Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Анализ трансренальной ДНК как новый подход к диагностике злокачественных новообразований



р-

На правах рукописи

БОТЕЗАТУ ИРИНА ВИКТОРОВНА

АНАЛИЗ ТРАНСРЕНАЛЬНОЙ ДНК КАК НОВЫЙ ПОДХОД К ДИАГНОСТИКЕ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

Специальность 14.01.12 - онкология

1 9 ДПР 2012

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2012

7 Я

005018192

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук (директор - академик РАН и РАМН, д.м.н., проф. М.И. Давыдов)

Научный руководитель:

доктор биологических наук Лихтенштейн Анатолий Владимирович

Официальные оппоненты:

Якубовская Марианна Геннадиевна, доктор медицинских наук, ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, заведующая отделом химического канцерогенеза

Горбачева Лора Борисовна, доктор биологических наук, профессор, ФГБУ Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, главный научный сотрудник лаборатории количественной онкологии

Ведущая организация:

ФГБУ Медико-Генетический Научный Центр РАМН

Защита диссертации состоится « //» / СШЛ 2012 г. в ¿Учасов на заседании диссертационного совета Д 001.017.01 при ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина»

РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24. , _

[

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН.

Автореферат разослан «_. _2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ Актуальность проблемы

Канцерогенез - длительный многоступенчатый процесс накопления е клетке дефектов генов, ответственных за деление, репарацию ДНК, апоптоз и ряда других функционально значимых генов. Некоторые из этих генетических дефектов можно рассматривать в прикладном аспекте, - не как факторы патогенеза, а как опухолевые маркеры, и использовать их в диагностических целях Значимость дефекта как маркера определяется не его функциональными последствиями, а такими факторами, как степень ассоциации с онкологической патологией (насколько часто встречается при разных опухолях), простота и надежность выявления. Детекция ДНК-маркеров может служить разным целям: как собственно диагностики, так и мониторинга роста опухоли (т.е., оценкг эффективности лечения, своевременного обнаружения рецидива или метастаза), а также, в перспективе, скрининга (выявления процесса на доклиническог его стадии, формирования групп риска).

Апоптоз (или программируемая клеточная гибель) - фундаментальны? феномен, суть которого заключается в клеточном «самоубийстве», индуцированном либо различными внешними стимулами, либо неразрешимыми внутренними конфликтами (например, невозможностью репарации поврежденно? ДНК). В организме взрослого человека ежесуточно погибает около 10" клеток количество высвобождаемой во внеклеточную среду ДНК может достигать 1 г В случае возникновения в организме опухоли некоторая часть опухолевых клеток также погибает по механизму апоптоза или некроза.

Ключевой момент клеточной гибели, знаменующий необратимость процесса, - деградация ДНК до низкомолекулярных фрагментов. Большая их част! реутилизнруется в организме, меньшая - попадает в кровеносное русло (циркулирующие ДНК). Выявление в их составе специфических мутантных аллеле{ свидетельствует об онкологическом процессе.

Возникает вопрос относительно дальнейшей судьбы внеклеточной ДНК в кровеносном русле. По всей видимости, она подвергается дальнейшей деградации и экскретируется с мочой. В этом случае особое значение имеют размеры экскретируемых продуктов (основания, моно- или олигонуклеотиды, полинук-леотиды). Имеется в виду возможность использования мочи в качестве источника ДНК, происходящей из внутренней среды организма. Благодаря неинва-зивности и легкодоступное™ такая «трансренальная» (т.е., преодолевшая почечный барьер) ДНК могла бы оказаться предпочтительной альтернативой циркулирующей ДНК плазмы при выявлении генетических опухолевых маркеров.

Цели и задачи исследования

Цель работы - исследование возможности использования трансренальной ДНК как нового неинвазивного способа генодиагностики рака.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. На модели экспериментальных животных исследовать:

а) метаболическую судьбу ДНК гибнущих клеток;

б) возможность использования трансренальной ДНК для ПЦР-анализа.

2. На модели женщин-«химер» (женщин, вынашивающих плод мужского пола, и женщин-реципиентов мужской донорской крови) оценить:

а) проницаемость почечного барьера человека для циркулирующих полимерных фрагментов ДНК;

б) пригодность трансренальной ДНК человека для ПЦР.

3. У онкологических больных определить возможность выявления в трансренальной ДНК опухолевых генетических маркеров.

4. В методических исследованиях:

а) исследовать различные возможности повышения чувствительности ДНК-диагностики;

б) разработать метод пгбрндизашги-элонгацшг полинуклеотидов для вовлечения в ПЦР сверхмалых фрагментов циркулирующей ДНК;

в) оптимизировать метод плавления ДНК для сканирования мутаций 1 коротких ампликонах.

Научная новизна н практическая значимость работы

В настоящей работе впервые обнаружена проницаемость почечного барь ера экспериментальных животных и человека для фрагментированной ДН1 гибнущих клеток. Показано, что эта ДНК, названная нами трансренальной, т.е преодолевшей почечный барьер, способна служить матрицей в ПЦР. При ис следовании мочи больных с опухолями поджелудочной железы и толстого ки шечника обнаружены мутантные последовательности онкогена К-ЯАБ. Впер вые показана принципиальная возможность использования трансренально! ДНК для диагностики злокачественных новообразований.

Разработан неинвазивный метод генодиагностики рака посредством ана лиза трансренальной ДНК. Его премущества по сравнению с анализом ДН1 плазмы: неинвазивный характер, возможность получения больших количест биопробы, отсутствие сильных ингибиторов ПЦР.

Разработан оригинальный метод гибридизации-элонгации фрагментиро ванных ДНК, составляющих основную массу циркулирующей ДНК. По данныг ПЦР в реальном времени, этот метод существенно повышает чувствительност генодиагностического анализа.

