Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:Мутация гена BRAF V600E

На правах рукописи

БЫКОВ Михаил Андрианович

МУТАЦИЯ ГЕНА ВИАР У600Е: ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ЛЕЧЕНИИ ПАПИЛЛЯРНОГО РАКА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.01.17 - хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

21 ОКТ 2015

005563477

Санкт-Петербург - 2015

005563477

Работа выполнена на кафедре общей хирургии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Первый Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

Семёнов Дмитрий Юрьевич - доктор медицинских наук, профессор.

Официальные оппоненты:

Бубнов Александр Николаевич, доктор медицинских наук, профессор кафедры факультетской хирургии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет».

Ванушко Владимир Эдуардович, доктор медицинских наук, главный научный сотрудник отдела хирургии эндокринных органов ФГБУ «Эндокринологический научный центр» МЗ РФ.

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» МЗ РФ.

Защита диссертации состоится «_»_2015 г.

в_часов на заседании диссертационного совета Д 208.090.05 ГБОУ

ВПО «Первый Санкт-Петербургский Государственный медицинский Университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ (197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д.6-8; тел. 8(812)338-71-04, e-mail: usovet@spb-gmu.ru) в зале Ученого Совета.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский Государственный медицинский Университет имени академика И.П. Павлова» Минздрава России и на сайте www.spb-gmu.ru

Автореферат диссертации разослан «_»_2015 г.

Ученый секретарь совета доктор медицинских наук, доцент

Мясникова Марина Олеговна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Рак щитовидной железы (РЩЖ) — наиболее часто встречающаяся опухоль эндокринной системы (Fleming I.D. et al., 1998; Davies L., Welch H., 2006;). В России отмечается увеличение количества больных РЩЖ с 55,0 на 100 000 населения в 2003 г., до 93,2 в 2013 г., когда было выявлено 9 092 новых случаев заболевания (Состояние онкологической помощи.., 2014). Папиллярный рак является наиболее распространенным гистологическим типом РЩЖ, увеличение заболеваемости которым связано с улучшением диагностики этого вида рака, особенно микрокарцином папиллярного строения (Васьков В.М. и др., 2003; Leenhardt L. et al., 2004).

Общепринятым методом диагностики папиллярного РЩЖ является тонкоигольная аспирационная биопсия, которая имеет высокую диагностическую точность. Однако возможности этого исследования в отношении выявления фолликулярного варианта папиллярного рака ограничены. Нередко у больных диагностируется фолликулярная опухоль, после чего выполняется неадекватный объем операции, что требует впоследствии повторного вмешательства в объеме завершающей тиреоидэктомии (Любаев В.Л. и др., 2007; Назаров В.А., Вон С.А., 2009). Таким образом, повышение чувствительности и специфичности дооперационной диагностики РЩЖ важно с точки зрения выработки дальнейшей тактики лечения. Однако принятая в настоящее время тактика лечения и, в частности, хирургическая тактика, основана на гистологической классификации и стадии по TNM (Cooper D.S. et al., 2006). В связи с этим возникает проблема не только своевременной и точной диагностики, но и прогнозирования течения опухолевого процесса, что позволит выбрать оптимальный для каждого пациента алгоритм лечения. Индивидуальный подход с учетом прогностических критериев может позволить улучшить отдаленные результаты лечения.

Степень разработанности темы исследования. В настоящее время большинство исследователей рассматривают в качестве перспективных подходов к диагностике онкозаболеваний использование достижений молекулярной генетики, способствующих поиску и внедрению новых диагностических онкомаркеров (Коган Е.А. и др., 2006; Agretti P. et al., 2012). Появились сообщения о возможности использования молекулярного анализа различных мутаций, в частности, BRAF-мутации в образцах тонкоигольной пункционной биопсии в качестве факторов прогноза РЩЖ (Bellevicine С. et al., 2012; Romei С. et al., 2012). Исследователи полагают, что внедрение такого подхода в клиническую

практику повысит диагностическую точность цитологического исследования пунктатов из узлов щитовидной железы (ЩЖ) и будет способствовать улучшению дооперацио нной диагностики РЩЖ. В этом аспекте активно обсуждается вопрос прогностической ценности В11АР-мутации (Румянцева У.В. и др., 2006; ЕН5е1 Л. е1 а1., 2012). Однако, сведения о частоте встречаемости данной мутации при различных вариантах папиллярного РЩЖ, а также о ее диагностической и прогностической значимости единичны и не систематизированы. Представляется, что дальнейшее получение и анализ информации позволит улучшить диагностику и хирургическую тактику лечения РЩЖ, и, соответственно, повысить клиническую эффективность лечения данной категории больных.

Цель исследования - совершенствование хирургической тактики лечения папиллярного рака щитовидной железы за счет внедрения в дооперационную диагностику определения мутации гена ВЯАР У600Е. Задачи исследования:

1. Разработать и апробировать методы определения ВЯАР-мутации в материале тонкоигольной аспирационной биопсии и парафинизированных блоках у пациентов с высокодифференцированным раком щитовидной железы.

2. Провести сравнительный анализ частоты встречаемости спорадической мутации гена ВЯАР в различных вариантах высокодифференцированного рака щитовидной железы в популяции жителей Санкт-Петербурга.

3. Оценить диагностическую ценность выявления В Я АР-мутации в дооперационном выявлении папиллярного рака щитовидной железы.

4. Изучить прогностическое значение наличия ВЯАР-мутации у больных раком щитовидной железы.

5. Разработать хирургическую тактику лечения папиллярного рака щитовидной железы с учетом диагностических и прогностических возможностей генетических методов.

Научная новизна. В работе впервые определена роль выявления мутации гена ВЯАР У600Е в качестве фактора, определяющего тактику хирургического лечения папиллярного рака щитовидной железы.

Впервые выявлены взаимосвязи наличия мутации гена ВЯАР в ткани щитовидной железы с клиническими и морфологическими особенностями рака щитовидной железы, а также определена прогностическая значимость данного фактора.

