Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка иммобилизованных лекарственных форм доксорубицина и методик его анализа

На правах рукописи

Карпенко Елена Николаевна

РАЗРАБОТКА ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ ДОКСОРУБИЦИНА И МЕТОДИК ЕГО АНАЛИЗА

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия 15.00.01 - фармацевтическая технология и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Курск - 2004

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской федерации»

Научные руководители:

доктор биологических наук, чл.-корр. РАЕН, профессор Сипливая Любовь Евгеньевна

доктор фармацевтических наук, профессор Ерофеева Лия Никифоровна Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Базарный Валентин Леонтьевич кандидат фармацевтических наук Дурицын Евгений Петрович

Ведущее учреждение:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Защита состоится «__/£_» 2004 года в /V часов

на заседании диссертационного совета К 208.039.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации» (305041, Курск, ул. Карла Маркса 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации» (305041, Курск, ул. Карла Маркса 3).

Автореферат разослан «_//_»_(ДДс^ 2004 Г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Пашин Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Злокачественные новообразования являются второй (после заболеваний сердечно-сосудистой системы) ведущей причиной смертности в нашей стране и за рубежом. Одним из основных методов лечения онкологических больных является химиотерапия. Большинство схем комбинированного лечения злокачественных новообразований включает противоопухолевый антибиотик доксорубицин, обладающий, наряду с высокой эффективностью и широким спектром противоопухолевого действия, высокой системной токсичностью. В связи с этим перспективным направлением в терапии злокачественных новообразований является создание иммобилизованных лекарственных форм доксорубицина, обеспечивающих органоспецифичность и снижение общей токсичности антибиотика.

С точки зрения биологической совместимости, наиболее выгодны системы доставки, в которых используются собственные клетки организма (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты), которые обеспечивают целенаправленную доставку лекарственного средства в определенные органы и ткани с созданием в них высоких терапевтических концентраций, снижают возможность возникновения побочных реакций от проникновения препаратов в здоровые ткани организма.

Для лечения злокачественных новообразований местной локализации рационально создание систем с определенными конструктивными особенностями, позволяющими депонировать действующее вещество в заданном временном интервале и сократить до минимума токсичность лекарственного средства. Примером таких систем являются биорастворимые лекарственные пленки, широкое применение которых открыло новые возможности для использования как новых, так и давно известных лекарственных средств.

Количественное определение доксорубицина согласно нормативной документации проводят микробиологическим методом диффузии в агар, который характеризуется большой трудоемкостью и длительностью, а его воспроизводимость в значительной степени зависит от состояния тест-культуры и качества

питательной среды. Для количественного определения доксорубицина в полимерных пленках и эритроцитарных носителях микробиологический метод имеет ограниченную пригодность, в связи с чем возникла необходимость разработки доступных, экспрессных и легковоспроизводимых методик анализа'анти-биотика в предложенных лекарственных формах: Известные методики количественного определения доксорубицина требуют дорогостоящего оборудования и реактивов, обладают низкой чувствительностью, селективностью и сложны в исполнении. В связи с этим разработка иммобилизованных лекарственных форм доксорубицина и экспрессных, точных методик его анализа является весьма актуальной.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилась разработка методик анализа доксорубицина в субстанции, лиофилизированном порошке и крови с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. (ВЭЖХ), разработка иммобилизованных лекарственных форм доксорубицина (эритроцитарные носители и полимерные пленки) и методик их анализа. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать более чувствительные, селективные и простые методики количественного определения доксорубицина в субстанции, лиофилизирован-ном порошке и крови с помощью метода ВЭЖХ.

2. Изучить особенности включения доксорубицина в эритроцитарные носители, их стабильность, разработать методику количественного определения антибиотика, инкапсулированного в эритроцитарные носители.

3. Теоретически обосновать и экспериментально установить оптимальный состав лекарственных пленок с доксорубицином и разработать технологию их изготовления.

4. Разработать методики качественного и количественного определения доксорубицина в пленках, изучить стабильность полученной лекарственной формы в процессе хранения.

5. Изучить влияние доксорубицина, иммобилизованного в пленках, на ткани слизистой оболочки полости рта.

Научная новизна исследований. Разработаны более чувствительные, селективные и простые методики количественного определения доксорубицина в субстанции, лиофилизированном порошке и крови с помощью метода ВЭЖХ. Впервые определены оптимальные условия выделения доксорубицина из биологического материала с помощью колоночного варианта гель-хроматографии.

Установлены оптимальные условия включения доксорубицина в эрит-роцитарные носители, разработана методика спектрофотометрического определения антибиотика, инкапсулированного в эритроцитарные носители; определены сроки их хранения.

Впервые теоретически обоснован и экспериментально установлен качественный и количественный состав полимерных пленок с доксорубицином для лечения местно локализованных злокачественных опухолей слизистых оболочек. Разработаны точные методики качественного (тонкослойная хроматография) и количественного (спектрофотометрия) анализа антибиотика в полимерных пленках. Установлено незначительное цитотоксическое действие доксору-бицина на здоровые ткани слизистой оболочки полости рта в месте аппликации пленок, определено количественное содержание несвязанного антибиотика в тканях слизистой оболочки.

Новизна результатов исследования отражена в заявке (№ 2003137539 от 25.12.2003 г.) о выдаче патента на изобретение "Иммобилизованная форма доксорубицина".

Практическая значимость. Получены иммобилизованные лекарственные формы доксорубицина: полимерные пленки и эритроцитарные носители. Разработаны чувствительные и экспрессные методики количественного определения антибиотика в разработанных лекарственных формах и крови. Установлено незначительное цитотоксическое действие доксорубицина, иммобилизованного в пленках, на здоровые ткани слизистой оболочки полости рта в месте аппликации. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- методика количественного определения доксорубицина в субстанции (акты о внедрении в научный процесс кафедр Курского государственного медицинского университета (КГМУ): фармацевтической, химии. № 99 от

10.04.2003 г., органической химии № 99/2 от 15.01.2003 г.; практическую деятельность МУЗ «ЦКК и СЛС» № 99/1 от 23.12.2002 г.);

- методика количественного определения доксорубицина в лиофилизиро-ванном порошке (акты о внедрении в научный процесс кафедры фармацевтической химии КГМУ № 100 от 10.04.2003 г.; практическую деятельность МУЗ «ЦКК и СЛС» № 100/1 от 23.12.2002 г.);

- методика количественного определения доксорубицина в крови (акты о внедрении; в научный процесс кафедр КГМУ: фармацевтической химии-№ 101/1 от 15.10.2003 г., биологической химии № 101/2 от 8.12.2002 г. и клинической фармакологии № 101 от 11.02.2003 г.);

- состав, показатели качества, методики анализа и технология полимерных пленок с доксорубицином (проект ФСП, лабораторный регламент «Производство пленок с доксорубицином» (акт апробации № 139 в лаборатории кафедры фармацевтической технологии КГМУ от 23.03.2004 г.), методические рекомендации «Изготовление и контроль качества пленок с доксорубицином», акт о внедрении в научный процесс кафедры фармацевтической технологии КГМУ № 104 от 17.12.2002 г.);

- методика количественного анализа доксорубицина в пленках (акт о внедрении в научно-исследовательский процесс кафедры фармацевтической химии КГМУ № 105 от 26.03.2003 г.);

- модифицированная методика включения доксорубицина в эритроцитар-ные носители- (удостоверение на рационализаторское предложение КГМУ «Способ включения антибиотиков в эритроцитарные носители на примере доксорубицина» № 1602-04 от 20.01.2004 г., акты о внедрении в научно-исследовательский процесс кафедр КГМУ: фармацевтической технологии № 103/1 от 12.11.2002 г. и биологической химии № 103 от 16.10.2002 г.);

- методика количественного определения доксорубицина, инкапсулированного в эритроцитарные носители (акты о внедрении в научно-исследовательский процесс кафедр КГМУ: фармацевтической химии № 102 от 18.02.2003 г. и биологической химии № 102/1 от 16.10.2002 г.).

