С6 (1), 5Е1 (2), 2В8 (3

и АФП (4) с клетками линии Jurkat (1,2,3,4) и свежевыделенны м и лимфоцитами периферической крови человека (5 - клон 5Е1), (6 - АФП, клоны 2В8, 5С6).

могло происходить неспецифическое взаимодействие изучаемых МоАт. Оказалось, ч ингибирование связывания МоАт к РеАФП и с клетками человека и с клетками мыши присутствии избытка мыши составляло не более 5%. Эти данные свидетельствуют возможности использования МоАт к РеАФП в экспериментах с человеческими и мышиньт клетками без дополнительного блокирования Рс-рецепторов.

Конкурентное взаимодействие МоАт с природным лигандом за сайты связываю является объективной характеристикой специфичности МоАт к лиганд-узнающему эпитол Исследование взаимодействия МоАт к РеАФП с опухолевыми клетками человека проводили присутствии 10-кратного избытка АФП. Клетки предварительно инкубировали с АФП течение 10 минут при 4°С. Затем добавляли меченные ФИТЦ МоАт к РеАФП, инкубировали час при 4°С, дважды отмывали ФСБ, фиксировали 1% параформальдегидом и измерял интенсивность флуоресценции на проточном цитофлуориметре. Полученные результат представлены в таблице 1. Наиболее значительное ингибирование связывания антител опухолевыми клетками человека обнаружено в случае МоАт клона 2В8. Аналогична

¡следования были проведены в присутствии 90-кратного избытка (по отношению к МоАт) [сгворимого препарата РеАФП (препарат РеАФП для изучения конкурентного аимодействия с МоАт был предоставлен лабораторией биохимии белка, зав. лабораторией И. Сотниченко). Обнаружено, что РеАФП ингибировал связывание только двух клонов оАт: 2В8 и 5С6. Связывание МоАт двух других клонов не изменялось.

Таблица 1.

нгибирование связывания меченных ФИТЦ МоАт к РеАФП человека с опухолевыми [еткамя человека линии ,Гчг1Ш в присутствии 10 кратного избытка препарата АФП ловска или 90-кратного избытка растворимого препарата РеАФП.

Клон МоАт Ингибировапие связывания МоАт, %

АФП РеАФП

5Е1 0 0

5С6 8 13

2В8 57 39

2Е1 39 0

При исследовании ингибирования связывания МоАт к РеАФП в присутствии избытка Щ с клетками мьпяи линии Р388 обнаружено, что ингибирование для клонов 5Е1, 5С6, 2В8 ',Е1 составило 52%, 30%, 76% и 15%, соответственно. Это позволяет считать, что АФП не "ибирует связывание МоАт клона 5Е1 с клетками человека линии Jurkat, но уменьшает их имодействие с мышиными клетками линии Р388 на 39%. Наибольшее ингибирование имодействия как с клетками человека, так и с клетками мыши было обнаружено для МоАт »na 2В8, что свидетельствует о связывании этого МоАт с АФП-узнающим участком РеАФП обеих клеточных линиях.

Таким образом, среди четырех исследованных клонов МоАт к РеАФП клон 2В8 гадает наибольшим сродством к АФП-узнающему участку как клеток человека так и клеток ши, а также к растворимому препарату РеАФП. Это дает возможность заключить, что уктура АФП-связывающего участка РеАФП этих видов довольно близки, и позволяет в периментах с опухолевыми клетками мыши использовать АФП человека и некоторые аы МоАт к РеАФП человека.

Количественная характеристика экспрессии РеАФП на различных клетках важна в свете ледования возможности использования лигандов РеАФП в качестве векторов для иосцинтииммунографии опухолей и создания методов направленной терапии. 'Иратсльность распределения лигандов РеАФП in vivo будет зависеть от количества

РеАФП и Ка лиганда на опухолевых клетках. Поэтому было важно сравнить количество РеАФП, выявляемое с помощью МоАт различных клонов с тем, которое может быть выявлено с помощью АФП. Кроме того важно было определить степень аффинности связывания различных клонов МоАт к РеАФП по величине Ка с опухолевыми клетками в сравнении с АФП.