Продемонстрированы возможности нового высокотехнологичного метода исследования - определения мутации гена ВКАБ в материале

тонкоигольной аспирационной биопсии образований щитовидной железы, на основании полученных данных обоснованы направления дальнейшего совершенствования алгоритмов диагностики и хирургического лечения рака щитовидной железы.

Практическая значимость работы. Разработан и апробирован метод определения ВЯЛТ-мутации у пациентов с папиллярным раком щитовидной железы, доказана его эффективность. Результаты работы подтвердили высокую диагностическую значимость определения мутации гена ВЯАР, что позволяет значительно улучшить дооперационную диагностику и усовершенствовать тактику хирургического лечения папиллярного рака щитовидной железы путем выполнения оптимального объема оперативного вмешательства.

Новый подход к диагностике узловых образований щитовидной железы на основе использования методов ультразвукового, цитологического и молекулярно-генетического анализа позволяет уточнить прогноз заболевания и оптимизировать диагностические и лечебные протоколы при раке щитовидной железы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Мутация гена ВИАР У600Е является диагностическим маркером папиллярного рака щитовидной железы. Выявление мутации гена ВЯАР У600Е может быть использовано в качестве дополнительного метода дооперационной диагностики папиллярного рака щитовидной железы.

2. ВЯАР-мутация является фактором неблагоприятного прогноза при папиллярном раке щитовидной железы.

3. Выявление ВЯЛИ-статуса опухоли на дооперационном этапе позволяет оптимизировать хирургическую тактику лечения папиллярного рака щитовидной железы за счет индивидуального подхода к выбору объема оперативного вмешательства.

Внедрение в практику. Предлагаемый метод определения мутации гена ВЯАР У600Е используется в практической работе онкологического отделения клиники общей хирургии ПСПбГМУ им. И.П. Павлова (СПб., ул. Л. Толстого 6-8). Полученные результаты используются при подготовке студентов, аспирантов, врачей-интернов и клинических ординаторов на кафедре общей хирургии (СПб., ул. Л. Толстого 6-8).

Апробация работы. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Алмазовские чтения 2011», посвещенной 80-летию со дня рождения академика РАМН В.А. Алмазова (Санкт-Петербург, 2011); II Всероссийском конгрессе с участием стран СНГ «Инновационные технологии в эндокринологии» (Москва, 2014);

Ежегодном европейском тиреодологическом конфессе (Сантьяго де Компостело, Испания, 2014); 2445 заседании Хирургического общества Пирогова (Санкт-Петербург, 2015).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них: 3 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования РФ для публикаций основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, и 1 статья в зарубежном медицинском журнале.

Личное участие автора в получении результатов. Автором лично выполнено планирование исследования, проведен ретроспективный анализ у 100% больных. Осуществлялись обследование и подготовка пациентов к операции. Около 70% больных, включенных в исследование, было прооперировано при непосредственном участии автора, 15% операций выполнил самостоятельно. Автор освоил методы, применяемые для получения и оценки результатов, провел сравнительное исследование данных основных клинических, лабораторных и инструментальных исследований. Автором выполнены анализ, статистическая обработка и описание материала.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 1 рисунком. Указатель использованной литературы содержит 256 библиографических источников, в том числе 87 отечественных и 169 иностранных публикаций.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Для решения поставленных задач проанализированы результаты обследования и лечения 267 пациентов с узловыми образованиями ЩЖ, прооперированных в клинике общей хирургии ПСПбГМУ им. акад. И.П.Павлова в период с 2001 по 2014 гг. Дизайн работы состоял из двух этапов. Первый этап заключался в молекулярно-генетическом исследовании операционного материала (парафиновые блоки) 107 пациентов высокодифференцированным РЩЖ. Проведен ретроспективный анализ частоты встречаемости В11АР-мутации у пациентов с различными гистологическими вариантами заболевания.

Второй этап работы включал исследование мутации ВЯЛР У600Е в материале тонкоигольной пункционной биопсии больных с узловыми образованиями ЩЖ. Помимо стандартного цитологического исследования был выполнен генетический анализ.

У всех пациентов применяли единый алгоритм предоперационного обследования, включавший сбор анамнеза, клинико-лабораторное обследование, ультразвуковое исследование и тонкоигольную аспирационную биопсию ЩЖ. Изотопные и лучевые методы исследования применяли по показаниям. У всех больных определяли уровни ТТГ, по показаниям свободный ТЗ и Т4.

Забор материала для генетического анализа проводили на дооперационном этапе при выполнении ТАБ узловых образований ЩЖ под ультразвуковым контролем либо интраоперационно.

Две трети полученного пункционного материала подвергали цитологическому исследованию, одну треть направляли на генетический анализ. Далее выполняли молекулярно-генетическое исследование на наличие в материале пункционной биопсии мутации У600Е гена В11АЕ Окончательную верификацию диагноза проводили на основании данных > гистологического исследования.

На первом этапе в исследуемую группу вошли 107 пациентов с ВДРЩЖ. Все пациенты были оперированы. Показанием к операции являлись данные цитологического исследования материала ТАБ (папиллярный рак или фолликулярная опухоль). В результате послеоперационного гистологического исследования у всех пациентов диагностирован ВДРЩЖ (папиллярный или фолликулярный рак).

Средний возраст пациентов составил 51,2±11,6 лет. Соотношение мужчин и женщин 1:9 (мужчин 10,3%, женщин - 89,7%). В зависимости от гистологической структуры опухоли все пациенты были разделены на три группы: папиллярный рак классический вариант - 57 больных (53,3%), папиллярный рак фолликулярный вариант - 28 больных (26,2%), фолликулярный рак - 22 пациента (20,5%).

На втором этапе работы нами было обследовано 160 пациентов с узловыми образованиями ЩЖ. Средний возраст обследованных пациентов составил 52,1±8,5 лет. Соотношение мужчин и женщин 1:4,5 (мужчины -18,1%, женщины - 81,9%). Помимо стандартного исследования, всем больным было выполнено молекулярно-генетического исследования материала ТАБ. По результатам цитологического исследования ТАБ пациенты были разделены на группы: папиллярный рак, фолликулярная опухоль и узловой коллоидный зоб. На долю рака пришлось 65,6% (105) случаев, в 23,8% (38) случаев, результат был охарактеризован как

неопределенный, доброкачественные изменения в ЩЖ выявлены в 17 (10,6%) случаях.