Связь исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного совета № 47 РАМН. Номер государственной регистрации 01.200.208415.

Основные положения выносимые на защиту:

- методики количественного определения доксорубицина в субстанции, лиофилизированном порошке и крови с использованием метода ВЭЖХ;

- методика включения доксорубицина в эритроцитарные носители;

- спектрофотометрическая методика количественного определения док-сорубицина, инкапсулированного в эритроцитарные носители;

- состав и технология полимерных пленок с доксорубицином;

- методики качественного и количественного анализа доксорубицина в полимерных пленках.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и представлены на IX и X Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва 2002, 2003 гг.), 67-й и 68-й межвузовских научных конференциях студентов и молодых ученых (Курск 2002, 2003 г.), 67-й, 68-й и 69-й итоговых научных сессиях КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск 2002, 2003, 2004 гг.) и межкафедральной научно-практической конференции.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальных исследований, общих выводов и библиографического указателя. Работа иллюстрирована 41 таблицей и 24 рисунками. Список литературы включает 215 источников, из них 86 на, иностранных языках.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ»

В экспериментальных исследованиях использованы лекарственные и вспомогательные вещества, отвечающие требованиям действующей нормативной документации: доксорубицина гидрохлорид; оксипропилметилцеллюлоза (ОПМЦ); метил целлюлоза (МЦ); поливиниловый спирт (ПВС); глицерин; натрия хлорид; вода очищенная. Объектами исследования служили эритроциты, плазма крови, полученные от здоровых доноров, и кровь, полученная от экспериментальных животных (кролики).

РАЗРАБОТКА МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОКСО-РУБИЦИНА В СУБСТАНЦИИ, ЛИОФИЛИЗИРОВАННОМ ПОРОШКЕ И КРОВИ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА ВЭЖХ

Для выбора условий анализа доксорубицина методом ВЭЖХ рассмотрено хроматографическое поведение антибиотика в тонких слоях нормальнофазного и обращеннофазного сорбентов с применением 17 подвижных фаз различной полярности. Оптимальные условия хроматографирования были достигнуты при использовании подвижной фазы изопропанол-ацетатный буфер (рН=4,5) (3:7) и обращеннофазного сорбента. Исследования проводили в ультрафиолетовой области спектра. В качестве аналитической выбрана длина волны равная 290 нм, так как влияние соэкстрактивных веществ в данной области спектра минимально. Измерения осуществляли на жидкостном хроматографе "Water Alian" (USA) с детектором фото диодной матрицы на колонке размером 150*3,9 мм, заполненной сорбентом "Новопак Т-18". Скорость подачи элюента 0,7 мл/мин при-температуре колонки 37°С. Отдельные параметры хроматографирования и характеристики хроматографического пика свидетельствуют о соответствии хро-матографической системы критериям пригодности (рис. 1, табл. 1).

Рисунок 1. Хроматограмма субстанции доксорубицина.

Результаты хроматографирования доксорубицина и характеристики хроматографирования

Таблица 1

Время удерживания, мин Отклонение времени удерживания от среднего результата, % Стандартное отклонение площади лика, % (п=5) Фактор ассиметрни, Т,% Коэффициент распределения, к,

2,06 0,10 0,47 0,95 1,18

Установлено наличие прямопропорционалыюй зависимости между содержанием анализируемого вещества в хроматографируемой пробе и площадью хроматографического пика в интервале концентраций 0,01-0,6 мкг. Открываемый минимум доксорубицина составил 0,006 мкг в хроматографируемой пробе. По результатам хроматографирования отдельных проб рассчитывали уравнение калибровочного графика. На основании проведенных исследований разработаны методики количественного определения доксорубицина в субстанции, лио-филизированном порошке и крови.

Согласно нормативной документации биологическую активность доксо-рубицина в субстанции и лиофилизированном порошке оценивали микробиоло-

гическим методом диффузии в агар в сравнении с разработанной нами методикой ВЭЖХ. Установлено, что время определения по предлагаемой нами методике составляет 40 минут, а относительная ошибка определения не превышает ±1,43% и ±1,76% для субстанции и лиофилизированного порошка доксоруби-цина соответственно, в то время как продолжительность исследования методом диффузии в агар составляет 18 часов, а относительная ошибка определения составляет ±3,60% и ±4,80%.

Для количественного определения антибиотика в крови в опытах in vivo использовали кроликов, которым внутривенно вводили доксорубицин, предварительно растворенный в изотоническом растворе натрия хлорида, в количестве 5 мг. Выделение антибиотика из крови осуществляли путем осаждения белка с помощью 30%-го раствора трихлоруксусной кислоты, взятой в соотношении с биоматериалом 1:1. Дальнейшую очистку осуществляли методом гель-хроматографии с использованием колонки размером 110x9 мм, заполненной гелем марки «Сефадекс-10». Экспериментально установлено, что эффективно применение последовательного элюирования водой и 5%-м раствором уксусной кислоты. После упаривания в вакуумном испарителе элюат количественно переносили в мерную колбу, доводили до метки системой растворителей изопро-панол-ацетатный буфер (рН=4,5) (3:7) и проводили хроматографирование. Результаты исследований; показали, что относительная ошибка определения док-сорубицина в крови экспериментальных животных методом ВЭЖХ составляет ±7,53%.

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ВКЛЮЧЕНИЯ ДОКСОРУБИЦИНА В ЭРИТРОЦИТАРНЫЕ НОСИТЕЛИ

Для включения доксорубицина в эритроцитарные носители использовали методику, предложенную Ж.Ш, Жумадиловым и соавторами, которая имеет существенный недостаток - наблюдается неполный гемолиз эритроцитов вследствие нагревания взвеси в процессе центрифугирования, что делает невозможным включение лекарственного средства в эритроцитарные носители. Экспериментально установлено, что для достижения полноты гемолиза эритроцитов необходимо троекратное центрифугирование при 8000 об/мин в течение 10 минут с периодической сменой воды, охлажденной до 0°С (удостоверение на рационализаторское предложение КГМУ № 1602-04 от 20.01.2004 г.).