Для получения абсолютных значений количества РеАФП на клетку использовали метод обратных координат Скэтчарда. Разрешающая способность использованного метода проточной цитофлуориметрии позволяет регистрировать связывание флуоресцептно-меченных лигандов с опухолевыми клетками при концентрации лиганда более 10 нМ. При этом для клеточных линий НеЬа, Р388, Нер02 и кривая связывания АФП имела только одно плато, и на графике Скэтчарда точки апроксимировались единственной прямой, определяющей среднее количество сайтов связывания и среднее значение Кй (Рис. 2). В то же время для клеточных линий вКОУЗ, МСР-7, ЛлкаЪ и В-16 были получены графики связывания АФП с несколькими платообразными участками (Рис. 3). На рис. ЗА цифрами обозначены три платообразных участка кривой. На врезке (Б) значения представлены в координатах Скэтчарда, где прямые 1, 2, 3 соответствуют трем плато насыщения на Рис. ЗА и характеризуют количество РеАФП с разной аффинностью (с разной Ка). Прямая 4 на графике Скэтчарда позволяет определить среднее число РеАФП. В этих случаях было рассчитано как среднее количество сайтов связывания (Табл. 2), так и количество сайтов связывания каждого типа и их Кй (Табл. 3). На рис. 3 показано три плато насыщения в случае клеток линии МСР-7 для диапазонов концентраций АФП: 50-400 нМ, 400-1000 нМ, 1-2 мкМ. На графике Скэтчарда при апроксимации значений каждого участка насыщения прямой наблюдается несколько типов сайтов связывания, различающихся по К^' для диапазона концентраций 50-400 нМ обнаружено 170 тысяч сайтов связывания с К[1 равной 1.4х10'7 М; для диапазона 400-1000 нМ - 340 тысяч с К<1 равной 3.3x10"6 М; а для диапазона 1-2 мкМ - 920 тысяч с К^ равной 7.8Х10"6 М.

При исследовании взаимодействия МоАт клонов 2Е1, 5С6 и 2В8 с клетками опухолевых линий в большинстве случаев так же выявлялось несколько типов сайтов связывания МоАт, различающихся по Кд. Так на рис. 4 приведена зависимость связывания МоАт клона 2В8 с клеточной линией МСР-7. На рис. 4А цифрами обозначены три платообразных участка кривой. На врезке (Б) значения представлены в координатах Скэтчарда, где прямые 1, 2, 3 соответствуют трем плато насыщения на рис. 4А и характеризуют количество РеАФП с разной аффинностью (с разной Кй). Прямая 4 на графике Скэтчарда позволяет рассчитать

и

с о ьс

500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Концентрация АФП, нМ.

Рис. 2. Связывание АФП с клетками линии Нер02 (А). На врезке данные представлены в координатах Скэтчарда (Б).

с

100-.

ф

с 90 -

о

Е 80-

1С

о X 70-

э 60-

о я 'о 50-

п

к X 40-

ш о СО 30-

о С

01 н в 20 -

о О) < 10-

т

0 н

с; (

о

/

В х10"

500 750 1000 1250 1500 1750 2000

Концентрация АФП, нМ.

'ис. 3. Связывание АФП с клетками линии МСР-7 (А). 1а врезке данные представлены в координатах Скэтчарда (Б).

:днее количество сайтов связывания МоАт. При обработке результатов для диапазонов щентраций 50-200,200-400, 400-1000 нМ определяются различные значения количества [тов связывания с разной Ка. Аналогичные данные получены и для других клеточных шй. Полученные результаты представлены в таблицах 2 и 3. При этом следует отметить, > при связывании МоАт к РеАФП отмечены, как правило, более низкие значения Ка, чем I использовании АФП.

Концентрация МоАт 2В8, нМ. Рис. 4. Связывание МоАт клона 2В8 с клетками МСР-7 (А). На врезке (Б) данные представлены в координатахС кэтчарда.

Таблица 2

Среднее количество сайтов связывания АФП и различных клонов МоАт к РеАФП и и: Кл для различных линий опухолевых клеток человека и мыши.

Ливия АФП МоАт к РеАФП

клеток 2Е1 5С6 2В8

Кол-во сайтов х10"3 Kj rid"', М Кол-во сайтов хЮ"3 К„ х10"', М Кол-во сайтов х10"3 K,ixlO-7,M Кол-во сайтов х10"3 KaxlO"

HeLa 260 1.2 580 1.9 160 4.3 100 2.3

SKOV3 440 6.4 207 13 307 2.1 207 1.9

MCF-7 310 30.0 140 1.5 350 1.7 300 1.5

Jurkat 580 89.0 120 4.8 210 5.0 175 4.0

Raji 420 4.8 120 0.6 180 3.4 180 5.1

HepG2 450 4.9 520 12.0 620 7.5 400 4.8

B-16 430 25.0 - - 685 18.0 750 19.0

P388 160 32.0 108 1.4 166 2.5 200 1.7

Из представленных данных следует, что количество сайтов связывания АФП н: опухолевых клетках различного происхождения существенно различается и колеблется от 16( тысяч (Р388) до 1 млн (7игкаЦ с разбросом К<з от около 1х10"7 М (НеЬа, МСР-7) до 1.4х10"5 Л-(•Гиткаг) (Табл. 2, 3). Число сайтов связывания МоАт к РеАФП разных клонов с опухолевши клетками было того же порядка, что и сайтов связывания АФП, но количественно отличалос] от того, которое было обнаружено для АФП. Кроме того, важно отметить, что связываши

Таблица 3.

