Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Генодиагностика наследственной предрасположенности к раку молочной железы и разработка системы индивидуального прогнозирования развития, течения и профилактики заболеванияm

РГ5 ОД

Российская Академия Медицинских Наук 0 п . п _ _пп.

L / А11Р Z00Z

Онкологический Научный Центр им. H.H. Блохина

на правах рукописи

ЛЮБЧЕНКО ЛЮДМИЛА НИКОЛАЕВНА

«Генодиагностика наследственной предрасположенности к раку молочной железы и разработка системы индивидуального прогнозирования развития, течения и профилактики заболевания» 14.00.14. -онкология, 03.00.15.- генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -2002 г.

Работа выполнена в лаборатории клинической онкогенетики НИИ

клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (директор, чл.корр., проф. - м.и.Давыдов)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук,профессор

Р.Ф.Гарькавцева В.А.Хайленко

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор С.М.Портной

доктор биологических наук, профессор Д.В. Залетаев

Ведущая организация: Российская Медицинская Академия постдипломного образования.

Защита диссертации - состоится__

года в

часов на заседании специализированного Совета при Российском Онкологическом Научном Центре им. Н.Н.Блохина Российской Академии Медицинских Наук по адресу: Москва, 115478, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н.Блохина

РАМН.

Автореферат разослан: «_»

2002 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук, профессор

Ю.А.Барсуков

•-) о

Актуальность темы. Рак молочной железы (РМЖ) занимает лидирующее положение в структуре онкологической заболеваемости и смертности в России, странах Европы и Америки и является основной причиной смерти женщин репродуктивного возраста. В последнее десятилетие решение вопросов этиологии, патогенеза, ранней диагностики и профилактики РМЖ связывают с открытиями в области молекулярной генетики, благодаря чему появилась возможность выявить гены предрасположенности, которые вовлекаются в процесс канцерогенеза при РМЖ (Miki et al. 1994; Wooster et al.1995). Фундаментальные исследования в этой области существенно изменили и конкретизировали представления о структуре генов, взаимоотношениях ген-белок, ген-признак и генотип - фенотип, что имеет огромное прикладное значение для трактовки клинического, биохимического, морфологического фенотипа РМЖ, а так же для прогнозирования развития, доклинической диагностики и профилактики злокачественных новообразований. Это конкретно касается и наследственных вариантов рака молочной железы (НРМЖ), при котором терминальные мутации в одной из копий генов BRCA определяют наследственную предрасположенность к развитию РМЖ и/или РЯ.

Критериями для постановки генетического диагноза НРМЖ служат наличие в семье двух и более родственниц I—II степени родства, страдающих РМЖ, ранний возраст манифестации заболевания, двухстороннее поражение молочных желез, первичная множественность новообразований у пробанда или его родственников, специфические опухолевые ассоциации (Lynch Н.,1973; Гарькавцева Р.Ф.,1999) Положительный результат формально-генетического анализа является показанием для проведения ДНК - диагностического исследования с целью выявления терминальных мутаций генов предрасположенности BRCA.

Мутации генов BRCA 1 и BRCA2 несу г высокий, до 80-95% риск развития РМЖ, а также высокую вероятность возникновения рака яичников, рака желудка, толстой кишки, эндометрия, поджелудочной железы, меланомы, мочевого пузыря, опухолей головы и шеи (BCLC 1999). Различия в молекулярном патогенезе между BRCA -ассоциировавши и ненаследственными опухолями молочной железы позволили использовать терминальные мутации генов BRCA 1 и BRCA 2 в качестве независимых прогностических молекулярно-генетических маркеров наследственного РМЖ.

Разработанные ранее принципы медико - генетического консультирования нуждаются в коррекции с учетом возможности проведения ДНК — диагностики и выявления лиц - носителей патологических генов BRCA, определяющих высокий риск развития заболевания, что позволит более дифференцированно подходить к проблеме ранней диагностики, профилактики и лечению таких пациентов.

Настоящее исследование посвящено детальной характеристике наследственной предрасположенности к возникновению рака молочной железы, анализа генетической и фенотипической гетерогенности рака молочной железы, ассоциированного с терминальными мутациями генов BRCA 1 и BRCA 2 и разработке системного подхода для мониторинга пациентов - носителей онкопатологического BRCA генотипа. Целью данного исследования являлась генодиагностика наследственной предрасположенности к развитию рака молочной железы и разработка индивидуального прогнозирования развития, течения и профилактики заболевания.

Для выполнения исследования были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать спектр мутаций генов предрасположенности ВЯСА 1 и ВЯСА 2 у пробандов, создать канцер-регистр носителей онкопатологических генов ВЯСА.

2. Провести анализ частот агрегации злокачественных новообразований в семьях пробандов - носителей мутаций генов ВЯСА 1/2.

3. Расчитать риск развития вторых первичных опухолей у больных -носителей мутаций генов ВЛСА 1/2.

4. Оценить возможность исследования спонтанных хромосомных аберраций как цитогенетического маркера индивидуальной наследственной предрасположенности, связанной с терминальными мутациями генов В11СА 1/2.

5. Провести сравнительный многофакторный клинико - генотипический анализ наследственного рака молочной железы, ассоциированного с герминальнымими мутациями генов ВЯСА 1/2 и спорадического РМЖ.

6. Разработать основные принципы медико-генетического консультирования пациентов - носителей мутаций генов ВИС А 1/2.