Для определения количества доксорубицина, инкапсулированного в эритроцитарные носители, разработана спектрофотометрическая методика. С целью выявления возможностей количественного анализа доксорубицина в эритроцитарных носителях изучен спектр поглощения водного раствора антибиотика. Обнаружено пять максимумов при длинах волн равных 234, 252, 288, 334, 475 и 495 нм. Так как максимум при длине волны равной 475 нм более специфичен, то данная длина волны была выбрана в качестве аналитической.

Определение количества доксорубицина, иммобилизованного в эритро-цитарные носители, производили после их разрушения с последующим осаждением белка с помощью 30%-го раствора трихлоруксусной кислоты Установлено, что спектр поглощения доксорубицина после включения в тени эритроцитов в видимой области не изменен. При проведении контрольного опыта показано отсутствие влияния поглощения балластных веществ на результаты количественного определения доксорубицина при аналитической длине волны равной 475 нм. Расчеты количества доксорубицина, включенного в эритроцитар-ные носители, проводили по уравнению калибровочного графика.

Время анализа по предлагаемой нами методике составило 40 минут, а относительная ошибка определения ±7,28%, в то время как продолжительность

исследований микробиологическим методом - 18 часов, а относительная ошибка определения ± 15,62% (табл. 2).

Таблица 2

Результаты количественного определения доксорубицина в субстанции и эритроцитарных носителях (п=10; Р=0,95)

Метрологические х арактеристики

Спектрофотометрнческий метод Микробиологическим метол

' Субстанция

Л"=0,050; 8=0,00084; А" =0,049; 8=0,0018;

в;=0,00037; 85=0,00081;

ЛГ±ЛЛ'=0,050±0,0010; Л"±Д Л'=0,049±0,0023

е=2,09% £=4,57%

Эритроцитарные носители

Х=0,019; 8=0,00130; А-=0,019; 8=0,00283;

Б -,=0,00053; Б-=0,00116;

Х±Д А"=0,0 19±0,00 14; Л"±Д 3^=0,019±0,00297;

£=7,28% е= 15,62%

С целью изыскания возможностей более рационального использования дорогостоящего химиотерапевтического средства изучено влияние на включение доксорубицина в эритроцитарные носители таких факторов, как количество и концентрация раствора для инкубации, время инкубации.

Установлено, что количество раствора доксорубицина для инкубации и время инкубации не оказывают существенного влияния на включение антибиотика в эритроцитарные носители (табл. 3,4).

Таблица 3

Включение доксорубицина в эритроцитарные носители в зависимости от количества раствора для инкубации (п=6; Р=0,95)

Количество раствора доксорубицина для инкубации, мл

1 2 4 5 10

0,021 ±0,0013 0,020±0,0015 0,019±0,0012 0,019±0,0011 0,019±0,0013

Таблица 4

Включение доксорубицина в эритроцитарные носители в зависимости от времени инкубации (п=6; Р=0,95)

Время инкубации, мин

Количество доксорубицина, мг 10 20 30 60

0,529±0,0274 0,524±0,0270 0,523±0,0266 0,516+0,0206

Поэтому рационально использовать объем раствора доксорубицина, равный объему аллогенных эритроцитов. Для предупреждения влияния разрушающих факторов на эритроцитарные носители выбрано время инкубации 10-20 минут. Концентрация раствора антибиотика, обеспечивающая максимальное включение доксорубицина в эритроцитарные носители составляет 2,5 мг/мл (рис. 2).

0,6-1

£

0 1 2 3 4 5 6

концентрация раствора доксорубиинна, мг/мл

Рисунок 2. Включение доксорубицина в эритроцитарные носители в зависимости от концентрации раствора антибиотика для инкубации.

Модифицированная нами методика состоит в следующем: 1 мл аллоген-ных эритроцитов отмывают изотоническим раствором натрия хлорида, центрифугируя при 3000 об/мин 5 минут, до получения прозрачного, бесцветного су-пернатанта. Отмытые эритроциты подвергают гемолизу путем троекратного добавления семикратного объема воды очищенной, охлажденной до 0°С, и цен-

трифугирования при 8000 об/мин по 10 минут. Полученные тени эритроцитов инкубируют в 1 мл водного раствора доксорубицина с концентрацией 2,5 мг/мл, полученном при растворении антибиотика в воде очищенной, охлажденной до 0°С. Взвесь выдерживают, в течение 10-20 минут при температуре (4±2)°С. Для восстановления целостности цитоплазматической мембраны добавляют 1/9 объема 9% раствора натрия хлорида и инкубируют 30 минут при (37±2)°С, после чего эритроцитарные носители дважды отмывают раствором натрия хлорида изотонического, центрифугируя при 8000 об/мин 10 минут.

С целью изучения устойчивости к возможной десорбции и выделению доксорубицина в кровеносном русле эритроцитарные носители с включенным доксорубицином дважды отмывали изотоническим раствором натрия хлорида и затем инкубировали в аутологичной плазме при температуре (37±2)°С в течение 0,5; 1;2;3;6; 10 и 24 часов.

90->

0) ЯП-

т

а>

% я 70-

У т-

о

л

со 50-

40-

30-

20-

10-

0-

О 5 10 15 20 25 30

Рисунок 3. Высвобождение доксорубицина из эритроцитарных носителей в плазму крови.

Результаты, представленные на рис. 3, показали, что происходит постепенное высвобождение доксорубицина из эритроцитарных носителей в плазму крови, которое через 0,5 часа составляет 19%, а через 10 часов достигает 75%.

Установлено, что свободные эритроцитарные носители сохраняют способность включать доксорубицин в течение 10-11 суток, а стабильность эрит-роцитарных носителей, с включенным доксорубицином, сохраняется трое суток при температуре (4±2)°С.

РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМЕРНЫХ ПЛЕНОК СДОКСОРУБИЦИНОМ

Концентрацию доксорубицина в пленках определяли, исходя из дозы для внутрипузырного введения, которая составила 0,15 мг/см2. В качестве полимеров-носителей использовали водорастворимые производные целлюлозы и поливиниловый спирт в сочетании с метилцеллюлозой.

Для идентификации компонентов пленок и изучения их стабильности, изучено хроматографическое поведение доксорубицина в разработанных нами системах растворителей на пластинках "Silufol ЦУ-254" (табл. 5).

Таблица 5

Значения Rfдоксорубицина в пленках и свидетелей

Скстема Свидетель. Пленки на основе ОПМЦ

1. Хлороформ-метанол-вода-11% р-р аммиака (16 6:1:1) 0,45 0,43

2. Метанол-11% р-р аммиака (8 2) 0,62 0,62

3. Этанол-11 % р-р аммиака (10 4) 0,55 0,53

4. Ацетон-бснзол-вода-11%р-р аммиака (1222 2) 0,46 0,41

5. Метанод-фосф буфер рН =7,4-ацетонитрил (3 5:3) 0,63 0,65

Примечание: величины Ш, представленные в таблице 5, имеют отклонения не более

±0,06.