В этой выборке также все пациенты были оперированы, показанием являлись данные цитологического исследования ТАБ (ПР, подозрение на ПР, фолликулярная опухоль) и наличие узла большого размера, вызывающего компрессионный синдром (сдавление и смещение трахеи, пищевода).

Анализ распределения пациентов с диагнозом ПРЩЖ по стадиям заболевания (Т1<ГМ) показал, что около половины пациентов имели стадию Т3, таких случаев было 48 (45,3%). Треть пациентов имели стадию Ть у многих этих пациентов размер первичной опухоли был меньше или равен одному сантиметру (Т1а). Количество пациентов со стадией заболевания Т2 составило 10 (9,4%) случаев, со стадией заболевания Т4 - составило 11 (10,4%) случаев.

Половина пациентов в исследовании не имели регионарные метастазы - заболевание было выявлено на стадии N0 - 52 больных (49,1%). Поражение регионарных лимфатических узлов диагностировано у 54 (50,9%), из них КГ1а - 39 больной (36,8%) и Ы1Ь - 15 пациентов (14,1%). Отдаленные метастазы были диагностированы у 3 пациентов (2,8%). По данным послеоперационного гистологического исследования диагноз ВДРЩЖ (ПР или ФР) был подтвержден у 107 пациентов (таблица 1).

Таблица 1 - Распределение пациентов с узловыми образованиями ЩЖ в зависимости от цитологического и гистологического диагноза (п=160)

Цитологический диагноз п Окончательный гистологический диагноз п %

Узловой коллоидный зоб 17 Узловой коллоидный зоб 17 10,6

Папиллярный рак 105 Папиллярный рак 101 63,1

Фолликулярный рак 1 0,6

Узловой коллоидный зоб 3 1,9

Фолликулярная опухоль 38 Фолликулярная аденома 27 16,9

Узловой коллоидный зоб 6 3,8

Папиллярный рак 5 3,1

Всего 160 160 100

Среди пациентов с подтвержденным по данным гистологического исследования папиллярным раком, особый интерес представляют больные с размером опухоли 1,0±0,3 см - «маленький» рак ЩЖ. Если следовать рекомендациям Согласительной комиссии, объем операции в данном случае - гемитиреоидэктомия. Однако в ряде случаев у этой категории больных встречается прорастание капсулы, что определяет стадию как Т3 и требует выполнения тиреоидэктомии. Также обнаруживаются пораженные регионарные лимфатические узлы, что диктует расширение объема операции и дальнейшей тактики лечения (РЙТ). Задачей являлось выделить группу пациентов, которых размер опухоли не превышал 1,0±0,3 см и проанализировать прогностические возможности выявления ВКАР-мутации для определения тактики лечения. В данную подгруппу вошли 44 пациента с ПРЩЖ, средний возраст - 51,9±8,5 лет (мужчины -15,9%, женщины - 84,1%).

Методы лечения. Всем больным было проведено хирургическое лечение, показаниями к которому были:

1. выявленные при цитологическом исследовании аспирата узла признаки злокачественности у 105 пациентов (65,6%);

2. невозможность подтвердить или исключить наличие рака ЩЖ в 38 случаях (23,8%);

3. наличие узла большого размера, вызывающего компрессионный синдром у 17 (10,6%) пациентов (сдавление и смещение трахеи, пищевода).

При выборе хирургической тактики придерживались клинических рекомендаций по диагностике и лечению узлового зоба Европейской Тиреоидологической Ассоциации (2006), рекомендаций Российской Ассоциации Эндокринологов (2004) и клинических рекомендаций Согласительной комиссии по диагностике и лечению дифференцированного рака щитовидной железы (2008).

При диагностированном на дооперационном этапе с помощью ТАБ папиллярном РЩЖ объем оперативного вмешательства определяли на основании результатов ТАБ, данных дооперационного обследования и интраоперационной ревизии. У пациентов с папиллярной карциномой Т^оМо без признаков инвазии в окружающие ткани и метастазирования в регионарные лимфоузлы допускалось выполнение гемитиреоидэктомии.

В случае выявления стадии более чем Т^дМд выполняли тиреоидэктомию с биопсией лимфоузлов центральной (VI) группы. Если на этапе дооперационного или интраоперационного обследования появлялось подозрение на наличие регионарных метастазов РЩЖ, выполняли биопсию лимфатических узлов соответствующей группы.

В группе больных с неопределенным результатом цитологического исследования (ФО), при выполнении диагностической операции объем оперативного вмешательства определяли на основании данных интраоперационного обследования, т.е. макроскопической картины изменений в ЩЖ и результатов срочного гистологического исследования.

При подтверждении доброкачественной природы узла ЩЖ и отсутствии узловых изменений во второй доле ЩЖ объем операции ограничивали удалением доли и перешейка ЩЖ. Если во время операции по данным срочного гистологического исследования диагностировали РЩЖ (кроме папиллярной карциномы T1N0M0), объем оперативного вмешательства расширяли: выполняли экстирпацию ЩЖ.

При выявлении РЩЖ выполняли биопсию лимфоузлов центральной (VI) группы со срочным цитологическим и/или гистологическим исследованием. При отсутствии данных о наличии метастазов операцию завершали, при подтверждении данных о наличии метастатического поражении лимфатических узлов выполняли центральную лимфодиссекцию.

Методы исследования. УЗИ щитовидной железы и лимфоузлов шеи производили на аппарате FFsonic FUKUDA DENSHI с использованием стандартных линейных датчиков 7,5 Мгц в кабинете ультразвуковой диагностики клиники общей хирургии (зав. отделением Т.В. Малахова).