Научная новизна

В результате выполнения исследования впервые в России были использованы ДНК-диагностические методы прямого выявления терминальных мутаций генов ВЯСА 1 и ВЯСА 2 с целью подтверждения диагноза наследственного рака молочной железы и выявления наследственной предрасположенности к развитию РМЖ, РЯ и других злокачественных новообразований. Впервые охарактеризован спектр мутаций и полиморфизмов генов предрасположенности ВЯСА у пробандов, страдающих наследственной формой рака молочной железы и здоровых пациентов из онкологически отягощенных семей. Показана высокая частота мутации 5382 ¡пбС в российской популяции. Мутации 4816 шбС, П808М, ЬЗ КНР гена ВШИА 2 выявлены впервые в мире. Рассчитаны риски развития РМЖ и/или РЯ, злокачественных новообразований других

локализаций в семьях пробандов - носителей мутаций генов предрасположенности В11СА. Показана частота возникновения первично-множественных опухолей у носителей мутаций генов ВЯСА и их родственников. Впервые продемонстрирована взаимосвязь хромосомной нестабильности и мутантного ВИ.СА генотипа. Впервые представлены сравнительные фено-генотипические характеристики рака молочной железы, ассоциированного с терминальными мутациями генов ВЯСА 1 и ВЯСА 2. Усовершенствованы принципы медико-генетического консультирования лиц-носителей патологического ВЯСА-генотипа с целью ранней диагностики и профилактики. Практическая значимость.

В ходе проведения данной диссертационной работы создан канце-регистр носителей онкопатологических генов В11СА. Собрана коллекция образцов крови и библиотеки ДНК онкологических больных и их родствеников. На основании проведенного клинико-генетического исследования продемонстрирована практическая значимость ДНК-диагностики наследственной предрасположенности (мутаций генов ВЯСА 1 и ВЯСА 2) при раке молочной железы для индивидуального прогнозирования развития РМЖ и/или РЯ, а также злокачественных новообразований других локализаций. Цитогенетические методы исследования с целью выявления хромосомной нестабильности могут быть использованы в качестве косвенного биомаркера при медико-генетическом обследовании. Выявление носительства онкопатологического ВЯСА генотипа позволит дифференцировать наследственные и спорадические формы РМЖ с целью оптимизации методов наблюдения и лечения в зависимости от индивидуального генотипа пациента. Формирование канцер-регистра поможет в организации патогенетически обоснованного мониторинга с использованием лекарственной и хирургической

профилактики, а также ранней диагностики онкологических заболеваний в целом.

Положения, выносимые на защиту:

1. Определены спектры мутаций и полиморфизмов генов BRCA в российской популяции.

2. Агрегация рака молочной железы в семьях, где идет наследование мутаций генов BRCA 1 и BRCA 2 составляет 48% и 58% соответственно; наследование терминальных мутаций гена BRCA 1 обуславливает высокий риск развития РЯ - 30,6%. Среди злокачественных новообразований других локализаций преобладают рак желудка, рак легкого, рак эндометрия и рак толстой кишки.

3. У пробандов-носигелей мутаций генов BRCA 1/2 и их родственников повышен риск развития ПМЗН.

4. Хромосомная нестабильность ассоциирована с носительством терминальных мутаций генов предрасположенности BRCA.

5. Фенотипическая гетерогенность наследственного и спорадического РМЖ ассоциирована с мутациями генов предрасположенности BRCA.

6. Разработана система индивидуального прогнозирования развития, ранней диагностики и профилактики РМЖ.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на II Съезде медицинских генетиков 2000, Курск; II Съезде Онкологов 2000, Киев; The III International Workshop on Advanced Genomics 2000, Japan; The 10 International Congress of Human Genetics 2001, Veinna, Austria . Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста,

содержит 16 таблиц и 17 рисунков. Список литературы включает 111 источников.

Материалы и методы исследования

Материалом исследования являлись клинико-генетические данные, объединившие генеалогические, цигогенетические, молекулярно-генетические и клинические характеристики о 1 487 членах из 98 семей, 579 из которых являлись родственниками I-II-III степени родства в отношении больной РМЖ и составившие 41 онкологически отягощенную семью. В контрольную группу были включены 57 семей, в которых не было случаев онкологических заболеваний, а также коллекция образцов крови больных РМЖ и/или РЯ и членов их семей. Молекулярно-генетическое исследование было выполнено у 82 пробандов. Самостоятельным этапом сбора клинических информационных данных являлся ретроспективный анализ стационарных историй болезней и амбулаторных карт пробандов -больных РМЖ, состоящих на учете в отделении амбулаторных методов диагностики и лечения РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Определение структурных вариантов ДНК генов BRCА1/2 проводили с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) экзонов указанных генов и конформационно-чувствительного электрофоретического метода с последующим подтверждением наличия мутации и выявлением ее характеристик путем секвенирования. Анализ генов BRCA1/2 включал следующие этапы: выделение ДНК из образцов крови пациентов; амплификация экзонов изучаемого гена; электрофоретический анализ продуктов амплификации; секвенирование фрагментов ДНК, идентифицированных в качестве мутантных.

Хромосомный анализ проводили на G-окрашенных метафазных пластинках лимфоцитов периферической крови, культивируемых по стандартной методике. Кровь для анализа у пациенток, страдающих РМЖ брали до проведения химио-лучевой терапии. Определяли количество

аберрантных клеток и число разрывов хромосом. В каждом случае анализировали по 100 метафаз.

Статистический анализ результатов исследования осуществлялся на персональном компьютером PC-Pentium I с помощью комплекса программ медико-биологической статистики "ACTA", разработанный в лаборатории медицинской кибернетики РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Генетический скрининг и создание канцер - регистра носителей онкопатологических BRCA генов

С 1996 по 2000 гг. нами активно проводился скрининг пациентов, страдающих раком молочной железы (РМЖ) с целью выявления наследственных форм рака этой локализации. В результате госпитальный канцер - регистр, созданный в лаборатории оикогенетики НИИ КО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, дополнен 138 онкологически отягощенными семьями. Для подтверждения генетического диагноза был выполнен молекулярно - генетический анализ с целью определения наследственных мутаций генов предрасположенности BRCA 1 и BRCA 2 у 82 пробандов, из которых 55 больных страдали различными типами злокачественных новообразований, а именно: наследственным РМЖ - 42 пациентки (76,3%); РЯ- 5 больных (9%); синдром сочетанного наследственного РМЖ/РЯ был отмечен у 4-х больных (7,2%), наследственная форма рака эндометрия у 1 больной (2%), рака почки у 1 больной (2%), рак легкого у 1 больной (2%), рак желудка у 1 пациентки (2%). В 71% случаев (39 больных) были выявлены изменения генов предрасположенности BRCA 1/2. Кроме того, ДНК-диагностика генов BRCA проведена у 27 практически здоровых пациенток из онкологически отягощенных семей. Изменения генов предрасположенности выявлены у 14 пациенток (51,8%). Все пробанды включены в клинико-генетический регистр.