Оптимизирован «открытый формат» плавления ДНК. Этот метод позво ляет, во-первых, применять для мутационного сканирования стандартные ам плификаторы для ПЦР-РВ вместо дорогостоящего высокотехнологичного обо рудования, используемого для анализа плавления ДНК с высоким разрешением и, во-вторых, повысить чувствительность детекции мутанций гена К-/М5, част обнаруживаемого в опухолевой ткани. Выявление мутаций этого онкогена име ет большое значение, поскольку определяет прогноз заболевания и стратегии лечения больных колоректальным раком и немелкоклеточным раком легки* Чувствительность разработанного метода превышает таковую секвенированн

по Сэнгеру, его применение должно способствовать снижению числа ложноот-рнцательных результатов тестирования мутантного гена К-1Ы8 и повышению эффективности таргетной терапии.

Апробация работы

Диссертационная работа была апробирована 26 декабря 2011 года на совместной научной конференции лабораторий биохимии опухолей, онкогеноми-ки, молекулярной биологии вирусов, вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН.

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 12 статей опубликованы в журналах, рекоменованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 33 рисунка, 5 таблиц и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение, выводы и список литературы, который содержит 211 источников.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Проницаемость почечного барьера животных для циркулирующей ДНК исследовали в экспериментах на мышах линии СЗНА и крысах линии \Vistar. Животным вводили подкожно [32Р]-меченную ДНК или клетки лимфомы человека Яа^ (меченные [3Н]-тимидином или немеченные), предварительно подвергнутые у-облучению для индукции апоптоза. Трансренальную ДНК грызунов анализировали методами электрофореза и ПЦР.

Проницаемость почечного барьера человека для циркулирующей ДНР определяли на модели женщин-«химер», т.е. женщин, в организме которы? присутствуют клетки мужчин, содержащие Y хромосому. Методом ПЦР иссле довали трансренальную ДНК беременных женщин (55 образцов мочи были по лучены в родильном отделении Городской больницы № 7, Москва) или реципи ентов крови донора-мужчины (9 образцов мочи были получены в абдоминаль ном отделении НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина> РАМН).

Возможность выявления опухолевых генетических маркеров в трансре нальной ДНК онкологических больных исследовали на клиническом материале полученном в НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН. Коллекция состояла из образцов операционного материала (опухолево! и прилежащей к ней нормальной ткани), крови и мочи от 17 больных ракод толстой кишки, 20 больных раком яичников, 8 больных раком поджелудочно! железы, а также парафиновых блоков от 20 больных раком толстой кишки.

В работе были использованы следующие методы исследования: выделе ние ДНК из образцов тканей и мочи депротеинизацией фенолом и гуанидини зотиоцианатным методом, электрофоретическое разделение фрагментов ДНК i гелях агарозы и полиакриламида, получение радиоактивно меченной ДНК, раз личные варианты ПЦР: стандартная, «гнездная», «обогащенная» (реакции про водили на приборе Eppendorf MasterCycler, Германия), ПЦР в реальном време ни (ПЦР-РВ) и плавление ампликонов (приборы Bio-Rad iQ5 и CFX96, США) определение концентрации ДНК спектрофотометрическим и флуориметриче ским методами.

Выявление мутаций онкогена К-RAS проводили методами: секвенирова ния по Сэнгеру, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), HRMA (High Resolution Melting Analysis).

В ходе выполнения диссертационного исследования были разработаны новые методические приемы, повышающие чувствительность ДНК-диагностпки: «шаблон»-опосредованная ПЦР, гибридизация-элонгация фраг-ментированной ДНК, «открытый формат» плавления ампликонов.

Результаты и обсуждение 1. Трансренальная ДНК: обнаружение и использование 1.1. Эксперименты на животных

На первом этапе работы было проведено исследование метаболической судьбы ДНК гибнущих в организме клеток. В экспериментах на лабораторных животных с введением им подкожно радиоактивно меченной ДНК было установлено: преобладающая часть экзогенной ДНК деградирует до мономеров и реутилизируется в тканях организма, небольшая часть избегает полного распада и экскретируется с мочой в виде низкомолекулярных фрагментов. Количественный анализ экскреции экзогенной ДНК показал: небольшая доля введенной радиоактивной метки (0,06%) выводится из организма животного в виде кисло-тонерастворимых (т.е., относительно полимерных) продуктов (табл. 1).

Таким образом, впервые показана проницаемость почечного барьера животных для низкомолекулярных фрагментов ДНК. Результаты этих экспериментов определили направление дальнейших исследований настоящей работы.

Таблица 1. Экскреция с мочой продуктов распада экзогенной [32Р]ДНК

Радиоактивность (% от введенной метки) 1 сут 2 сут 3 сут Всего

Общая 2,9% 0,3% 0,02% 3,2%

Кнслотонерастворимая 0,06% Н/О Н/О 0,06%

Крысам вводили [32Р]-меченнуто ДНК фага X, мочу собирали 3 сут и определяли общую и кислотонерастворимую экскретированную радиоактивность. Н/О -радиоактивность не определяется.

Анализ размеров экскретируемых продуктов электрофорезом в агарозном геле с последующей авторадиографией показал, что основную их долю составляют фрагменты мононуклеосомной величины (примерно 160 и.о.) (рис. 1).

А В

12 12

Рис. 1. Электрофорез трансренальной ДНК мыши

Мышам вводили [32Р]-меченную ДНК фага X, мочу собирали 3 сут, ДНК выделяли и анализировали электрофорезом в агарозном геле. Дорожки 1 и 2 - независимые эксперименты. А -окрашивание бромистым этидием; В - авторадиография.