Количество различающихся по К4 сайтов связывания АФП и различных клопов МоАт к РеАФП для различных линий опухолевых клеток человека и мыши.

Ливия АФП МоАт к РеАФП

клеток 2Е1 5С6 2В8

Кол-во са- KdXlO"7, М Кол-во са- Ka xlO'7, М Кол-во са- Ко хЮ"7, М Кол-во са- К, xlO7, М

йтов хЮ"3 йтов х№3 йтов хЮ*3 йтов xl О"3

SKOV3 180 3.2 170 0.2 307 2.1 220 0.4

255 21.0 170 3.4 375 5.0

MCF-7 180 1.4 140 1.5 300 0.3 280 0.4

325 22.3 810 7.2 308 1.7

920 77.8 508 9.8

Jurkat 150 10.0 120 4.8 220 1.8 175 4.0

1000 140.0 400 18.0

HepG2 450 4.9 500 4.7 620 7.5 400 4.8

900 80.0

В-16 425 4.1 - - 685 18.0 200 4.8

1050 68.0 600 44.0

Р388 160 32.0 74 0.3 180 1.4 100 0.5

300 23.0 500 19.0 300 5.6

МоАт к РеАФП всех клонов в большинстве случаев было более аффинным, чем связывание АФП. При этом соотношение между количеством сайтов связывания АФП и сайтов :вязывания МоАт к РеАФП разных клонов было различным для клеток разных линий. Эти данные свидетельствуют о наличии индивидуальных особенностей в организации РеАФП в метках различных опухолевых линий.

Таким образом, количество рецепторов, определенное как с помощью АФП, так и с томощью МоАт к РеАФП было одного порядка. Причем, если среднее количество сайтов :вязывания для АФП и для МоАт различалось существенно, то количество высокоаффинных •айтов связывания для МоАт было близким к значениям количества высокоаффинных сайтов вязывания для АФП. При этом, в большинстве случаев, константа связывания МоАт имела ¡олее высокое значение по сравнению с константой связывания АФП, что говорит о более ысокой аффинности связывания МоАт к РеАФП по сравнению с АФП. Обработка езультатов опытов по взаимодействию меченных ФИТЦ АФП и МоАт с нормальными имфоцитами периферической крови здоровых добровольцев в координатах Скэтчарда

свидетельствует об отсутствии сайтов связывания АФП на свежевыделенных нормальных лимфоцитах.

Исследование уровня эндоцитоза МоАт к 1'сАФП опухолевыми клетками в сравнении с эндоцитозом АФП.

Для использования клеточных рецепторов в качестве мишени для направленного транспорта биологически активных веществ важно, чтобы связывание лиганда с этим рецептором индуцировало его эндоцитоз. Поэтому были поставлены специальные эксперименты для изучения скорости эндоцитоза ФИТЦ-меченных МоАт к РеАФП в сравнении с АФП. Количество связавшихся и эндоцитировавшихся ФИТЦ-меченных лигандов также оценивали с помощью проточной цитофлуориметрии.

При инкубации клеток в условиях, обеспечивающих эндоцитоз (37°С), обнаружено существенно более высокое накопление АФП и МоАт клонов 2Е1, 2В8 и 5С6 по сравнению с их связыванием с клетками при 0°С (Рис. 5), что свидетельствует о возможности эндоцитоза не только АФП, но и МоАт к РеАФП. При сравнении взаимодействия МоАт и АФП с клетками линий Нер02 и при 0°С и 37°С, следует прежде всего отметить, что связывание МоАт клетками линии НерС2 было более высоким, чем связывание АФП (Рис. 5А), а клетками линии Над (Рис. 5Б) - более низким по сравнению с АФП. Связывание МоАт к РеАФП было более высоким с клетками линии Нер02, что коррелирует с количеством сайтов связывания для МоАт к РеАФП на этой клеточной линии по сравнению с клетками линии (Табл. 2,3). В то же время, уровень интернализации АФП и МоАт клетками линии Нер02 был близок и соответствовал 35, 26, 42 и 46 тысяч молекул на клетку в час для АФП и МоАт клонов 2Е1, 5С6 и 2В8 при исходной концентрации 4 мкМ, соответственно (Рис. 5). В случае линии Кар скорость интернализации была более интенсивной и накопление АФП и МоАт клонов 2Е1, 5С6 и 2В8 составило 117, 190,289 и 369 тысяч молекул МоАт на клетку в час при исходной концентрации лигандов 4 мкМ, соответственно. Таким образом, эндоцитоз МоАт клетками линии Яа^, как и в случае клеток Нер02 превосходил накопление АФП, но был более интенсивным, чем в клетках НерС2. Эти результаты свидетельствуют о наличии некоторых специфических особенностей как в организации РеАФП на клетках различных линий, так и в их функционировании.