С целью выявления возможностей количественного определения доксорубицина в пленках методом спектрофотометрии изучали спектры поглощения водных растворов субстанции доксорубицина, полимеров и пленок. Установлено, что спектры поглощения доксорубицина в растворах пленок аналогичны спектру поглощения доксорубицина в субстанции. В видимой области спектра оптическая плотность водных растворов полимеров близка к нулю, что свидетельствует об отсутствии их существенного влияния на результаты количест-

венного определения доксорубицина в пленках при аналитической длине волны равной 475 нм (максимум при данной длине волны более специфичен). Расчеты осуществляли по уравнению калибровочного графика. Результаты исследований представлены в табл. 6.

Таблица 6

Результаты количественного определения доксорубицина в пленках (п=6; Р=0,95)

Пленки на основах: Метрологические характеристики

Спектрофотометрический-метод Микробиологический метод

ОПМЦ ^=418,6; 82=46,3; в ¡=3,04; ¿^=8,46; 6=2,02% Х=417,4; 52=233,8; Б х=6,84; Д ЛТ = 19,01; 6=4,55%

мц Х=416,2, 82=94,7; Б -=4,35; Д Л" = 12,10, 6=2,91% •Л"=433,0; 82=407,5; 8 ¿=9,03; АЛГ=25,10; 6=5,80%

мц+пвс Х=429,2; 82=98,2; Б т=4,43; Д* = 12,32; 6=2,87% *=430,8; Э2=310,7; 85=7,88; д]г=21,91; 6=5,09%

На предлагаемых основах с учетом свойств входящих ингредиентов разработана технология изготовления полимерных пленок с доксорубицином, которая заключалась в получении полимерной композиции путем смешивания водных растворов полимера и доксорубицина до однородности, деаэрации, сушке при температуре 40-60°С, дозировании и упаковке в стерильные стеклянные флаконы для лекарственных средств, укупоренные "под обкатку". Пленки хранили при температуре (4±2)°С в защищенном от света месте (в холодильнике).

Выбор оптимального полимера-носителя проводили в три этапа: методом диализа через целлофан, с использованием официнального теста "Растворение" и методом диффузии в агар (рис. 4). Установлено, что максимальное равномерное высвобождение и растворение доксорубицина из пленок обеспечивает ОПМЦ, которая является оптимальным полимером-носителем для биорастворимых пленок с доксорубицином.

опмц мц мц+пвс

Я Метод диализа, % ■ Тест "Растворение", % П Метод диффузии в агар мм

Рисунок 4. Биофармацевтические исследования полимерных пленок с доксору-бицином.

Установлена стабильность пленок с доксорубицином на основе ОПМЦ в процессе хранения при температуре (4±2)°С в защищенном от света месте в течение 24 месяцев (срок наблюдения) (табл. 7).

Таблица 7

Результаты изучения стабильности пленок с доксорубицином в процессе хранения

Показатели качества пленок Пленки на основе ОПМЦ

свежеприготовленные 24 месяца хранения

Окраска ярко-красная ярко-красная

Средняя масса, г 0,0261 ±0,0027 0,0243 ± 0,0033

Потеря в массе при высушива-

нии, % 8,71 ± 1,35 7,48 ± 2,25

Растворимость, мин 10,0 ± 0,5 10,0 ±0,8

Количественное содержание, %

отн 102,87 ±1,97 101,40 ±2,76

Значение pH, ед 5,05 ±0,01 5,10 ±0,02

Адгезия, Н 0,99 ±0,04 1,00 ±0,08

Значения Rf в системах

метанол-11% р-р аммиака (8 2) 0,62 ±0,02 0,59 ±0,04

этанол-11% р-р аммиака (10 4) 0,53 ± 0,03 0,55 ±0,02

ацетон-бензол-вода-11% р-р ам-

миака (12 2 2 2) 0,41+0,03 0,40 + 0,03

метанол-фосфатный буфер рН=7,4

ацетонитрил (3 5 3)

0,65 ±0,04 0,65 ± 0,02

хлороформ-метанол-вода-11%

р-р аммиака (16 6 1 1) 0,43 ±0,01 0,38*0,06

Диаметр зон угнетения роста

Bacillus cereus var mycoides 537

(споры), мм 33,17 ±1,54 31,33 ± 1,07

Так как при попадании доксорубицина в окружающие ткани во время инфузии могут развиваться некрозы и флебиты, определяли цитотоксическое действие доксорубицина на слизистую оболочку полости рта в месте аппликации пленки. В результате гистологического исследования, которое проводили совместно с доцентом кафедры патологической анатомии, к м н. В.Т. Дудкой, установлено, что доксорубицин в пленках оказывает несущественное цитотоксическое воздействие на единичные клетки шиповатого слоя, которые полностью восстанавливаются через 5-7 дней (табл. 8).

Таблица 8

Результаты гистологического исследования ткани слизистой оболочки полости рта кролика в месте аппликации пленки с доксорубицином

Показатели гистологического строения Срок наблюдения, сут.

5 10 15 20 25

Назального слоя Норма Норма Норма Норма Норма

Слоя шиповатых клеток Норма Увеличение размера отдельных клеток Баллонная дистрофия отдельных клеток Истончение слоя Норма

Поверхностного слоя плоских клеток эпителия Норма Норма Норма Истончение слоя Норма

Поскольку терапевтическая эффективность препаратов тесно связана с их концентрацией в тестируемом биоматериале, определяли количество доксору-бицина в ткани слизистой оболочки полости рта. Установлено, что количество несвязанного доксорубицина в 1 см2 ткани слизистой оболочки полости рта в месте аппликации пленки составляет 27,22±3,32 мкг (136,1± 16,6 мкг/ г). При внутривенном введении на 1 см2 площади поверхности тела в среднем приходится 6,5-7,5 мкг антибиотика, поэтому очевидна эффективность разработанной иммобилизованной формы доксорубицина.

выводы

1. Определены оптимальные условия для высокоэффективной жидкостной хроматографии доксорубицина: подвижная фаза - изопропанол-ацетатный буфер (рН=4,5) (3:7), неподвижная фаза - обращеннофазный сорбент "Новопак Т-18". Разработаны методики ВЭЖХ для количественного определения доксо-рубицина в субстанции и лиофилизированном порошке для инъекций, относительные ошибки которых ±1,43% и ±1,76% для субстации и лиофилизирован-ного порошка соответственно.

2. Разработаны методики количественного определения доксорубицина с помощью метода ВЭЖХ в крови с использованием колоночного варианта гель-хроматографии для очистки биологического материала. Относительные ошибки определения ±4,79% и 7,53% для модельных смесей и крови экспериментальных животных соответственно.

3. Модифицирована методика включения химиотерапевтических препаратов в эритроцитарные носители. Установлены оптимальные условия иммобилизации доксорубицина в тени эритроцитов: объем раствора антибиотика для инкубации должен быть равен объему аллогенных эритроцитов, концентрация раствора доксорубицина - 2,5 мг/мл, время инкубации- 10-20 минут.