С помощью конформационно - чувствительного электрофорезного метода была проскринирована вся кодирующая часть гена ВЯСА 1 (22 экзона) и ВЖГА 2 (26 экзонов) с последующим секвенированием мутантных вариантов. В ходе проведения ДНК- диагностики были выявлены следующие структурные варианты генов ВЯСА 1/2 (таблица 1, 2): Таблица 1.

Спектр структурных вариантов гена ВИСА1 (российская популяция)

Экзон Мутация Экзон Полиморфизм

2 185с1е1АС 2 1У81-21т8АТ

1У82-55Т/С

1У88-58бе1Т

11 2080(1с1А 8 1У87-34С/Т

11 8104(Ш И Р871Ь

11 4154(1е1А 16 81613С

16 М1628Т 20 1У820+60тх12

16 81613С 2 1У81-103Т/С

2 1У81-115Т/С

9 ГУ88-58(1е1Т

11 2430Т/С

11 Е1038С

11 К1183Я

13 4428Т/С

15 1У814-63С/С

20 5382!пвС

Пример электрофореза мутации 5382шзС гена В11СА1 и сиквенс мутантного варианта представлен на рис. 1

Рис.1 Электрофорез и сиквенс мутантного варианта 5382т$С

218 ¡2) 23 :с с »г \:: ;к !: 5\с: г.с:ч ! |П I1-цг"'/ 1 (Т !|| {МИ'' на I е в к'5 с -а; с •• с •! 1 . , «1 VI ! ! | , % нШ ¡Л<

Таблица 2.

Спектр структрных вариантов гена ВИСА 2 (российская популяция)

Экзон Мутация Экзон Полиморфизм

10 83261* 2 203С/А

10 8384Р 10 N37211

10 Е394А 11 ГУБП+вО с1е! 4

И 48161п$С 17 7470АУС

11 11808М 17 1У816 -14 Т/С

11 Ь3101Р 17 1Ув8 + 56 С/Т

Таким образом, выявлено 7 различных мутаций гена ВЯСА 1 во 2, 11, 16 и 20 экзонах и 6 мутаций гена ВЯСА 2 в 10 и 11 экзонах, причем мутации 4816 ¡ПБв, 11808М, Ь3101Р гена ВЯСА 2 выявлены впервые в мире. Кроме того, найдены полиморфные варианты гена ВЯСА 1 во 2,8,9,11,13,15,16 и 20 экзонах. Полиморфизмы гена В11СА 2 обнаружены во 2,10,11 и 17 экзонах. Спектр мутаций гена ВЯСА 2 представлен в выборке российской популяции впервые.

Все выявленные нами мутации и полиморфизмы генов BRCA 1 и BRCA 2 зарегистрированы в Международной базе данных (BIC date base online.http://www.nhgri.nih.gov/).

В дальнейшем, для детального изучения фено-генотипических характеристик отобрана 41 семья с накоплением злокачественных новообразований женской репродуктивной сферы и других локализаций. Генетические диагнозы в семьях пробандов подразделялись на следующие категории и синдромы: семейный органоспецифический РМЖ - 17 семей (41,5%), синдром сочетанного семейного РМЖ/РЯ - 5 семей (12,1%), синдром Линч II - 17 семей (41,5%), синдром Ли -Фраумени - 2 семьи

На основании того, изменения какого гена наследовали пробанды, было сформировано 2 группы пациентов: в первую группу включены пациенты- носители терминальных мутаций гена BRCA 1 (п=14) (группа BRCA 1+). Частотный спектр мутаций гена BRCA 1 в этой группе пациентов представлен на Рис 2. Из них, у 11 больных (78,5%) выявлена мутация 5382 insC в 20 экзоне. У двух женщин (14,2%) обнаружена основополагающая для еврейской популяции мутация 185 delAG во 2 экзоне. В одном случае обнаружена мутация в 11 экзоне 2080 del А (7,1%).

Рис.2. Частотный спектр мутаций гена BRCA1 у пробандов

(4,9%).

185delA'~ 14,3%

2080de!A 7,1%

5382insC 78,6%

Учитывая данные ранее проведенных (Gayther S.,1997) и настоящего исследований, можно говорить о том, что в российской популяции частота мутации 5382 insC BRCA 1 гена высока - составляет по нашим данным 78,5%; лицам из семей, отягощенных злокачественными новообразованиями женской репродуктивной сферы необходимо проводить ДНК- диагностику гена BRCA 1 в первую очередь на предмет выявления этой наследственной мутации.

Вторую группу составили больные, страдающие РМЖ, с онкологически отягощенным анамнезом, у которых не было мутаций гена BRCA 1, а в 11 случаях (40,7%) выявлены терминальные мутации гена BRCA 2 (п=27) (группа BRCA 1 -).