Таким образом, РеАФП опухолевых клеток интенсивно эндоцитирует МоАт к РеАФП, что делает их использование, наряду с АФП, приемлемым для создания препаратов для направленной терапии онкологических заболеваний. Учитывая более высокую аффинность (как было показано выше) и большую скорость эндоцитоза МоАт и, в первую очередь, клона 2В8 по сравнению с АФП, использование МоАт для направленной терапии и при

200

£ 150

х

Д

«Г 100 к

50

АФП

I

2Е1

I

1

5С6

1

ж

2В8

А

400 350 300

2 250 * 200 03

а 150

100 50

I

АФП

2

2Е1

I

5С6

2 Б

5ис. 5. Связывние при 0 С (1) и накопле \ФП, МоАт к РеАФП клонов 2Е 1, 5С6, I и и и и Нер02 (А) и На^ (Б).

2В8

ние при 37°С (2) и 2В 8 клетками

о

¡агностических исследованиях может оказаться более предпочтительным по сравнению с ФП.

Среди известных механизмов развития клеточной резистентности к действию ютивоопухолевых средств наиболее изученным является феномен множественной карственной устойчивости (МЛУ), проявляющейся нечувствительностью опухолевых еток к различным группам противоопухолевых препаратов. В основе развития МЛУ лежит перэкспрессия гена множественной лекарственной устойчивости тс!г1, в результате торой в клетках происходит увеличение уровня гликопротеина Pgpl70, функционирующего к АТФ-зависимый насос, удаляющий противоопухолевые препараты из цитоплазмы во еклеточную среду.

Механизм обращения МЛУ с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза конъюгатов противоопухолевых препаратов с белками-векторами определяется особенностями трансмембранного переноса в процессе эндоцитоза, когда коньюгаты оказываются внутри клетки в составе эндоплазматических везикул, формирующих ранние эндосомы, где и происходит постепенное освобождение цитотоксического препарата из конъюгата. По-видимому, эффективность преодоления функционирования Pgpl70 в значительной мере будет определяться количеством рецепторов белка-вектора на поверхности клеточной мембраны и скоростью эндоцитоза этого вектора.

В связи с этим, целью настоящей серии опытов явилось исследование количества рецепторов АФП на поверхности клеток линий SKOV3 и MCF-?*1 (аденокарциномы яичников и молочной железы человека) - чувствительных к доксорубицину, и на мембране резистентных вариантов тех же линий, полученных с помощью селекции по устойчивости к доксорубицину - SKVLB и MCF-7Adr, а также скорости рецептор-опосредованного эндоцитоза через РеАФП этих клеток. Для определения количества рецепторов АФП и их функциональной активности использовали МоАт к РеАФП клона 2В8.

Среднее количество рецепторов АФП на резистентных клетках аденокарциномы молочной железы линии MCF-7Adr и карциномы яичника SKVLB превышало количество таких рецепторов на чувствительных клетках аденокарциномы молочной железы линии MCF-7м и карциномы яичника SKOV3 и составляло 230 тысяч и 90 тысяч для клеток MCF-7Adr и MCF-7"1 и 280 тысяч и 141 тысячу для клеток SKVLB и SKOV3, соответственно.

При исследовании рецептор-опосредованного эндоцитоза клетки инкубировали в течение часа с меченными ФИТЦ МоАт к РеАФП клона 2В8 в концентрации 500 нМ при 37°С. Скорость эндоцитоза оценивали по разности значения связавшихся и эндоцнтированных молекул при 37°С и значения связавшихся молекул при 4°С (Рис. б). Скорость эндоцитоза МоАт клона 2В8 клетками аденокарциномы молочной железы MCF-7Adr превосходила этот показатель для клеток линии MCF-7*1. Скорость эндоцитоза этих же антител клетками карциномы яичника линий SKVLB и SKOV3 также была более высокой для резистентной линии. Полученные результаты позволяют сделать вывод о существенном увеличении не только экспрессии РеАФП, но и его функциональной активности на опухолевых клетках при развитии у них резистентности к противоопухолевым препаратам.