4. Разработана методика спектрофотометрического определения доксо-рубицина, инкапсулированного в эритроцитарные носители. Относительная ошибка определения ±7,28%. Установлено, что высвобождение доксорубицина из эритроцитарных носителей через 0,5 часа составляет 19%, а через 10 часов достигает 75%.

5. Установлено, что свободные эритроцитарные носители сохраняют способность включать доксорубицин в течение 10-11 суток, а эритроцитарные носители с доксорубицином стабильны в течение 3-х суток в условиях хранения при (4±2)°С.

6. Изготовлены полимерные пленки с доксорубицином, разработаны методики качественного (тонкослойная хроматография в 5 системах растворите-

лей) и количественного (спектрофотометрия в видимой области спектра при аналитической длине волны 475 нм) определения доксорубицина в полимерных пленках, относительная ошибка определения ±2,67%.

7. Установлен оптимальный состав лекарственных пленок с доксоруби-цином (содержание антибиотика - 0,15 мг/см2, оптимальный полимер-носитель-оксипропилметилцеллюлоза). Разработана технология их изготовления и установлена стабильность в течение 24 месяцев при температуре (4±2)°С.

8. Установлено незначительное цитотоксическое действие доксорубици-на, иммобилизованного в пленках, на здоровые ткани слизистой оболочки полости рта в месте аппликации. Содержание антибиотика в месте наложения пленки составило 27,22±3,32 мкг/см2 (136,1± 16,6 мкг/г) биологического материала, что достаточно для проявления терапевтического эффекта.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Разработка и исследование иммуномодулирующей активности пленок с доксорубицином / Л.Е. Сипливая, Л.Н. Ерофеева, Е.Н. Карпенко и др. // Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство» (8-12 апреля 2002 года, Москва). - М.: РЦ «Фармединфо», 2002. - С. 696.

2. Разработка спектрофотометрического определения доксорубицина в субстанции и лекарственных формах / Л.Е. Сипливая, Л.Н. Ерофеева, Е.Н. Карпенко и др. // Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство» (8-12 апреля 2002 года, Москва). - М.: РЦ «Фармединфо», 2002. - С. 696.

3. Сипливый, Г.В. Иммуномодулирующая и антиоксидантная активность антибиотиков, иммобилизованных в пленках / Г.В. Сипливый, А.В. Кукурека, Е.Н. Карпенко // Тр. 67-й итог. науч. сес. КГМУ и отд-ния мед.-биолог. наук Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН: В 2-х ч. - Ч. 1. - Курск, 2002. - С. 38-39.

4. Карпенко, Е.Н. Анализ полимерных лекарственных пленок с доксорубицином / Е.Н.Карпенко // Материалы 67-й межвузов, науч. конф. студентов и молодых ученых: В 2-х ч. - Ч. 2. - Курск, 2002. - С. 116.

5. Карпенко, Е.Н. Изучение возможности создания полимерных пленок с доксорубицином / Е.Н.Карпенко // Материалы 67-й межвузов, науч. конф. студентов и молодых ученых: В 2-х ч. - Ч. 2. - Курск, 2002. - С. 117.

6. Сипливый, Г.В. Сравнительная оценка иммуномодулирующей активности некоторых антибиотиков при различных технологиях введения / Г.В. Сипливый, А.В. Кукурека, Е.Н. Карпенко // Материалы 67-й межвузов, науч. конф. студентов и молодых ученых: В 2-х ч. - Ч. 2. - Курск, 2002.'- С. 228.

7. Карпенко, Е.Н. Изучение устойчивости водного раствора доксорубицина при воздействии различных факторов / Е.Н. Карпенко, Л.Н. Ерофеева, Л.Е. Си-пливая // Сб. 68-й итог. науч. сес. КГМУ и отд-ния мед.-биолог. наук Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН: В 2-х ч. - Ч. 2. - Курск, 2002. - С. 225-226.

8. Сравнительная характеристика микробиологического и спектрофотомет-рического методов количественного определения доксорубицина в полимерных пленках и модельных смесях / Е.Н. Карпенко, О.Д. Печенин, Л.Н. Ерофеева, Л.Е. Сипливая // Сб. 68-й итог. науч. сес. КГМУ и отд-ния мед.-биолог. наук Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН: В 2-х ч. - Ч. 2. - Курск, 2002. -С. 226-227.

9. Карпенко, Е.Н. Определение оптимального полимера-носителя при разработке полимерных лекарственных пленок с доксорубицином / Е.Н. Карпенко, Л.Н. Ерофеева, Л.Е. Сипливая // Сб. 68-й итог. науч. сес. КГМУ и отд-ния мед.-биолог. наук Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН: В 2-х ч. - Ч. 2. - Курск, 2002. - С. 224-225.

10. Разработка пленок с антибиотикамл для лечения ринитов и отитов / Л.Н. Ерофеева, С.З. Пискунов, НД. Афонина и др. // Курский науч.-практ. вести. «Человек и его здоровье». - 2002. - № 4. - С. 51-58.

11. Разработка рациональных лекарственных препаратов / Л.Н. Ерофеева, Н.Д. Афонина, Е.Н. Карпенко и др. // Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство» (7-11 апреля 2003 года, Москва). - М.: РЦ «Фармединфо», 2003. - С. 714.

12. Разработка препаратов для лечения воспалительных заболеваний / Л.Н. Ерофеева, Е.Н. Карпенко, Е.В. Кобзарева и др. // Рос. нац. конгр. «Человек

и лекарство» (7-11 апреля 2003 года, Москва). - М.: РЦ «Фармединфо», 2003. -С. 715.

13. Карпенко, Е.Н. Изучение возможности включения доксорубицина в эритроцитарные носители / Е.Н. Карпенко, Н.В. Штука// Материалы 68-й межвузов, науч. конф. студентов и молодых ученых: В 3-х ч, - Ч. 3.- Курск, 2003. -С.148.

14. Карпенко, Е.Н. Биофармацевтические исследования полимерных пленок с доксорубицином / Е.Н. Карпенко, Н.В. Штука // Материалы 68-й межвузов, науч. конф. студентов и молодых ученых: В 3-х ч. - Ч. 3. - Курск, 2003. -СЬ148.

15. Пленки с рифампицином для лечения ЛОР-заболеваний / Л.Н. Ерофеева, Н Д. Афонина, Е.Н. Карпенко // Фармация. - 2003. - № 4. - С. 23-25.

16. Изучение цитотоксического действия доксорубицина, иммобилизованного в пленках / В.Т. Дудка, Е.Н. Карпенко, Т.И. Ананьева, Г.В. Сипливый // Сб. раб. 69-й итог. науч. сес. КГМУ и отд-ния мед.-биолог. наук Центр,-Чернозем. науч. центра РАМН. - Курск, 2004.- С. 260-261.

17. Изучение устойчивости эритроцитарных носителей с доксорубицином / Е Н. Карпенко, Л.Е. Сипливая, Л Н. Ерофеева, Г.В. Сипливый // Сб. раб. 69-й итог. науч. сес. КГМУ и отд-ния мед.-биолог. наук Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН. - Курск, 2004. - С. 271-272.