Тот факт, что трансренальная ДНК имеет относительно большие размерь делает правомерным вопрос о возможности ее использования в ПЦР с целью ге нетического анализа. Для получения ответа на поставленный вопрос требовг лось установить, сохраняются ли матричные свойства экскретируемой ДНВ Кроме того, в состав ДНК мочи могут входить как трансренальные (преодолен шие почечный барьер) полинуклеотиды, так и фрагменты, происходящие и гибнущих клеток мочевой системы организма (почек, мочеточников, мочевог пузыря). Для выявления методом ПЦР в ДНК мочи трансренальных последовг тельностей необходимо, чтобы они генетически отличались от ДНК организм; В связи с этим в следующей серии опытов мышам вводили клетки лимфомы че ловека 11а.р, предварительно подвергнутые у-облучению для индукции апоптоз. В ДНК мочи мыши методом ПЦР выявляли специфические для человека (и от

сутствующие у грызунов) Л/и-последовательности (рис. 2). Последние действительно были обнаружены.

1 2 з

идис

Рис. 2. Выявление методом ПЦР трансренальной ДНК

Облученные клетки лимфомы человека Raji ннокулировали мышам, мочу собирали 3 сут, ДНК выделяли и анализировали методом ПЦР с праймерами к специфическим для человека повторяющимся последовательностям (Alu-опосредованная ПЦР). Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в полиакри-ламидном геле. Дорожки: 1 - ДНК мочи контрольной мыши; 2 - ДР1К клеток Raji; 3 - ДНК мочи мыши, которой вводили клетки Raji.

Таким образом, впервые было получено свидетельство того, что полимерные ДНК гибнущих клеток способны преодолевать почечный барьер животного, сохраняя при этом свои матричные свойства для ПЦР. Данное наблюдение открывает принципиальную возможность использования трансренальной ДНК для генетического анализа.

1.2. Исследование женщнн-«химер»

Целью следующего этапа работы было выяснение того, насколько данные, полученные на экспериментальных животных, применимы для человека. Иными словами, присутствуют ли в моче человека преодолевшие почечный барьер фрагменты ДНК, пригодные для ПЦР.

Поскольку использование радиоизотопного метода применительно к человеку невозможно, о проницаемости его почечного барьера для полимерных ДНК можно было судить косвенным образом. Для выявления методом ПЦР в ДНК мочи трансренальных фрагментов, последние должны генетически отличаться от ДНК клеток мочевой системы. В связи с этим была выбрана модель женщин-«химер», т.е. женщин, в организме которых присутствуют клетки мужчин, содержащие У хромосому. Таковыми являются женщины, беременные плодом мужского пола, а также женщины, которым по медицинским показаниям перелили кровь (в том случае, если донором оказался мужчина). Обнаружение в ДНК мочи таких женщин нуклеотидной последовательности, специфической для У хромосомы, явилось бы свидетельством проницаемости почечногс барьера для полимерных ДНК, пригодных для генетического анализа.

На рис. 3 представлены результаты опытов, демонстрирующих присутствие в моче человека трансренальной ДНК. Спустя 10 сут после переливания 5 женщинам 250 мл крови донора-мужчины в моче пяти из них детектировано присутствие У-специфических последовательностей.

12 3 4 5 6

Щ —77 1

Рис. 3. Выявление методом ПЦР У-специфической последовательности в ДНК мочи женщин после трансфузии кровн донора-мужчины

Дорожки: 1-4 - моча женщин (10 сут после трансфузии 250 мл крови); 5 - положительный контроль (1 пг ДНК лимфоцитов мужчины); 6 - отрицательный контроль (солевой раствор, прошедший все этапы выделения и анализа ДНК).

В следующих экспериментах выявляли присутствие У-специфически? последовательностей у беременных женщин. При исследовании 55 образцог ДНК мочи женщин пол ребенка был верно определен в -80% случаев. Результаты типичного эксперимента представлены на рис. 4.

А В С

12345 1 2345 123 45

Рис. 4. Выявление методом ПЦР У-специфической последовательности в ДНК мочи женщин, беременных плодом мужского пола

Дорожки: 1 - моча женщины, беременной девочкой; 2, 3, 4, 5 - моча беременных мальчиками женщин. А, В и С - три независимых эксперимента, в которых сопоставлены разные способы выделения трансренальной ДНК.

Таким образом, впервые установлена проницаемость почечного барьера человека по отношению к фрагментам ДНК, пригодным для ПЦР.

1.3. Трансренальная ДНК как объект генодиагностики

Определение возможности выявления в трансренальной ДНК онкологических больных опухолевых маркеров проведено на модели онкогена К-ЯАЯ (кодон 12 экзона 2). Мутации выявляли методом РТЪР («обогащенная» ПЦР), позволяющим детектировать мутантные последовательности в условиях избытка последовательностей дикого типа [КоргеэИ е1 а1., 1997]. При реализации этого метода создается искусственный сайт рестрикции в ампликоне дикого типа, отсутствующий (из-за нуклеотидной замены) в ампликоне с мутацией. Это создает возможность промежуточного этапа рестрикции, приводящего к снижению содержания нормальных аллелей гена К-ЛАБ и относительному обогащению мутантных аллелей. Обработка продуктов второго раунда ПЦР рестриктазой

позволяет идентифицировать аллели дикого типа и мутантные (по присутствию фрагментов размером 42 п.о. и 71 п.о., соответственно).

Проведено исследование больных раком толстой кишки и поджелудочной железы (в опухолях этих локализаций мутации гена К-ЯАБ встречаются в -40%

и -90% случаев, соответственно). У больных раком поджелудочной железы (IV стадия) мутации К-ЛЛ5 обнаружены в ДНК мочи в 5 случаях из 8. Результаты типичного эксперимента приведены на рис. 5.

1 2 3

' - 1.

• щ Щ • ^ ▼ * ш >— 1гИас1 'Щ \Iutant

Рис. 5. Выявление мутаций гена К-ЛЛ^ в трансренальной ДНК больных раком поджелудочной железы методом Ш<ЪР

Цифрами обозначены больные. Ампликоны, интактные (-) и обработанные реет риктазой ВяЛЧ! (+), разделяли электрофорезом в ПААГ. Положение интактног ампликона и аллелей мутантного и дикого типа указано стрелками.