Гистологическое исследование было выполнено по стандартной методике на парафиновых срезах с окраской гематоксилином и эозином. Срочное гистологическое исследование узловых образований ЩЖ и регионарных лимфатических узлов выполняли также по стандартной методике на основе получения замороженных срезов без фиксации, окрашенных гематоксилином в патологоанатомическом отделении ПСПбГМУ им. И.П. Павлова (зав. патологоанатомическим отделением к.м.н. A.M. Фионик). Окончательный диагноз был поставлен на основании данных гистологического заключения.

Тонкоигольную аспирационную биопсию узловых образований ЩЖ выполняли в условиях асептики в перевязочной под контролем УЗИ. Пациент находился в положении на спине, под плечи ему подкладывали валик для разгибания шеи. При наличии нескольких узлов в ЩЖ пунктировали образования с ультразвуковыми признаками злокачественности, а при идентичности ультразвуковой картины по возможности осуществляли пункцию всех узлов.

При выполнении тонкоигольной аспирационной биопсии пункцию одного узла проводили трижды. Узловые образования более 1 см в диаметре

пунктировали в центре и по периферии. Если при УЗИ обнаруживали узел менее 1 см, имеющий признаки злокачественности, то пункцию проводили в центре узла. При пункции кистозного узла аспирировали все его содержимое.

Для проведения тонкоигольной аспирационной биопсии использовали стандартные иглы № 22 длиной 4 см с наружным диаметром 0,8 мм. Пункцию проводили стерильным шприцом 10-20 мл без предварительного обезболивания. При выполнении пункции конец иглы визуализировался на мониторе ультразвукового аппарата, что позволяло прицельно направлять его в место пункции. Полученный путем аспирации материал из иглы наносили и равномерно распределяли на предметном стекле, высушивали при комнатной температуре, затем окрашивали. Цитологическое исследование аспирата проводили в цитологической лаборатории ПСПбГМУ им. И.П. Павлова (зав. цитологической лабораторией к.м.н. Н.М. Соколова).

Метод выявления BRAF- мутации. Определение наличия мутации в гене BRAF в парафиновых блоках (операционном материале) выполнялась у пациентов с высокодифференцированным РЩЖ. Методика выделения ДНК заключалась в депарафинизации срезов ксилолом и этанолом и последующей обработке образца протеиназой К в течение ночи. Дальнейшее выделение ДНК проводилось сорбентным методом с использованием гуанидина. Для депарафинизации брали 10-12 срезов парафинового блока материала от одного пациента толщиной 5-10 мкм, которые после нарезки переносились в эппендорф. Для предотвращения перекрестной контаминации генетическим материалом образцов, после нарезки каждого образца микротомный нож тщательно очищался ксилолом. Далее к образцам добавляли по 1 мл ксилола, перемешивали на вортексе и инкубировали в термостате при 65°С. После центрифугирования образцов 1 мин при 13 000 об/мин прозрачную часть супернатанта удаляли. Процедуру повторяли, затем проводили аналогичные последовательные отмывки 96° и 70° этиловым спиртом. После последней отмывки осадок высушивали при 75°С до исчезновения запаха, добавляли 200 мкл лизирующего раствора, содержащего в качестве детергента 2% Triton Х-100, перемешивали на вортексе и инкубировали 10 мин при 99°С. После остывания к реакционной смеси добавляли 15 мкл водного раствора протеиназы К (НПО "СибЭнзим", Новосибирск), перемешивали на вортексе, помещали пробы в ротатор в режиме вращения и инкубировали при 60°С в течение ночи.

Для выделения ДНК из полученного раствора на следующий день к образцам добавляли лизирующий раствор, содержащий 4M тиоционата гуанидина, 1% Triton Х-100 и 1% Твин-20, а также смесь сорбентов Silica Gel и Diatomaceous Earth (Sigma-Aldrich, США). После перемешивания на вортексе и инкубации в термостате при 80°С в течение 15 минут пробы помещались в ротатор на 15 минут для связывания ДНК с сорбентом. Добавляли холодный изопропиловый спирт и центрифугировали пробы 10 минут при 13 ООО об/мин для дополнительного осаждения ДНК, надосадочную жидкость удаляли и проводили 2-х кратную отмывку осадка 70% этиловым спиртом. После отмывки осадок высушивали 10 минут при 75 °С и элюировали ДНК в бидистиллированной воде при таких же условиях. Полученный раствор центрифугировали для осаждения сорбента, а супернатант, содержащий раствор ДНК, переносили в чистый эппендорф и использовали для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Выделение ДНК из материала тонкоигольной аспирационной биопсии щитовидной железы. После выполнения биопсии полученный материал помещали в стерильную пробирку, содержащую 2 мл PBS-буфера (Santa Cruz Biotechnology, США) и 142 мкл ACD-A-буфера (Haemonetics, США) и перемешивали переворачиванием. Затем 300 мкл полученного раствора аспирата центрифугировали при 13 000 об/мин в течение 10 мин, супернатант частично удаляли, оставив для выделения осадок и 100 мкл надосадочной жидкости. Выделение ДНК осуществляли с помощью комплекта реагентов ПРОБА-НК (ООО «ДНК-Технология», Москва) согласно прилагаемой инструкции.

Постановка ПЦР. Определение мутации Т1799А (V600E) в гене BRAF как в случае ДНК из парафиновых блоков, так и в случае материала аспирационной биопсии проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием аллельспецифичных праймеров. Для каждого образца ДНК ставятся параллельно две реакции ПЦР, в каждой из которых используется праймер, комплементарный одному из вариантов типируемой мутации. В случае если в ДНК пациента мутация отсутствует, то ПЦР проходит только в одной пробирке, где использовался праймер, комлиментарный аллелю нормы. При наличии мутации ПЦР пройдет в обеих пробирках.

