Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Выявление точечных мутаций при онкологических заболеваниях: фундаментальные и прикладные аспекты

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе описан новый биологический феномен спонтанного ДНК-ДНК взаимодействия гомологичных линейных дуплексов с образованием структур Холлидея, крестообразных четырехцепочечных структур ДНК, в том числе, и при формировании гетеродуплексов. Демонстрация нового феномена с использованием современной электронно-микроскопической техники, изучение механизма выявленного ДНК-ДНК взаимодействия, определение сравнительных термодинамических характеристик процессов, происходящих в растворах гомологичных дуплексов, открывает новую область в изучении структуры и функций нуклеиновых кислот. Полученные данные расширили наши представления о механизмах, лежащих в основе перестроек ДНК, эволюции нуклеиновых кислот, и раскрыли новые возможности дальнейшего усовершенствования подходов для выявления точечных генетических нарушений, происходящих при опухолевой трансформации клеток. В данной работе впервые проанализированы и выбраны оптимальные условия для формирования линейных гетеродуплексов, что позволило значительно снизить уровень неспецифического расщепления при выявлении мутаций неизвестной локализации и, таким образом, повысить чувствительность анализа. Впервые была создана модельная система, представляющая собой набор гетеродуплексов, несущих все варианты неканонических пар Ьуклеотидов. В работе показана перспективность применения усовершенствованного метода химического расщепления дуплексов ДНК по неканоническим парам на примере анализа мутаций в гене супрессоре опухолевого роста р53 в опухолях молочной железы. Представленное исследование было также посвящено анализу и развитию нового методического подхода, обогащенной ПЦР, для выявления точечных мутаций известной локализации с целью его усовершенствования и повышения чувствительности. Впервые проведен теоретический и экспериментальный анализ причин появления ложно положительных и ложноотрицательных результатов в зависимости от характеристик используемых ферментов и протоколов используемых методических процедур. Теоретически разработанный оптимальный протокол проведения анализа по выявлению точечных мутаций в 12 ко доне онкогена Кл-гаэ был проверен экспериментально и были выработаны требования для предотвращения как ложно положительных, так и ложно отрицательных результатов при проведении клинических анализов. Исследование по выявлению точечных мутаций в 12 кодоне онкогена Кл-гаэ в образцах ДНК, полученных из опухолей, их метастазов, условно нормальной ткани легких и мокроты пациентов с немелкоклеточным раком легкого, мокроты пациентов с неонкологическими заболеваниями легких и нормальной ткани легких людей, погибших при несчастных случаях с использованием высокочувствительных методов анализа, позволяющих не только выявить наличие генетического нарушения, но и определить его тип, было проведено впервые. Кроме того, исследование по выявлению мутаций онкогена Ю-гаБ впервые проводилось на коллекции образцов ДНК из нормальной и опухолевой тканей, полученных от больных ПМЗН, что позволило оценить вклад данного генетического нарушения в генез опухолей различной локализации.