Фено-генотипические взаимосвязи наследственного рака 4 молочной железы Накопление случаев РМЖ, РЯ и других злокачественных новообразований различно в семьях пробандов, наследующих мутации генов предрасположенности BRCA 1 и BRCA 2 (Ford D.,1994; Whittemore A., 1997; Ford D.,1998; Breast Cancer Linkage Consortium 1999). Частота рака молочной железы в семьях среди родственников I—IX степени родства высока в обеих группах в зависимости от генотипа BRCA 1 (BRCA 1+) и BRCA 2 (BRCA 1-) и отличается незначительно - составляет 48% и 58% соответственно, однако случаи двухстороннего рака молочной железы в 1,7 раза чаще встречались в семьях с измененным геном BRCA 2 (группа BRCA 1-) - 9,7% по сравнению с семьями-носителями терминальных мутаций гена BRCA 1 (BRCA1+) -5,6%>. Следует особо подчеркнуть, что прослеживается четкая зависимость между наследованием терминальных мутаций гена BRCA 1 (BRCA1+) и высоким риском развития РЯ. В нашей выборке эта величина составила 30,6%, которая в 5 раз превысила частоту возникновения РЯ в семьях с патологическим BRCA 2 генотипом (BRCA1-), равную 6,5% (рис.3).

Рис. 3.

Агрегация РМЖ, РЯ и других злокачественных новообразований в семьх пробандов - носителей мутаций ВИСА и ВИСА 2 генов

4

РМЖ РЯ

Другие раки

48,1

3158

30,6

6,5

21,3

□ В1*СА1 ЕВ ВГ1СА2

|| 35,5

0

10 20 30 40 50 60

Соотношение РМЖ/РЯ в семьях пробандов - носителей терминальных мутаций гена ВЯСА 1 (В11СА1+) составило 1,5 : 1, при мутантном В КС А 2 генотипе (ВКСА1-) - 8,9 : 1, что подтверждает плейотропное действие генов предрасположенности. Такая частота и вероятность проявления неоплазий может быть следствием влияния различных мутации генов ВИСА, не исключено также влияние других генов и эпигенетических факторов, изучение которых поможет точнее определять риск развития того или иного злокачественного новообразования у пациента. Анализ родословных показал также, что в 64,3% (9) семей пробандов-носителей мутаций гена В11СА1 и 51,9% (14) семей с В11СА 2 патологическим генотипом прослеживался симптом антиципации «упреждения», при котором возраст возникновения онкологического заболевания (РМЖ и/или РЯ) снижался в последующем поколении в среднем на 16 лет, что в свою очередь

является определяющим моментом в наблюдении здоровых потомков-носителей BRCA мутаций.

В отношении злокачественных новообразований других локализаций продемонстрировано, что в семьях, где идет наследование мутаций гена BRCA 1 (BRCA1+), чаще возникают рак желудка, рак тела матки (р<0,05) и рак легкого; среди родственников пробандов-носителей мутаций BRCA 2 гена (BRCA1-) отмечается высокое накопление рака желудка и рака толстой кишки, что согласуется с литературными данными (Ford et al.,1994; Goldar et al.,1995; Burke et al.,1997; Johannsson et al.,1999). Следует отметить более молодой возраст возникновения неоплазий в семьях, где идет наследование мутаций гена BRCA 1, что необходимо учитывать при медико-генетическом консультировании.

Первично — множественные опухоли при мутантном BRCA генотипе

Важным показателем вариабельной эксрессивности генов BRCA 1/2 является развитие вторых первичных опухолей у пробандов и их родственников. Оценивая частоту первично множественных злокачественных новообразований (ПМЗН), можно говорить о том, что риск развития второй первичной опухоли молочной железы у больных РМЖ, ассоциированного с терминальными мутациями гена BRCA 2 (BRCA1-), в нашей выборке пробандов составляет 14,8%, тогда как риск развития последующего после РМЖ, рака яичников выше у пациентов - носителей терминальных мутаций гена BRCA 1 (BRCA1+) и составляет 28,6%, что значительно превышает этот показатель в общей популяции, равный 1,8%.В целом, накопление первично-множественных опухолей, одной из локализаций которых является РМЖ в семьях, наследующих мутации генов BRCA представлено на рис 4.

Рис. 4

Частота первично-множественных злокачественных новообразований (ПМЗН) в семьях в зависимости от генотипа

ВШ1А1/2.

Клинико-генетические данные убедительно показывают, что в семьях больных РМЖ, ассоциированного с терминальными мутациями генов В11СА 1 (1ЖСА1+) и ВИСА 2 (В11СА1-) прослеживается накопление полинеоплазий, с частотой, превышающей популяционную, причем при ВИСА 1 патологическом генотипе ПМЗН встречаются в 1,7 раза чаще по сравнению с ВЯСА 2. Таким образом, наличие первично-множественных злокачественных новообразований у родственников может служить достоверным критерием наследственной этиологии заболевания у пробанда. Выполнение молекулярно-генетического исследования с целью выявления терминальных мутаций генов ВЯСА 1/2 у больных из онкологически отягощенных семей, необходимо также и для расчета риска возникновения вторых первичных опухолей женской репродуктивной сферы с целью ранней диагностики и профилактики. Случаи ПМЗН в семье являются основанием для

зачисления в клинико-генетический регистр с последующим динамическим наблюдением в условиях онкодиспансера.

Хромосомная нестабильность как цнтогенетнческнй маркер наследственной предрасположенности, ассоциированной с мутациями генов ВПСА

В поисках цитогенетических маркеров мы исследовали частоту спонтанных хромосомных аберраций и разрывов хромосом в лимфоцитах периферической крови у пациентов из следующих групп:

1. Пациенты, страдающие наследственной формой РМЖ - 7 человек.

2. Практически здоровые женщины с онкологически отягощенным анамнезом — носители мутаций генов ВКСА-9 человек.

3. Практически здоровые женщины, из онкологически отягощенных семей не унаследовавшие мутаций генов ВЯСА -6 пациенток.

4. Контрольную группу составили практически здоровые пациенты не имеющие родственников, пораженных злокачественными новообразованиями-11 человек.

Изучение хромосомной нестабильности показало статистически

значимое повышение частоты аберрантных клеток по сравнению с

контрольной группой в группе больных РМЖ, ассоциированного с

носительством терминальных мутаций генов ВЯСА 1/2 (р = О, 002В) и во

второй группе практически здоровых пациенток-носительниц

патологического ВЯСА генотипа (р = 0, 0048). В этих же группах число

разрывов хромосом на 100 клеток также достоверно выше, по

сравнению с контрольной группой.