А 1 2 3

' - + ^ (_

— — — ■*— Мае!

< — -—WT

В 1 2 3

' - + > + ^ (_ + ^ £«N1

„ | т — Май ■*—М^аШ

и ч—у/Т

Рис. 6. Выявление мутаций гена К-Л/15у больных раком толстой кишки методом 1*РЬР

А и В - два больных раком толстой кишки. 1 - ДНК нормальной (окружающей опухоль) ткани; 2 - ДНК опухолевой ткани; 3 - транеренальная ДНК (значки - и + обозначают ампликоны, не обработанные и обработанные ре-стриктазой 6«<1М1). Положение интактного ампликона, а также аллелей мутантного и дикого типа указано стрелками.

У 7 больных раком толстой кишки мы имели возможность исследовать по 3 образца у каждого пациента: фрагмент опухоли, окружающую ее морфологически не измененную нормальную ткань и мочу (пробу получали за 24 часа до операции). Мутации онкогена обнаружены в опухолевой ткани 5 больных, у 4 из которых мутации присутствовали и в трансренальной ДНК (рис. 6). У здоровых доноров и больных, в опухолевой ткани которых не выявлены мутации, их не было и в трансренальной ДНК.

Таким образом, впервые в ДНК мочи онкологических больных обнаружено присутствие мутантного гена К-Л45, происходящего из опухолевого очага. Тем самым продемонстрирована принципиальная возможность использования трансренальной ДНК для выявления растущей в организме опухоли.

Вместе с тем, анализ данных литературы о диагностической ценности циркулирующих ДНК, а также критическая оценка собственных результатов свидетельствуют о необходимости совершенствования соответствующих методических приемов как первостепенной задаче генодиагностики рака, поскольку недостаточно высокая чувствительность существующих методов детекции имеет следствием большую долю ложноотрицательных результатов.

2. Новые методические подходы 2.1. «Шаблон»-опосредованная ПЦР

В исследованиях опухолевого роста одной из наиболее трудных проблем является необходимость выявления генных мутаций в условиях избытка аллелей дикого типа. Это обстоятельство затрудняет обнаружение мутантных форм. Объектом такого анализа часто является онкоген К-Л45, мутации которого (ко-дон 12) обнаружены во многих опухолях. Эффективным способом снижения содержания нормальных аллелей К-ЯАБ является т.н. «обогащенная» ПЦР (см. выше). Однако, данный метод проблему конкуренции полностью не решает, поскольку избыток аллелей дикого типа в исходной пробе сохраняется ненз-

менным (рестрикционному расщеплению подвержены лишь продукты самой реакции).

Ранее в нашей лаборатории был разработан способ избирательного расщепления аллелей дикого типа гена К-/Ш" в исходной пробе ДНК, в значительной степени устраняющий, в сочетании с последующей «обогащенной» ПЦР, существующие проблемы. Суть подхода заключается в применении "шаблона", 16-нуклеотидной последовательности дикого типа, включающей последовательность кодона 12 и. непосредственно перед ним расположенного сайта рестрикции А1и\ (рис. 7). Отжиг денатурированной ДНК с "шаблоном" приводит к восстановлению полноценного сайта рестрикции А1и\ в случае последовательности дикого типа, тогда как в случае мутантного аллеля сайт исчезает из-за неспаренного основания в кодоне 12 (рестриктазы обычно требуют фланкирования сайта узнавания б парами оснований с обеих сторон). Двух-этапная обработка ДНК рестриктазой А1и\ (вначале гибрида шаблона с одной нитью, а затем с другой) при 45°С приводит к преимущественному расщеплению аллелей дикого типа и, соответственно, значительному обогащению му-тантных аллелей.

Эффективность этого приема зависит, как было обнаружено, от размера фрагментов ДНК исходной пробы: чем более полимерна ДНК, тем хуже оказывалась дискриминация нормальных и мутантных аллелей. При исследовании этого феномена были получены данные, свидетельствующие о том, что «шаблоны» не могут гибридизоваться с денатурированной высокополимерной ДНК из-за ее выраженной вторичной структуры (повышенной способности к внутри-и межмолекулярным взаимодействиям, к образованию «шпилек»). Исключение «шаблонов» из комплементарных взаимодействий и восстановление сайта рестрикции А1и\ в ренатурированной ДНК приводило к отсутствию «шаблон»-оносредованной дискриминации нормальных и мутантных аллелей. Предварительная обработка образца геномной ДНК рестриктазой НаеIII, фрагмента-рующей препарат и снижающей тем самым возможность внутри- и межмолеку-

лярных взаимодействий, но не затрагивающей ампликон К-Л45, устраняла это нежелательное явление.

Sense primer Anti-sense primer Hae\\\ (1236)

_Л. "КГ-

НаеIII (827) Mill (868) ji4r ^Codon 12

w»® у

Exon 1

В

K-&4S (+нить)_

г

А1и\ 12

1-1

...5 '-tgtggtagttggAGCT GGT ggcgtaggcaagag .

Ill ITTI I I I III TTI

3 '-tcaaccTCGA CCA ccg

ШАБЛОН (-нить) -

Рис. 7. Схема «шаблои»-опосредованного обогащения мутантного К-ЛЛ5

А - схематическое представление анализируемого участка, включающего экзон 2 с кодоном 12, сайты рестрикции НаеIII и А1и\ (последний непосредственно предшествует кодону 12), а также sense и antisense праймеры, используемые для амплификации фрагмента длиной 157 п.о.

В - комплементарное взаимодействие денатурированной ДНК дикого типа (+ нить) с шаблоном длиной 16 нуклеотидов (- нить) восстанавливает сайт рестрикции Alul, благодаря чему становится возможным ферментативное расщепление последовательности дикого типа. Мутация в кодоне 12 создает при гибридизации с шаблоном неспаренное основание в участке связывания фермента, что препятствует расщеплению мутантного аллеля.