Общий праймер, используемый в обеих реакциях, имел нуклеотидную последовательность 5'-ggccaaaatttaatcagtgga-3'. В качестве специфичного праймера для детекции аллеля нормы (аллель «Т»), а также оценки адекватности забранного материала, использовался праймер

с последовательностью 5'-gtgattttggtctagctacagt-3', для мутантного аллеля «А» праймер 5'-gtgattttggtctagctacaga-3' (все праймеры ЗАО «Синтол»),

ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» (ООО «ДНК-Технология», Москва). В качестве фермента для амплификации ДНК использовалась Hot-Taq полимераза производства ЗАО «Силекс». После приготовления амплификационной смеси в пробирки добавляли 50 мкл минерального масла для предотвращения испарения во время реакции. ПЦР состояла из 40 циклов с предварительной денатурацией в течение 9 мин при 95°С для активации полимеразы. Дальнейшие этапы денатурации, отжига и синтеза происходили в течение 35 с при 95°С, 58°С и 72°С соответственно.

Детекцию продуктов амплификации осуществляли с помощью электрофореза в 7% полиакриламидном геле с окрашиванием раствором бромистого этидия (LOBA, Австрия) и последующей визуализацией в УФ-свете при длине волны 302нм на приборе Gel Doc (Bi-oRad, США). Считалось, что ПЦР прошла, если в соответствующей дорожке на геле наблюдался фрагмент весом 119 пар нуклеотидов. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК-маркеры 100 bp (НПО "СибЭнзим", Новосибирск).

Статистическая обработка полученных данных выполнена на персональном компьютере при помощи пакета программ для статистической обработки данных STATISTICA for Windows 7,0. Использовали методы параметрической и непараметрической статистики. Методы описательной статистики включали в себя оценку среднего арифметического (М), средней ошибки среднего значения (ш) - для признаков, имеющих непрерывное распределение, а также для частоты встречаемости признаков с дискретными значениями. Определение достоверности различий между качественными показателями сравниваемых групп проводили с помощью критерия

Для определения наличия количественной характеристики выраженности связи между частотой BRAF-мутации и характеристиками заболевания (в частности, частотой поражения лимфатических узлов, мультицентричностью, частотой прорастания капсулы щитовидной железы опухолью, частотой развития рецидивов) проводили многомерный регрессионный анализ. Для данных видов анализа оценку качественных показателей проводили по системе 1 - есть, 0 - нет. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы принимали равным 0,05.

В ходе обработки данных оценивали эффективность использованных методов диагностики путем сопоставления с референтным диагнозом, то есть установленным с помощью наиболее надежного метода.

Для таких методов дифференциальной диагностики, как тонкоигольная аспирационная биопсия с цитологическим исследованием и гистологическое исследование удаленной щитовидной железы с выявлением мутации У600Е гена ВЯАР, оценивали чувствительность, специфичность, диагностическую точность, предсказательную ценность положительного и отрицательного результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На первом этапе работы проведено определение ВКАР-мутации методом фореза в гистологическом материале после депарафинизации. Анализ встречаемости мутации гена ВЯАР у пациентов с ВДРЩЖ (п=107) показал, что данная мутация не встречается в случаях ФРЩЖ (п=22), частота встречаемости ВЯАР-мутации при ПРЩЖ составила 62,4% (мутация гена ВЯАР была обнаружена у 53 пациентов из 85).

Анализ частоты встречаемости ВКАР-мутации в группе больных с ПРЩЖ показал, что при классическом варианте ПР мутация гена ВЯАР была обнаружена у 40 пациентов из 57 (70,2%), при ФВПР данная мутация была выявлена у 13 пациентов из 28 (46,4%).

Таким образом, учитывая высокую встречаемость ВЯАР-мутации при ПРЩЖ, данный маркер может быть использован в диагностике ПРЩЖ.

На следующем этапе было проведено определение ВКАР-мутации в пункционном материале из узловых образований ЩЖ. Пациенты были разделены на 3 группы в зависимости от результатов цитологического исследования - коллоидный зоб (п=17), папиллярный рак (п=105) и фолликулярная опухоль (п=38).

Все пациенты были прооперированы. Показанием к операции были: папиллярный рак и фолликулярная опухоль по данным ТАБ. У 17 пациентов с диагнозом узловой коллоидный зоб по данным цитологического исследования показанием к операции был узловой зоб больших размеров со смещением органов шеи.

Всем прооперированным больным было выполнено гистологическое исследование операционного материала, по результатам которого проведен сравнительный анализ данных цитологического и гистологического исследований (таблица 2).

Как видно из таблицы 2, в случаях цитологического ответа узловой коллоидный зоб, диагноз подтвердился у всех пациентов по результатам планового гистологического исследования. В группе пациентов

с цитологическим ответом ПР этот диагноз подтвердился у 101 пациента, у одного больного был выявлен фолликулярный рак. В 3 случаях диагностирован узловой коллоидный зоб.

В случае выявления фолликулярной опухоли по данным цитологии, ПР был диагностирован в 5 случаях, тогда как в 27 случаях диагностирована фолликулярная аденома и в 6 случаях узловой коллоидный зоб. Таким образом, цитологический метод имеет ряд ограничений, что зачастую приводит к выполнению неадекватного объема операции. В связи с этим нами была предпринята попытка улучшить диагностику ВДРЩЖ путем внедрения в дооперационную диагностику определения мутации гена В ПАР.

В группе пациентов с дооперационным цитологическим диагнозом «коллоидный зоб» мутантного типа гена ВЯАР не было выявлено ни в одном случае, что полностью совпало с данными планового гистологического послеоперационного исследования, при котором были поставлен диагноз узлового коллоидного зоба (таблица 2).

Таблица 2 - Результаты планового гистологического исследования и выявление мутации гена ВЯАРУбООЕ у больных с узловыми образованиями ЩЖ (п=160)

Цитологический Кол- Окончательный Кол- ВЯАР- ВИА!7-

диагноз во гистологический диагноз во мутация ЕСТЬ мутации НЕТ

Узловой 17 Узловой коллоидный зоб 17 — 17

коллоидный зоб

Папиллярный рак 105 Папиллярный рак 101 60 41

Фолликулярный рак 1 - 1

Узловой коллоидный зоб 3 - 3

Фолликулярная 38 Фолликулярная аденома 27 - 27

опухоль Папиллярный рак 5 5 -

Узловой коллоидный зоб 6 - 6

Всего 160 160 65 95

Из 105 пациентов с цитологическим ответом папиллярный рак, диагноз не подтвердился у 4-х больных и ни у кого из них мутации выявлено не было. У 101 пациента с подтвержденным по данным гистологии папиллярным раком мутация гена ВЯАР была выявлена в 60 случаях (59,4%).