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 06.04.2004 г. Подписано в печать 07.04.2004 г. Формат 30х42'/8 Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № ЗОА.

Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

ÜMO 70

Актуальность темы. Злокачественные новообразования являются второй (после заболеваний сердечно-сосудистой системы) ведущей причиной смертности в нашей стране и за рубежом. Одним из основных методов лечения онкологических больных является химиотерапия. Большинство схем комбинированного лечения злокачественных новообразований включает противоопухолевый антибиотик доксорубицин, обладающий наряду с высокой эффективностью и широким спектром противоопухолевого действия, высокой системной токсичностью. В связи с этим перспективным направлением в терапии злокачественных новообразований является создание иммобилизованных лекарственных форм доксорубицина, обеспечивающих органоспецифичность и снижение общей токсичности антибиотика.

С точки зрения биологической совместимости, наиболее выгодны системы доставки, в которых используются собственные клетки организма (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты), которые обеспечивают целенаправленную доставку лекарственного средства в определенные органы и ткани с созданием в них высоких терапевтических концентраций, снижают возможность возникновения побочных реакций от проникновения препаратов в здоровые ткани организма.

Для лечения злокачественных новообразований местной локализации рационально создание систем с определенными конструктивными особенностями, позволяющими депонировать действующее вещество в заданном временном интервале и сократить до минимума токсичность лекарственного средства. Примером таких систем являются биорастворимые лекарственные пленки, широкое применение которых открыло новые возможности для использования как новых, так и давно известных лекарственных средств.

Количественное определение доксорубицина согласно нормативной документации проводят микробиологическим методом диффузии в агар, который характеризуется большой трудоемкостью и длительностью, а его воспроизводимость в значительной степени зависит от состояния тест-культуры и качества питательной среды. Для количественного определения доксорубицина в полимерных пленках и эритроцитарных носителях микробиологический метод имеет ограниченную пригодность, в связи с чем возникла необходимость разработки доступных, экспрессных и легко воспроизводимых методик анализа антибиотика в предложенных лекарственных формах. Известные методики количественного определения доксорубицина требуют дорогостоящего оборудования и реактивов, обладают низкой чувствительностью, селективностью и сложны в исполнении. В связи с этим разработка иммобилизованных лекарственных форм доксорубицина и экспрессных, точных методик его анализа является весьма актуальной.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилась разработка методик анализа доксорубицина в субстанции, лиофилизированном порошке и крови с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), разработка иммобилизованных лекарственных форм доксорубицина (эритроцитарные носители и полимерные пленки) и методик их анализа. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать более чувствительные, селективные и простые методики количественного определения доксорубицина в субстанции, лиофилизированном порошке и крови с помощью метода ВЭЖХ.

2. Изучить особенности включения доксорубицина в эритроцитарные носители, их стабильность, разработать методику количественного определения антибиотика, инкапсулированного в эритроцитарные носители.

3. Теоретически обосновать и экспериментально установить оптимальный состав лекарственных пленок с доксорубицином и разработать технологию их изготовления.

4. Разработать методики качественного и количественного определения доксорубицина в пленках, изучить стабильность полученной лекарственной формы в процессе хранения.

5. Изучить влияние доксорубицина, иммобилизованного в пленках, на ткани слизистой оболочки полости рта.

Научная новизна исследований. Разработаны более чувствительные, селективные и простые методики количественного определения доксорубицина в субстанции, лиофилизированном порошке и крови с помощью метода ВЭЖХ. Впервые определены оптимальные условия выделения доксорубицина из биологического материала с помощью колоночного варианта гель-хроматографии.

Установлены оптимальные условия включения доксорубицина в эрит-роцитарные носители, разработана методика спектрофотометрического определения антибиотика, инкапсулированного в эритроцитарные носители, определены сроки их хранения.

Впервые теоретически обоснован и экспериментально установлен качественный и количественный состав полимерных пленок с доксорубицином для лечения местно локализованных злокачественных опухолей слизистых оболочек. Разработаны точные методики качественного (тонкослойная хроматография) и количественного (спектрофотометрия) анализа антибиотика в полимерных пленках. Установлено незначительное цитотоксическое действие доксорубицина на здоровые ткани слизистой оболочки полости рта в месте аппликации пленок, определено количественное содержание несвязанного антибиотика в тканях слизистой оболочки.

Новизна результатов исследования отражена в заявке (№ 2003137539 от 25.12.2003 г.) о выдаче патента на изобретение "Иммобилизованная форма доксорубицина".

Практическая значимость. Получены иммобилизованные лекарственные формы доксорубицина: полимерные пленки и эритроцитарные носители. Разработаны чувствительные и экспрессные методики количественного определения антибиотика в разработанных лекарственных формах и крови. Установлено незначительное цитотоксическое действие доксорубицина, иммобилизованного в пленках, на здоровые ткани слизистой оболочки полости рта в месте аппликации. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- методика количественного определения доксорубицина в субстанции (акты о внедрении в научный процесс кафедр Курского государственного медицинского университета (КГМУ): фармацевтической химии №99 от 10.04.2003 г., органической химии №99/2 от 15.01.2003 г. и практическую деятельность МУЗ «ЦКК И СЛС» №99/1 от 23.12.2002 г.);

- методика количественного определения доксорубицина в лиофилизированном порошке (акты о внедрении в научный процесс кафедры фармацевтической химии КГМУ №100 от 10.04.2003 г. и практическую деятельность МУЗ «ЦКК И СЛС» №100/1 от 23.12.2002 г.);

- методика количественного определения доксорубицина в крови (акты о внедрении в научный процесс кафедр КГМУ: фармацевтической химии №101/1 от 15.10.2003 г., биологической химии №101/2 от 8.12.2002 г. и клинической фармакологии №101 от 11.02.2003 г.);

- состав, показатели качества, методики анализа и технология полимерных пленок с доксорубицином (проект ФСП, лабораторный регламент «Производство пленок с доксорубицином» (акт апробации №139 в лаборатории кафедры фармацевтической технологии КГМУ от 23.03.2004 г.), методические рекомендации «Изготовление и контроль качества пленок с доксорубицином», акт о внедрении в научный процесс кафедры фармацевтической технологии КГМУ №104 от 17.12.2002 г.);

- методика количественного анализа доксорубицина в пленках (акт о внедрении в научно-исследовательский процесс кафедры фармацевтической химии КГМУ №105 от 26.03.2003 г.);

- модифицированная методика включения доксорубицина в эритроцитарные носители (удостоверение на рационализаторское предложение КГМУ «Способ включения антибиотиков в эритроцитарные носители на примере доксорубицина» №1602-04 от 20.01.2004 г., акты о внедрении в научно-исследовательский процесс кафедр КГМУ: фармацевтической технологии №103/1 от 12.11.2002 г. и биологической химии №103 от 16.10.2002 г.);

- методика количественного определения доксорубицина, инкапсулированного в эритроцитарные носители (акты о внедрении в научно-исследовательский процесс кафедр КГМУ: фармацевтической химии №102 от 18.02.2003 г. и биологической химии №102/1 от 16.10.2002 г.).