Таким образом, обнаруженное ранее (Moskaleva E.Yu. et al. 1997) явление преодоления лекарственной устойчивости опухолевых клеток при использовании АФП в качестве векторной молекулы для направленного транспорта объясняется не только поступлением препарата в резистентные клетки в результате другого механизма транспорта, но и благодаря

ч >> во

>>

и и 70

о U

ч ч во

о а

S о 50

о ч еа В" 40

о я "о 30

ЕГ 20

10

ШМСР-7м' 2 3x1 03моле кул/час/клетку 'МСР-?™' 1 8 х103м о л е кул /ч а с/клетку

А

120

ч >ч

>> «

м н 100 -

о о

ч ч

о «

S U

о ч га ¡Г 60 -

о я о 40 -

ег X

го -0 -

Рис 6.

K^jS KVLB 31x1 О3 моле кул/час/клетку SKOV3 1 5х103молекул/час/клетку

37 С

МоАтклона 2В8 резистентными (MCF-7 (A), SKVLB (Б)) и чувствительными (MCF-7 (A), SKOV3 (Б)) клетками.

более высокому уровню экспрессии РеАФЛ и более высокой скорости рецептор-опосредованного эндоцитоза при связывании специфического лиганда с РеАФП именно в резистентных опухолевых клетках.

Изучение влияния исследуемых МоАт на выживаемость опухолевых клеток и их чувствительность к действию цитотоксическнх лимфоцитов.

В случае использования МоАт на организменном уровне важно, чтобы они не оказывали цитотоксического эффекта. Используемые МоАт не должны оказывать и стимулирующего влияния на опухоль. Поэтому для изучения влияния МоАт к РеАФП на опухолевые клепси-мишени были поставлены специальные эксперименты.

При изучении влияния исследуемых МоАт на выживаемость опухолевых клеток при их инкубации с клетками в течение 72 часов не обнаружено ни ингибирования, ни стимуляции пролиферации клеток мыши (РЗ88 и В16) в присутствии различных концентраций МоАт к РеАФП, в то же время при инкубации этих МоАт с клетками карциномы яичников человека

линии SK0V3 обнаружено недостоверное снижение их выживаемости на 10-15% при концентрации МоАт 1 мкМ.

Таким образом, МоАт трех клонов in vitro оказывали незначительное ингибирующее действие на опухолевые клетки человека и не оказывали влияния на опухолевые клетки мыши. Цитотоксической активностью исследованные МоАт к РеАФП не обладали. При исследовании влияния МоАт к РеАФП на цитотоксическую активность лимфоцитов (спленоцитов) мыши линии С57В1аск в отношении опухолевых клеток линии В-16 обнаружили, что в присутствии МоАт клопов 2В8, 2Е1 и 5С6 в концентрации 200 нМ ЦТА спленоцитов возрастала на 5-20% (Рис. 7). Наиболее высокая ЦТА - 20% - обнаружена при использовании клона 2В8. Усиление ЦТА спленоцитов составило 3% для клона 2Е1 и 6% для клона 5С6. При сравнении стимулирующего влияния МоАт клона 2В8 на ЦТА спленоцитов мыши в отношении двух линий клеток В-16 и Р388 обнаружили более высокое усиление в отношении клеток меланомы мыши линии В-16 (Рис. 8), что может быть объяснено большим количеством сайтов связывания для МоАт к РеАФП на клетках данной линии по сравнению с клетками линии Р388 (Табл. 2,3).

Рис.7. Влияние различных клонов моноклональных антитеj к рецептору АФП на чувствительность клеток меланомы мыши линии В 16 к цитотоксическому действию спленоцит мыши линии С 57В lack. 1 - контрольные клетки-миш ени; 2-4 - клетки-миш ени перед добавлением спленоцитов инкубировали в течение 30 минут с моноклональными антителами клонов 2В8(2), 2Е1(3)или 5С6 (4).

<

н t?

1 о

2

о

20

3 0

4 О

Соотношение э ф ф е к т о р : м и ш е н ь

Рис.8. Влияние МоАт к РеАФП клон 2В8 на чувствительность клетком меланомы мыши линии В16 (1) и лимфолейкозамыши линии Р388 (2) к цигогоксическому действию спленоцитов мыши линии С57В1 и DBA/2, соответственно.