Фенотипнческая гетерогенность РМЖ, ассоциированного с терминальными мутациями генов ВЯСА и спорадического рака молочной железы

Изучая фенотипическую гетерогенность РМЖ, ассоциированного с терминальными мутациями генов ВКСА и спорадического рака молочной железы, мы сделали попытку провести сравнительный гено-

фенотипический анализ прогностически значимых признаков гетерогенных форм РМЖ. Для проведения многофакторного корреляционного анализа сформирована контрольная группа пациентов, страдающих спорадической формой РМЖ, отобранная по возрасту, стадии заболевания и методам лечения.

Оценивая возрастзависимую пенетрантность показано, что пик максимальной заболеваемости женщин, наследующих мутации гена ВКСА 1 (группа ВСА1+), приходится на возрастной период 35-39 лет. Тогда как в группе больных- носителей мутаций гена ВКСА 2 (группа ВЯСА1-), отмечено 2 пика максимальной заболеваемости: в 43 и 54 года (Рис.5). Рис. 5. Возрастзавнсимая заболеваемость.

Патоморфологические характеристики опухолей, ассоциированных с изменениями генов ВКСА 1/2 и спорадического РМЖ были оценены нами, опираясь на результаты пересмотра трепанбиоптатов и постоперационных гистологических препаратов. Статистически достоверной оказалась высокая частота инфильтративного протокового рака у больных РМЖ, обусловленного мутациями гена ВКСА 1 (ВКСА1+) - (92,8%) и спорадического РМЖ-49 (86%) по сравнению с другими гистологическими типами опухоли в этих группах. Тубуло-дольковая подгруппа инвазивного рака, описываемая как фенотип ВЫСА 2 генотипа, в нашем исследовании

также наблюдалась в группе больных с онкологически отягощенным анамнезом и изменениями гена BRCA 2 (BRCAI-) - 51,9% (14 больных).

При изучении степени злокачественности достоверно значимыми оказались различия по частоте низкодифференцированных опухолей (III степени злокачественности), ассоциированных с мутациями генов BRCA 1 (BRCA1+) и BRCA 2 (BRCA1-) по сравнению с контрольной группой спорадического рака молочной железы: 57,2% (8 человек), 33,3% (9 человек) и 8,8% (5 человек) соответственно, причем у больных - носителей мутаций BRCA 1 гена (BRCA1+) этот вид опухоли встречается в 1,7 раза чаще по отношению к больным, наследовавшим BRCA 2 патологический генотип (BRCA1-), что в свою очередь может отражаться на прогнозе заболевания.

Представление об иммунологических свойствах опухоли, дает воспалительный лимфоцитарный инфильтрат, формирующийся вокруг опухоли, который мы оценивали по степени выраженности. В группе пациентов-носителей мутаций гена BRCA 1 (BRCA1+) вокруг опухоли активно формировался воспалительный лимфацитарный инфильтрат, который был резко и умеренно выражен в 78,6% случаев у 11 больных по сравнению с опухолями в группе спорадического РМЖ - 17,5% у 10 пациентов (р<0,05). Выраженный лимфацитарный инфильтрат был отмечен в 15 опухолях (55,5%), обусловленных патологическим BRCA 2 генотипом (BRCA1-) по отношению к тем же 17,5% в группе спорадического рака (р<0,05).

Важным молекулярным маркером прогноза и гормоно-чувствительности рака молочной железы являются рецепторы эстрогенов (РЕ) и прогестеронов, при анализе уровня которых нами выяснено, что преобладающее число опухолей РМЖ, ассоциированного с мутациями BRCA 1 гена (группа BRCA1+), были эстрогенотрицательными (РЕ (-) менее 10 фмоль/мг белка) - 78,6% по сравнению со спорадическим РМЖ -

26,3%. Что касается различий в наследственно отягощенных группах, нами установлено, что частота эстрогенположительных опухолей в группе больных - носителей терминальных мутаций гена BRCA 1 (BR.CA1+) значительно ниже по сравнению с пациентами, наследовавших BRCA 2 патологический генотип (BRCA1-) - 14,2% (2) и 51,8% (14 опухолей) соответственно (р<0,05).

При изучении уровня рецепторов прогестерона в изучаемых группах не получено статистически достоверных результатов, однако интересным на наш взгляд оказалось наличие парадоксально высокого уровня рецепторов прогестерона - 148-501 фмоль/мг белка в группе наследственно отягощенных пациентов - носителей мутаций BRCA 2 гена (BRCA1-).

Оценка степени лечебного патоморфоза Гены предрасположенности BRCA могут рассматриваться как независимые молекулярно - генетические прогностические маркеры, имеющие клиническое значение при раке молочной железы. Предполагают так же, что BRCA - белок имеет рецептор, теоретически доступный для лекарственной терапии (Jensen et al.,1996;Holt et al.,1996;Wright et al.,1999).

Для оценки степени лечебного патоморфоза были отобраны пациенты, страдающие наследственной и спорадической формой РМЖ, которым в предоперационном периоде была проведена неоадьювантная химиотерапия - всего 41 человек. Среди пациентов - носителей терминальных мутаций гена BRCA 1 такой вид лечения был проведен у 4 пациентов (28,5%), в группе больных, наследовавших патологический BRCA 2 генотип - у 12 человек (44,4%), в контрольной группе спорадического рака - у 25 больных (43,8%). Для неоадьвантного лечения использовались стандартные схемы, применяемые в РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН в соответствии с научными протоколоми.

Суммируя полученные результаты, мы можем говорить о том, что у пациентов - носителей терминальных мутаций генов BRCA 1 (BRCA1+) и

ВЯСА 2 (ВЯСА1-) в 100% случаев (4 из 4) и в 83,3% (10 из 12) соответственно были отмечены полная регрессия опухоли и резко выраженный лечебный патоморфоз по сравнению с контрольной группой спорадического рака, где III степень лечебного патоморфоза наблюдалась только у двух пациентов (8%) (р< 0,05). Такой выраженный положительный эффект на проведение неоадьювантной терапии у пациентов - носителей терминальных мутаций генов ВЯСА 1/2 возможно имеет свою основу в молекулярном патогенезе наследственных форм РМЖ, что несомненно требует тщательного изучения в дальнейшем.