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и представлены на: IX и X Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва 2002, 2003 г.г.), 67-й и 68-й межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых (Курск 2002, 2003 г.), 67-й, 68-й и 69-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск 2002, 2003, 2004 г.г.) и межкафедральной научно-практической конференции.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ.

Связь исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного совета № 47 РАМН. Номер государственной регистрации 01.200.208415.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальных исследований, общих выводов и библиографического указателя. Работа иллюстрирована 41 таблицей и 24 рисунками. Список литературы включает 215 источников, из них 86 на иностранных языках.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1.Определены оптимальные условия для высокоэффективной жидкостной хроматографии доксорубицина: подвижная фаза - изопропанол-ацетатный буфер (рН=4,5) (3:7), неподвижная фаза - обращеннофазный сорбент "Новопак Т-18". Разработаны методики ВЭЖХ для количественного определения доксорубицина в субстанции и лиофилизированном порошке для инъекций, относительные ошибки которых ±1,43 % и ±1,76 % для субстации и лиофилизирован-ного порошка соответственно.

2. Разработаны методики количественного определения доксорубицина с помощью метода ВЭЖХ в крови с использованием колоночного варианта гель-хроматографии для очистки биологического материала. Относительные ошибки определения ±4,79 % и 7,53 % для модельных смесей и крови экспериментальных животных соответственно.

3. Модифицирована методика включения химиотерапевтических препаратов в эритроцитарные носители. Установлены оптимальные условия иммобилизации доксорубицина в тени эритроцитов: объем раствора антибиотика для инкубации должен быть равен объему аллогенных эритроцитов, концентрация раствора доксорубицина - 2,5 мг/мл, время инкубации - 10-20 минут.

4. Разработана методика спектрофотометрического определения доксорубицина, инкапсулированного в эритроцитарные носители. Относительная ошибка определения ±7,28 %. Установлено, что высвобождение доксорубицина из эритроцитарных носителей через 0,5 часа составляет 19 %, а через 10 часов достигает 75 %.

5. Установлено, что свободные эритроцитарные носители сохраняют способность включать доксорубицин в течение 10-11 суток, а эритроцитарные носители с доксорубицином стабильны в течение 3-х суток в условиях хранения при (4±2)°С.

6. Изготовлены полимерные пленки с доксорубицином, разработаны методики качественного (тонкослойная хроматография в 5 системах растворителей) и количественного (спектрофотометрия в видимой области спектра при аналитической длине волны 475 нм) определения доксорубицина в полимерных пленках, относительная ошибка определения ±2,67 %.

7. Установлен оптимальный состав лекарственных пленок с доксорубицином (содержание антибиотика - 0,15 мг/см2, оптимальный полимер-носитель - оксипропилметилцеллюлоза). Разработана технология их изготовления и установлена стабильность в течение 24 месяцев при температуре (4±2)°С.

8. Установлено незначительное цитотоксическое действие доксорубицина, иммобилизованного в пленках, на здоровые ткани слизистой оболочки полости рта в месте аппликации. Содержание антибиотика в месте наложения

•у пленки составило 27,22 ± 3,32 мкг/см (136,1±16,6 мкг/ г) биологического материала, что достаточно для проявления терапевтического эффекта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ литературных данных показывает, что антрациклиновые антибиотики, в частности доксорубицин, находят широкое применение в полихимиотерапии злокачественных новообразований. Доксорубицин характеризуется широким спектром противоопухолевого действия и высокой эффективностью, действуя на генетический аппарат опухолевой клетки. Основным недостатком антибиотика является высокая системная токсичность при внутривенном пути введения (кардиотоксичнность, угнетение костномозгового кроветворения, нарушения со стороны желудочно-кишечного тракта и др.).

Для снижения общей токсичности и обеспечения целенаправленного действия доксорубицина перспективным является разработка иммобилизованных лекарственных форм: лекарственных пленок для местного лечения опухолей слизистых оболочек и эритроцитарных носителей для лечения злокачественных новообразований печени и селезенки.

Количественное определение доксорубицина в субстанции и лиофилизи-рованном порошке проводят фармакопейным методом диффузии в агар, который имеет ряд существенных недостатков - трудоемкость, длительность, неспецифичность, низкая воспроизводимость. Известные методики требуют дорогостоящего оборудования и реактивов, обладают низкой чувствительностью, селективностью и сложны в исполнении.

В связи с этим актуальной является разработка иммобилизованных лекарственных форм доксорубицина и экспрессных, точных методик его определения в лекарственных препаратах и биологическом материале.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

Были использованы лекарственные и вспомогательные вещества, отвечающие требованиям соответствующей действующей нормативной документации (НД):

-Доксорубицина гидрохлорид ЛЕНСфарм (Россия) (ФС 42 -3374-97)

-Натрий-карбоксиметилцеллюлоза (ТУ 6-55-39-90)

-Оксипропилметилцеллюлоза (ВФС 42-187-73)

-Метилцеллюлоза (ТУ 64-11-129-92)

-Поливиниловый спирт (ФС 42-2299-86)

-Глицерин (ФС 42-2202-99)

-Натрия хлорид (ФС 42-2572-95)

-Вода очищенная (ФС 42-2619-97)

Объектами исследования служили эритроциты и плазма крови, полученные от здоровых доноров и кровь, полученная от экспериментальных животных. Экспериментальные исследования выполнены на кроликах массой 2-2,5 кг. В опытах использовали животных, прошедших карантинный режим в условиях вивария Курского государственного медицинского университета и не имеющих видимых заболеваний. Животные содержались на обычном кормовом рационе вивария.

2.2. Методы исследования

2.2.1. Исследование лекарственных пленок с доксорубицином

Исходя из современных требований к лекарственным препаратам, при разработке технологии и в процессе хранения контролировались такие показатели полимерных пленок как внешний вид (окраска, прозрачность, однородность), размеры (толщина, длина, ширина), средняя масса, потеря в массе при высушивании, значение рН водного раствора, растворимость, подлинность, количественное содержание, микробиологическая чистота.

Окраску пленок и прозрачность оценивали визуально.

Среднюю массу пленок определяли путем взвешивания десяти разовых доз на аналитических весах типа BJIP-200. Допустимым считали отклонение от средней массы ±10 %.

Потерю в массе при высушивании определяли согласно ГФ XI издания (вып.1, с.176) путем высушивания 10 разовых доз при температуре (102 ± 2) °С до постоянной массы. Потеря в массе не должна превышать ±10 %.

Значение рН водных растворов (1 пленку в 10 мл воды) определяли согласно ГФ XI издания (вып. 1, с. 113-115) на иономере универсальном марки ЭВ-74.

Адгезию пленок определяли с помощью методики предложенной П.Г. л

Мизиной [120]. Для этого 1 см пленки помещали на предметное стекло, добавляли каплю воды и накрывали другим предметным стеклом, на которое помещали груз массой 100 г на 10 секунд. Затем на чашку весов добавляли гири до отрыва верхнего предметного стекла и рассчитывали силу отрыва по формуле:

F = m х а, где F - сила отрыва, Н; m - масса воды, кг; а - ускорение свободного падения, м/с2.