Аналогичные данные были получены при использовании в качестве клеток-мишеней легок карциномы яичника человека линии SKOV3, а в качестве клеток-эффекторов - МЛПК еловека (Рис. 9). При этом оказалось, что усиление антителозависимой активности !аблюдается только в определенном диапазоне концентраций (при 0.5 мкМ), в то время как ри увеличении концентрации МоАт до 1 мкМ наблюдается ингибирование ЦТА МЛПК в тношении опухолевых клеток. Эти результаты свидетельствуют о способности отдельных лонов МоАт к РеАФП активировать иммунную систему в отношении опухолевых клеток, днако при возрастании концентрации антител к РеАФП возможно блокирование ротивоопухолевой ЦТА МЛПК.

Таким образом, МоАт к РеАФП не обладают ЦТА в отношении опухолевых клеток, но казывают стимулирующее действие на ЦТА МЛПК человека и мьппи в отношении пухолевых клеток, в концентрации 0.2 - 0.5 мкМ, но угнетают ее при более высокой шцентрации (1 мкМ).

Резюмируя данные, полученные на культурах опухолевых и нормальных клеток in vitro гедует отметить, что все изученные МоАт к РеАФП, также как и АФП, связываются с гухолевыми клетками человека и мыши и не взаимодействуют со свежевыделенными шфоцитами периферической крови здоровых доноров. Исходя из того, что МоАт к РеАФП

А

Соотношение мишвнь:эф фактор

в

Рис. 9. Влияние различных клонов МоАт к РеАФП на чувствительность клеток карциномы яичника человека линии БКОУЗ к цитотоксическому действию мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека. (А) - МоАт клон 2В8, (Б) - клон 5С6, (В) - клон 2Е1

лона 2В8 связываются с АФП-узнающим участком рецептора, можно заключить, что они [аиболее специфично взаимодействуют с РеАФП и могут быть использованы для [ммуногистохимического выявления РеАФП на клетках нормальных и опухолевых тканей ¡еловека.

Иммуногистохимическое выявление РеАФП на клетках и срезах тканей.

В результате исследований, проведенных на гистологических препаратах опухолей еловека различных типов обнаружено, что МоАт к РеАФП наиболее интенсивно реагируют с пухолевыми клетками аденокарциномы молочной железы и опухолевыми клетками киррозного рака желудка как замороженных, так и залитых в парафин тканей. В этих случаях аблюдалось наиболее сильное и равномерное окрашивание опухолевых клеток при дновременном отсутствии реакции в соединительной ткани и клетках стромы и в имфоцитах. Интенсивное неравномерное окрашивание опухолевых клеток наблюдалось при бработке МоАт к РеАФП срезов папиллярной серозной цистаденомы пограничной токачественности, гепатоцеллюлярного рака, холангиоцеллюлярного рака и центрального ака легких. Умеренное и слабовыраженное неравномерное окрашивание опухолевых клеток 1оАт к РеАФП обнаружено на срезах серозной сосочковой цистаденокарциномы, уцинозной аденокарциномы толстого кишечника и доброкачественной миксомы сердца, эторая, как предполагают, происходит из эмбриональных зачатков предсердий. Все груктуры тканей нормального яичника, серозной сосочковой цистаденомы, нормальной гчени вне зоны опухоли, доброкачественного карциноида легких и нормального яфуркационного лимфоузла не окрашивались МоАт к РеАФП. Нужно отметить, что в 1учаях опухолей соединительная ткань и нормальные клетки стромы и инфильтрирующие мфовдты не окрашивались, поэтому в таблице приведена степень окрашивания только для гухолевых клеток. Во всех случаях интенсивно окрашивалась мембрана, перинуклеарная отасть и редко цитоплазма опухолевых клеток. Все подученные и описанные выше ¡зультаты суммированы в таблице 4.

Таким образом, обнаружено, что во всех изученных тканях экспрессия РеАФП имеет ;сто в клетках злокачественных опухолей и опухолевых клетках доброкачественной 1ухоли, происходящей из эмбриональных зачатков. В большинстве типов )брокачественных опухолевых клеток и в клетках нормальных тканей экспрессия РеАФП ■сутствует.

В заключение следует еще раз отметить, что МоАт к РеАФП клона 2В8 связываются с ФП-узнающим участком РеАФП и специфически связываются с поверхностью яовеческих опухолевых клеток in vitro. Эти МоАт могут быть использованы для

Таблица <

Экспрессия РеАФП в различных нормальных и опухолевых тканях по дашгы:

иммуногистохимического исследования с использованием МоАт к РеАФР (клон 2В8).