В третью группу вошли пациенты с цитологическим диагнозом «фолликулярная опухоль». По данным гистологической оценки препаратов у 27 пациентов был поставлен окончательный диагноз фолликулярная аденома, у 6 пациентов - узловой коллоидный зоб и у 5 - папиллярный рак. Мутантный тип гена BRAF не определялся ни в одном из образцов, взятых у пациентов с фолликулярной аденомой и узловым коллоидным зобом, однако во всех 5 образцах, взятых у пациентов с ПР, был обнаружен мутантный тип гена BRAF. Соответственно, при наличии в материале ТАБ пациентов с фолликулярной опухолью мутации гена BRAF, можно утверждать, что диагностирован ПР.

Полученные данные позволяют у ряда пациентов ставить показания к операции по поводу РЩЖ с соответствующим объемом оперативного вмешательства и соблюдением онкологических принципов. Это позволит выполнить радикальную операцию в один этап, то есть избавит пациента от повторной операции в объеме завершающей тиреоидэктомии. Отсутствие данной мутации позволяет выполнять операцию в объеме гемитиреоидэктомии с последующим гистологическим исследованием.

Критерии достоверности выявления BRAF-мутации при дооперационной диагностике ПР представлены таблице 3.

Таблица 3 - Критерии достоверности метода выявления мутации У600Е гена ВЯАР у пациентов с подозрением на рак щитовидной железы

Параметры BRAF-мутация Доверительный интервал

Предсказательная ценность положительного теста 100% 92-100%

Чувствительность теста 86% 80-87%

Предсказательная ценность отрицательного теста 86% 78-86%

Специфичность теста 100% 91-100%

Диагностическая точность метода 92% -

Оценка прогностической ценности метода выявления ВКАР-мутации при папиллярном РЩЖ. Для выявления прогностической значимости ВКАР-мутации оценивали общепринятые признаки агрессивного течения опухоли, такие как мультицентричность, регионарное и отдаленное метастазирование, прорастание капсулы органа, а также рецидив заболевания.

Зависимости частоты выявления мутации от возраста пациентов выявлено не было. Оценка зависимости частоты выявления BRAF-мутации от распределения по полу больных показало, что данный признак значимо чаще (р<0,05) выявлялся у 16 из 21 (76,2%) обследованных мужчин и у 49 из 85 (57,7%) женщин. Достоверно более частая встречаемость BRAF-мутации у лиц мужского пола объясняет тот факт, что папиллярный рак щитовидной железы у мужчин имеет более агрессивное течение и менее благоприятный прогноз.

Из 106 пациентов с папиллярным РЩЖ прорастание капсулы органа, то есть стадия ТЗ и Т4, встречалась у 59 больных. BRAF-мутация определялась у 42 из 59 больных (71,2%), а у пациентов без признаков инвазии капсулы органа (стадия TI, Т2) мутация отмечалась значимо реже - у 23 из 47 больных (48,9%).

Сравнение частоты выявления точечной мутации в зависимости количества узлов опухоли показало, что из 24 пациентов, у которых наблюдалась мультицентричность, BRAF-мутация была обнаружена в 20 случаях (83,3%). В то же время у 82 больных с наличием одного узла мутация была выявлена достоверно реже (р<0,05) - в 45 случаях (54,9%). Таким образом, пациентам с выявленной BRAF-мутацией мы можем с высокой долей вероятности прогнозировать мультицентричность опухоли, что позволит планировать адекватный объем операции.

Наиболее дискутабельным вопросом хирургической тактики лечения папиллярного рака щитовидной железы является вопрос выполнения профилактической центральной лимфодиссекции. Мы попытались выявить связь между наличием мутации гена BRAF и развитием регионарного лимфогенного метастазирования. Из 106 пациентов регионарное метастазирование было диагностировано у 54 больных. У больных с выявленным поражением регионарных лимфатических узлов (центральных и/или боковых) была обнаружена BRAF-мутация в 46 из 54 (85,2%) случаев, в то время как у пациентов без поражения лимфоузлов частота выявления точечной мутации была достоверно (р<0,05) ниже -18 случаев из 52 (34,6%).

В нашем исследовании поражение центральных лимфоузлов (VI, VII группы) наблюдалось у 39 пациентов (стадия Nía). Поражение как центральных, так и боковых лимфоузлов диагностировано у 15 больных (стадия Nlb). При оценке зависимости частоты выявления BRAF-мутации у пациентов в зависимости от стадий составила: при Nla -33 из 39 (84,6%) случаев, npnNlb- 13 из 15 (86,7%) случаев.

Полученные данные позволяют с высокой долей вероятности прогнозировать поражение регионарных лимфоузлов и, соответственно,

ставить показания к выполнению центральной лимфодиссекции. Это позволит, с одной стороны, сталировать процесс и планировать дальнейшую радиойодтерапию, с другой стороны, радикальное оперативное вмешательство позволит избежать рецидива заболевания.

Оценка частоты обнаружения мутации у больных с метастазами высокодифференцированного РЩЖ показала, что ВЯАР-мутация была выявлена у всех пациентов с отдаленными метастазами (п=3), то есть в 100% случаев. Эти случаи были представлены метастазами опухоли в легкие. У пациентов без метастазов мутация была выявлена в 60,2% случаях.

Исследование частоты развития рецидивов у больных с раком ЩЖ, включенных в исследование, показало, что рецидивы наблюдались у 10 из 106 больных, то есть в 9,4% случаях. У абсолютного большинства обследованных пациентов - в 8 случаях (80,0%) была выявлена ВКАР-мутация, соответственно у 2 человек (20,0%) - не было обнаружено данного признака. В то же время из 96 пациентов с отсутствием рецидивов мутация была обнаружена у 57 больных - в 59,4 % случаев.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о тенденции к увеличению частоты рецидивов в тех случаях, когда у больных РЩЖ выявляется ВКАР-мутация, однако малый размер выборки не позволяет сделать однозначный вывод о прогностической значимости наличия мутации в отношении развития рецидива заболевания.