В результате «шаблон»-опосредованной ПЦР в описанном варианте было достигнуто не только значительное обогащение мутантных аллелей, но и повышение на 10-30% эффективности самой амплификации. Усиление амплификации также обусловлено фрагментацией ДНК и меньшей возможностью внутри- и межмолекулярных взаимодействий, что должно облегчать праймерам доступ к комплементарным участкам матрицы. На рис. 8 представлена количественная оценка «шаблон»-опосредованной дискриминации нормальных и мутантных аллелей на примере образцов ДНК, полученных из нормальной (до-

рожки 1-4) и опухолевой (дорожки 5-8) ткани. Судя по результатам денсито-метрии (программа ТЫаИлЬ), предложенным нами способом удаляется -80% аллелей дикого типа.

Норма

Шаблоны + А1и\

ппИ-

1 Г

Опухоль

12 3 4 5 6 7

иЧ ■

к д ж 1

Рис. 8. «Шаблон»-опосредованное обогащение мутантных аллелей

ДНК нормальной (дорожки 1-4) и опухолевой (дорожки 5-8) ткани фрагмента ровали рестриктазой НаеIII, после чего амплифицировали либо непосредствен но (контроль - дорожки 1,2 и 5,6), либо после «шаблон»-опосредованного обо гащения (дорожки 3,4 и 7,8). Под рисунком - денситограммы дорожек 5 и 8 свидетельствующие о значительном обогащении мутантного аллеля в анализи руемой ДНК (пик 1 - мутантная полоса; пик 2 - нормальная полоса).

2.2. Метод гибридизации-элонгации фрагментов ДНК

Другой проблемой, существенно ограничивающей чувствительность анализа циркулирующей ДНК, является ее фрагментация присутствующими в биологических жидкостях нуклеазами. Фрагменты меньшего размера, чем ампли-кон, не участвуют в ПЦР. и лишь малая доля фрагментов, равных по величине ампликону, может быть матрицей из-за несовпадения с «рамкой», задаваемой праймерами. Матрицами могут служить лишь те молекулы, размер которых е

несколько раз превышает размер ампликона. Таких фрагментов в образце циркулирующей ДНК может оказаться немного или не оказаться вовсе.

Один из способов преодоления этой проблемы - синтез максимально коротких ампликонов, что, однако, не всегда возможно. Другой способ, разрабатываемый нами, состоит в удлинении, элонгации 3'-концов коротких фрагментов ДНК для вовлечения их в ПЦР.

-Гк-

ф Гибридизация

.......^

ф Элонгация

ф Удал

ение матрицы

ф ПЦР

Рис. 9. Этапы гибридизационной селекции-элонгации фрагментов ДНК

А - конструкция избирательно расщепляемой матрицы, предназначенной «захватывать» специфические последовательности из денатурированного образца циркулирующей ДНК: на магнитной грануле 8Ь-ер1ау1с1т-Оупа1 иммобилизована однонитевая ДНК (ее 3'-конец биотинилирован, а тимидин в ее составе заменен уридином).

В - гибридизация с короткими специфическими последовательностями К-&45. С - элонгация коротких фрагментов (перенос магнитных гранул в среду с Тац-полимеразой и дезоксинуклеозидтрифосфатами; инкубация при 43°С). Б - расщепление матрицы (обработка образца урацил ДНК гликозилазой во избежание ложноположительных результатов ПЦР). Е - амплификация элонгированных фрагментов.

При реализации этого подхода была синтезирована избирательно расщепляемая матрица - однонитевая ДНК, представляющая собой (минус)-нить ампликона К-МЯ дикого типа, биотинилированная на 3'-конце и содержащая в своем составе уридин вместо тимидина. Эту конструкцию иммобилизовали на

магнитных гранулах 8Ц'ер1ау1сНп-Вупа1 и использовали для гибридизационно? селекции последовательностей-«мишеней» К-Л451, присутствующих в образце исследуемой предварительно денатурированной ДНК. Гибридизованные коррт-кие фрагменты, играющие в данной ситуации роль праймеров при амплификации, элонгировали Taq-пoлимepaзoй, а матрицу затем расщепляли урацил ДН[< гликозилазой. Модифицированные таким образом специфические последовательности амплифицировали в ПЦР (рис. 9).

2000

1500 | 1000 500

0

0 I [I 20 30 40

Cycles

Рис. 10. Характеристика методом ПЦР-РВ эффективности гибридизацшг-элонгации коротких фрагментов,ДНК

Ампликон K-&4S размером 87 п.о. синтезировали в ПЦР в реальном времени е присутствии красителя SYJ3R Green I. Кривые амплификации: I и 2 - искусственно синтезированный фрагмент K-R/iS размером 25 оснований (положительный контроль) до и после элонгации, соответственно; 3 и 4 - транеренальная ДНК четырех онкологических больных до и после элонгации, соответственно.

Демонстрация эффективности этого подхода применительно к транере нальной ДНК представлена на рис. 10. Судя по результатам П.ЦР-РВ, предвари тельная процедура гибридизации-элонгации во много раз повышает чувстви тельность анализа (сдвиг порогового цикла С, на 5 единиц влево соответствуе-

Amplification

...............

: 2 —*■/ а

/ //; ¡г3 // ; $ 11 и

- Threshold line / "' ff '■■/

---т---—------

увеличению исходного числа копий последовательностей-«мишеней» в образце в-30 раз).