Тип опухоли Тип ткани и опухоли Интенсивно«

окрашивали!

Нормальные ткани Здоровый яичник 0

Нормальная печень вне зоны опухоли 0

Нормальный бифуркационный лимфоузел легкого 0

Доброкачественные Доброкачественный карциноид легкого 0

опухоли Серозная сосочковая цистаденома яичника 0

Добро качественная Миксома сердца ++

опухоль

эмбрионального

происхождения

Злокачественные Молодая скиррозная аденокарцинома желудка ++++

опухоли Аденокарцинома молочной железы 1 I I 1

Аденокарцинома толстой кишки -н-

Центральный рак легкого +++/++

Гепатоцеллюлярный рак ++/-Н-+

Холангиоцеллюлярный рак +++/++

Папиллярная серозная цистаденома пограничной +++

злокачественности

Серозная сосочковая цистаденокарцинома яичника

иммуногистохимического исследования срезов тканей как замороженных, так и залитых парафин. При иммуногистохимическом исследовании обнаружена экспрессия РеАФП н злокачественных, интенсивно пролиферирующих опухолевых клетках. На нормальных i доброкачественных опухолевых клетках экспрессия РеАФП отсутствует. Кроме тоге обнаружена экспрессия РеАФП на опухолевых клетках миксомы сердца, что подтверждает е эмбриональное происхождение. Полученные результаты позволяют полагать, чт радиоактивно меченные МоАт к РеАФП клона 2В8 могут быть использованы и для создали метода ранней диагностики рака с помощью радиосцинтиграфических исследований, коньюгаты этих антител или АФП с противоопухолевыми препаратами - для направленног транспорта.

Выводы.

1. МоАт к РеАФП человека клонов 5С6, 2В8 и 2Е1 специфически связываются с РеАФП н поверхности опухолевых клеток in vitro и не взаимодействуют с нормальными лимфоцитам периферической крови человека. МоАт клона 2В8 специфически связываются с АФП узнающим участком РеАФП.

МоАт к РеАФП человека интенсивно эндоцитяруются опухолевыми клетками и поэтому >гут бьггь использованы в качестве вектора для доставки в опухолевые клетки биологически тивных веществ.

Количество сайтов связывания АФП на опухолевых клетках, выявляемое с помощью МоАт РеАФП и АФП, совпадает, но различается для клеток разного происхождения (от 160 тысяч 1 млн). При этом, обнаружено несколько типов сайтов связывания и АФП и МоАт к АФП, различающихся по величине Kj.

Количество рецепторов АФП на резистентных клетках аденокарциномы молочной железы нии MCF-7Adr и карциномы яичника SKVLB, характеризующихся высоким уровнем гпрессии mdrl, превышает количество таких рецепторов на чувствительных клетках гнокарциномы молочной железы линии MCF-7wt и карциномы яичника линии SKOV3. Для резистентных опухолевых линий MCF-7Air и SKVLB обнаружена более высокая эрость рецептор-опосредованного эндоцитоза РеАФП, чем для чувствительных клеток 3F-7'*1 и SKOV3, что предопределяет эффективность использования направленного шспорта цитотоксических препаратов через РеАФП для обращения множественной дарственной устойчивости.

МоАт к РеАФП клона 2В8 пригодны для иммуногисто химического исследования :прессии РеАФП на срезах тканей как замороженных, так и залитых в парафин. На злокачественных, интенсивно пролиферирующих опухолевых клетках обнаружен сокий уровень экспрессия РеАФП, в то время как на нормальных клетках и зрокачественных опухолевых клетках экспрессия РеАФП отсутствует.

Практические рекомендации.

МоАт к РеАФП клона 2В8 целесообразно использовать для иммуногистохимического явления злокачественных клеток.

МоАт к РеАФП клона 2В8 могут быть использованы для разработки методов щонуклидной диагностики злокачественных опухолей.

vIoAt к РеАФП клона 2В8 могут быть использованы для разработки методов направленной 1алии злокачественных опухолей,

Список опубликованной литературы. SCaraulov A.V., Rodina A.V., Nitsvetov М.В., Posypanova G.A., Kolibaba L.G., Severin S.E., >ova O.N., Sologub V.K., Koromyslova I.A., Severin E.S. Momclonal antibodies to human AFP-receptor -le prcpaties and regulation of cdl finrfons. The 27th Meeting of the întanstiorci Society fer Onasdevdcpmaial fogy and Medicine ISOBM. 1999, P. 93.