Были проанализированы истории болезни пациентов с развившимися рецидивами. Из 10 больных четырем была выполнена органосохраняющая операция, в трех случаях - гемитиреоидэктомия, в одном - субтотальная резекция. Во всех случаях рецидив носил местный характер - опухолевый узел в оставленной доле и метастатическое поражение центральных лимфоузлов. В одном случае помимо центральных, наблюдалось поражение лимфоузлов III, IV, V групп. Все опухоли имели В11АР-позитивный статус. У остальных пациентов с ВКАР-позитивными опухолями рецидив был выявлен после выполнения тиреоидэктомии с ценральной лимфодиссекцией, а в двух случаях еще и боковой лимфодиссекцией. Рецидив носил характер регионарного лимфогенного метастазирования. Можно предположить, что причина рецидива в половине случаев — нерадикальный объем операции у пациентов с В11АР-позитивными опухолями.

Таким образом, проведенное исследование показало, что исследуемые признаки агрессивности опухоли, такие как инвазия органной капсулы, регионарные и отдаленные метастазы, мультицентричность, имеют прямую корреляционную зависимость с наличием ВКАР-мутации.

Частота встречаемости BRAF-мутации при «маленьком» раке щитовидной железы. Обследовали пациентов с пограничным размером опухоли 1,0±0,3 см, когда вопрос об объеме операции наиболее дискутабельный - у 44 больных. Частота выявления мутации во всех случаях микрокарцином ЩЖ составила 68,2% (в 30 из 44 образцов). Частота встречаемости BRAF мутации была сопоставима с таковой в общем пуле папиллярного РЩЖ, что опровергает имеющиеся данные о более высокой частоте встречаемости мутации в микрокарцинах ЩЖ (Zhou Y.L. et al., 2012).

Прорастание капсулы щитовидной железы было выявлено у 8 пациентов с микрокарциномами. При определении зависимости фактора инвазии в органную капсулу и наличия BRAF мутации получены следующие результаты: из 8 пациентов с прорастанием капсулы ЩЖ (сталированных по результатам окончательного гистологического исследования как ТЗ), 7 пациентов имели BRAF положительный статус (87,5%).

Регионарные лимфогенные метастазы были диагностированы у 15 из 44 больных с микрокарциномами. BRAF-мутация выявлена у 11 из 15 пациентов с регионарными метастазами (73,3%), метастатическое поражение центральной клетчатки шеи - у 9 больных, из них в 7 случаях выявлена BRAF-мутация (77,8%). Из 6 пациентов с диагностированными метастазами в боковую клетчатку шеи у 4 выявлена мутация гена BRAF. При оценке мультицентричности множественные локусы папиллярного рака были выявлены в 8 случаях микрокарцином. При этом в 87,5% случаев мультицентричного роста микрокарцинома была BRAF положительной (в 7 случаях из 8).

Полученные результаты подтверждают данные о том, что микрокарциномы щитовидной железы являются гетерогенной группой опухолей, объединённых лишь размером узлового образования, и не отражают биологической активности опухоли. Таким образом, размер опухолевого узла не может определять объем оперативного лечения.

Анализ статистических взаимосвязей наличия мутации с характеристиками опухоли. Использование многомерного регрессионного анализа, позволившего оценить связь наличия мутации со всеми перечисленными критериями в общей выборке обследуемых пациентов с ПРЩЖ (наличие метастазов в регионарные лимфоузлы (центральные, боковые), мультицентричности, прорастание капсулы ЩЖ), показало статистически значимую взаимосвязь выявления BRAF-мутации как с отдельными параметрами, так и с совокупностью вышеперечисленных показателей (таблица 4).

Многомерный регрессионный анализ показал взаимосвязь частоты выявления В11АР-мутации с комплексом признаков опухоли -мультицентричностью, прорастанием капсулы органа и поражением лимфоузлов. У 93% пациентов при наличии ВЯАР-мутации имеется хотя бы один из этих признаков, при ее отсутствии эти признаки отмечаются значимо (р<0,0001) реже - у 42% пациентов.

Таблица 4 - Результаты многомерного регрессионного анализа для всей выборки больных ПРЩЖ

Признак OR (95% CI) P*

Мультицентричность 1,3 (0,89-15,13) 0,04

Инвазия капсулы щитовидной железы 1,96 (0,74-4,15) 0,012

Метастазы в регионарные лимфоузлы 1,84(1,44-3,45) 0,023

Комплекс признаков: мультицентричность, прорастание капсулы органа, поражение лимфоузлов 1,92(1,35-4,21) 0,008

Примечания 1 * — р<0,05. 2 OR — odds ratio. 3 CI - доверительный интервал.

Аналогичными были результаты изучения наличия мутации для больных с диагностированным «маленьким раком»: выявлено наличие статистически значимых взаимосвязей выявления ВИАР-мутации с отдельными характеристиками опухоли (мультицентричность (Ж 1,42 (0,91-7,22), р=0,009; регионарное метастазирование (Ж 1,55 (0,84-2,79) р=0,005; инвазия органной капсулы СЖ 1,43 (0,71-2,74), р=0,021).

Таким образом, при выявлении на дооперационном этапе в материале ТАБ мутации гена В11АР, можно с высокой долей вероятности предположить наличие у пациента хотя бы одного из признаков агрессивного течения опухоли: мультицентричность, инвазию органной капсулы, регионарное метастазирование. Соответственно, прогнозирование у данного пациента на основании выявления ВКАР-мутации стадии тТЗ диктует необходимость выполнения тиреоидэктомии, а риск наличия регионарных лимфогенных метастазов -выполнения центральной лимфодиссекции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что точечная мутация гена BRAF является характерной для папиллярного рака щитовидной железы в популяции Санкт-Петербурга. Наше исследование подтвердило имеющиеся данные о том, что данная мутация не встречается при фолликулярном раке.