Растворимость пленок характеризовало время полного растворения 1 см пленки в 5 мл воды очищенной при температуре (20 ± 2)°С при периодическом встряхивании.

Размеры (толщина, длина, ширина) пленки (мм) измеряли с помощью штангенциркуля.

Подлинность и наличие продуктов разложения определяли методом тонкослойной хроматографии на пластинках "Silufol UV-254" в пяти системах растворителей.

Количественное определение доксорубицина проводили методом спек-трофотометрии в видимой области. Оптическую плотность раствора измеряли на спектрофотометре СФ-2000.

Антимикробную активность оценивали по зонам угнетения роста тест-микроорганизма Bacillus cereus var.mycoides 537(споры) методом диффузии в агар [26,42].

Биофармацевтическую оценку пленок с доксорубицином проводили методом диализа через мембрану - целлофан толщиной 0,025 ± 0,002 мм, с помощью теста "Растворение" в приборе "Вращающаяся корзинка» и в опытах in vivo методом диффузии в агар [42].

Микробиологическую чистоту определяли согласно изменению к статье ГФ XI изд. (вып.2, с. 187-191) с использованием метода мембранной фильтрации.

2.2.2. Включение доксорубицина в эритроцитарные носители

Выделение аллогенных эритроцитов. Эритроциты получали в растворе Олсвера и хранили при 4°С. Перед употреблением эритроциты центрифугировали при 3000 об/мин, удаляли надосадочную жидкость и верхнюю лейкоцитарную пленку. Полученный осадок эритроцитов ресуспендировали в 0,15 М растворе натрия хлорида и центрифугировали при 3000 об/мин (описанную операцию повторяли дважды). Присутствие лейкоцитов и эритроцитов контролировали при микроскопировании.

Включение антибиотиков в эритроцитарные носители. Для включения доксорубицина в эритроцитарные носители использовали метод гипоосмо-тического гемолиза [53].

2.2.3. Количественное определение доксорубицина микробиологическим методом диффузии в агар

Согласно нормативной документации биологическую активность доксорубицина определяли методом диффузии в агар с тест-культурой Вас. cereus var. mycoides 537 (споры), посевная доза 10000000 спор на 1 мл среды. Для определения активности использовали среду №4, которую разливали в чашки Петри в один слой по 20 мл на чашку.

Основной раствор субстанции доксорубицина готовили в воде в концентрации 1 мг/мл. Для построения стандартной кривой использовали растворы с концентрацией 7, 10, 15, 20 и 25 мкг в 1 мл, полученные путем разведения основного раствора фосфатным буферным раствором №4. В качестве контрольного использовали раствор субстанции доксорубицина с концентрацией 15 мкг/мл. Определение антимикробной активности проводили с использованием стандартной кривой (рис. 1), расчет активности доксорубицина осуществляли графическим методом [42].

Методика количественного определения доксорубицина в лиофили-зированном порошке. К содержимому флакона прибавляли 10 мл воды, затем 1,5 мл исходного раствора помещали в колбу на 100 мл и доводили до метки фосфатным буфером №4. Полученный раствор наносили на чашки с питательной средой и инкубировали при (37±2) °С 18 часов. Определение антимикробной активности проводили с использование стандартной кривой, расчет активности доксорубицина осуществляли графическим методом.

Методика количественного определения доксорубицина в полимерных пленках. На анализ брали 10 пленок размером 3 см , взвешивали их на аналитических весах, вносили в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводили водой до метки. Полученный раствор наносили на чашки с питательной средой и инкубировали при (37+2) °С 18 часов. Определение антимикробной активности проводили с использование стандартной кривой, расчет активности доксорубицина осуществляли графическим методом.

IgC

2 -| 1,8 -1,6 -1,4 -1,2 -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 -0-

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Рис.1

Методика количественного определения доксорубицина в ткани слизистой оболочки полости рта кролика. Ткань слизистой (0,1 г) измельчали в фарфоровой чашке со стеклянным порошком, смесь центрифугировали при 8000 об/мин 10 мин. Полученный центрифугат наносили на чашки с питательной средой и инкубировали при (37+2) °С 18 часов. Определение антимикробной активности проводили с использование стандартной кривой, расчет активности доксорубицина осуществляли графическим методом.

Методика количественного определения доксорубицина в эритроцитарных носителях. Для количественного определения доксорубицина в эритроцитарных носителях методом диффузии в агар, проводили их замораживание

Стандартная кривая для количественного определения доксорубицина методом диффузиив агар

Я А/Т К/Г с последующим размораживанием и центрифугированием при 8000 об/мин 10 минут. Полученный центрифугат наносили на чашки с питательной средой и инкубировали при и инкубировали при (37+2)°С 18 часов. Количественное содержание рассчитывали по стандартной кривой графическим способом.

2.2.4. Определение содержания доксорубицина в крови методом ВЭЖХ

Для приготовления пластин с обращеннофазным сорбентом пластины «Silufol UV-254» обрабатывали смесью, содержащей вазелиновое масло и гек-сан в соотношении (2:8). С целью выделения доксорубицина из биологического материала была использована колонка размером (110x9), заполненная гелем марки «Сефадекс-10». Количественное определение антибиотика проводили на жидкостном хроматографе "Water Alian" (USA) с детектором фотодиодной матрицы на колонке размером 150x3,9 мм, заполненной сорбентом "Новопак Т-18".

Статистическую обработку результатов осуществляли в соответствии с требованиями ГФ XI изд. (вып.1, с. 199-221 ) с использованием пакета прикладных программ "Microsoft Excel".

ГЛАВА 3 РАЗРАБОТКА МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОКСОРУБИЦИНА В СУБСТАНЦИИ, ЛИОФИЛИЗИРОВАННОМ ПОРОШКЕ И КРОВИ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА ВЭЖХ

3.1. Определение оптимальных условий хроматографирования доксорубицина с помощью метода ВЭЖХ

Для выбора оптимальных условий анализа рассмотрено хроматографи-ческое поведение доксорубицина в тонких слоях нормальнофазного (пластины «Silufol UV-254») и обращеннофазного (пластины «Silufol UV-254», обработанные вазелиновым маслом) сорбентов с применением подвижных фаз различной полярности. Учитывая физико-химические свойства антибиотика, проводили изучение хроматографической активности доксорубицина в системах растворителей, представленных в табл.1.

Методика хроматографического исследования. С помощью капилляров на линию старта наносили около 5 мкл 0,05 %-ого водного раствора доксорубицина, растворитель испаряли в токе холодного воздуха. Пластины помещали в стеклянные камеры, предварительно насыщенные парами растворителей и хроматографировали восходящим способом, затем сушили при комнатной температуре.

Детекцию пятен проводили по собственной окраске и в УФ-свете. Доксорубицин проявлялся в виде пятен розового цвета. При облучении хроматогра-фических пластин УФ-светом дополнительных пятен не обнаружено.