Оценка результатов выживаемости

Результаты по выживаемости пациентов, страдающих НРМЖ, спорны, возможно ввиду различного методологического подхода (Акуленко Л., 1995; Маапшоп е1 а1.,1998; Уег1кк^ е1 а1.,1998;1999; ЯоЬзоп е1 а1.,1998). В нашем исследовании общая выживаемость больных, страдающих РМЖ, ассоциированного с мутациями гена ВЯСА2 (ВЯСА1 -) статистически достоверно лучше значений выживаемости у больных спорадическим РМЖ -87,4% и 71,0% (р<0,05). Пациенты-носители мутаций гена ВЯСА I (ВИ.СА1+) имеют сходный прогноз с больными, страдающими спорадической формой РМЖ, однако оценки статистически недостоверны (рис.6).

Рис.6.

Общая выживаемость больных в зависимости от генотипа

годы

Разработка системы индивидуального прогнозирования развития

РМЖ.

Проблема ранней диагностики и эффективной профилактики злокачественных новообразований является первоочередной задачей онкологии. Одним из наиболее реальных подходов к решению этой проблемы следует рассматривать медико-генетическое консультирование, деятельность которого подразделяется на следующие этапы:

1. Создание канцер-регистров путем генетического скрининга онкологически отягощенных семей;

2. Проведение медико-генетического обследования пациентов с различной онкопатологией и членов их семей с использованием ДНК -диагностических методов, позволяющих идентифицировать наследственно обусловленные формы рака у больных и предрасположенность к их развитию у здороых родственников.

3. Организация клинико-генетического мониторинга групп "онкологического риска".

На первом этапе проводится медико-генетическое консультирование пробандов из наследственно отягощенных семей. Критериями для включения в канцер-регистр являются:

- молодой возраст возникновения онкологического заболевания;

- двухстороннее поражение парных органов;

- наличие первично-множественных злокачественных новообразований (ПМЗН) у пробанда и его родственников;

- онкологически отягощенный анамнез (1 и более родственников 1-П степени родства, страдающие РМЖ и/или РЯ, а также злокачественными новообразованиями различной локализации);

- специфические опухолевые ассоциации, определяющие генетические синдромы.

На следующем этапе проводится отбор в две группы: первую группу составляют лица с выявленными злокачественными новообразованиями, включая РМЖ; вторая группа - "практически здоровые" пациенты. На заключительном этапе формируется регистр "раковых семей" с последующим активным диспансерным наблюдением в выделенных группах в зависимости от возраста и в соответствии с уровнем риска.

Тактика создання профилактического регистра

1. Оценка семейного отягощения и необходимости выполнения моле-кулярно-генетического исследования больному и членам семьи.

2. Получение согласия пациента на проведение ДНК-тестирования с целью выявления онкопатологических генов.

3. Сообщение результатов тестирования и всей необходимой информации лично пациенту.

4. Включение пациента-носителя мутаций генов предрасположенности в профилактический канцер-регистр.

5. Для улучшения клинико-генетического мониторинга привлечение специалистов-онкологов различного профиля.

6. Обеспечение психологической помощи.

В данной работе в методологии расчетов риска представлены молекулярно-генетические методы (ДНК-диагностика мутаций генов ВКСД), которые резко повышают эффективность медико-генетического консультирования, включая все его аспекты: подтверждение генетического диагноза, определение течения и прогноза, доклиническую диагностику и своевременную профилактику заболевания. На основании выявленных наследственных мутаций рассчитывался индивидуальный риск развития злокачественных новообразований. У больных пробандов - носителей наследственных мутаций генов ВЯСА высок риск развития ПМЗН: риск развития второй первичной опухоли молочной железы составляет 37-48% до 50-ти летнего возраста и 50-64% в течении всей жизни. Риск развития

двухстороннего рака молочной железы в течении первых 5-ти лет после первичного диагноза РМЖ составляет 12-20% (Frank et al.,1998; Ford et al.,1998). В нашем исследовании риск развития метахронного рака молочной железы составил 11,1%. Риск развития последующего после рака молочной железы рака яичников при носительстве терминальных мутаций генов BRCA повышен в 10 раз. По нашим данным частота возникновения рака этой локализации у носителей мутаций гена BRCA 1 (группа BRCA1+) составляет 28,6%.

Практически здоровые пациенты - носители наследственных мутаций генов предрасположенности BRCA имеют высокий риск развития РМЖ и/или РЯ, а так же других злокачественных новообразований: риск развития рака молочной железы до 50-ти летнего возраста составляет 33-50%, и 5687% в течении всей жизни. Риск развития рака яичников в течении всей жизни составляет для носителей мутаций этих генов предрасположенности 27-44%. В нашем исследовании совокупный накопленный риск развития РМЖ в семьях носителей мутаций генов BRCA 1/2 составил 53,8%. Риск развития РЯ для носителей мутаций гена BRCA 1 (BRCA1+)- 30,6% и 6,5% для носителей мутаций гена BRCA 2 (BRCA1-) (без учета возрастного риска). Наследование мутаций генов BRCA и высокого риска развития РМЖ и/или РЯ в 50% случаев происходит по отцовской линии. Тактика проведения клинико-генетического наблюдения

Больные пациенты -носители мутаций

1. Скрининг с целью выявления вторых первичных опухолей.