2.3. «Открытый» формат плавления ДНК

Одним из наиболее эффективных способов выявления генных полиморфизмов и мутаций является разработанный несколько лет назад физический метод плавления ампликонов HRMA (High Resolution Melting Analysis) [Erali et al., 2010]. Его основой является зависимость температуры плавления (Тт) двойной спирали ДНК от ее длины, содержания GC пар, нуклеотидной последовательности и степени комплементарности нитей. О присутствии неспаренных оснований в гетеродуплексах ДНК, образующихся в ходе ПЦР, и, следовательно, о наличии мутаций в них свидетельствуют характерные изменения кривых плавления (гетеродуплексы, менее стабильные, чем гомодуплексы, плавятся при более низкой температуре). Благодаря появлению в последние годы «насыщающих» флуоресцентных красителей ДНК, не ингибирующих ПЦР даже в высоких концентрациях, а также приборов ПЦР, снабженных модулем плавления ДНК высокого разрешения и соответствующим программным обеспечением, оказалось возможным выявлять полиморфизмы протяженных (до 1000 п.о.) последовательностей ДНК [Montgomery et al., 2007]. i

Одним из главных преимуществ HRMA является так называемый «закрытый» формат («closed tube» format), т.е., плавление ДНК происходит непосредственно после ПЦР, без каких-либо дополнительных манипуляций. «Закрытый» формат обеспечивает высокую производительность метода.

У HRMA есть и недостатки. Во-первых, широкое'сго применение ограничено высокой стоимостью соответствующего оборудования. Во-вторых, "закрытый" формат делает HRMA «заложником» условий предшествующей ПЦР. По этой причине HRMA, крайне чувствительный к солевому составу среды плавления, почти всегда реализуется в неоптимальных условиях (в среде ПЦР).

В-третьих, среда ПЦР содержит Трис-буфер, pH которого зависит от температуры и меняется в процессе анализа, что влияет на стабильность ДНК.

Таким образом, можно заключить, что хотя HRMA весьма эффективен в решении многих экспериментальных и клинических задач, для реализации всего его потенциала (и, в частности, максимальной чувствительности) необходим отказ от «закрытого» формата. Плавление ампликонов следует проводить в «открытом» формате, предполагающем промежуточную между ПЦР и плавлением процедуру оптимизации условий среды.

Необходимым этапом определения этих условий было исследование факторов, влияющих на плавление ДНК: концентрации красителя, ионного состава среды, величины pH, размера анализируемого ампликона, положения неспа-ренного основания в ампликоне, величины фона. В качестве объекта исследования был выбран онкоген К-RAS как наиболее часто мутирующий во многих опухолях человека (выявление этих мутаций может определять стратегию лечения больных колоректальным раком и немелкоклеточным раком легких [Deschoolmeester et al., 2010]. Стремясь сделать метод плавления ДНК доступным клиническим лабораториям, мы разрабатывали его «открытый» формат применительно к стандартному (не имеющему модуля HRMA) прибору ПЦР-РВ Bio-Rad iQ5 и общеупотребительному красителю ДНК SYBR Green I.

В результате этих исследований был разработан протокол «открытого*: формата плавления, состоящий из двух этапов: а) продукты ПЦР, включающие два искусственно созданных сайта рестрикции НаеIII, обрабатывали рестрикта-зой Нае III 60 мин при 37°С (цель - укорочение ампликона: чем короче фрагмент ДНК, тем выше вероятность обнаружения мутации); б) инкубационную среду разводили в 4 раза стандартным раствором: 60 мМ Na-фосфзтный буфер pH 7 или 8, 4,5 мМ Na-ЭДТА, 0,5-кратный SYBR Green I (цель - снизить в растворе концентрацию свободного Mg2+, стабилизировать и довести до оптимального значение pH, повысить до необходимой концентрацию SYBR Green I). Е необходимых случаях перед рестрикцией снижали фон иммобилизацией био-

тинилированных ампликонов на магнитных гранулах. Чувствительность метода оценивали посредством последовательных разведений ДНК клеток 8\¥480 (содержат 1 мутантный аллель К-ПАЗ) в избытке ДНК дикого типа (рис.11). Предел обнаружения мутантных аллелей оказался -5%, что сопоставимо с аналогичным показателем НЫМА [ОезсЬоо1тее51ег е1 а!., 2010].

Рнс. 11. Чувствительность «открытого» формата плавления ДНК

Мутантную ДНК из клеток 8\У480 серийно разводили в ДНК дикого типа. Содержание мутантной ДНК представлено в процентной концентрации к тотальной ДНК.

Применение метода плавления ДНК в нашей модификации позволяет констатировать наличие или отсутствие мутации кодонов 12 и 13 онкогена К-ЯЛЯ в образце ДНК, информации о типе мутации метод обычно не дает. О наличии мутации свидетельствует искажение формы пика плавления. Было исследовано 10 образцов ДНК опухолевой ткани больных раком толстой кишки. Присутствие мутаций в 5 образцах было верифицировано методами КРЬР и се-квенирования по Сэнгеру. Результаты эксперимента представлены на рис. 12.

70 75 80 85

Temperature (°C)

—■— #2 —х— #4 —*—#5

■ #6 —— #7 —♦— #8 #9 #10

Рис. 12. Выявление мутаций К-RAS в клинических образцах

Образцы ДНК опухолевой ткани 10 случайно отобранных больных раком толстой кишки исследовали методом плавления ДНК в «открытом» формате. Дополнительный пик слева от основного свидетельствует о присутствии гетеро-дуплексов и, следовательно, о наличии мутации в 5 образцах.

Мы тестировали далее мутации K-RsiS в 20 образцах ДНК парафиновых срезов опухолей толстой кишки (образцы ДНК были любезно предоставлены проф. А.И. Карселадзе и A.M. Строгановой, лаборатория молекулярной патологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН). ДНК исследовали тремя независимыми методами: RFLP, секвенирования по Сэнгеру и плавления ДНК в предложенном нами варианте (табл. 2). Секвенирование по Сэнгеру (общепринятый стандарт в современной генодиагностике) выявило мутации в 13 образцах из 20: кодона 12 - в 10 (методом RFLP подтверждено присутствие мутаций во всех образцах, за исключением #19, где из-за низкого, по-видимому, качества ДНК не прошла амплификация) и кодона 13 - в 3 (RFLP состояние этого кодона не тестирует).