2. Северин С.Е, Ницветов М.Б., Караулов A.B., Посыпанова Г.А., Родина A.B., Попова О.Н., Северин Е.С. Мшокюнатьные ашшела к рецапору АФП Псдаэды к иммунотерапии опухолей. Russian J. Immunol. Тезисы докл. 2-го съезда иммунологов Рооаш. 1999. V. 4, Siçpl. 1, Р. 6®.

3. Е.С.Северин, М.Б.Ницветов, Е.Ю.Москалева, В.К. Сологуб, Ю.В.Белоусова, И.А. Коромыслова, А.В.Родана, А.В.Караулов. Изучение возможности использования моноклональных антител к рецептору альфа-фетопротеина для регуляции противоопухолевого иммунитета. Вторая международная ассамблея "Новые медицинские технологии". Аптека - 2000. Москва. 2000, С. 68-69.

4. Ницветов М.Б., Родина A.B., Москалева Е.Ю. и др. Характеристика моноклональных антител к рецептору АФП в сравнении с АФП по их взаимодействию с опухолевыми клетками человека. Вопр. Биол. Мед. и Фарм. Хим. 2001, №3, С.19 - 25.

5. С.Е. Северин, A.B. Родина, М.Б. Ницветов, Д.В. Астахов, H.A. Коваленко, Е.Ю. Москалева, Г.А. Посыпанова, О.Н. Попова, В.К. Сологуб, И.А. Коромыслова, И.И. Шмырев, A.B. Караулов. Регуляция противоопухолевой активности с помощью моноклональных антител к рецептору альфа-фетопротеина и иммунизации этим белком. Russian Journal of Immunology. 2001, V. 6, N.3, P. 249-257.

6. Ницветов М.Б. Караулов A.B., Москалева Е.Ю., Родина A.B., Посыпанова Г.А., Сологуб В.К., Попова О.Н., Шмырев И.И., Северин С.Е., Северин Е.С. Моноклональные антитела к рецептору альфа-фетопротеина. Возможность иммунодиагностики, иммунопрофилактики и иммунотерапии онкологических заболеваний. Материалы H Российской конференции молодых ученых с международным участием. 24-27 апреля 2001., Москва, Т.1, С. 185.

7. Nitsvetov М.В., Rodina A.V., Severin S.E., Popova O.N.,Posypanova G.A., Sologub V.K., Koromyslova I.A., Sotnichenko A.I., Belousova Yu.V., Severin E.S. Monoclonal antibodies to the AFP receptor and their activity. Biomarcers and enviroment. 2001, V. 4, N. 1,2, P. 51.

8. М.Б.Ницветов, Е.Ю.Москалева, Л.В.Сладкова, А.В.Родана, Г.А.Посыпанова, О.НЛопова, В.К.Сологуб, А.В.Караулов, С.Е.Северин, Е.С.Северин. Анализ количества и активности рецепторов АФП на чувствительных и резистентных опухолевых клетках и преодоление множественной лекарственной устойчивости с помощью направленного транспорта доксорубицина через рецептор АФП. I Всероссийская научно-практическая конференция "Биотерапия рака". Москва. 2002, С.73.

9. Ницветов М.Б., Москалева Е.Ю., Макарова О.В., Сладкова Л.В., Родина A.B., Посыпанова Г.А., Попова О.Н., Сологуб В.К., Коромыслова И.А., Караулов A.B., Северин С.Е., Северин Е.С. Выявление рецептора АФП с помощью иммуногистохимического окрашивания моноклональными антителами. 5-й Конгресс "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии". Москва. 2002, С. 106.

10. Ницветов М.Б., Москалева Е.Ю., Сладкова Л.В., Родина A.B., Посыпанова Г.А., Попова О.Н., Коромыслова И.А., Караулов A.B., Северин С.Е., Северин Е.С. Характеристика чувствительных и резистентных к доксорубицину опухолевых клеточных линий по уровню экспрессии рецептора альфа-фетопротеина и способности к рецептор-опосредованному эндоцитозу. Молекулярная медицина. 2003, N.2, с.57 - 60.

11. М.Б.Ницветов, Е.Ю.Москалева, Г.А. Посыпанова, О.В.Макарова, В.А.Степанов, К.А.Рогов, О.Н.Попова, В.К.Сологуб, И.А.Коромыслова, А.В.Караулов, С.Е.Северин, Е.С.Северин. Экспрессия РеАФП в опухолевых и нормальных тканях человека. Материалы 3 научной конференции и школы-семинара для молодых ученых "Белки-маркеры патологических состояний". Астрахань-Москва. 2003, С. 14- 19.