2. Проведение лечебно-профилактических операций

Здоровые пациенты-носители мутаций

1. Клинико-генетическое наблюдение

2. Химиопрофилактика

3. Профилактическая хирургия

При наблюдении больных - носителей мутаций генов BRCA 1 и BRCA 2 на первый план выходят вопросы, касающиеся течения основного заболевания и риска развития вторых первичных опухолей. В связи с этим, программа динамического наблюдения должна быть индивидуально разработана для каждого больного - носителя и учитывать, мутацию какого гена наследует пациент. В зависимости от этого, скринирующая программа может быть расширена и включать дополнительные методы обследования, направленные на выявление ПМЗН - яичников, желудка, тела матки при носительстве мутаций гена BRCA 1, тогда как при BRCA 2 патологическом генотипе особое внимание следует уделять обследованию второй молочной железы и желудочно - кишечного тракта.

Для практически здоровых носителей мутаций наиболее актуальным является раннее выявление заболевания посредством скринирующих программ, изменение стиля • жизни, химиопрофилактика и клинико-хирургические профилактические методы. В протокол клинико-генетического мониторинга пациентов из групп риска включены следующие методы исследования: маммография, УКЗТ молочных желез, интровагинальное исследование органов малого таза, определение уровня опухолевых маркеров СА-15,3, СА-125, консультации маммолога, гинеколога. При наличии у пациента-носителя жалоб со стороны других органов, обследование может быть дополнено методами исследования, проводящимися в РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Проведение профилактической химиотерапии у женщин с высоким риском развития РМЖ, основывается на применении антиэстрогенных препаратов, одним из которых является тамоксифен (Fisher et al.,1998). Протокол исследования по профилактическому применению тамоксифена подразумевает клинико-генетическое обследование практически здоровых пациентов из генетического канцер-регистра. Нами такая работа начата, но

научно обоснованные выводы будут сделаны после завершения сбора собственного материала.

Методом выбора для здоровых пациенток-носителей мутаций генов BRCA 1/2 является профилактическое удаление органов-мишеней (Hartmann et al., 1999).

Примером выполнения профилактической овариоэктомии у пациентки-носительницы наследственной мутации гена BRCA 1 может служить пробанд К., состоящая на учете в медико-генетическом кабинете с 1992 года в связи семейным анамнезом, отягощенным раком яичников (родословная представлена на рис.7). Учитывая высокий риск развития рака яичников при носительстве мутации 4153 delA гена BRCA 1, завершение периода деторождения (41 год), желание пациентки, рекомендовано проведение профилактической овариоэктомии. Пациентка госпитализирована в отделени онкогинекологии, где выполнена профилактическая овариоэктомия. Гистологическое заключение: В яичниках кисты эндометриоза.

Рис. 7 К. (1У-1)

68 70

Обобщая вышесказанное, мы можем говорить о том, что эффективность применения ДНК-диагностических методов при медико-генетическом консультировании в онкологии трудно переоценить. Генодиагностика наследственной предрасположенности, в данном случае мутаций генов В КС А 1 и ВЯСА 2, позволяет подтвердить генетический диагноз, оценить риск развития злокачественного новообразования и разработать индивидуальные подходы к ранней диагностике, профилактике и лечению пациентов из "групп генетического риска". Создание клинико-

генетического регистра лиц-носителей патологических генов поможет организовать и координировать мониторинг за состоянием их здоровья, решить морально-этические и юридические проблемы, связанные с доклинической диагностикой наследственной предрасположенности к развитию РМЖ и/или РЯ, а так же использование лекарственной и хирургической профилактики у таких лиц.

ВЫВОДЫ

1. Определен спектр молекулярной патологии генов ВКСА 1 и ВЯСА 2 при наследственных формах РМЖ и/или РЯ в российской популяции. Показано, что частота мутации 5382 ¡^С гена ВЯСА 1 в российской популяции составляет 78,5%. Мутации гена ВЯСА 2-4816 Ый, 11808М, ЬЗ101Р выявлены впервые в мире.

2. Установлено, что накопленный риск развития РМЖ в семьях пробандов - носителей мутаций ВКСА 1 (ВЯСА1+) гена составляет 48%, гена ВЯСА 2 (ВЯСА1-) - 58%. Наследование в семье мутаций гена ВЯСА 1 повышает риск развития РЯ у родственников до 30,6%.

3. Выявлено, что риск развития метахронного РЯ у больных РМЖ, ассоциированного с мутациями гена ВИСА 1 (ВЯСА1+) повышен и составляет 28,6%; при мутациях гена ВЯСА 2 (В11СА1-) высок риск развития второй первичной опухоли молочной железы - 14,8% (р<0.05). Случаи первично-множественных злокачественных новообразований (ГТМЗН) в семье являются основанием для зачисления в клинико-генетический регистр с последующим динамическим наблюдением.

4. Показано, что повышение частоты хромосомных аберраций у носителей мутаций генов ВКСА 1/2 может служить косвенным биомаркером для оценки риска возникновения злокачественных новообразований.

5. Клинико-генетические корреляции позволили определить фенотипические проявления мутаций генов BRCA1/2.

Фенотипом BRCA 1- ассоциированного РМЖ (BRCA1+) являются: молодой возраст манифестации болезни (35-39 лет); высокая частота инфильтративного протокового рака - 92,8%

(р<0,05);

более высокая - (III) степень злокачественности по сравнению со спорадическим РМЖ - 57,2% (р<0,05);

- выраженная лимфоидная инфильтрация - 50,5 % (р<0,05);

- высокая частота эстрогенотрицательных, (меньше <10 фмоль/мг белка) опухолей - 78,6% (р<0,05).

- выраженный лечебный патоморфоз вплоть до полной регрессии опухоли-100% (р< 0,05).

Фенотипическими характеристиками BRCA2 - ассоциированного (BRCA1-) РМЖ являются:

- максимальная заболеваемость в возрасте 43 и 54 лет;

- тубуло-дольковый морфологический тип опухоли (р<0,05);

- преобладание II - III степень злокачественности - 55,6% и 33,3% (р<0,05);

- выраженный лимфацитарный инфильтрат вокруг опухоли- 44,4% (р<0,05);

выраженный лечебный патоморфоз, по сравнению с группой спорадического рака - 83,3% (р< 0,05), что может говорить о высокой чувствительности опухолей, обусловленных мутациями генов предрасположенности BRCA, к химиотерапевтическим препаратам;

- лучшие результаты 5-ти летней выживаемости - 87.4% (р<0,5) по сравнению со спорадическим РМЖ.