Плавление ДНК не только выявило все образцы с мутациями, идентифицированными другими методами, но и обнаружило дополнительно еще четыре «подозрительных» образца (обозначены в табл. 2 вопросительными знаками). У них искажение формы пика плавления было выражено не столь явно, как у «несомненных» мутантов, что, по-видимому, свидетельствует об относительно низком содержании мутантных аллелей в тотальном препарате ДНК. Это предположение подтвердилось в дополнительном углубленном исследовании «подозрительных» образцов методом HRMA (прибор CFX96, снабженный модулем HRMA, краситель EvaGreen, укороченный ампликон, удаление фона, применение программного обеспечения HRMA).

Таким образом, наши данные в согласии с данным литературы [Vossen et al., 2009] свидетельствуют о более высокой чувствительности метода плавления ДНК по сравнению с секвенированием по Сэнгеру (стандартным методом в клинических исследованиях). Недостаточная чувствительность последнего (предел обнаружения мутапгиых аллелей - 20-30%) приводит к высокой доле ложноотрицательных результатов и, как следствие, неверному выбору стратегии лечения больных раком легких и толстой кишки [Querings et al., 2011].

Предлагаемый нами вариант плавления ампликонов: а) повышает чувствительность мутационного сканирования, что способствует снижению доли ложноотрицательных результатов, б) применим в клинических лабораториях, поскольку адаптирован к стандартным приборам ПЦР-РВ (без модуля HRMA), менее дорогим и более широко распространенным.

«Открытый» формат предложен нами для сканирования мутаций гена К-RAS, но аналогичный подход может найти применение и в других подобных ситуациях. Простота, высокая производительность и чувствительность метода плавления ДНК делают его весьма привлекательным для применения в клинической генодиагностике.

Таблица 2. Сопоставление методов выявления мутаций К-НАБ

Образцы ДНК Патология Мутации

Секвенирование ЯРЬР Плавление ДНК

1 Рак прямой кишки С12. СОТ>ОТТ + +

2 Рак прямой кишки - - 9

3 Рак прямой кишки С12. ОСТ>ОАТ + +

4 Рак сигмовидной кишки С12. ООТ>ОАТ + +

5 Рак толстой кишки - - 1

6 Рак ободочной кишки С13. вСОвАС - +

7 Рак сигмовидной кишки С12. ССГ^СТ + +

8 Рак прямой кишки - - ч

9 Рак прямой кишки С13.ССС>ТСС - +

10 Метастаз рака кишки в печень С12. ООТ>ОТТ + +

11 Рак сигмовидной кишки - - -

12 Рак прямой кишки - - 1

13 Рак сигмовидной кишки С12. ССРЮТТ + +

14 Рак толстой кишки С13. вСОвАС - +

15 Рак толстой кишки С12. ССГ>ОТТ + +

16 Рак толстой кишки - - -

17 Рак прямой кишки - - -

18 Рак толстой кишки С12. СОТ>ОАТ + +

19 Рак слепой кишки С12. ООГЮАТ и.о. +

20 Рак сигмовидной кишки С12. ООТ>ТОТ + +

выводы

Впервые показано, что фрагменты циркулирующей ДНК мононуклеосом-ного размера способны преодолевать почечный барьер экспериментальных животных и человека.

Впервые показано, что трансренальная ДНК пригодна для неинвазивного генетического анализа методом ПЦР.

Впервые в трансренальной ДНК онкологических больных обнаружены опухолевые генетические маркеры.

Разработан метод «шаблон»-опосредованной ПЦР, позволяющий избирательно расщеплять аллели дикого типа в клинических пробах ДНК для обогащения мутантного аллеля гена К-RAS. Показано, что предварительная рестриктазная обработка высокополимерной ДНК повышает эффективность ПЦР-амплификации и дискриминации нормальных и мутантных аллелей.

Разработан метод гибридизации-элонгации фрагментов циркулирующей ДНК, позволяющий вовлекать в ПЦР-анализ короткие последовательности-мишени, что повышает чувствительность ДНК-диагностики опухолевого роста.

Разработан «открытый формат» плавления ампликонов для сканирования мутаций гена К-RAS. Метод позволяет повысить чувствительность выявления мутантных аллелей, а также использовать для плавления в режиме высокого разрешения (High Resolution Melting Analysis, HRMA) как дорогостоящие приборы с модулем HRMA, так и стандартные приборы ПЦР-РВ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1. Шелепов, В.П. Возможность использования полимерной ДНК, происходящей из гибнущих в организме клеток и проходящей через почечный барьер, для генетического анализа / В.П. Шелепов, С.Л. Арсенин, И.В. Бо-тезату, Р.П. Алехина, Г.И. Потапова, О.В. Горбунов, О.С. Мелконян, С.Р. Уманский, А.В. Лихтенштейн // Вестник ВОНЦ РАМН. — 1997. — №4, —С. 13-17.

2. Моляка, Ю.К. Анализ экскретируемой из организма ДНК как подход к выявлению растущей в организме опухоли / Ю.К. Моляка, И.В. Ботезату. Г.И. Потапова, И.С. Косорукова, О.И. Сердюк, Р.П. Алехина, В.П. Шелепов, B.C. Ананьев, Е.В. Огородникова, О.С. Мелконян, С.Р. Уманский,

B.И. Кныш, А.В. Лихтенштейн // Вестник РАМН. — 2000. — № 7. —

C. 24-27.

3. Botezatu, I. Genetic Analysis of DNA Excreted in Urine: A New Approach foi Detecting Specific Genomic DNA Sequences from Cells Dying in an Organisrr /1. Botezatu, O. Serdyuk, G. Potapova, V. Shelepov, R. Alechina, Y. Molyaka. V. Anan'ev, I. Bazin, A. Garin, M. Narimanov, V. Knysh, H. Melkonyan. S. Umansky, A. Lichtenstein // Clinical Chemistry. — 2000. — Vol. 46, № 8. — P. 1078-1084.