Таким образом, при выявлении на дооперационном этапе в материале ТАБ BRAF-мутации, мы можем с одной стороны, в случаях неопределенного или подозрительного результата ТАБ диагностировать папиллярный рак и выполнять радикальный объем операции в один этап, что снижает риск персистенции и рецидива заболевания. С другой стороны, при наличии в материале ТАБ BRAF-мутации мы можем с высокой долей вероятности предположить наличие у пациента хотя бы одного из признаков агрессивного течения опухоли, а именно, мультицентричность, инвазию органной капсулы, регионарное метастазирование. Соответственно, прогнозирование у данного пациента на основании выявления BRAF-мутации стадии шТЗ диктует необходимость выполнения тиреоидэктомии, а риск наличия регионарных лимфогенных метастазов - выполнения центральной лимфодиссекции. При выявлении BRAF-мутации в материале ТАБ мы можем рекомендовать выполнение тиреоидэктомии с центральной лимфодиссекцией. Использование прогностических возможностей BRAF мутации на дооперационном этапе позволит персонализировать хирургическую тактику, что, в свою очередь, приведет к улучшению отдаленных результатов лечения.

ВЫВОДЫ

1. Точечная мутация гена BRAF является характерной для папиллярного рака щитовидной железы популяции Санкт-Петербурга и встречается в 62,4% случаев и не встречается при фолликулярном раке щитовидной железы.

2. Мутация гена BRAF наиболее часто встречается в случаях классического варианта папиллярного рака щитовидной железы (70,2%), тогда как при фолликулярном варианте - в 46,4% случаев.

3. Наличие в материале тонкоигольной аспирационной биопсии мутантного типа гена BRAF с вероятностью 100% свидетельствует о злокачественности процесса в щитовидной железе, что может быть использовано в дооперационной диагностике папиллярного рака щитовидной железы.

Чувствительность метода определения BRAF-мутации при раке щитовидной железы составляет 86%, специфичность - 100%, диагностическая ценность - 92%. Предсказательная положительная ценность теста составляет 100%, предсказательная отрицательная ценность - 86%.

4. Выявление BRAF-мутации достоверно коррелирует с агрессивным течением папиллярного рака щитовидной железы, а именно -поражением регионарных лимфоузлов, мультицентричностью, прорастанием органной капсулы.

5. BRAF-мутация является прогностически неблагоприятным признаком для микрокарцином папиллярного строения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Выявление BRAF-мутации целесообразно использовать в качестве дополнительного критерия дооперационной диагностики рака щитовидной железы.

2. При выявлении BRAF мутации в материале тонкоигольной аспирационной биопсии мы можем рекомендовать выполнение тиреоидэктомии с центральной лимфодиссекцией.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Семенов, Ю.Д. Комбинированный анализ выявления мутации гена BRAF V600E и экспрессии галектина-3 в дооперационной диагностике рака щитовидной железы / Д.Ю. Семенов, М.И. Зарайский, Л.Е. Колоскова, М.Е. Борискова, И.Ю. Сабурова, П.А. Панкова, Н.С. Фещенко, О.И. Филиппова, У.В. Фарафонова, О.П. Пестерова, М.А. Быков // Клиническая и экспериментальная тиреоидологияю. - 2011. — Т. 7, № 2. — С. 49-56.

2. Семенов, Д.Ю. Использование мутации BRAF V600E в дифференциальной диагностике фолликулярных опухолей и папиллярного рака щитовидной железы и оптимизация тактики лечения / Д.Ю. Семенов, М.Е. Борискова, М.И. Зарайский, И.Ю. Сабурова, П.А. Панкова, У.В. Фарафонова, М.А. Быков // Вопросы онкологии. - 2012. - Т. 58, № 5. - С. 649-652.

3. Семенов, Д.Ю. Определение BRAF-мутации в папиллярных микрокарциномах щитовидной железы - дополнительный маркер

стратификации риска / Д.Ю. Семенов, М.Е. Борискова, М.И. Зарайский, У.В. Фарафонова, М.А. Быков // Клиническая и экспериментальная тиреоидология. - 2014. - Т. 10, № 3. - С. 36-40.

4. Зарайский, М.И. Онкопаспорт-скрининг - система стандартизированной молекулярно-генетической оценки состояния генов для выявления групп населения с повышенным риском развития онкологических заболеваний / М.И. Зарайский, Е.Е. Зуева, А.Б. Чухловин, Д.В. Чередниченко, Е.Б. Морозова, О.В. Галкина, А.С. Бельтюкова, М.В. Горчакова, И.Ю. Сабурова, А.В. Артемьева, К.Ю. Слободнюк, Е.Б. Русанова, М.В. Иванченко, М.Е. Борискова, У.В. Фарафонова, М.А. Быков, Д.Ю. Семенов // Клинико-лабораторный консилиум. - 2013. - Т. 45, № 1. - С. 13-18.

5. Boriskova, М.Е. Implication of BRAF V600E gene mutation in preoperative diagnostic of thyroid gland cancer / M.E. Boriskova, D.Y. Semyonov, M.I. Zaraisky, P.A. Pankova, U.V. Farafonova, M.A. Bikov // Eur. Thyroid J.-2012.-Vol. l,suppl l.-p. 144.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВДРЩЖ - высокодифференцированный рак щитовидной железы

МК — микрокарцинома

ПРЩЖ - папиллярный рак щитовидной железы

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РЩЖ - рак щитовидной железы

ТАБ - тонкоигольная аспирационная биопсия

УЗИ - ультразвуковое исследование

ФРЩЖ - фолликулярный рак щитовидной железы.

Лицензия ИД №00597 от 15.12.99 г. Подписано в печать 08.09.15. Авт. л. 1,0 Уч-изд. л. 1,45. Усл. печ. л. 1,5 Формат 60x84 1/16. Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ № 869/15 197022, Санкт-Петербург, улица Льва Толстого, 6-8 Издательство СПбГМУ