7. Медико-генетическое консультирование является необходимым звеном онкопрофилактической помощи-использование ДНК-

диагностических методов позволяет разработать подход к ранней диагностике, лечению и профилактике рака на основании индивидуального генотипа пациента.

Считаем своим долгом выразить глубокую признательность руководителю отделения амбулаторных методов диагностики и лечения, профессору В.В.Брюзгину; в.н.с. отделения онкогинекологии, профессору К.И.Жордания; в.н.с. отделения патоморфологии М.А.Шабанову; врачу-цитогенетику лаборатории клинической онкогенетики О.П.Кириченко; м/с той же лаборатории JI.A. Денисовой; гл.н.с. лаб. молекулярной биологии МГНЦ РАМН A.B. Карпухину", с.н.с. той же лаборатории Н.И. Поспеховой, за сотрудничество и помощь при проведении настоящего исследования. Мы также хотели бы поблагодарить в.н.с. лаборатории клеточных и вирусных онкогенов НИИ Канцерогенеза И.Б. Зборовскую за рецензирование работы.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Генодиагностика наследственной предрасположенности к раку молочной железы// В сбор. "Актуальные проблемы маммологии", Москва 2000, с. 145-156. (соавт. Гарькавцева Р.Ф., Хайленко В.А.).

2. Влияние терминальных мутаций гена BRCA 1 на фенотипическое проявление рака молочной железы// Тезисы IV Ежегодной Российской Онкологической Конференции (ESMO) Москва 2000, с.84-85. (соавт. Поспехова Н.И., Шабанов М.А.и др.).

3. Наследуемые вариации структуры генов BRCA 1/2 ответственных за предрасположенность к раку молочной железы// Тезисы II (четвертого) съезда медицинских генетиков Курск 2000 с. 266-267. (соавт. Карпухин A.B., Поспехова Н.И. и др.).

4. Молекулярная диагностика предрасположенности к раку молочной железы и/или яичников: определение мутаций генов BRCA// Тезисы II съезда Онкологов стран СНГ, Украина Киев 2000, с. 274. (соавт. Карпухин A.B., Поспехова Н.И. и др.).

5.Возможности клинического применения генодиагностики предрасположенности к раку молочной железы и профилактического лечения носителей этого заболевания// В сбор. "Актуальные вопросы маммологии", Москва 2001, с. 127-132. (соавт. Гарькавцева Р.Ф., Поспехова Н.И.).

6. Генетическая гетерогенность и медико-генетическое консультирование наследственных форм рака.// Врач, Москва 2001, с 18-19. (соавт. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Белев Н.Ф.).

7. Наследственная предрасположенность и молекулярные маркеры в оценке генетического прогноза развития рака молочной железы и/или рака яичников// Тезисы V Ежегодной Российской Онкологической Конференции (ESMO), Москва 2001, с. 156. (соавт. Поспехова Н.И., Брюзгин В.В.).

8. Наследственные формы рака яичников: диагностика, генетическая гетерогенность, клинические особенности, медико-генетическое консультирование// В сбор. "Современные экспериментальные и клинические подходы к диагностике и рациональному лечению рака," Москва 2001, с.39-46. (соавт. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Жордания К.И.).

9. Наследственный рак: идентификация, генетическая гетерогенность, медико-генетическое консультирование// Вестник Российской Академии Медицинских Наук, Москва 2001, N 9, с.27-32. (соавт. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П.)

10. Sequence variations of BRCA 1 gene in breast/ovarian ccancer families from Russia// Breast Cancer Linkage Concortium 1999, Amsterdam p.245. (соавт. Karpukhin A., Pospekhova N.).

1!. Association of BRCA 1 gene single nucleotide polymorphisms with the occurrence of breast or ovarian cancer in families under inherited predisposition// The III International Workshop on Advanced Genomics 2000, Japan p. 147(соавт. Karpukhin A., Pospekhova N.).

12. New sequence variations of BRCA 1 gene correlative to breast/ovarian cancer family phdnotype// IV International Balkan Meeting on Human Genetics 2000, Yugoslavia p.326. (соавт. Karpukhin A., Pospekhova N.).

13. Analisys of BRCA 2 gene sequence variations in breast/ovarian cancer

families from Russia// IV International Balkan Meeting on Human Genetics 2000, Yugoslavia p.326. (соавт. Karpukhin A., Khomich E.).

14. Inherited variations of BRCA 1 gene in breast/ovarian cancer family and family phenotype// The 3 HUGO Pacific Meeting and the 4 Asia-Pacific Conference on Human Genetics 2000, China p.123. (соавт. Karpukhin A., Pospekhova N.).

15. Mutations and sequence variations of breast/ovarian cancer families from Russia// European Journal of Human Genetics 2001, V9,S1 p. 115. (соавт. Loginova A., Pospekhova N.)

16. Sequence variations of BRCA 2 gene in breast/ovarian cancer families from Russia// European Journal of Human Genetics 2001 V9, SI, p. 115. (соавт. Pospekhova N., Khomich L.)

17. The occurrence of breast or ovarian cancer in families under inherited predisposition is associated with single nucleotide polymorphisms of BRCA 1 gene// European Journal of Human Genetics 2001, V9, SI p. 114. (соавт. Karpukhin A., Pospekhova N.).

18. Частоты однонуклеотидных полиморфизмов и мутаций в гене BRCA1 при наследственно обусловленном раке молочной железы и/или раке яичников. Доклады Академии Наук (ДАН), Москва 2002, Т383, N 5, с. 1-4. (соавт. Карпухин А.В., Поспехова Н.И.).