4. Сердюк, О.И. Детекция мутантных последовательностей K-&4S в моче онкологических больных / О.И. Сердюк, И.В. Ботезату, В.П. Шелепов. Г.И. Потапова, Р.П. Алехина, Ю.К. Моляка, B.C. Ананьев, В.И. Кныш, О.С. Мелконян, С.Р. Уманский, А.В. Лихтенштейн // Бюллетень эксп биол. мед. —2001, —Т. 131, № 3. — С. 335-337.

5. Потапова, Г.И. Анализ трансренальной ДНК: новый подход к диагностике рака / Г.И. Потапова, О.И. Сердюк, И.В. Ботезату, В.П. Шелепов Р.П. Алехина, И.С. Базин, М.Н. Нариманов, A.M. Гарин, B.C. Ананьев В.И. Кныш, О.С. Мелконян, С.Р. Уманский, А.В. Лихтенштейн // Вопрось: биол. мед. фарм. химии. — 2002. — № 2. — С. 24-27.

6. Ботезату, И.В. Рестриктазное расщепление ДНК усиливает последующую полимеразную цепную реакцию и способствует дискриминации нормальных и мутантных аллелей K-RAS / И.В. Ботезату, О.И. Сердюк, Г.И. Потапова, В.П. Шелепов, А.В. Лихтенштейн // Доклады Академии наук. — 2003. — Т. 393, № 4. — С. 547-550.

7. Su, Y.-H. Transrenal DNA as a Diagnostic Tool. Important Technical Notes , Y.-H. Su, M. Wang, T. Block, O. Landt, I. Botezatu, O. Serdyuk A. Lichtenstein, H. Melkonyan, L.D. Tomei, S. Umansky // Annals New Yorl Academy of Sciences. — 2004. — Vol. 1022.— P. 81-89.

8. Ботезату, И.В. Детекция генных мутаций в биопробах онкологически? больных: сопоставление сканирующих методов NIRCA и SSCP / И.В. Ботезату, В.Н. Кондратова, В.Л. Черкес, Ю.А. Барсуков, В.Э. Алиев

В.П. Шелепов, А.В. Лихтенштейн // Вопросы онкологии. — 2007. — Т. 53, №5, —С. 549-553.

9. Кондратова, В.Н. Изотахофорез нуклеиновых кислот в трубках агарозного геля / В.Н. Кондратова, И.В. Ботезату, В.П. Шелепов, А.В. Лихтенштейн // Биохимия. — 2009. — Т. 74. — С. 1577-1581.

10. Kondratova, V.N. Tube gel isotachophoresis: a method for quantitative isolation of nucleic acids from diluted solution / V.N. Kondratova, I.V. Botezatu, V.P. Shelepov, A.V. Lichtenstein // Analytical Biochemistry. — 2011. — Vol. 408, № 2. — P. 304-308.

11. Botezatu, I.V. DNA melting analysis: Application of the "open tube" format for detection of mutant К-Ras / I.V, Botezatu, V.N. Kondratova, V.P. Shelepov, A.V. Lichtenstein // Analytical Biochemistry. — 2011. — Vol. 419, N 2. — P. 302-308.

12. Ботезату, И.В. Сканирование мутаций в коротких ампликонах: оптимизация метода плавления ДНК / И.В. Ботезату, К.И. Жордания, А.И. Карселадзе, A.M. Строганова, В.Н. Кондратова, В.П. Шелепов, М.В. Телков, А.В. Лихтенштейн // Молекулярная биология. — 2012. — Т. 46, №3, —С. 1-8.

Тезисы докладов

1. Сердюк, О.И. Выявление мутантных последовательностей К-RAS в ДНК мочи онкологических больных / О.И. Сердюк, В.П. Шелепов, И.В. Ботезату, Г.И. Потапова, Р.П. Алехина, B.C. Ананьев, И.С. Базин, М.Н. Нариманов, Ю.К. Моляка, О.С. Мелконян, С.Р. Уманский, В.И. Кныш, A.M. Гарин, А.В. Лихтенштейн // Экспериментальная онкология. — 2000. — Т. 22.

— С. 6.

2. Lichtenstein, A. Genetic Analysis of DNA Excreted from an organism: A New Approach to Cancer Diagnostics / A. Lichtenstein, I. Botezatu, O. Serdyuk,

G. Potapova, V. Shelepov, A. Garin, V. Knysh, V. Anan'ev, I. Bazin, M. Nari-manov, H. Melkonyan, S. Umansky// 18th UICC International Cancer Congress, 30 June-5 July 2002, Oslo-Norway. International J. Cancer. Abstract book. — 2002. — (Suppl. 13) —P. 361.

3. Лихтенштейн, А.В. Специфические дефекты ДНК: новый класс маркеров опухолевого роста / А.В. Лихтенштейн, О.И. Сердюк, И.В. Ботезату, Г.И. Потапова, В.П. Шелепов // Сборник трудов VI ежегодной российской онкологической конференции. Москва. Издательская группа РОНЦ им.

H.Н.Блохина РАМН. — 2002. — С. 97-99.

4. Потапова, Г.И. Обнаружение мутантного аллеля К-RAS в ДНК мочи больных раком поджелудочной железы и толстого кишечника / Г.И. Потапова, О.И. Сердюк, И.В. Ботезату, В.П. Шелепов, И.С. Базин, М.Н. Нариманов, A.M. Гарин, B.C. Ананьев, В.И. Кныш, А.В. Лихтенштейн // Сборник трудов VI ежегодной российской онкологической конференции. Москва. Издательская группа РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

— 2002, — С. 161.

Подписано в печать 28 . 03 .12 Формат 60x84/16.

Бумага офисная «ЗуеизСору». Тираж 100 экз. Заказ № Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24